НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ.Р.Є.КАВЕЦЬКОГО

НОВАК ОЛЕНА ЄВГЕНІВНА

УДК: 616-006:618.11:575.1:576.385.5

СПАДКОВИЙ ФАКТОР І БІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ПУХЛИННОГО РОСТУ У ХВОРИХ НА РАК ЯЄЧНИКА

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України і Київській міській онкологічній лікарні.

Науковий керівник – член-кореспондент НАН України,

доктор медичних наук, професор

Чехун Василь Федорович,

Інститут експериментальної патології, онкології і

радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України, м.Київ,

директор Інституту, завідувач відділу механізмів

протипухлинної терапії.

Офіційні опоненти: - доктор медичних наук, професор

Воробйова Люся Іванівна,

Інститут онкології АМН України, м.Київ,

керівник відділу онкогінекології;

- доктор медичних наук, професор

Коханевич Євгенія Вікторовна,

Київська медична академія післядипломної освіти

ім. П.Л.Шупика МОЗ України, м.Київ,

завідувач кафедри акушерства, гінекології і

репродуктології.

Провідна установа: Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького МОЗ України, кафедра онкології і медичної радіології, м.Львів.

Захист відбудеться 5 травня 2004 року о 13.30 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України

(03022,м.Київ, вул Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий 2 квітня 2004 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук Н.В.Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Серед злоякісних пухлин жіночої статевої системи рак яєчника (РЯ) є однією із найбільш складних проблем. Це обумовлено остаточно нез’ясованими його етіологією і патогенезом, відсутністю патогномонічних симптомів, запізнілою діагностикою, агресивним клінічним перебігом хвороби (А.Ф.Урманчеева, И.Е.Мешкова,2000; R.Maruyama, et al.,2000; Л.И.Воробьева,2001; J.Bar, 2001; Stiller 2002).

Завдяки застосуванню препаратів платини і перегляду схем лікування (Я.В.Шпарик, 1998; В.А.Горбунова и др., 2002; P.Vasey, 2002) спостерігаються певні успіхи у лікуванні хворих на РЯ за рахунок збільшення тривалості ремісій, проте смертність хворих за останнє 10-річчя майже не змінилась і є найвищою серед хворих на генітальний рак не тільки в Україні, але і у багатьох інших країнах світу (P.T.Greenlee, et al., 2000; В.М.Мерабишвили и др., 2001; В.С.Свинцицкий и др., 2001; Е.В.Старинский и др., 2002; З.П.Федоренко и др., 2003). За даними клінічних спостережень 5-річна виживаність хворих на РЯ не перевищує 20-35% (P.J.Hoskins et al., 1999; В.М.Мерабишвили и др., 2001; В.С.Свинцицкий и др., 2001; B.Davidson et al., 2001). Це обумовлено тим, що у 70-80% хворих на РЯ лікування розпочинається на пізніх стадіях хвороби, оскільки I стадія діагностується у незначної кількості хворих (P.Sevelda, 1996; А.Gadduci et al., 1997; Л.И.Воробьева, 2001). Метастази у лімфатичних вузлах виявляються у 23% випадків навіть на ранніх стадіях пухлинного процесу у яєчнику (А.Gadduci et al., 1997), що вказує на агресивний характер пухлинного процесу. Враховуючи, що за довгостроковим прогнозом Національного ракового реєстру Інституту онкології АМН України захворюваність жіночого населення України на рак до 2020 р. зросте на 20% (С.А.Шалимов и др.,2001), проблема ранньої діагностики РЯ, оптимізації лікування хворих і оцінка прогнозу набувають ще більшої актуальності і диктують необхідність наукових розробок у цьому напрямку.

Сучасні методи діагностики і лікування РЯ з орієнтацією лише на такі прогностичні фактори як стадія пухлинного процесу, гістологічна будова пухлин і ступінь їх диференціювання не задовольняють клініцистів. У зв’язку з цим подальші дослідження РЯ мають бути пов’язані з сучасними досягненнями молекулярної біології і генетики. Згідно з останніми розвиток злоякісних пухлин є складним процесом накопичення структурних і функціональних змін онкогенів і генів-супресорів, що задіяні у порушеннях механізмів проліферації, диференціювання і детермінують злоякісний фенотип (M.M.Quezado, et al., 1999; Б.П.Копнин, 2000; Л.Л.Киселев, 2000; H.Olsson, 2001; Y.Liu, et al., 2002). Тому дослідження біологічних особливостей пухлинного росту не втрачають своєї актуальності (А.Г.Блюменберг и др., 2000; В.Ф.Чехун, Ю.В.Шишова, 2001; P.R.Andreassen et al., 2001; F.R.Khuri et al., 2001).

