ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

МІЩЕНКО ЛІДІЯ ТРОХИМІВНА

УДК 578.864:633.11:[581.52.+57.084]

СМУГАСТА МОЗАЇКА ПШЕНИЦІ

(WHEAT STREAK MOSAIC VIRUS)

В ПРИРОДНИХ УМОВАХ І В ТРАНСФОРМОВАНОМУ

СЕРЕДОВИЩІ

03.00.06 – вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

КИЇВ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, академік УААН Бойко Анатолій Леонідович, Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, професор кафедри вірусології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Щербатенко Іван Степанович, Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу фітопатогенних вірусів

доктор біологічних наук, професор Радавський Юрій Леонідович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу структури та функцій білків та пептидів

доктор медичних наук, професор Васильєва Віра Львівна, Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л. В. Громашевського АМН України, професор відділу загальної вірусології

Провідна організація: Нікітський ботанічний сад національний науковий центр УААН, м. Ялта.

Захист дисертації відбудеться, “22“ June 2004 р. О 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, пр-т Глушкова 2, корпус 12, ауд. 433.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “ 21“ May 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В. Молчанець

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Останім часом зернові культури в Україні зазнають зростаючого впливу різних фітопатогенів, серед яких суттєве місце належить вірусам (Олійник А.М., 1968; Шевченко Ж.П., 1971; Бойко А.Л. та ін., 1990, Юхименко А.І., 2000). Відомо, що незбалансованість елементів живлення в грунті, різке коливання природних факторів, а також низький рівень застосування засобів хімічного захисту послабили імунну активність і підвищили ступінь пошкодження озимої пшениці вірусними інфекціями. Навіть у сприятливих для рослиництва умовах України втрати врожаю від вірусних хвороб можуть складати до 60 % при значному погіршенні якості зерна. Тому різке падіння врожаю озимої пшениці в так звані неврожайні роки пов’язане не лише з дією несприятливих екологічних факторів, але і з впливом вірусних інфекцій, які розвиваються на фоні послаблення імунної активності рослинного організму

В аграрному секторі України пшениця займає найбільші посівні площі – біля 6-7 млн. га. Врожайність в останнє десятиріччя складає 26,2 ц/га. Вона є набагато нижчою за потенційні можливості українських сортів і грунтів. Дані по валовому збору зерна пшениці з 1913–2001 рр. переконливо демонструють залежність її продуктивності від дії різних чиників, важливе місце серед яких займають вірусні інфекції.

В Україні не приділяється належної уваги вивченю вірусних хвороб пшениці, відсутні надійні тести по їх ідентифікації (науково-дослідні заклади, селекційні станції не мають високоспецифічних діагностичних антисироваток до вірусів пшениці, зокрема, до найбільш поширених та шкодочинних вірусу смугастої мозаїки пшениці та вірусу жовтої карликовості ячменю). Саме тому їх вивчення заслуговує на увагу та визначає актуальність і пріоритетність науково-дослідних робіт даного напрямку.

Вірус смугастої мозаїки пшениці (ВСМП) поширений в усьому світі й надзвичайно шкодочинний. Він належить до чинників першого (летального) типу впливу на врожайність злакових рослин, зокрема, озимої пшениці – основної сільськогосподарської культури ( Brakke et al., 1990; Rabenstein et al., 2002; Seifers et al., 1996, 1998; Бойко и др., 1990; Мichshenko et al., 1994, 1997; Шпаар и др., 2002).

Хоча вірус смугастої мозаїки пшениці було виявлено в Європі ще в кінці 30-х років, а його дослідження розпочалося в 60-х роках минулого століття, актуальність всебічного вивчення цього патогену і до нашого часу не зменшилась, оскільки через методологічні труднощі тривалий час не вдавалося накопичити, виділити і сконцентрувати патоген, а, отже, детально дослідити його біологічні і молекулярні властивості. Клітинні механізми взаємовідносин ВСМП з рослинами родини злакових (Poaceae, Gramineae), зокрема з пшеницею, та ультраструктурні зміни при патогенезі також майже не досліджені.

На сучасному етапі “початку екологічних криз“, зумовлених глобальними змінами клімату на Землі та трансформуванням людською діяльністю навколишнього середовища, моніторинг вірусних інфекцій у еко- та агроценозах є одним із першочергових заходів для запобігання їх знищення, збереження сталості розвитку та функціонування.

Недостатньо вивчено проблеми специфічності взаємодії вірусу з різними генотипами рослин-хазяїв та підвищення адаптогенних властивостей останніх за допомогою комплексу селекційних та агротехнічних заходів. Спираючись на відкриття останніх років, зроблених завдяки застосуванню методів електронної мікроскопії та молекулярної біології, можна вважати, що відбувалась еволюція, дивергенція та інтродукція ВСМП. Тому контроль за цією небезпечною хворобою вимагає створення стратегії боротьби, що враховує повний обсяг внутрішньовидової різноманітності вірусу смугастої мозаїки пшениці (Wheat streak mosaic virus), що належить до роду трітімовірусів (Tritimovirus), родини потівірусів (Potyviridae).

Створення орбітальних космічних станцій спричинило розробку нових технологій вирощування на них традиційних зернових культур і інших рослин (Кордюм, 2002; Левинских, 2002; Bingham et al., 2000; Черевченко, Заіменко, 2001; Musgrave et al., 1998; Сычев и др., 2003; Попова, 2003). Багато проблем, що стосуються розкриття особливостей росту і плодоношення рослин у космосі, зокрема, розвитку латентної вірусної інфекції, що може проявитися в умовах невагомості і призвести до небажаних наслідків, залишаються ще не вирішеними. З іншого боку, існує реальна перспектива створення нових підходів для отримання безвірусного рослинного матеріалу в умовах мікрогравітації.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами

Робота виконувалась згідно з науковими темами кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного університету та у відповідності з вітчизняними та зарубіжними замовленнями:

“Вивчити вірусні хвороби пшениці і стійкість до них перспективних сортів, вирощуваних за інтенсивними технологіями” (госпдоговір 485-86, № держреєстрації 01860111943, 1986-88 р.р.) – відповідальний виконавець.

