Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Матвієнко Юлія Олександрівна

УДК 616.248-085:615.37:611-018.5.001.6

Функціональний стан еозинофілів і базофілів крові хворих на бронхіальну астму та особливості його змін в умовах застосування імунокоригуючих препаратів

03.00.09 - імунологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2004

Дисертація є рукопис

Робота виконана в Інституті фтизіатрії і пульмонології

ім. Ф.Г. Яновського АМН України

Науковий керівник - член-кореспондент АМН України

доктор медичних наук, професор

К.Ф. Чернушенко

Інститут фтизіатрії і пульмонології

ім. Ф.Г. Яновського АМН України

завідувач лабораторії імунології.

Офіційні опоненти: -

доктор біологічних наук, Холодна Лідія Степанівна професор

кафедри мікробіології та загальної імунології біологічного

факультету Київського національного університету

імені Тараса Шевченка;

доктор біологічних наук, Алексеєва Ірина Миколаївна, старший

науковий співробітник, завідувач відділу імунології та цитотоксичних

сироваток Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Провідна установа - Національний медичний університет

ім. О.О. Богомольця.

Захист відбудеться „20” квітня 2004 р. о 16 00 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 в Київському національному університеті

імені Тараса Шевченка, за адресою:

03127, м. Київ, проспект академіка Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса 01033 м. Київ, вул.. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського

національного університету

імені Тараса Шевченка, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “4 ” березня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради _____________ к.б.н. Молчанець О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За останні 20 років поширеність бронхіальної астми (БА) збільшилась як серед дорослих, так і серед дітей. За статистичними даними нею хворіють 5 - 7 % населення світу. Показники захворюваності на астму і смертність від цієї недуги продовжують зростати, незважаючи на значне число робіт, присвячених механізмам розвитку цієї патології і наявності нових засобів лікування.

За сучасною концепцією бронхіальна астма - це хронічне запальне захворювання дихальних шляхів, яке характеризуються варіабільною зворотньою бронхообструкцією та гіперреактивністю бронхів – підвищеною чутливістю їх до різних подразнюючих стимулів. Основними клітинними елементами запалення виступають еозинофіли, базофіли, опасисті клітини, Т-лімфоцити і макрофаги.

Відомо, що ефекторні клітини (базофільні і еозинофільні гранулоцити) - є основою патогенезу при алергічних реакціях, а також при бронхіальній астмі (БА). Рання фаза алергічної відповіді, здійснювана первинним залученням у реакцію гладких (опасистих) клітин і базофілів, що призводить до підвищення судинної проникності, утворення і вивільнення хемотаксичних продуктів, забезпечує залучення в зону алергічної реакції інших ефекторних клітин, серед яких провідне місце займають еозинофіли. Еозинофіли виступають ключовою клітиною у виникненні ушкодження епітелію бронхів. Еозинофільні гранули служать джерелом великої кількості прозапальних токсичних продуктів, що призводить до деструкції і десквамації епітеліальних клітин бронхів. В залежності від кількості ефекторних клітин та їх співвідношень, особливостей їхніх взаємодій в присутності специфічного алергену (зв'язаного чи незв'язаного ІgЕ антитілами), запалення може бути спрямовано або на формування репаративних процесів і завершення алергічної реакції, або на перехід у її пізню фазу [А.Г. Чучалін (1997 р.), І.С. Гущін (1998 р.), К.Ф. Чернушенко (2003 р.)].

Велика кількість робіт присвячена ролі імунокомпетентних клітин при алергічних захворюваннях, зокрема при бронхіальній астмі. Однак багато питань залишаються ще не ясними. Недостатньо зведень про функціонування основних ефекторних клітин (еозинофілів і базофілів) при різних формах БА, залежності їх від стану імунної системи (Т- і В- системи лімфоцитів).

При лікуванні БА використовується велика кількість різноманітних препаратів, у тому числі тих, що мають імунокоригуючі властивості, але до останнього часу залишається неясним питання про всі можливі механізми дії цих препаратів на ефекторні клітини при БА, а також про критерії призначення цих препаратів пацієнтам з різними формами цієї недуги.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом колективних наукових досліджень у рамках: НДР А. 95.03 № держреєстрації 0195U002730 "Розробити нові діагностичні критерії і принципи лікування бронхіальної астми на основі сучасних поглядів на патогенез цього захворювання", НДР А. 95.01 № держреєстрації 0195U002723 "Вивчення клініко-патофізиологічних механізмів бронхіальної обструкції і розробка нових способів її корекції при хронічних обструктивних захворюваннях легень".

Мета і задачі дослідження. Мета роботи: вивчити особливості змін кількісного складу і функціонального стану еозинофілів і базофілів крові у хворих на бронхіальну астму в залежності від форми захворювання в умовах застосування імунокоригуючих препаратів.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися наступні задачі:

вивчення стану імунної системи (Т-, В- лімфоцитів і NK- клітин) у хворих на бронхіальну астму в залежності від форми захворювання до і після застосування імунокоригуючих препаратів;

вивчення порушення стану еозинофільних гранулоцитів периферичної крові у хворих на бронхіальну астму;

вивчення функціонального стану базофільних гранулоцитів крові в процесі варіантів терапії у хворих на бронхіальну астму;

вивчення залежності змін стану еозинофілів і базофілів від кількості і функціональної активності Т- і В- лімфоцитів, NK- клітин;

вивчення характеру взаємозалежності еозинофілів і базофілів крові в умовах застосування імунокоригуючих препаратів.