Cеред показників біологічних особливостей пухлинного росту кардинальне значення мають проліферація і пов’язаний з нею неоангіогенез, які є обов’язковими і невід’ємними ознаками неопластичного процесу і спостерігаються на усіх етапах туморогенезу – від малігнізації до метастазування (Folkman J.,2000; S.Hasan et al., 2001; Ellis L.M., Fidler I.J., 2001; A.Vazurec, et al., 2002). Проте даних літератури з цих питань відносно РЯ мало, вони не систематизовані, іноді суперечливі, що не дозволяє узагальнити взаємну роль показників проліферації і неоангіогенезу у механізмах прогресії пухлин, а також оцінити їх значення у прогнозі захворювання.

Ще одним надзвичайно важливим, але найменш розробленим напрямком онкології є клінічний поліморфізм, який характерний для мультифакторних хвороб, у схильності до яких мають значення як спадкові, так і інші фактори (чинники зовнішнього середовища, шкідливі умови праці і т.д.) (С.И.Козлова, 1982; Р.Ф.Гарькавцева, 2000). Ідентифікація генів схильності (BRCA1 і BRCA2) до виникнення злоякісного росту у молочній залозі і яєчнику послужила підгрунтям для більш поглибленого дослідження ролі спадкового фактору у розвитку раку (O.Johansson, et al., 1996; K.-A.Phillips, 2000), внаслідок чого були окреслені різні підваріанти раку – спадкові і неспадкові, які відрізняються варіабельним клінічним перебігом. Подібні розробки щодо РЯ поодинокі (І.І.Яковцова, 1995; К.П.Ганина та співав., 1996; H.Takahashi et al., 1996; Р.Ф.Гарькавцева, 2000), а схильність до розвитку раку виявилась неоднаковою для популяцій різних регіонів. Тому комплексний підхід до вивчення такої складної проблеми як гетерогенність РЯ потребує проведення клініко-генеалогічних досліджень і врахування ролі спадкового фактору у виникненні злоякісних пухлин.

Представлене свідчить про актуальність і необхідність подальших фундаментальних досліджень РЯ, результати яких будуть мати значення для клінічної онкології, а саме для уточнення механізмів розвитку, прогресії РЯ, а також для оптимізації ефективності індукційної поліхіміотерапії (ПХТ) і оцінки прогнозу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами і темами.

Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом науково-дослідної

роботи Інституту експериментальної, патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України за темами науково-дослідних робіт: “Розробити принципи пригнічення метастазування на основі комплексного використання факторів, які блокують пухлинний ангіогенез” (2000-2002рр.), реєстраційний номер 0100U000794; “Молекулярно-генетичні механізми модифікації властивостей лейкозних та інших злоякісних клітин” (2000-2003рр.), реєстраційний номер 0100U000999.

Мета дослідження.

Оцінити значення спадкової схильності до розвитку раку, маркерів проліферації і неоангіогенезу як факторів прогнозу клінічного перебігу РЯ.

Задачі дослідження.

1. Провести клініко-генеалогічні дослідження у хворих на РЯ, визначити сегрегаційну частоту РЯ та інших пухлин у родоводах, охарактеризувати первинно-множинні пухлини у пробандів.

2. Визначити типи асоціацій злоякісних новоутворень у родоводах хворих на РЯ і внесок спадкового фактору у схильність до розвитку раку у родинах пробандів.

3. Дослідити рівень фактору росту ендотеліальних клітин (VEGF) у сироватці крові хворих на злоякісні епітеліальні пухлини яєчника та його залежність від особливостей пухлинного процесу.

4. Визначити експресію антигену ядер проліферуючих клітин (PCNA) і показники мітотичного режиму в злоякісних епітеліальних пухлинах яєчника різної гістологічної структури.

5. Оцінити клінічну інформативність показників неоангіогенезу, проліферації і клініко-генеалогічних даних у хворих на РЯ та їх прогностичне значення.

Об’єкт дослідження.

Хворі на злоякісні епітеліальні пухлини яєчника, практично здорові жінки, операційний матеріал і сироватка крові хворих на РЯ I-IV стадії.

Предмет дослідження.

Фактор росту ендотелію судин, антиген ядер проліферуючих клітин, мітотичний режим, спадкова схильність, родоводи хворих, клініко-генетичні карти.