“Вивчення взаємодії вірусних і грибних хвороб зернових культур і надання рекомендацій для боротьби з ними в колгоспі ім. Бузницького Миронівського району Київської області” (госпдоговір № 472-89, № держреєстрації 01890052549, 1989-1990 рр.) – розробник проекту і відповідальний виконавець. “

Вивчити особливості прояву вірусних хвороб сільськогосподарських рослин в різних системах землеробства при проведенні агроекологічного моніторингу в УРСР, РРФСР (Нечорноземна і Центрально-Чорноземна зони), (договір № 14а (Росія, Москва), № 337 КДУ, 1990, 1991 р.) – розробник проекту і відповідальний виконавець.

Проект 3.1.12.22. ДКНТ України “Підвищення продуктивності озимої пшениці шляхом розробки екологічно безпечних засобів боротьби з вірусами рослин” (№ 356 КДУ, Програма 3.1.12. Охорона навколишнього середовища із застосуванням біотехнологій, 1992-1996 рр.) – керівник проекту.

“Вивчення впливу мікрогравітації та факторів космічного польоту на взаємовідносини злакових рослин з вірусною інфекцією” ( № держреєстрації 0193U32386, Програма “Космічна біологія”, 1994-1997 рр.) – розробник проекту і відповідальний виконавець.

“Дослідити закономірності патогенезу фітовірусних інфекцій з метою раціонального використання природних ресурсів” (№ теми 97089, № держреєстрації ДР 0179U003157, в рамках комплексної наукової програми “Агропродкомплекс”, 1997-2000) – виконавець.

“Дослідження вірусної етіології захворювання рослин пшениці в умовах зміненої сили тяжіння” (договір №13 б, № держреєстрації 0198U004498, Програма “Космічна біологія” 1998-2002 рр.) – розробник проекту і відповідальний виконавець.

Розробка екологічно чистих технологій вирощування та оздоровлення пшениці від вірусних інфекцій, (проект 2/952–97 ДКНТ України, 1997–2000 рр.) – розробник проекту і відповідальний виконавець.

Дослідження стійкості інфікованих вірусами рослин пшениці до умов мікрогравітації (проект NN– 14 США, 2002 р.) – керівник проекту.

“Моніторинг збудників вірусних інфекцій з метою розробки наукових основ екологічно чистих технологій вирощування сільськогосподарських культур”, (д/т № 01 БФ 036-01, № держреєстрації 0101U005076, 2001-2005 рр.) – виконавець.

Мета і завдання досліджень Метою наших досліджень було встановити закономірності росповсюдження та шкодочинності ВСМП і з’ясувати механізми інфекційного процесу та патогенезу в природних умовах і трансформованому середовищі для розробки заходів підвищення адаптивного потенціалу й продуктивності вірусінфікованих рослин пшениці.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Встановити ступінь ураженості посівів озимої пшениці вірусними інфекціями в агроценозах України та виявити найбільш поширений вірус.

2. Виділити природний ізолят розповсюдженого вірусу смугастої мозаїки пшениці і дослідити його морфологічні, біологічні, фізико-хімічні та молекулярно-генетичні властивості.

3. Розробити ефективну методику очищення вірусу смугастої мозаїки пшениці.

4. Отримати специфічну діагностичну сироватку і розробити тест-системи для діагностики ВСМП імунологічними методами (ТІФА, імунофлуоресценція).

5. Зясувати специфіку ультраструктурної організації клітин мезофілу пшениці за умов розвитку вірусної інфекції.

6. Дослідити вплив вірусної інфекції на фотосинтез рослин пшениці.

7. З’ясувати залежність вірусостійкості рослин пшениці від інтенсивності дихання та дихального коефіцієнту.

8. Визначити мікроспектральні характеристики флуоресценції листків пшениціі, інфікованих ВСМП.

9. Дослідити вплив вірусної інфекції на електропровідність листків пшениці.

10. Встановити структурні і анізотропні властивості листків пшениці, уражених ВСМП, методом повної лазерної Мюллер-поляриметрії.

11. Провести скринінг біологічно активних препаратів та мікроелементів для підвищення адаптаційного потенціалу рослин до вірусної інфекції.

12. Виготовити вдосконалений кліностат, розробити методики культивування рослин пшениці і дослідження інфекційного процесу за умов трансформованого середовища (переорієнтація повздовжньої осі рослин відносно вектора гравітації).

13. Дослідити вплив вірусної інфекції на фізіологічний стан рослин, та перебіг вірусної інфекції за умов трансформованого середовища (кліностатування).

Об’єкт дослідження – механізми поширення інфекційного процесу та зниження вірулентності ВСМП у природних і трансформованих умовах.

Предмет дослідження – вірус смугастої мозаїки пшениці та його взаємовідносини з клітиною і рослиною-хазяїном в природних і трансформованих умовах.

Методи дослідження вірусологічні, фізико-хімічні, біохімічні, біофізичні спектрофотометричні, електронно-мікроскопічні, імунологічні; молекулярно-генетичні; спектроскопічні, математично-статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Сформульована оригінальна концепція екологічної значимості вектора прискорення сили земного тяжіння для морфогенезу, росту і життєдіяльності рослин, включаючи їх взаємовідносини з вірусами.

Вперше показано суттєвий вплив кліностатування на процеси росту, морфогенезу, фотосинтезу та перебігу вірусної інфекції в рослинах пшениці. Встановлено, що тривале кліностатування рослин призводить до звільнення їх від вірусної інфекції.