Об’єкт дослідження: еозинофільні, базофільні, нейтрофільні гранулоцити периферичної крові, Т- і В- лімфоцити, NK-клітини.

Предмет дослідження: особливості порушення стану еозинофільних та базофільних гранулоцитів периферичної крові; вплив імунокоригуючих препаратів на функціональний стан еозинофільних і базофільних гранулоцитів крові; взаємозалежність стану еозинофілів, базофілів, Т- і В- лімфоцитів, NK- клітин в умовах застосування імунокоригуючих препаратів у хворих на бронхіальну астму.

Методи дослідження. Імунологічні – визначення вмісту Т-лімфоцитів та їх субпопуляцій (CD3+, CD4+, CD8+клітин методом непрямої імунофлюоресценції з використанням антилімфоцитарних моноклональних антитіл), В-лімфоцитів (CD22+), NK-клітин (CD16+) Оцінка функціонального стану нейтрофілів здійснювалася за їх поглинальною здатністю (процентом фагоцитозу – ПФ), та рівнем кисень залежного метаболізму в тесті з нітросинім тетразолієм (НСТ-тест), еозинофілів – за здатністю до спонтанного розеткоутворення з баранячими еритроцитами (Е-РУК Еф), їх фагоцитарною активністю (визначення ПФ та НСТ-тест), базофілів – в тестах спонтанної та активованої алергенами дегрануляції Бф). Спектрофотометричні методи використовувалися для визначення вмісту імуноглобулінів (ІgА, ІgМ, ІgG) та циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) у сироватці крові. Математичні - обчислення індексу ефективності терапії (ІЕТ). Достовірність отриманих результатів досліджувалась статистичними методами за допомогою пакету прикладних програм Microsoft Excel.

Наукова новизна отриманих результатів. На підставі комплексного дослідження хворих на БА, вперше були отримані дані про зміни функціонального стану еозинофілів (підвищення вмісту їх в крові, зміни в субпопуляційному складі, зниження поглинальної активності і активація кисеньзалежного метаболізму) та базофілів (активація спонтанної та активованої алергенами дегрануляції) в залежності від форми захворювання.

Вперше визначено, що показники стану еозинофілів і базофілів знаходяться в прямій кореляційній залежності між собою, також визначаються характерні зміни кореляційних зв’язків між показниками функціонального стану цих клітин та Т-, В- лімфоцитів і нейтрофільних гранулоцитів крові.

Вперше встановлені особливості впливу імуномодулюючих препаратів (Інтал, Тайлед, Інгакорт, Ербісол, В7 АТМА) на функціональний стан еозинофільних і базофільних гранулоцитів, та визначена імунологічна ефективність їх застосування при АБА і НБА.

Практичне значення досліджень. Розроблено новий спосіб оцінки функціонального стану базофільних гранулоцитів крові у хворих на бронхіальну астму, використання якого дозволяє удосконалити сучасні методи діагностики різних форм БА. Розроблені нові критерії оцінки ефективності імуномодулюючих препаратів у хворих на БА, які можуть бути використані в медичної практиці.

Впровадження в практику. За результатами проведених досліджень отримано патент на винахід МПК - 7 А 61 В 10/00 G 01 N 33/53, № 55201 А. Результати досліджень впроваджені в практику роботи у відділеннях бронхіальної астми і диференціальної діагностики Інституту фтизіатрії і пульмонології АМН України.

Особистий внесок. Самостійно проведені всі імунологічні дослідження у хворих на бронхіальну астму, у яких визначали особливості змін стану базофілів і еозинофілів крові в умовах застосування імунокоригуючих препаратів. Проведено математичний і статистичний аналіз отриманих результатів. Розроблені критерії оцінки ефективності застосування імуномодулюючих препаратів у хворих на БА. Аналіз і інтерпретація матеріалу належать автору.

Апробація результатів дисертації. Основні положення досліджень викладені в матеріалах І, ІІ і ІІІ з'їздів фтизіатрів і пульмонологів України (Київ 1993, 1998, 2003), V Російського національного конгресу „Человек и лекарство” (Москва, 1998), в доповіді на науково-практичній конференції Інституту фтизіатрії і пульмонології АМН України (2003).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 11 робіт, в тому числі 2 статті у виданнях, рекомендованих ВАК України, 1 патент на винахід, 1 раціоналізаторська пропозиція, 7 тез конференцій і з’їздів.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 184 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 40 таблицями, 13 малюнками. Робота має традиційну структуру і складається з вступу, літературного огляду, викладення матеріалів і методів дослідження, чотирьох розділів самостійних досліджень, підсумку, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел, що складається з 98 вітчизняних джерел і джерел країн близького зарубіжжя та 133 - далекого зарубіжжя і додатку.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Проведено обстеження 177 хворих на бронхіальну астму (БА) віком 18-60 років. В тому числі 99 (57 %) пацієнтів з атопічною формою захворювання та 78 (43 %) осіб з неатопічною формою БА. З обстежуваних пацієнтів 70 (42 %) - складали чоловіки і 98 (58 %) - жінки. Діагноз встановлювався на підставі аналізу даних анамнезу, клінічної симптоматики і результатів шкірного тестування з алергенами (домашнього пилу, бібліотечного пилу, рослинного пилку). Базисна комплексна терапія включала традиційне лікування з застосуванням бронхолітиків (беротек, беродуал, теофедрин), антигістамінних препаратів (діазолін, кларитин, задітен), і муколітиків (мукалтин, лазольван, бромгексин).