Методи дослідження.

Загальноклінічні, морфологічний, імуногістохімічний (визначення експресії антигену ядер проліферуючих клітин), імуноферментний (визначення рівня фактору росту ендотеліальних клітин), клініко-генеалогічний, генетико-математичний (генетико-сегрегаційний, генетико-кореляційний), статистичні (параметричні, непараметричні, коефіцієнти варіації, кореляції).

Наукова новизна одержаних результатів. Визначена роль спадковості у загальній схильності до розвитку РЯ. Вперше досліджено та конкретизовано внесок спадкового фактору до розвитку раку органів жіночої репродуктивної системи у сім’ях хворих на РЯ київської популяції. У межах однієї нозологічної форми хвороби “рак яєчника” виділені підваріанти раку - спадковий (органоспецифічний) і у складі сімейного ракового синдрому Лінч-П з найбільш частими типами асоціацій РЯ і злоякісних пухлин органів жіночої репродуктивної системи і/або шлунково-кишкового тракту. Встановлена висока інформативність показників неоангіогенезу і проліферації для оцінки біологічних особливостей пухлин яєчника та їх значення у прогнозі хвороби. Доведено, що рівень фактору росту ендотелію судин (VEGF) у сироватці крові хворих на РЯ збільшений і є показником розповсюдженості пухлинного процесу і несприятливого прогнозу. Визначена гетерогенність пухлин яєчника за експресією біомолекулярного маркеру проліферації (PCNA) і характером порушень мітотичного режиму, її залежність від гістологічної будови злоякісних епітеліальних пухлин яєчника і атипії клітин у граничних серозних цистаденомах. Виживаність хворих на РЯ із обтяжених на рак родин має тенденцію до зменшення поряд із достовірним зниженням медіани виживаності.

Практичне значення результатів дослідження. На сучасному рівні діагностики і лікування хворих клініко-генеалогічні дослідження, визначення показників проліферації клітин у видалених при оперативному втручанні пухлинах (експресія PCNA, мітотичний індекс, кількість патологічних мітозів), а також рівень VEGF у сироватці крові мають бути важливою складовою комплексного клінічного обстеження хворих на РЯ для характеристики біологічних особливостей пухлин і оцінки ступеню їх злоякісності. За результатами імуногістохімічного дослідження експресії PCNA і особливостей мітотичного режиму виділено різні ступені проліферації РЯ, що доцільно використовувати у роботі патоморфологічних відділень науково-дослідних інститутів і онкологічних диспансерів як для диференційної діагностики проліферуючих цистаденом і злоякісних пухлин яєчника, так і для характеристики злоякісності пухлинного процесу. Зміни рівня VEGF у сироватці крові обґрунтовують можливість його використання не тільки як показника поширеності пухлинного процесу і його прогнозу, але і для моніторингу ефективності ПХТ. Розрахунки індивідуального генетичного ризику виникнення злоякісних пухлин у родинах хворих на РЯ можуть бути використані онкологами і сімейними лікарями з метою проведення селективного скринінгу у родинах хворих на РЯ, а також для проведення медико-генетичного консультування онкологічних хворих. Результати дослідження впроваджені у Київській міській онкологічній лікарні.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто сформульована мета, програма і задачі дослідження, зібрана і проаналізована література за темою дисертації. Самостійно проведені збір, аналіз клінічного матеріалу, курси поліхіміотерапії хворим, охарактеризовані клінічні особливості РЯ, зіставлені результати морфологічного, імуногістохімічного і імуноферментного досліджень з клінічними особливостями РЯ та статистична обробка даних. Самостійно проведені клініко-генеалогічні дослідження, аналіз родоводів, визначені характерні для хворих на РЯ асоціації злоякісних пухлин у родоводах. Автором самостійно проведено теоретичне узагальнення результатів роботи, сформульовані основні положення і висновки дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладені на: Х з’їзді онкологів України. - Крим, 2001р.; науково-практичній конференції “Сучасні аспекти комплексного лікування раку молочної залози із застосуванням органозберігаючих та реконструктивних операцій”. - Ужгород, 2002р., III науково-практичній конференції “Проблеми онкогенетики: наукові та прикладні аспекти”.-Київ, 2002р.; IV науково-практичній конференції “Сучасні принципи діагностики та лікування візуальних форм генітального раку у жінок”. - Львів, 2002; V конференції молодих онкологів України “Сучасні аспекти експериментальної та клінічної онкології”. - Київ, 2002р.; Ш з’їзді медичних генетиків України. - Львів, 2002; науково-практичній конференції з міжнародною участю “Онкологія-ХХI”. - Київ, 2003р.; VII конгресі патологів України “Екологічна, інфекційна, судинна та онкологічна патологія – сучасні аспекти морфологічної діагностики і патоморфозу”. - Івано-Франківськ, 2003р.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 20 наукових робіт, у тому числі 6 статей у провідних фахових журналах і збірнику, рекомендованих ВАК України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 166 сторінках, складається із вступу, огляду літератури, 5 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку літератури, який включає 328 першоджерел, у тому числі 193 зарубіжних. Робота ілюстрована 24 таблицями і 25 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Матеріалом дослідження були результати клінічного обстеження 232 хворих на РЯ I-IV стадії віком 28-78 років, які знаходились на стаціонарному лікуванні у Київській міській онкологічній лікарні. Усім хворим проведено комплексне обстеження із застосуванням загально клінічних методів. Останні включали гінекологічний огляд (бімануальне дослідження, кольпоскопію і цитологічне дослідження мазків із шийки матки і цервікального каналу), аналізи крові (формула крові і біохімічні дослідження), ультразвукове дослідження органів малого тазу і черевної порожнини, рентгенографію органів грудної порожнини, загальний аналіз сечі, цитологічне дослідження асцитної рідини, морфологічне дослідження видалених пухлин після оперативного лікування. Стадію пухлинного процесу у яєчнику визначали за класифікаціями TNM і Міжнародної федерації гінекологів і акушерів (FIGO). Перша стадія пухлинного процесу була у 34 (14,7%), II стадія – у 41 (17,7%), III стадія – у 132 (56,9%), IV стадія – у 25 (10,7%) хворих.