Виділено і детально досліджено полтавський ізолят вірусу смугастої мозаїки пшениці. Встановлено, що виділений в Україні ізолят вірусу споріднений з ІІ групою північно-американських ізолятів ВСМП.

Вперше проведено всебічне дослідження структурної організації клітин та клітинних органел рослин пшениці, інфікованих ВСМП, в результаті чого встановлено особливості вірусіндукованих перебудов хлоропластів, мітохондрій, рибосом, пероксисом та мембран. Отримані дані важливі для розуміння механізмів вірусного патогенезу та захисних реакцій рослин.

Отримані нові експериментальні дані про вплив ВСМП на фотохімічну активність хлоропластів, вміст фотосинтетичних пігментів і хімічних елементів, інтенсивність дихання та дихальний коефіцієнт, електропровідність листків та індукцію флуоресценції.

Вперше з’ясована можливість застосування методу повної лазерної Мюллер-поляриметрії для діагностики ВСМП в природних умовах і трансформованому середовищі.

Практичне значення одержаних результатів. Результати моніторингу ураженості посівів пшениці вірусними інфекціями, зокрема, виявлення найбільш розповсюджених і шкодочинних вірусів представляє інтерес для планування раціонального розміщення посівів та інтегрованих систем захисту сільськогосподарських культур в Україні.

Розроблені та впроваджені практичні рекомендації щодо вибору сортів, строків сівби, розміщення посівів, агротехнічних заходів та способів підвищення адаптаційного потенціалу рослин мають важливе значення для захисту пшениці від вірусного ураження.

Удосконалена конструкція кліностату, розроблені методики кліностатування рослин, а також виявлене автором звільнення рослин від вірусної інфекції за тривалого кліностатування можуть бути використані для одержання безвірусного рослинного матеріалу в новітніх біотехнологіях як в наземних умовах, так і під час космічного польоту.

В науково-дослідних лабораторіях може бути використана методика очищення вірусу смугастої мозаїки пшениці, а також виявлені автором ультраструктурні особливості інфікованих рослин, що мають діагностичне значення.

Результати проведених досліджень використовуються в навчальному процесі кафедри вірусології у лекціях із загальної вірусології та у спецкурсі “Фітовіруси”. Вони війшли в методичні розробки АПК, навчальні посібники кафедри вірусології біологічного факультету та з молекулярної фізики фізичного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача.

В процесі виконання роботи автором було започатковано нові напрямки досліджень в рамках наукових програм кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка: “Моніторинг ураженості посівів с/г рослин вірусними інфекціями та їх прояв в різних системах землеробства”, “Інфекційний процес фітовірусів за умов стресових чинників”.

Здобувачем особисто здійснено інформаційний пошук і аналіз наукових джерел по темі дисертації, розроблено програму та методологію досліджень і схеми експериментів. Особисто виконано основні експериментальні дослідження, проаналізовано їх результати, сформульовано основні положення та висновки. Впродовж 17-ти років проведено моніторинг вірусного ураження пшениці в 12 областях України. Особисто вперше виділено полтавський ізолят вірусу смугастої мозаїки пшениці, досліджено його властивості, та визначено місце в філогенетичному ряду роду Tritimovirus родини Potyviridae. Вивчено взаємовідносини з рослиною в природних умовах і в трансформованому середовищі.

В процесі виконання роботи науково-консультативну допомогу надавали: д.б.н., професор, академік УААН А.Л. Бойко; к.ф.–м.н., доцент С.М. Савенков, радіофізичний факультет КНУ імені Тараса Шевченка; к.б.н., ст.н.с. О.І. Китаєв, Інститут садівництва УААН; цитологічні дослідження виконані разом з д.б.н., проф. А.М. Сілаєвою, Інститут фізіології рослин і генетики НАН України. Результати сумісних досліджень представлені у відповідних спільних публікаціях. Автор висловлює щиру вдячність колегам за допомогу і співробітництво.