Основну групу хворих, які крім базисної терапії одержували досліджувані препарати, складали 125 пацієнтів, в т.ч. з АБА - 72 особи і з НБА - 53. Групу порівняння складали 52 пацієнти, з яких 27 хворих було з АБА і 25 - із НБА. В контрольну групу було включено 30 практично здорових осіб - донорів крові.

Розподіл пацієнтів на групи представлений в (табл. 1). Хворим першої групи (20 пацієнтам), призначався препарат Інтал інгаляційно в терапевтичній дозі по 20 мг на добу протягом 14 днів. Пацієнтам другої групи (21 хворому) лікування проводилося препаратом Інгакорт (флунизолід) фірми "Берінгер Інгельхейм" у дозі 1000 мг на добу протягом 14 днів. В третю групу включено 31 пацієнти - вони отримували препарат Ербісол по 2 мг на добу протягом 10 днів, внутрішньом’язово. Хворим четвертої групи (31 особі) призначався препарат Тайлед (недокроміл натрію) фірми "Фізонс" інгаляційно в терапевтичній дозі 8 мг на добу, протягом трьох місяців. П'ята група була групою порівняння, (36 осіб), які одержували лише базисну терапію протягом двох тижнів. 22 пацієнта шостої групи одержували препарат В7 АТМА виробництва

Таблиця 1

Розподіл хворих за формою БА і статтю

в залежності від препаратів, які використовували

№ п/п | Групи хворих, які отримували: | БА | стать | усього

АБА | НБА | ж | ч

1. | Інтал | 12 | 8 | 11 | 9 | 20

2. | Інгакорт | 13 | 8 | 16 | 5 | 21

3. | Ербісол | 13 | 18 | 17 | 14 | 31

4. | Тайлед | 20 | 11 | 17 | 14 | 31

5. | Базисна терапія | 18 | 18 | 22 | 14 | 36

6. | В7 АТМА | 14 | 8 | 13 | 10 | 22

7. | Плацебо | 9 | 7 | 6 | 9 | 16

Всього | 99 | 78 | 102 | 75 | 177

% | 57% | 43% | 58% | 42% | 100%

Здорові особи | - | - | 15 | 15 | 30

"Ріхард Біттнер", по 10-20 крапель 3 рази на добу, протягом 3-х місяців. Сьому групу склали 16 чоловік, які крім базисної терапії одержували плацебо по 10-20 крапель 3 рази на добу протягом 3-х місяців. Контрольну групу склали 30 практично здорових осіб - донорів крові.

Імунологічне обстеження включало визначення стану Т-лімфоцитів, В-лімфоцитів, NK-клітин, функціонального стану нейтрофільних (НГ), еозинофільних (Еф), базофільних (Бф), гранулоцитів крові.

Стан Т- лімфоцитів вивчався визначенням загальної кількості і їх субпопуляційного складу за допомогою поверхневих антигенних мембранних маркерів CD3, CD4, CD8 методом непрямої імунофлюоресценції з використанням антилімфоцитарних моноклональних антитіл виробництва НПЦ "МедБиоСпектр" (Москва).

Стан В-системи лімфоцитів характеризували за їх вмістом (CD22+ Лф), рівнями сироваточних імуноглобулінів (ІgА, ІgМ, ІgG) та циркулюючих імунних комплексів. Вміст ІgА, ІgМ, ІgG визначали спектрофотометричо за інтенсивністю преципітації в поліетіленгліклі (ПЕГ) комплексів антиген-антитіло (модифікація Когосової Л.С., Матвієнко Ю.А, 1994 рік). В реакціях використовувалися моноспецифічні сироватки, виготовлені в Московському НДІ епідеміології і мікробіології ім. Н.Ф. Гамалеї. Рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) в сироватці крові оцінювали методом преципітації в поліетиленгліколі (ПЕГ) за методом Haskova V., et al. у модифікації Круглової І.Ф. та співавт.

Кількість NK-клітин визначали за допомогою МКАТ до поверхневого антигенного маркеру CD16.

Функціональний стан нейтрофільних гранулоцитів крові характеризували за їх здатністю поглинати частки латексу з розрахунком проценту фагоцитозу (ПФ) – відсотком фагоцитуючих клітин і та фагоцитарного числа (ФЧ) – середньою їх активністю (Потапова О.Г., Хрустіков В.С., (1974 р.), у модифікації Глейзера В.М. (1993 р.)) та інтенсивністю їх кисеньзалежного метаболізму в НСТ-тесті за методом Віксман М.Е., Маянського А.Н у модифікації Глейзера В.М. (1993 р.).

Визначення кількості Еф у крові підраховували стандартним методом на сто лейкоцитів, з попереднім фарбуванням препаратів реактивом Пероришвілі.

Субпопуляційний склад Еф визначали у такий спосіб: клітини виділяли за методом Parіllo L.E. Відмиті еозинофіли використовували для постановки реакції розеткоутворення за методом Мазіної Н.М.(1988 р.) Препарати висушували на повітрі, фіксували метанолом і фарбували реактивом Пероришвілі. Відсоток розеткоутворюючих клітин підраховували за допомогою світлової мікроскопії (в 200 клітинах).