Клініко-генеалогічні дані одержані від 232 хворих під час особистої бесіди з пробандом, вони заносились у спеціально розроблену нами клініко-генетичну карту.

У 46 хворих I-IV стадій віком 35-76 років і 10 практично здорових жінок віком 41-65 років (контроль) проведено визначення рівня VEGF у сироватці крові до лікування і після курсу ПХТ. У 36 хворих на РЯ і у 10 хворих з граничними пухлинами (архівний матеріал) досліджували експресію PCNA і мітотичний режим пухлин до лікування.

Оперативне лікування хворих проводилось в об’ємі надпіхвової ампутації або екстирпації матки з видаленням пухлини і додатків та резекції великого чепця. Частина хворих оперувалась в інших лікувальних закладах м.Києва і після морфологічної верифікації діагнозу у патоморфологічній лабораторії поступала у Київську міську онкологічну лікарню для подальшого лікування. Більшості хворих на РЯ проводилась неоПХТ+операція+ад’ювантна ПХТ (124-53,4% хворих), операція+ад’ювантна ПХТ – 83(35,8%) хворих, у 25 (10,8%) хворих на РЯ IV стадії пухлинного процесу проводили лише ПХТ.

У якості неоад'ювантної і ад'ювантної ПХТ хворим призначали цисплатин, (100 мг/м?) і циклофосфамід ( 600 мг/м?) за схемами СР і CАР (доза доксорубіцину 50 мг/м?) у cистемному режимі і шляхом внутрішньоочеревинного введення цисплатину. Кількість курсів ПХТ - 4-6 з інтервалом між курсами 3-4 тижні.

Для проведення генетико-популяційного дослідження нами застосований класичний метод медичної генетики – клініко-генеалогічний метод, об’єктом до застосування якого є сім’я (В.Ленц, 1984; Н.П.Бочков, 1978). Характер збору клініко-генеалогічного матеріалу відповідав поодинокій реєстрації сімей. Клініко-генеалогічне дослідження складалось з двох етапів. Перший - це одержання даних від пробандів (хворі на РЯ) про кількість родичів першого (батьки, сестри, брати, діти) і другого ступеню спорідненості (тітки, дядьки, бабусі, дідусі), їх хвороби і причини смерті. Другий етап – складання родоводів і наступний генетико-математичний аналіз.

Для обробки клініко-генеалогічних даних застосовували комп’ютерну програму генетико-математичного аналізу, яка була розроблена в лабораторії генетики Інституту психіатрії АМН Росії (В.И.Трубников, В.М. Гиндилис, 1981). Програма передбачала проведення сегрегаційного аналізу (аналіз розщеплення ознаки у поколіннях) і генетико-кореляційного аналізу, на основі результатів яких обчислювали внесок спадкових та інших факторів у загальну схильність до розвитку РЯ. Рекурентний ризик виникнення раку для родичів пробандів розраховані за N.E.Morton (1969).