Апробація результатів дисертації Основні наукові результати були представлені на конференції “Вирусология – народному хазяйству”, (Київ, 1987); VI Всесоюзному симпозіумі “Ультраструктура растений” (Київ, 1988); конференції “Ресурсосберегающие технологии в с.х. производстве”, (Волгоград, 1988); конференції “Экологические проблемы земледелия”, (Камянец-Подольский, 1990); На конференції “Биологическая роль микроэлементов и их применение в с.х. и медицине” (Самарканд, 1990); Всесоюзній конференції “Микробиологические и биологические основы интенсификации растениевододства и кормопроизводства”, (Алма–Ата, 1990); ІІІ Всесоюзному симпозіумі “Клеточные механизмы адаптации” “Цитология” (Москва, 1991); “Международной конференции, посвящённой 100-летию открытия вирусов Д.И. Ивановским” (Ростов-на-Дону, 1992); ІІ з’їзді Українського товариства фізіологів рослин, (Київ, 1993); міжнародній конференції “Сучасні методи досліджень в агрономії” (Умань, 1993); Радіобіологічному з’їзді, (Пущино-Київ, 1993); конференції “Fundamental and applied problems in phytovirology” (22–26 травня, 1994, Ялта, 1994); Міжнародній науково-практичній конференції, 12–16 вересня 1994, Одеса); Міжнародному симпозіумі “75 Years of phytopatological and resistance research at Aschersleben” (Німеччина, 12-16 червня, 1995); “31st Scientific Assembly of COSPAR 14 – 21 липня 1996); Міжнародній конференції “Protection of Cereal Crops Against Harmful Organisms”, (Kromeriz, Czech Republic, 1997); На II Міжнародній конференції “Bioresourses and Viruses” (Kиїв, 1998); На “VIII Conference on Virus Diseases of Gramineae in Europe”, Goslar; 1998); Міжнародній конференції “Онтогенез рослин в природному та трансформованому середовищі”, (Львів, 1998); першій Міжнародній конференції “Наука і освіта 98”, (Дніпропетровськ, 1998). На VII International Plant Virus epidemiology symposium, (Almeriа, Spain, 1999); Міжнародній конференції “Физиология растений – наука ІІІ тысячелетия” IV съезд общества физиологов растений России (Москва, 1999); “21st Annual International Gravitational Physiology Meeting 3-8 April”, (Nagoya, Japan, 2000); на ІІІ Міжнародній конференції "Біоресурси та віруси", (Київ, 2001);“22nd Annual International gravitational Physiology Meeting”, (22-27 April, Budapest, Hungary, 2001); “VIIIth International Plant Virus Epidemiology Symposium”, (Aschersleben, Germany, 2002), “VIII-th International Plant Virus Epidemiology Symposium”, (Aschersleben, Germany, 2002); “23 Annual International Gravitational Physiology Meeting and 8th European Symposium on Life Sciences Research in Space “Life in Space for Life on Earth” (Karolinska Institute, Stockholm, Sweden, 2002); 12 Конференції по космічній біології і авіакосмічній медицині 10 – 14 червня, Москва, Росія, 2002); “34-th COSPAR Scientific Assembly”, (Houston, Texas, USA, 2002); Українській конференції з перспективних космічних досліджень, (Кацивелі, Крим, 2002); “13-th FESPP Congress, (Греція, 2002); “24-th Annual International Society for Gravitational Physiology Meeting, (Santa Monica, California, USA, May 4-9, 2003); “54-th International Astronautical Congress, Bremen, Germany, September 29 October 3, 2003). International Conference “Photopolarimetry In Remote Sensing”. Yalta, Ukraine, 2003; Третій Українській конференції з перспективних космічних досліджень (Кацивелі, Крим, 2003).На конференції “Организм и окружающая среда: адаптация к экстремальным условиям. Космическая биология и авиакосмическая медицина, посвященной 40-летию Института медико-биологических проблем – ведущего научного учреждения России по проблемам космической биологии и медицины (3–5 ноября, Москва, 2003).

Публікації. Основні результати дисертації висвітлені у 72 наукових працях, в тому числі 22 статтях, що опубліковані у наукових виданнях, перелік яких затверджений ВАК України.

Структура та об’єм дисертації Дисертація викладена на 313 сторінках машинописного тексту, і складається зі вступу, огляду літератури, результатів власних експериментів,матеріалів і методів досліджень аналізу та узагальнення результатів, висновків та списку використаних літературних джерел із 556 найменувань, із них 274 іноземних авторів, містить 37 таблиць, 91 рисунок і додатки.

Основний зміст роботи

Огляд літератури. В чотирьох розділах огляду літератури наведено сучасні відомості щодо вірусних хвороб пшениці та їх збудників, методів дослідження фітопатогенних вірусів, впливу вірусу на метаболізм рослини-хазяїна та дії факторів космічного польоту і кліностатування на метаболізм рослин та перебіг вірусної інфекції.

Матеріали та методи досліджень. В роботі були використані: виділений нами полтавський ізолят ВСМП; специфічні діагностичні антисироватки до ВСМП (МДУ, Москва; Ашерслебен, Брауншвейг, Німеччина); здорові та природно інфіковані рослини пшениці (Triticum) сортів Донська напівкарликова, Саратівська-29 (російська селекція); Альбатрос одеський, Чайка, Миронівська-808, 61, Коломак, Колективна-3, Українка полтавська, Айсберг одеський, Поліська-87, Щедра Полісся, Киянка, Мирлебен, (українська селекція); Апогей (селекція США); традиційні (Datura stramonium L., Chenopodium murale L., Chenopodium amaranticolor Coste et Regen, Lycopersicon esculentum L., Nicotiana tabacum L., Vicia faba L., Pisum sativum L., Capsicum annuum L., Gomphrena globosa L.) та специфічні рослини-індикатори (Triticum durum D e s f., Triticum aestirvum L., Triticum monococcum L., Secale cereale L., Hordeum vulgare L., Avena sativa L., Zea mays L., Panicum miliaceum L., Sorghum vulgare P e r s. та інші); рістрегулюючі препарати: емістим С, агростимулін, триман, синтезовані П.Г.Дульнєвим та С.П. Пономаренко в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України; Б–1 (Бойко, Міщенко); солі мікроелементів.

Вірус накопичували на рослинах ячменю сортів Рось і Цезар, пшениці Струмок, вівса Скакун, кукурудзи Цукрова. Виділення вірусу проводили методом диференційного центрифугування за Brakke (1990) в нашій модифікації. Концентрацію очищеного вірусного препарату визначали спектрофотометрично. Специфічну діагностичну антисироватку до ВСМП отримували шляхом імунізації кролів породи Шиншила за Кетті ( 1991) свіжо- очищеним препаратом вірусу (Радавский, 1994).

Для виявлення вірусу в рослинах, визначення його вмісту та дослідження властивостей використовували методи індикаторного аналізу (Развязкина и Белянчикова, 1966; Решетник та ін., 1996), імунофлуоресценції (Дунин, Володарский 1966, в нашій модифікації); трансмісивної електронної мікроскопії (негативне контрастування, Карупу, 1984; Бойко, 1990, 2003; Салига, 1999); ультратонких зрізів (Силаева, Ширяев, 1966; Силаева, 1978); твердофазного імуноферментного аналізу (ТІФА), диск-електрофорезу, зворотньої полімеразної ланцюгової реакції (RT-PCR). Імуноферментний аналіз проводили за Clark, Adams (1977), Гнутова (1993). Оптичну щільність продукту ферментативної реакції вимірювали при двох довжинах хвиль (492/620 нм) через 30 хв. інкубації при кімнатній температурі на рідері фірми Termo Labsystems Opsys MR (США) із програмним забезпеченням Dynex Revelation Quicklink. Електрофорез структурних білків вірусу проводили за Laemmli (1970), використовуючи набір маркерних білків: 67; 66; 45; 36; 29; 25; 24,1; 20,1; 14,2 кДа (“Sigma”США). Для полімеразної ланцюгової реакції були використані універсальні для потівірусів олігонуклеотидні праймери (Chen et al., 2001): M4T (5'- GTT TTC CCA GTC ACG AC (T)15 - 3') та Sprimer (5'- GGX AAY AAY AGY GGX CAZ CC - 3'), X=A, G, C чи T; Y=T чи C; Z=A чи G (Литех, Москва). РТ-ПЛР проводили, використовуючи реактиви (“Sigma”  США) в термоциклері (Ампліфікатор ДНК багатоканальний “Терцик”, АО ДНК-технологія, Москва, 2001р).