Функціональні властивості еозинофілів характеризували за їх поглинальною здатністю Еф (Потапова О.Г., (1974 р.) в модифікації Глейзера В.М., (1993 р.) та за інтенсивністю кисеньзалежного метаболізму цих клітин в НСТ-тесті (методика Віксман М.Е., Маянського А.Н в модифікації Глейзера В.М).

Функціональний стан базофільних гранулоцитів оцінювали в реакції прямої дегрануляції за методом Stachl S.P., Norn S., у власній модифікації, суть якої полягала в мікроскопіюванні прямої спонтанної та активованої алергенами дегрануляції Бф крові хворих на БА.

Для з’ясування імунологічної ефективності препаратів визначали індекс дії кожного з досліджуваних препаратів і порівнювали ці показники з однойменними показниками контрольних груп та між собою. Індекс дії препаратів обчислювали за формулою: (Д-П)/Д)·100%, де Д - це значення показника до лікування; П - його значення після лікування.

Статистична обробка матеріалу проводилась на персональному комп'ютері ІBM Atlon з використанням пакету прикладних програм варіаційної статистики з використанням критерію Ст’юдента в Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Стан імунної системи у хворих на бронхіальну астму в залежності від форми захворювання в умовах застосування імунокоригуючих препаратів.

У ході проведених досліджень нами встановлено (Рис. 1), що на момент первинного імунологічного обстеження у всіх пацієнтів мали місце чітко виражені порушення імунного стану, однотипні в основних і контрольних групах. Виявлені зміни імунологічних показників характеризувалися статистично достовірним зниженням вмісту Т-лимфоцитів (CD3+), переважно за рахунок їх супресорної популяції (CD8+), що призводило до підвищення імунорегуляторного індексу CD4/CD8. Збільшенню кількості В-лімфоцитів відповідало зростання продукції ІgМ, а також достовірно вищий рівень ЦІК. Одночасно мало місце зменшення кількості NK-клітин. Порушення функціональної активності нейтрофільних гранулоцитів крові знайшло відображення в достовірному зменшенні відсотку фагоцитуючих клітин на фоні підвищення їх середньої поглинальної здатності та активації кисеньзалежного метаболізму. Виявлені зміни імунологічних показників при АБА і при НБА були схожими. Отримані нами дані збігаються з результатами досліджень порушень імунного стану при БА інших авторів: Бережної Н.М. (1997 р.), Чучаліна А.Г. (1997 р.), Холгейта С.Т. (1997 р.), Чернушенко К.Ф. (2003 р.), та ін.

Повторне обстеження хворих на БА показало чітко виражений позитивний вплив лікування на стан імунної системи, який проявився в нормалізації загальної кількості Т-клітин і їх субпопуляцій. Рівень CD16+ Лф також нормалізувався. Спостерігалося зниження експресії лімфоцитами CD22 рецепторів і зниження продукції ІgМ до нормальних рівнів.

Рис.1 Показники системи імунітету у хворих на атопічну і неатопічна бронхіальну астму.

Також чітко простежувалося зниження рівня ЦІК. У хворих спостерігали позитивні зміни показників кисеньзалежного метаболізму і достовірне підвищення поглинальної здатності нейтрофільних гранулоцитів.

Дослідження дії препаратів показали, що найбільший стимулюючим ефект у відношенні Т-системи імунітету при АБА мав препарат Тайлед, а при НБА - препарат Ербісол. Гуморальну ланку імунітету, як при АБА, так і при НБА у більшому ступені відновлював препарат Ербісол, а функціональні властивості нейтрофільних гранулоцитів при НБА – Тайлед, а при АБА - Ербісол.

Особливості кількісного і функціонального стану еозинофілів периферичної крові у хворих з різними формами бронхіальної астми в умовах застосування імунокоригуючих препаратів.

Наступною задачею було з'ясування функціональної активності еозинофілів крові і їх субпопуляційного складу у хворих на атопічну і неатопічну форми БА в процесі терапії з застосуванням Інтала, Інгакорта, Ербісола, Тайледа і гомеопатичних крапель В7 АТМА.

До початку лікування у хворих на БА відзначався високий вміст еозинофілів у периферичній крові (10,3 ± 0,9), в т.ч. при з АБА - (11,7 ± 1,0) % і при НБА - (9,8 ± 1,3) %, при нормі (0,7 ± 0,2) %. Спостерігалися також зміни субпопуляційного складу цих клітин, що проявлялося зниженням числа спонтанних розеткоутворюючих Еф, їх активної фракції, зменшенням відсотку теофілінрезистентних і теофілінчутливих розеткоутворюючих Еф і різким підвищенням числа термостабільних розеток (p < 0,05), що є характерним для активного запального процесу при БА (Рис. 2).

Рис. 2 Показники функціонального стану еозинофільних гранулоцитів крові у хворих на бронхіальну астму.

Слід зазначити, що в пацієнтів із НБА перераховані вище зміни мали більш виразний характер, ніж у хворих на АБА. Показники, які характеризують функціональну активність еозинофілів, достовірно відрізнялися від норми. Так, поглинальна здатність еозинофілів, була зниженою: при АБА до (38,1 ± 2,1) % і при НБА до (34,6 ± 1,3) %, тоді як у здорових цей показник сягав (50,5 ± 0,7) %, (р < 0,05). а НСТ-тест – підвищеним – відповідно, до (73,5 ± 1,8) % у пацієнтів з АБА і (79,3 ± 1,8) % у хворих на НБА, при нормі - (53,9 ± 0,8) %, (p < 0,05). Виявлені зміни цих показників свідчать про пригнічення поглинальної здатності клітин і активізацію їх метаболізму. В літературі є відомості про функціональні властивості Еф і їх субпопуляційний склад при різних патологічних станах, але даних, які стосуються БА ми не знайшли.