Клінічні діагнози у хворих на РЯ були підтверджені при гістологічному дослідженні видалених пухлин і цитологічному дослідженні асцитної рідини в патоморфологічній і цитологічній лабораторіях Київської міської онкологічної лікарні. Оцінку характеру неопластичних процесів у яєчнику і ступеня диференціювання злоякісних пухлин (G1-G4) проводили за Міжнародною класифікацією пухлин і пухлинних процесів яєчника (1975). Дослідження мітотичного режиму включало розрахунок декількох показників: мітотичний індекс (МІ, %о); метафазно-профазний індекс; кількість усіх патологічних мітозів та окремих форм патологічних мітозів (%). Патологічні мітози характеризували за класифікацією І.А.Алова (1965).

На серійних зрізах парафінових блоків із операційного матеріалу проводили імуногістохімічне визначення експресії PCNA з використанням моноклональних антитіл проти антигену ядер проліферуючих клітин РС-10 фірми “Dako” (Данія) та АВС-кіт фірми “Vector” (США). Результати імуногістохімічної реакції оцінювали як відсоток позитивно експресуючих PCNA клітин на 2000 підрахованих при збільшенні мікроскопу х400. За позитивний результат вважали коричневе забарвлення ядер клітин без забарвлення цитоплазми.

Для визначення рівня VEGF застосовували імуноферментний метод (E.Engvall et al., 1971). Визначення рівня VEGF у сироватці крові проводили на фотометрі “Мультискан” при довжині хвилі 492 нм.

Виживаність хворих вивчали за допомогою інтервального методу побудови таблиць дожиття (актуаріальний метод). Для порівняння виживаності груп розраховували медіану виживаності (В.В.Двойрин, 1982).Середню помилку виживаності рахували за E.L.Kaplan, P.Meyer (1958).

При статистичній обробці використовували параметричні (критерій Стьюдента) і непараметричні методи (точний метод Фішера, Колмогорова-Смірнова), коефіцієнти кореляції, варіації, критерій інформативності за Кульбаком (Е.В. Гублер, 1978). Різниця між показниками вважалась достовірною при р 0,05.

Імуногістохімічні, імуноферментні дослідження та математична обробка клініко-генеалогічних даних проведені в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Аналіз клінічних даних показав, що середній вік хворих становив 60,3 9,1 років. Кількість хворих до 50 років дорівнювала 38,3%, після 50 років – 61,7%. Найбільша кількість хворих (85,2%) була у віці 41-70 років, що співпадає з даними літератури про найбільшу захворюваність жінок на РЯ у цьому віковому інтервалі (Л.И.Воробьева, 2001; В.С.Свінцицький, 2001).

Оскільки у патогенезі злоякісних пухлин органів репродуктивної системи у жінок мають значення особливості менструальної і репродуктивної функції, ми провели їх аналіз у хворих на РЯ. Показано, що найбільшу інформативність за Кульбаком мають менархе після 15 років, менопауза до 50 років, відсутність пологів, викидні в анамнезі. При аналізі гінекологічної і екстрагенітальної патології, яка була у хворих до виникнення РЯ, найчастіше спостерігались аднексити (22,0%), фіброміома матки (9,9%), зоб (4,7%), позаматкова вагітність (3,0%), кісти яєчників (4,3%), мастопатії (2,2%), полікістоз яєчників (1,6%), поліпи шлунково-кишкового тракту (1,2%) і цервікального каналу (1,2%). Тобто, у хворих на РЯ реєструється незначна кількість захворювань, пов’язаних з гормонально-метаболічними порушеннями, що підтверджує результати інших дослідників (С.М.Карташов, 2002).

Клініко-генеалогічні дослідження були проведені у 232 хворих на РЯ I-IV стадій. На підставі результатів клініко-генеалогічного дослідження пацієнтки були розподілені на дві групи: пацієнтки, у родоводах яких були онкологічні хворі (108 – 46,6% хворих) у кількості 2-5 ( обтяжені на онкологічну патологію родоводи), і хворі без будь-якої онкологічної патології у родоводах (124 – 53,4%). За стадією пухлинного процесу відносна кількість хворих у групах була однаковою, що дозволило нам порівнювати ці групи хворих між собою.