Вплив вірусу на рослину-хазяїна досліджували фізико-хімічними, біохімічними та біофізичними методами. Топографію клітиних некрозів досліджували за допомогою світлового мікроскопу Axioscop (Karl Zeiss Jena, Німеччина). Концентрацію макро- і мікроелементів визначали за Ринькас (1977) методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії (ААS-30, Німеччина); фотосинтетичних пігментів за Wettstein (1957); Welburn (1994); білків за Кьєльдалем, вуглеводів за Починком (1976). Фотохімічну активність хлоропластів визначали за Лебедевим (1977); інтенсивність дихання за Толмачовим (1951); активність пероксидази за швидкістю реакції окислення бензидину (Ермаков, 1973). Індукційні зміни і спектри флуоресценції хлорофілу листків (ефект Каутського) реєстрували за допомогою люмінесцентної мікроспектральної установки СМФ-2 (Китаев, 1988); електропровідність листків пшениці за допомогою електроміру Е7–13, (Сілаєва, Китаєв, Тороп, 1999; Тороп, 2003); структурні та анізотропні властивості методом повної лазерної Мюллер-поляриметрії (Mar’enko and Savenkov, 1994).

Агроекологічний моніторинг ураженості посівів пшениці проводили методом польових маршрутних обстежень (Гешеле, 1978; Артемьева, 1971 Чумаков, 1990). Урожайність сортів, якість зерна та борошна визначали загальноприйнятими методами. Зразки висушеного зерна розмелювали на лабораторному млині Cyklone Sample Mill і використовували для визначення вмісту білка і "сирої" клейковини на приладі Глютоматик (Жемела, 1988).

Досліди в трансформованому середовищі проводили в кліностаті “Цикл- 2” за методиками вирощування рослин і дослідження інфекційного процесу, розробленими нами (Mishchenko et al., 1998; Мищенко, 2002; Мищенко и др., 2003).

Математично-статистичну оцінку вірогідності отриманих результатів проводили методом дисперсійного аналізу (Доспехов, 1985) з використанням статистичних функцій комп’ютерних програм Microsoft Excel, Agrostat.

Результати дослідження та їх обговорення

Моніторинг ураженості посівів озимої пшениці вірусними інфекціями

Агроекологічний моніторинг ураженості посівів пшениці вірусними хворобами, проведений протягом 1986-2003 рр. показав широке варіювання розповсюдження вірусних інфекцій і прояву симптомів ураження в залежності від області, року та сорту (Рис.1).

Рис.1. Розповсюдженість вірусних інфекцій у посівах пшениці господарств різних областей України (1986-2003)

Із 12 обстежених областей України найменший рівень ураженості посівів пшениці (5-10%) спостерігався в Закарпатській, Сумській, Рівненській, Чернігівській, Волинській областях і Республіці Крим (Рис.1). Більш високі рівні ураженості реєструвались в Дніпропетровській обл.–23%, Черкаській–25%, Харківський–29%, Одеській–32%, Київській–30%, Полтавській –35. На окремих ділянках ланів в роки епіфітотій кількість уражених рослин сягала до 85–90%, що призводило до зниження урожайності до 60 % і значно погіршувало якість зерна (Бойко и др., 1988, 1990).

Найбільш чітко симптоми вірусної інфекції проявляються у сортів Донська напівкарликова, Ювілейна-75, Струмок, Українка полтавська, Коломак. Найменш сприйнятливим до ВСМП виявився сорт Чайка. Рівень ураженості рослин даного сорту був у 12 разів нижчим у порівнянні зі сприйнятливим сортом Ювілейна-75. Суворість симптомів хворих рослин даного сорту була у 3 рази нижчою. Ця закономірність зберігалася також і за штучної інокуляції рослин цих сортів у контрольованих умовах закритого ґрунту. Отримані результати узгоджуються з літературними даними про кореляцію між симптомами враження рослин і концентрацією вірусу в них (Юхименко, 2001; Seifers, 1988).

В посівах пшениці циркулюють такі віруси: вірус смугастої мозаїки пшениці (ВСМП), вірус жовтої карликовості ячменю (ВЖКЯ), вірус мозаїки костра безостого (ВМКБ), вірус смугастої мозаїки костра безостого(ВСМКБ), вірус мозаїки пшениці (ВМП) або “російська мозаїка” і вірус штрихуватої мозаїки ячменю (ВШМЯ). Останній на полях зустрічається дуже рідко.

На озимій пшениці досить часто зустрічається мазаїка озимої пшениці (ВМП) “російська мозаїка”, збудником якої є рабдовірус Triticum mosaic virus Zachurilo et Sitnikova. Віріони ВМП мають бациловидну форму довжиною 260 20 нм і діаметром 60 5 нм (рис. 2).