Таким чином, виявлені порушення стану еозинофільних гранулоцитів у хворих на БА характеризуються підвищенням їх вмісту в периферичній крові, зниженням поглинальної активності з одночасним посиленням кисеньзалежного метаболізму цих клітин, а також зміною їх здатності до розеткоутворення (зменшення відсотку спонтанних та активних і підвищення числа термостабільних Е-РУКЕ).

Після закінчення лікування ми з’ясували, що дія препарату Інтал полягала у зниженні числа еозинофілів в периферичній крові, нормалізації фагоцитарної активності Еф, інтенсивності їх кисеньзалежного метаболізму (головним чином при АБА). Позитивний вплив Інгакорту на функціональний стан Еф проявлявся зниженням числа Еф, достовірним підвищенням ПФ до (53,4 ± 1,5) % і НСТ-тесту до (55,8 ± 2,6) %. Достовірних розходжень між рівнями показників при різних формах захворювання ними виявлено не було. Препарат Ербісол нормалізував як кількісні показники Еф (число і їх субпопуляційний склад), так і показники функціональної активності цих клітин - ПФ, ФЧ та НСТ-тест. Наприкінці лікування препаратом Тайлед відносна кількість Еф Е-РУК і їх субпопуляційний склад, а також фагоцитарна та метаболічна активність Еф хворих на БА нормалізувалися. Після 3-х місячного курсу комплексного лікування з застосуванням крапель В7 АТМА, поглинальна здатність і метаболічна активність Еф цілком відновлювалися як у хворих на АБА, так і при НБА. Знизилася кількість Еф у периферичній крові, нормалізувалися вміст Е-РУКЕ та їх субпопуляційний склад. Препарат більшою мірою сприяв відновленню здатності до спонтанного розеткоутворення Еф. Слід зазначити, що при НБА вплив цього препарату на субпопуляційний склад Еф мав більш виразний характер ніж при АБА.

Результати проведених досліджень дають підставу зробити висновок про те, що комплексне лікування з застосуванням препаратів, які вивчалися, мало виразний модулюючий вплив на еозинофіли. В результаті лікування нормалізувалися їх поглинальна здатність і кисеньзалежний метаболізм, загальний вміст і субпопуляційний склад цих клітин.

Таким чином, застосування різних імуномодулюючих препаратів у комплексній терапії БА сприяє відновленню кількісних і функціональних характеристик еозинофільних гранулоцитів.

Стан базофільних гранулоцитів крові та особливості змін реакції прямої їх дегрануляції в умовах застосування імунокоригуючих препаратів при бронхіальній астмі.

Однією з основних задач роботи було вивчення стану базофільних гранулоцитів крові у хворих на різні форми БА. З одного боку, ми досліджували спонтанну (СП) дегрануляцію базофілів, яка характеризує функціональну активність цих ефекторних клітин. З іншого боку, були проведені навантажувальні тести алергенами для визначення резервної активності Бф і чутливості пацієнтів до даних алергенів (Рис. 2). Для цих тестів нами використовувалися алергени Вінницького виробництва: алерген із суміші пилкових рослинних компонентів (Рмікст), алерген домашнього пилу (Дп), алерген бібліотечного пилу (Бп), у стандартній концентрації 1000 од.

Дослідження проведені у 156 хворих на БА, в тому числі у 86 осіб з АБА та 60 - з НБА.

На момент обстеження у хворих на БА спостерігався підвищений ступінь спонтанної ДГБ (35,6 ± 2,1) % , тоді як у здорових осіб цей показник склав (25,2 ± 1,4) %. Слід зазначити, що при АБА рівень спонтанної ДГБ був майже таким, що при НБА - (33,9 ± 2,3) % і (37,0 ± 1,8) % відповідно.

Ймовірно, при загостренні зростає частота рецепторних взаємодій, що веде до спонтанного викиду медіаторів та до нестабільності клітинної мембрани Бф. Це у свою чергу викликає реакцію цих клітин на подразник, зокрема на побутові та пилкові алергени. Через незначну різницю між показниками прямої дегрануляції базофілів у загальній групі пацієнтів на АБА і НБА, було проведено шкірне тестування у 25 пацієнтів БА. Відсоток збігів позитивних шкірних проб і позитивного ступеня дегрануляції базофілів був досить високий. Так для міксту пилка рослин відсоток збігів дорівнює (78) %, а для алергенів домашнього пилу і бібліотечного пилу - (100) % (Рис. 3).

Також був проведений аналіз зміни зазначених показників за чутливістю до специфічних алергенів хворих з атопічною формою БА до і після лікування зазначеними вище препаратами.

При обстеженні було встановлено, що ступінь ДГБ на рослинний мікст, домашній і бібліотечний пил була достовірно вищою, ніж у здорових осіб, що свідчило про високий ступінь сенсибілізації даного контингенту до цих алергенів. Після проведеної терапії інтенсивність ДГБ

Рис. 3 Порівняльна оцінка прямої дегрануляції базофілів крові та шкірних проб у хворих на бронхіальну астму (n=25).