Середній вік хворих у виділених групах був різним (51,55,6 і 55,46,8) з тенденцією до зниження у хворих із обтяжених на онкологічну патологію родин (р0,05). В обтяжених на онкологічні хвороби родинах більше в 1,6 разів виявилося пробандів віком 41-50 років (37,0%), ніж у родинах без онкологічної обтяженості (23,4%) (р0,05). У групі з онкологічною патологією у родоводах більше хворих з раннім (до 12 років) і пізнім (після 15 років) менархе, а також хворих, що мали одні пологи. Аналіз родоводів показав, що більша кількість онкологічних хворих простежується серед родичів першого ступеня спорідненості. У 60 родоводах на рак хворіли батьки, у тому числі у 5 родоводах – обоє батьків. У пробандів вік маніфестації РЯ був меншим, ніж у батьків з таких родин, що свідчить про феномен антиципації.

У 5,2% пробандів були первинно-множинні пухлини, РЯ у таких випадках був синхронним або метахронним. Множинні пухлини у обстежених хворих розвинулись через різний строк – від 3 міс. до 39 років і мали різну гістологічну будову, що виключає метастатичний процес. Первинно-множинні пухлини у хворих є характерною ознакою спадкового раку і сімейного ракового синдрому, що підтверджується асоціацією злоякісних пухлин у вивчених родоводах. Такі факти ми, як і інші автори (Р.Ф.Гарькавцева, 2000), пояснюємо плейотропним механізмом дії одного і того ж мутантного гена.

За допомогою генетико-дисперсійного (сегрегаційного) аналізу було встановлено, що сегрегаційна частота РЯ у родинах пробандів була у 5 разів більшою, ніж у популяції. Характерно, що у родинах хворих на РЯ частота РОЖРС перевищувала частоту РЯ у 3,8 рази. Детальний аналіз родоводів дозволив виділити певні асоціації новоутворень, які виявились характерними для родин обстежених нами пробандів. Найчастіше (39,8%) спостерігалась асоціація РЯ і раку органів жіночої репродуктивної системи, у тому числі асоціація РЯ у про банда і РЯ у матерів або сестер (7,4% родоводів), У 31,5% родоводів була асоціація РЯ і РШКТ (рак шлунково-кишкового тракту), у 28,7% - асоціація РЯ та інших пухлин (рис.1). Серед типів асоціацій раку у родинах пробандів особливу увагу звертає асоціація РЯ+РЯ, що є проявом спадкового характеру раку. Асоціації злоякісних пухлин різного генезу у родинах пробандів відповідають сімейному раковому синдрому Лінч-II.

Для визначення спадкового внеску у виникнення злоякісних пухлин була розрахована кореляція між злоякісними пухлинами у родичів, яка виявилась найбільшою у мультифакторній моделі, коефіцієнт кореляції (r=0,7050,052) свідчить про прямий сильний зв’язок.

Рис.1. Різні типи асоціації злоякісних пухлин у родоводах хворих на РЯ.

На основі одержаних даних ми конкретизували внесок спадкової компоненти у схильність до розвитку злоякісних новоутворень у родинах пробандів, який становить 66,86,3%, внесок інших факторів - 33,26,3%. Хоча вивчення останніх не входило в задачі дослідження, слід зазначити, що за результатами наших досліджень 23,3% хворих працювали у шкідливих умовах виробництва. У світлі поданого важливе значення надається визначенню індивідуального ризику розвитку злоякісних новоутворень у родичів пробандів, що стало заключним етапом даного клініко-генеалогічного дослідження, в результаті якого були розраховані спеціальні таблиці, які можна використовувати при медико-генетичному консультуванні онкологічних хворих та їх родичів.

Дослідження біологічних особливостей пухлинного росту включало визначення рівня фактору росту ендотеліальних клітин у сироватці крові хворих на РЯ і вивчення особливостей проліферації у злоякісних епітеліальних пухлинах яєчника.

Дослідження рівня VEGF у хворих на РЯ виявило його варіабельність із значними коливаннями від 280 нг/мл (мінімальне значення) до 483 нг/мл (максимальне значення). Середній рівень VEGF у обстежених хворих дорівнював 367,221,4 нг/мл, що майже у 6 разів перевищувало його середній показник у контролі (63,44,8 нг/мл з крайніми коливаннями від 50 до 70 нг/мл) (р 0,001) (рис. 2)

Рис. 2. Середній рівень VEGF у сироватці крові хворих на рак яєчника і практично здорових жінок (контроль).