Найбільш розповсюдженою є смугаста мозаїка пшениці, яка проявляється у вигляді світло–зелених і жовтих смужок різної довжини, що поширюються паралельно до жилкування. При сильному розвитку хвороби смуги вкривають поверхню всього листка, штрихи зливаються в смуги, які ширшають. При цьому хлоротичність охоплює всю листкову пластинку, яка нерідко стає майже білою, як пергаментний папір. Через деякий час листок набуває світло-коричневого кольору і засихає.(Рис. 3.4) Подібні симптоми спостерігали Шевченко (1971, 1996) та ін.

Ізолят вірусу, найбільш розповсюдженого в Полтавській обл., відібрано нами для вивчення йго властивостей.

Властивості полтавського ізоляту ВСМП. Біологічні властивості ізоляту досліджували на 12 видах традиційних (класичних) індикаторах вірусних інфекцій–Datura stramonium, .Chenopodium quinaa Wild, Ch. Amaranticolor Coste et Reyen та ін., а також на 9 видах злакових рослин –Triticum aestivum L., Secale cereale L. Hordeum vulgare L. Zea mays L. і ін. За механічної інокуляції рослин-індикаторів виділеним ізолятом вірус передавався лише на злакові рослини. Симптоми вірусного ураження проявлялись у вигляді хлоротичних плям, що згодом переходили у світло-зелені штрихи і повздовжню смугастість, пожовтіння (починаючи з апікальної частини) і наступне відмирання листка. Найчіткіше проявлялися симптоми на ячмені, вівсі, деяких сортах кукурудзи, ярої пшениці. Найбільш високий рівень ураженості рослин (до 80-90%) і найчіткіші симптоми проявлялись на механічно інокульованих рослинах кукурудзи (рис.5).

На ультратонких зрізах клітин мезофілу інокульваних листків пшениці віріони ВСМП були представлені у вигляді пучків ниток трохи звивистих або зігнутих (Рис.6). Профілі поперечних зрізів через ці пучки демонструють впорядковане розміщення віріонів. Вони розташовані рядами з однаковою відстанню як між окремими нитками, так і між рядами.

Дослідження ультраструктурної організації клітин хворих і здорових рослин показали, що в здорових клітинах спостерігається нормальна структура хлоропласту з добре розвиненою ламелярно-гранулярною системою, дрібними пластоглобулами, мітохондрії з кристами і матриксом; рівномірно розміщені рибосоми в цитоплазмі, плазмалема щільно торкається клітинної оболонки. З появою на листках хлорозних смужок в хлоропластах різко збільшуються кількість і розміри пластоглобул, зменшуються середня кількість тилакоїдів у гранах і кількість самих гран, що призводить до різкого зниження об'єму комплексу фотосинтетичних мембран, тобто спостерігається типова картина старіння хлоропластів, яка, звичайно, супроводжується зниженням інтенсивності фотосинтезу листків. З подальшим розвитком хвороби, коли на листках з'являються некротичні зони, настає повна структурна деградація хлоропластів: їх внутрішність заповнюється великими пластоглобулами, залишками здеформованих тилакоїдів, оболонка в багатьох місцях руйнується (рис. 7).

.

В ультраструктурі мітохондрій відбуваються ще більш помітні зміни. Навіть на початковій стадії захворювання починають зникати кристи і матрикс. Надалі мітохондрїї перетворюються на везикулоподібні структури, можливо втрачаючи властивості енергетичного компартмента і починаючи виконувати разом з лізосомами автолітичну функцію. Наші спостереження узгоджуються з повідомленням про участь мітохондрій в елімінації вірусної інфекції (ВТМ) у листках тютюну (Лапшина Л. А., Реунов А.В., Поляков А. М. И др. 1991). На ранніх етапах вірусного патогенезу виявляються структурні особливості, які можуть свідчити про певну переорієнтацію роботи білоксинтезуючої системи. Зокрема, цитоплазматичні рибосоми починають скупчуватися в окремих зонах клітини, утворюючи ланцюжки рибосом, які закручуються в кільця або спіралі (Рис. 8).Частіше це відбувається поблизу ядра і біля колоній віріонів, тому можна припустити, що такі полісоми мають відношення до процесів мультиплікації вірусу, утворення вірусних та патогенозалежних білків.

Поряд з цим спостерігається утворення мембранних везикул, заповнених вільними рибосомами, які інколи осідають на внутрішній поверхні везикулярної оболонки.

Характерним проявом взаємовідносин вірусу з системою синтезу білка є утворення навколо віріонів та їх скупчень мембранних капсул, циліндричних (Рис.9) або віялоподібних (Рис.10) структур, пов'язаних з шорстким ендоплазматичним ретикулумом.

Висловлюється припущення, що такі утвори мають відношення до процесів локалізації і внутриклітинного знешкодження вірусів (Rodriguerz-Cerezo et al., 1993).

За вірусної інфекції плазмалема часто стає звивистою, значно збільшуючи свою поверхню. Між нею і клітинною оболонкою утворюється екстра-целюлярний простір, в якому спостерігаються численні скупчення різноманітних структур. Клітина намагається чинити опір міграції вірусу, утворюючи на плазмалемі з боку цитоплазми захисний шар електронно-щільного матеріалу, а в екстрацелюлярному просторі – губчасту масу. З розвитком інфекції відбувається тотальний автоліз клітини, її структурні елементи злипаються в суцільну електроннощільну масу. Такі сколапсовані клітини і утворюють некротичні ділянки листків.

Можна припустити, що так звана запрограмована загибель клітини чи групи клітин апоптоз (Бережнов, 1990; Дин, 1981; Greenberg, 1996; Ванюшин, 2001; Замятнина, 2002) утворює бар'єр для подальшого розповсюдження вірусу (Малиновский, 1992). Таким чином, проведені електронно-мікроскопічні дослідження дозволили прослідкувати структурні зміни в рослинних клітинах, спровоковані вірусами. На початковій стадії інфекції ці перебудови свідчать про деяку інтенсифікацію діяльності клітини у зв'язку з її примусовою переорієнтацією на обслуговування, відтворення та розповсюдження вірусу. Згодом починають переважати перетворення, викликані мобілізацією сил самозахисту клітини, включаючи такий крайній захід, як апоптоз.