на специфічні алергени достовірно знизилась. Так після лікування препаратом Тайлед ДГБ Рмікст знизилась з (47,75 ± 4,56) % до (19,00 ± 3,62) %, Інталом - з (35,80 ± 2,80) % до (22,40 ± 2,50) %, Ербісолом - з (40,50 ± 1,93) % до (23,17 ± 3,27) %, В7 АТМА - з (43,27 ± 1,87) % до (20,82 ± 1,99) % (р < 0,05). Аналогічно змінювалася інтенсивність ДГБ на домашній і бібліотечний пил. При наявності до лікування чітко вираженої сенсибілізації хворих АБА до причинних алергенів, після лікування під впливом досліджуваних препаратів спостерігалося виразне зниження інтенсивності ДГБ на дані алергени (табл. 2).

Таблиця 2

Зміна ступеня дегрануляції базофілів у хворих на атопічну бронхіальну астму

під впливом препаратів, які досліджувались

Показники ДГБ | n | до лікування | після лікування

Інтал

Рослинний мікст | 5 | 35,8 ± 2,8 | 22,4 ± 2,50 *

Домашній пил | 4 | 40,3 ± 2,6 | 26,5 ± 3,40 *

Бібліотечний пил | 4 | 41,3 ± 3,6 | 21,0 ± 4,40 *

Тайлед

Рослинний мікст | 4 | 47,75 ± 4,56 | 19,00 ± 3,62 *

Домашній пил | 8 | 48,25 ± 1,81 | 24,63 ± 1,48 *

Бібліотечний пил | 5 | 45,80 ± 3,99 | 21,60 ± 3,80 *

Ербісол

Рослинний мікст | 12 | 40,50 ± 1,93 | 23,17 ± 3,27 *

Домашній пил | 16 | 45,75 ± 2,33 | 23,94 ±2,40 *

Бібліотечний пил | 16 | 43,44 ± 2,14 | 22,94 ± 2,04 *

В7 АТМА

Рослинний мікст | 11 | 43,27 ± 1,87 | 20,82 ± 1,99 *

Домашній пил | 15 | 46,60 ± 2,13 | 23,80 ± 1,69 *

Бібліотечний пил | 16 | 47,00 ± 1,97 | 24,38 ± 1,71 *

Примітка. * - вірогідність різниці показника відносно даних до лікування (р < 0,05).

Таким чином, у хворих на БА мають місце зміни функціонального стану базофільних гранулоцитів крові, які виявляються підвищенням їх спонтанної дегрануляції і посиленою реакцією цих клітин на алергенні подразники (побутові і пилкові алергени). Існує пряма залежність між ступенем активованої дегрануляції базофілів при АБА та шкірними пробами з тими ж алергенами. Визначення ступеня специфічної дегрануляції базофілів можна вважати додатковим критерієм діагностики атопічної бронхіальної астми і критерієм чутливості пацієнтів до алергенів.

Щоб визначити ефективність застосування препаратів в порівнянні з базисною терапією (чи плацебо), ми визначали індекс ефективності терапії кожного з досліджуваних препаратів і порівнювали ці показники між собою і з однойменними показниками пацієнтів контрольних груп.

Індекс дії препаратів обчислювали за формулою: (Д-П)/Д)·100%, де Д - це значення показника до лікування; П - його значення після лікування (Рис. 4).

Імунологічну ефективність призначення препаратів хворим на БА оцінювали в залежності від форми захворювання. Найефективнішим виявився препарат Тайлед, а порівнюючи ІД гомеопатичних крапель В7 АТМА з плацебо, слід зазначити, що ефективність терапії з застосуванням досліджуваного препарату була набагато вищою. Так само нами була оцінена ефективність терапії препаратами в залежності від форми БА. Було показано, що при АБА найбільша ефективність мала місце при прийомі Тайледу. За ним був Ербісол, наступним – Інтал. . Що ж стосується препарату В7 АТМА, то ІД його при НБА був вищім і склав: для ДГБ СП –

Рис. 4 Індекси дії досліджуваних препаратів на дегрануляцію базофілів у хворих на бронхіальну астму.

(37,0 ± 7,4) %; ДГБ Рмікст - (42,0 ± 5,1) %; ДГБ Дп - (42,6 ± 4,3) %; ДГБ Бп - (43,6 ± 4,6) %, (р < 0,05), в порівнянні з плацебо: ДГБ СП - (21,9 ± 8,0) %; ДГБ Рмікст - (27,8 ± 7,5) %; ДГБ Дп - (22,9 ± 9,3) %; ДГБ Бп - (23,8 ± 9,5) %.

Порівняльна оцінка ефективності застосування запропонованих препаратів показала, що при АБА вона вище у Тайледа, ніж Ербісола та Інтала, а всі вони ефективніші за базисну терапію. При НБА імунологічна ефективність Тайледа достовірно вища лише в порівнянні з базисною терапією. Ефективність препаратів Ербісол і Інтал достовірно вища в порівнянні з базисною терапією незалежно від форми захворювання.