Для з’ясування причин такої варіабельності рівня VEGF одержані результати були розглянуті у залежності від ряду факторів: віку хворих, розповсюдженості пухлинного процесу, гістологічної будови пухлин яєчника. У хворих різного віку не виявлено достовірної різниці рівнів VEGF за його середніми значеннями. Дослідження рівня VEGF у залежності від гістологічної будови злоякісних пухлин яєчника і ступеня їх диференціювання також не виявили достовірних змін рівня VEGF, хоча морфологічна будова пухлин була різною: аденокарциноми (n=16), серозний рак (n=11), низькодиференційований рак (n=3), гранульозоклітинний рак (n=2), муцинозний рак (n=1).

Достовірними виявились зміни рівня VEGF у хворих IVстадії (405,421,6 нг/мл) порівняно з I стадією пухлинного процесу (301,423,3 нг/мл) (р0,05), що дає підстави вважати рівень VEGF у хворих на РЯ біологічним показником розповсюдженості пухлинного процесу.

Комплексні дослідження проліферації пухлин яєчника показали, що експресія PCNA проявлялась в усіх новоутвореннях яєчника із значною варіабельністю кількості клітин, експресуючих PCNA, у різних спостереженнях – від 11,3 до 89,7%. У граничних цистаденомах кількість PCNA-позитивних клітин становила у середньому 19,62,8%. У цих пухлинах мітотичний індекс був невисоким і становив 5,90,7‰, кількість патологічних мітозів - 5,70,5%.

Варіабельність показників проліферації в граничних серозних цистаденомах, клінічний перебіг яких за даними літератури є непередбаченим, стала основою для більш детальної характеристики їх проліферативної активності. Виявилося, що рівень експресії PCNA асоціювався з атипією епітелію і у цистаденомах з ознаками атипії клітин був достовірно вищим (24,52,7%), ніж у цистаденомах без такої (15,31,7%) (р0,05). Середні значення мітотичного індексу в цистаденомах з атипією клітин також виявилися більшими, ніж у пухлинах без атипових змін епітелію. Серед патологічних форм мітозів більше було мітозів, пов’язаних з пошкодженнями хромосом (56,7%). Отже, одержані результати є свідченням гетерогенності не тільки морфологічної структури, але і проліферативного потенціалу граничних цистаденом, що вимагає диференційованого підходу до лікування хворих з такою онкологічною патологією, особливо коли вирішується питання про призначення ад’ювантної ПХТ після оперативного втручання.

У злоякісних епітеліальних пухлинах також визначена значна гетерогенность показників у різних пухлинах із значним діапазоном коливань від 27,3 до 89,7%. Середня кількість клітин, експресуючих PCNA у злоякісних серозних пухлинах яєчника, становила 56,03,1%, що у 2,3 рази більше за таку у проліферуючих граничних серозних цистаденомах з атипією клітин (р0,01). В усіх спостереженнях раку позитивна PCNA-реакція виявлялась у вигляді гомогенного темнокоричневого забарвлення ядер у 80-100 клітин, що вказує на S-фазу клітинного циклу.

У серозних злоякісних пухлинах яєчника виявлено також більш високий мітотичний індекс (21,32,5%о), ніж у граничних цистаденомах з переважанням кількості метафаз над профазами (3,6 при нормі 1). Кількість патологічних мітозів дорівнювала 23,91,7% і була більшою у тих пухлинах, де виявлялись високі показники експресії PCNA. Визначалось також розширення їх спектру із переважанням мітозів, які виникають при порушеннях мітотичного апарату (67,8%). У злоякісних епітеліальних пухлинах визначена пряма помірна кореляція між експресією PCNA і показниками мітотичної активності (r = 0,53).

Виявлена залежність експресії PCNA від гістологічної будови РЯ: найменша кількість клітин, експресуючих PCNA, спостерігалась у муцинозних цистаденокарциномах (32,23,5%), найбільша їх кількість - у папілярних цистаденокарциномах (59,33,7%) (p0,05). Серозні цистаденокарциноми за цим показником займають проміжне положення. У злоякісних епітеліальних пухлинах яєчника зі ступенем диференціювання G3 рівень експресії PCNA більший (46,7%), ніж при G2 ( 36,2%) (р0,05). У межах серозних злоякісних пухлин яєчника виділені три рівня проліферації, які разом із цитоморфологічною характеристикою пухлин і ступенем їх диференціації можна вважати відображенням різного рівня їх злоякісності, що є аргументом для проведення диференційованої ПХТ.