Очищення полтавського ізоляту ВСМП. Оскільки концентрація ВСМП в соці інфікованих рослин дуже низька (Brakke, 1958, 1968, 1990; Олейник, 1968; Онищенко, 1971, 1974; Шевченко, 1971; Развязкина, 1975), а в процесі очистки віріони агрегують і фрагментуються, необхідно було вдосконалити методику очищення вірусу.

В результаті проведеих досліджень нами розроблена модифікація методики Brakke (1990), яка дає найбільш високий вихід і чистоту вірусного препарату, ніж інші апробовані методики (Новиков, 1982; Решетник та ін., 1996). Вигляд свіжоочищеного препарату показано на рисунку 11.

Одержана нами концентрація вірусу, що складала в середньому 13 мг/кг рослинної маси, дещо нижча за концентрацію вірусу звичайної мозаїки квасолі (18-30 мг/кг), що належать до роду Potyvirus, родини Potyviridae (Гнутова та ін., 2000).

Перевірка очищеного вірусного препарату показала, що співвідношення екстинцій при довжинах хвиль 260 та 280 нм (Е260/Е280) становило 1,28–1,37 (для різних зразків), що характерно для ВСМП та інших потівірусів (Бракке, 1990). Про чистоту вірусних препаратів свідчать також і отримані електронограми віріонів у вигляді гнучких ниток діаметром 12–13 нм і довжиною 71030 нм (Рис. 11, 12, 13).

Рис.13. Електронограма очищеного препарату ВСМП, виділеного із ячменю Рось. Інструментальне збільшення 40000.

Відомо (Brakke, 1990; Московец и др., 1971; Развязкина, 1971, 1975; Решетник та ін., 1996), що віріони ВСМП агрегуються в процесі очистки, що призводить до втрати вірусу. Агрегація ВСМП представлена на (Рис.12, 13). На електронограмах окремих віріонів чітко виявляється внутрішній канал, окремі субодиниці та поперечна спіраль РНК. Нитка вірусної нуклеїнової кислоти закручена у вигляді спіралі, кожний її виток покритий капсомерами, що тісно прилягають один до одного (Рис.13.b).

Отже, виділений нами полтавський ізолят, очевидно, належить до роду Tritimovirus родини Potyviridae (потівірусів), для якого характерні ниткоподібні віріони з модальною довжиною 700 нм, константою седиментації 165 S. Віріони містять одну молекулу однониткової РНК, довжиною 8500 нуклеотидів та один структурний білок (Rabenstein et al., 2002).

Дослідження структурних білків полтавського ізоляту ВСМП проводили методом диск-електрофорезу з використанням ДСН (Laemmli, 1970). На отриманих електрофореграмах ідентифіковано один мажорний білок 45000 та два мінорних: 39000 і 35000 Да (Рис. 14).

Рис. 14. Електрофореграма ВСМП в поліакриламідному гелі.

1 - маркер 67000. 45000, 25000 Да

2 – препарат ВСМП із листків рослин пшениці у фазу осіннього кущіння;

3 - препарат ВСМП із листків рослин пшениці у фазу колосіння

4 - маркер 67000, 36000, 29000, 24000, 20100, 14200 Да.

З’ясовано, що вміст мінорних білків зростає з віком рослин, а мажорних – зменшується.

В дослідженнях Brakke (1990) також виявлено один мажорний білок 45 кДа та кілька мінорних 43, 42, 33, 31 кДа , причому вміст мінорних білків зростав із віком рослини.

За молекулярною масою капсидного білка ізоляти ВСМП зі штатів Небраска, Оклахома, Індіана та Іллінойс розподілені на дві групи: 47 і 45 кДа (Brakke, 1990). Виділений нами полтавський ізолят близький до другої групи, з молекулярною масою 45 кДа.

Вплив вірусу на метаболізм та адаптаційний потенціал рослин пшениці. Дослідження впливу ВСМП на вміст фотосинтетичних пігментів показало, що у фазу колосіння в листках вірусінфікованих рослин пшениці вміст суми хлорофілів знижувався до 56%, а каротиноїдів, навпаки, зростав у середньому на 58% залежно від сорту (табл. 1). Зниження суми хлорофілів у листках картоплі і квасолі при вірусній інфекції описано також іншими дослідниками (Жукова, 2001; Таран і ін., 2001). Як для молодих рослин у модельних дослідах, так і в польових дослідах для дорослих рослин у фазу колосіння характерним є більш суттєвий вплив ВСМП на вміст хлорофілу а (зниження на 21% ; сорт Альбатрос одеський), ніж хлорофілу b (зниження на 10%). У сорту Коломак вміст хлорофілів a та b знижувався на 38% і 31%, відповідно. Сорти Коломак і Альбатрос одеський суттєво відрізнялись між собою також і за співвідношенням суми зелених пігментів до каротиноїдів.

Таблиця 1.

Вплив вірусної інфекції на вміст фотосинтетичних пігментів, азоту та білка в листках озимої пшениці (фаза колосіння)

Сорт |

Варіант |

Хлорофіли,

мг на г сирої речовини |

a/в |

Каротиноїди | Хл. а+в | N мг % | Білок на сиру речовину, %

Каротиноїди

а |

в |

а+в

Альбатрос одеський |

Здорові ВСМП |

2,68 2,18 |

1,83 1,64 |

4,5 1 3,82 |

1,46 1,32 |

0,7

1,14 |

6,4

3,4 |

3,22 2,92 |

20,1

16,3

Коломак |

Здорові ВСМП |

1,88 1,16 |

0,75 0,52 |

2,63 1,68 |

2,7 2,23 |

0,55 0,83 |

4,8

2,0 |

4,39 2,10 |

27,4

19,5

НІР0,05 |

0,16 |

0,07 |

0,23 |

- |

0,09 |

- |

0,12 |

1,2

Визначення фотохімічної активності (реакція Хілла) в ізольованих хлоропластах показало, що вона достовірно нижча у вірусінфікованих рослин, порівняно зі здоровими, як в модельних, так і в польових дослідах

(Рис.15).