Підводячи підсумок проведеним дослідженням, можна зробити висновок, що препарати Тайлед і Інтал, Ербісол і В7 АТМА позитивно впливають на стан базофільних гранулоцитів крові. Вищевказані препарати достовірно знижують ступінь ДГБ у пацієнтів як з АБА так і з НБА на відміну від базисної терапії. Найбільш ефективним стосовно функціонального стану базофілів периферичної крові виявився препарат Тайлед, а включення препарату "В7 АТМА" у традиційне лікування хворих БА достовірно підвищує імунологічну ефективність проведеної терапії у відношенні базофілів периферичної крові.

Кореляційні взаємовідношення клітин імунної системи (еозинофілів, базофілів і Т-, В- лімфоцитів) та їх зміни під впливом імунокоригуючих препаратів.

Складна і багатокомпонентна імунна система функціонує при погодженій роботі її окремих компонентів, що виявляється у наявності між імунологічними параметрами чисельних взаємозв'язків. В процесі захворювання відбувається зміна балансу імунної системи, що супроводжується змінами числа взаємозв'язків між різними її компонентами, їх характеру та сили.

Для визначення взаємозалежності між станом базофільних та еозинофільних гранулоцитів крові у хворих на БА та кількістю і функціональною активністю Т- і В- лімфоцитів, а також впливу на ці показники різних варіантів терапії кореляційний аналіз був проведений у 77 пацієнтів. За варіантом терапії вони були розподілені на 3 групи: 21 пацієнту першої групи призначався препарат Тайлед, 21 хворий другої групи одержував препарат Ербісол, в контрольну групу включено 20 осіб - хворих на БА, яким призначалася лише базисна терапія. Для контролю проведено також кореляційний аналіз показників 15 практично здорових осіб.

Аналіз кореляційних зв'язків між показниками функціональної активності еозинофілів і показниками Т- і В- лімфоцитів показав, що до лікування у хворих І-ої, ІІ-ої і контрольної груп спостерігалися однотипні кореляційні зв'язки, між показниками функціонального стану еозинофілів та Т- і В- систем лімфоцитів. Необхідно відзначити, що різниця виявлених кореляційних зв'язків між групами не була достовірною, але мали місце достовірні відмінності з аналогічними зв’язками у здорових людей.

Проведена терапія призводила до суттєвих змін кореляційної взаємозалежності досліджених показників, які залежали від варіанту лікування. Так, терапія із застосуванням препаратів Тайлед і Ербісол відновлювала близько 41 % вищезгаданих зв'язків, а препарати базисної терапії лише 29 %. Проте треба підкреслити, що жоден із запропонованих методів лікування БА повністю (100 %) порушених зв'язків між клітинами не відновлював (табл. 3).

Таблиця 3

Показники нормалізації кореляційної залежності між еозинофільними та базофильными гранулоцитами крові та Т- і В- лімфоцитами у хворих на бронхіальну астму після застосування препаратів

Препарати | Тайлед | Ербісол | Базисна терапія

відсоток нормалізації показників відносно | Еф | 41,2 ± 4,3 %* | 41,1 ± 4,3 %* | 29,0 ± 4,0 %

Бф | 50,4 ± 4,4 %* | 50,2 ± 4,4 %* | 17,3± 3,3 %

Примітка. * - достовірно стосовно базисної терапії (p < 0,05).

Аналіз кореляційних зв'язків між показниками стану Т- і В- лімфоцитів і базофілів показав, що до лікування у хворих на АБА та НБА спостерігалися однотипні кореляційні зв'язки (табл. 3). Ці зв'язки були прямими для показників CD3 і CD8 лімфоцитів і зворотними для - CD16 і імунорегуляторного коефіцієнта CD4/CD8, але завжди достовірними. Чіткої кореляційної залежності між показниками функціональної активності базофілів і гуморальної ланки імунітету не виявлено.

Після проведеної терапії ця кореляційна залежність значно змінювалась. Терапія до складу якої входили препарати Тайлед і Ербісол нормалізувала близько 50% вищезгаданих зв'язків, а препарати традиційної терапії лише 17 %. Але при жодному із цих варіантів лікування БА 100% відновлення порушених зв'язків між клітинами не відбувалося.

При аналізі кореляційних зв'язків між показниками функціональної активності еозинофілів і базофілів крові здорових осіб і хворих на БА, було визначено, що у останніх їх розподіл суттєво відрізнявся від такого у здорових осіб. Це дозволило нам висловити припущення про порушення цих зв'язків при БА. Аналіз даних після проведення відповідної терапії, дав підстави зробити висновок про те, що запропоновані препарати частіше, ніж традиційна терапія відновлюють зв'язки між еозинофілами усередині популяції.

Зміни кореляційних зв'язків між спонтанно дегранулюючими та активованими алергенами базофілами у здорових людей носили зворотно пропорційний характер. У хворих на БА до лікування характер кореляційних зв'язків був виражений у достовірній прямій кореляційній залежності середнього ступеня. Після закінчення варіантів лікування характер кореляційних зв'язків не змінювався і продовжував залишатися достовірно високим, але ступінь цих залежностей помітно знизився. Найбільш ефективним у відношенні нормалізації взаємозв'язків був препарат Ербісол; а гомеопатичні краплі В7 АТМА сприяли зниженню ступеня кореляційних залежностей між цими клітинами, однак жоден з вищевказаних препаратів цілком дані зв'язки не нормалізував.

Підводячи підсумок проведеним дослідженням, можна зробити такий висновок: показники функціонального стану еозинофілів і базофілів знаходяться в достовірному кореляційному зв'язку. Виявляється залежність між спонтанною та активованою побутовими алергенами дегрануляцією базофілів і розеткоутворюючою здатністю еозинофілів, їхньою поглинальною активністю, показниками спонтанної дегрануляції базофілів і кисеньзалежного метаболізму Еф. Включення препаратів Тайлед і Ербісол у комплексне лікування хворих БА частіше ніж традиційна терапія нормалізує взаємозалежні зв'язки між ефекторними клітками (Еф і Бф), препарат В7 АТМА сприяє більш повній нормалізації практично всіх міжклітинних взаємин, відзначається зниження ступеня кореляції між активованими і неактивованими базофілами, але вищевказані препарати не нормалізують зв'язків цілком.

Отримані нами дані не тільки підтверджують літературні відомості про значення міжклітинних взаємовідносин між ефекторними клітинами першого і другого порядку (базофілами і еозинофілами) при БА, але й дозволяють виявити вплив на ці взаємозв'язки різних варіантів проведеної терапії, що також може бути використано для оцінки їх імунологічної ефективності.

Таким чином вивчення у хворих на БА функціональних властивостей ефекторних клітин першого і другого порядку, зокрема базофілів та еозинофілів крові, їхніх взаємодій між собою та іншими імунокомпетентними клітинами, дозволяє не тільки розширити уявлення про перебіг запального процесу при БА, але й планувати адекватний комплекс методів лабораторної діагностики БА різного генезу, прогнозувати імунологічну ефективність лікування даного захворювання та обирати найбільш раціональні варіанти лікування пацієнтів в залежності від форми захворювання, рівня і характеру змін імунологічних показників.

ВИСНОВКИ

В дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукового завдання, що виявляється у вивченні особливостей кількісних і функціональних змін основних ефекторних клітин при БА - базофілів і еозинофілів крові в умовах застосування імуномодуляторів різної природи. У ході роботи були зроблені наступні висновки:

У хворих на БА відзначаються зміни імунної системи, аналогічні для пацієнтів з АБА і НБА, які проявляються зниженням вмісту Т-лімфоцитів, порушенням їх субпопуляційного складу за рахунок пригнічення Т-супресорів, зміною гуморальної ланки імунітету з наявністю дисімуноглобулінемії та підвищенням рівня ЦІК, зниженням поглинальної здатності та підвищенням метаболічної активності нейтрофільних гранулоцитів, зменшенням числа NK-клітин.

Порушення стану еозинофільних гранулоцитів у хворих на БА характеризуються підвищенням їх вмісту в периферичній крові, зниженням поглинальної здатності і посиленням кисеньзалежного метаболізму, зміною розеткоутворюючої здатності основних клітинних субпопуляцій (зниження спонтанних і активних розеткоутворюючих еозинофілів і підвищення числа термостабільних). Порушення функціональних властивостей еозинофілів у хворих НБА було достовірно більш виразне ніж у пацієнтів з АБА .

Застосування імуномодулюючих препаратів у комплексній терапії БА впливає на інтенсивність змін стану еозинофілів, що виявляється нормалізацією кількісних і функціональних характеристик Еф: під дією препаратів Тайлед і Інтал у хворих на АБА, Ербісол - у хворих на НБА. Препарат Інгакорт нормалізує кількісну і функціональну активність еозинофільних гранулоцитів крові однаково у хворих на АБА і НБА. При застосуванні крапель "В7 АТМА" спостерігається тенденція до нормалізації функціонального стану еозинофілів.

У хворих на БА всіх досліджених груп до лікування виявляється чітка кореляційна залежність між станом еозинофілів та Т- і В- лімфоцитів, що відрізняється від такої у здорових осіб. Після застосування Тайледа і Ербісола відновлюються 41 % кореляційних зв'язків.

У хворих на БА мають місце зміни функціонального стану базофільних гранулоцитів крові, які проявляються підвищенням спонтанної дегрануляції базофілів і посиленням реакції цих клітин на алергенні подразники (побутові і пилкові алергени). Існує пряма залежність між ступенем активованої дегрануляції базофілів при АБА та шкірними пробами з тими ж алергенами.

Застосування препаратів Тайлед, Інтал і Ербісол у хворих БА достовірно поліпшує показники ступеня дегрануляції базофілів, нормалізує стан мембран базофілів, як при АБА, так і при НБА; застосування крапель "В7-АТМА" сприяє нормалізації стану базофілів.

У хворих на БА виявляється порушення кореляційних зв'язків між показниками функціонального стану базофілів і Т- клітин, зокрема їх субпопуляцій. Застосування препаратів Тайлед і Ербісол відновлює 50 % порушених зв'язків.

Показники функціонального стану еозинофілів і базофілів знаходяться в достовірному кореляційному зв'язку: виявляється залежність спонтанної та активованої побутовими алергенами дегрануляції базофілів і розеткоутворюючою здатністю еозинофілів; їхньою поглинальною здатністю та показниками спонтанної дегрануляции базофілів і кисеньзалежного метаболізму Еф. Приєднання препаратів Тайлед і Ербісол до комплексного лікування хворих на БА частіше ніж традиційна терапія нормалізує взаємозалежні зв'язки між еозинофілами і базофілами, препарат "В7 АТМА" сприяє більш повній нормалізації практично всіх міжклітинних взаємин. Відзначається зниження ступеня кореляції між активованими та неактивованими базофілами, але