В результаті дослідження різних показників вірусіндукованих змін метаболізму рослин (таких як інтенсивність дихання і дихальний коефіцієнт; коефіціент індукції флуоресценції та час напівспаду індукційної кривої, електропровідність листків та параметрів лазерної поляриметрії) встановлено можливість їх практичного використання. Зокрема, дихальний коефіцієнт може бути використаний для оцінки вірусостійкості рослин, коефіціент індукції флуоресценції – для бездеградаційної діагностики хвороб, зростання ентропії розсіяного лазерного випромінювання – для ранньої діагностики вірусної інфекції.

Беручи до уваги той факт, що хімічні елементи відіграють надзвичайно важливу роль у життєдіяльності організмів, ми досліджували вплив вірусу на вміст макро- і мікроелементів в рослинах пшениці (табл.2). Встановлено, що

за вмістом в уражених листках пшениці досліджені хімічні елементи можна розділити на три групи. До першої відносяться Na, K і Li, вміст яких в інфікованих рослинах мало відрізнявся від контролю; до другої Fe, Cu і Zn, вміст яких зменшувався в 1, 5 рази порівняно з контролем; до третьої - Mg, Mn і Ca, вміст яких знижувався в 3,5 разів, порівняно з контролем. За результатами досліджень розроблені рекомендації по застосуванню мікроелементів для підвищення урожайності та вірусостійкості рослин і якості зерна пшениці (Mishchеnko et al. 1994, 2002; Міщенко, 2004).

Ми також припустили, що засобами, які підвищують стійкість рослин до вірусних інфекцій, можуть бути біологічно активні сполуки. З цією метою було випробувано препарати з рістрегулюючою (цитокініновою) активністю, серед яких виявлено сполуки з антифітовірусними властивостями.

І – Модельні досліди. Штучне інфікування рослин ярої пшениці сорту Саратівска-29, фаза чотирьох листків;

II – Польові досліди, природний інфекційний фон (фаза весняного кущіння). Сорт озимої пшениці Альбатрос одеський

ІІI – Польові досліди, природний інфекційний фон (фаза виходу в трубку). Сорт озимої пшениці Альбатрос одеський;

ІV – Польові досліди, природний інфекційний фон (фаза колосіння). Сорт озимої пшениці Альбатрос одеський.

Деякі з них значно знижували ступінь ураження рослин ВСМП, збільшували на 25 % суху масу рослин і вміст хлорофілів у листках (Mishchеnko et al., 1994; Решетник и др., 2000; Mishchеnko et al., 2002). Результати польових досліджень показали, що некореневі обприскування рослин озимої пшениці рістрегулюючими препаратами в фазу весняного кущіння та виходу в трубку дали приріст урожаю на 3,7 - 5,9 ц/га . Приріст білка складав 0,4-2,4 %, "сирої" клейковини до 0,8-4,8%. Хлібопекарські якості борошна із зерна оброблених рослин також значно підвищувались (Міщенко, 2004). Одержані результати свідчать про те, що інтенсифікуючи фізіологічні процеси рослинного організму, можна істотно підвищити його адаптаційні та імунні властивості. Підвищення вірусостійкості рослин рістрегулюючими препаратами показана в роботах інших авторів (Шевченко та ін., 1998; Frahm et al., 1998; Рожкова и др., 1999). Наші дані розширюють уявлення щодо антистресових властивостей досліджених препаратів та демонструють можливість використання їх неспецифічної дії на захисні системи, для формування загального рівня адаптивного потенціалу та продукційних властивостей.

Таблиця 2.

Вміст мікро- і макроелементів в листках озимої пшениці сорту Донська напівкарликова.

Хімічні елементи

Варіанти

Контроль (здорові) рослини

Вірусінфіковані рослини

Жовті листки

лілово-фіолетові листки

Мікроелементи мкг/г

Zn 30,0±0,8

20,0±0,6

20,8+0,4

Li 1,0±0,02

3,0±0,02

3,5±0,03

Сu 22,5+0,6

14,0±0,4

20,8±0,6

Мп

279,2±8,2

88,3±1,8

90,0+2,6

Fe 251,7+7,4

187,5+3,7

175,0+3,4

Макроелементи мг/г

Mg 2,3±0,06

0,6+0,02

0,8±0,03

Са 3,2+0,09

1,0±0,04

1,5+0,06

К 8,1+0,2

6,7+0,3

5,9+0,2

Показано, що один із шляхів реалізації пристосувальних механізмів адаптаційного синдрому визначається трансформаціями ліпід-пігментних компонетів фотосинтетичних мембран, регулюванням інтенсивності їх пероксидного окислення антиоксидантними системами (зокрема, каротиноїдами), спрямованими на підтримання гомеостазу мембранних структур для забезпечення виконання їх функцій у змінених умовах існування (Таран, 2001, 2003).

Таким чином, дослідження показали, що ураження пшениці ВСМП призводить до зниження хлорофілів а і b у листках усіх вивчених сортів як при штучній інокуляції, так і в польових умовах на природному інфекційному фоні. Також показано, що у вірусінфікованих рослин, порівняно зі здоровими, зменшувались фотохімічна активність хлоропластів і вміст білка та азоту в листках.

Вплив кліностатування на рослини та перебіг вірусної інфекції. Створення орбітальних космічних станцій дало поштовх становленню нової галузі біологічних наук космічної біології (Kordyum, 1997, 2003; Monje