Клінічне значення комплексу вивчених біологічних показників і спадкового фактору.

Особливого значення набувають результати визначення рівня VEGF у хворих з різною обтяженістю родоводів на рак, оскільки подібні дослідження іншими авторами не проводились. Максимальні індивідуальні показники рівня VEGF були у хворих з обтяженим сімейним анамнезом. За середніми значеннями рівень VEGF у хворих з обтяженим на рак сімейним анамнезом мав лише тенденцію до підвищення (382,510,7 нг/мл) проти такого у хворих з необтяженим на рак сімейним анамнезом (361,712,7 нг/мл) (р0,05) (табл.1).

Таблиця 1.

Рівень VEGF у хворих на РЯ у залежності від обтяженості родоводів на злоякісні новоутворення

Характеристика

і кількість хворих

на РЯ | Рівень VEGF (нг/мл)

Mm (коливання), v-коеф. варіації (%)

До курсу ПХТ | після курсу ПХТ | Хворі з обтяжен. на рак родоводами (n=20) | 361,712,7 (280-483)

v=15,7 |

357,115,2 (215-490)

v=18,6 | Хворі з необтяжен. на рак родоводами (n=26) | 382,510,7 (295-456)

v=12,8 | 375,611,8 (295-470)

v=14,0

Оскільки залишається відкритим питання щодо значення рівня VEGF як фактору прогнозу клінічного перебігу РЯ, ми зіставили і проаналізували його значення у 25 хворих, які перебувають під наглядом протягом 6 місяців - 2,5 років (I група хворих), і у 15 хворих (II група хворих) з агресивним перебігом хвороби і низькими показниками виживання. Вік хворих у цих групах коливався від 35 до 72 років. Аналіз виявив достовірну різницю (р0,05) між показниками VEGF: у хворих II групи рівень VEGF був достовірно вищим (391,1 15,4 нг/мл), ніж у хворих I групи (337,313,6 нг/мл) (рис.3). У 57,3% хворих II групи після курсу ПХТ спостерігалось підвищення рівня VEGF, у 35,7% – його зниження, у 7,0% – рівень VEGF не змінювався. У хворих I групи розподіл змін VEGF після курсу ПХТ був іншим – у більшості хворих (47,4%) спостерігалось зниження показників, у 21,0% – вони не змінювались і лише у 31,6% - підвищувались. Орієнтуючись на результати таких зіставлень, можна стверджувати, що рівень VEGF у хворих на РЯ може розглядатись як індивідуальний прогностичний фактор клінічного перебігу РЯ і його стабільність чи підвищення свідчить про несприятливий прогноз. Одержані дані дають підставу розглядати високий рівень VEGF у сироватці крові хворих на РЯ показником несприятливого прогнозу

Рис. 3. Показники VEGF у сироватці крові хворих на РЯ до і після ПХТ.

Не менш важливе значення для прогнозу мають показники проліферації РЯ (рис. 4). Аналіз біомолекулярного маркера проліферації показав, що у злоякісних пухлинах хворих з агресивним перебігом хвороби рівень експресії PCNA був достовірно більшим (50,63,5%) порівняно з таким у хворих, що продовжують перебувати під наглядом (32,62,9%)(р0,05). З наведеного рис.4 видно, що рівень експресії PCNA у хворих на РЯ із обтяжених на рак родин був збільшеним, але невірогідно (р0,05) і становив 49,25,6%, тоді як у хворих без онкологічної обтяженості родоводів він був меншим і дорівнював 42,34,3%.

Розрахунки кумулятивної виживаності показали, що 1-річна виживаність хворих на РЯ становить 87,04,5%, 2-річна – 58,02,8%, 3-річна – 41,64,3%. Такі результати співпадають з даними літератури щодо низької виживаності хворих на РЯ.

Розрахунки загальної 3-річної виживаності хворих на РЯ у залежності від родинного анамнеза показали, що у хворих з обтяженим на рак родинним анамнезом вона становила 39,75,4% і вірогідно не відрізнялась від такої у хворих без онкологічної патології у родоводах – 40,94,8% (р0,05). Достовірні зміни були притаманні медіані виживаності, яка зменшувалась до 18,2 міс. у хворих із обтяжених на рак родин проти 24,6 міс. у хворих із родин без онкологічної патології (р0,05).

Рис. 4. Середні рівні експресії PCNA у злоякісних пухлинах яєчника хворих з різним перебігом хвороби і у залежності від обтяженості родоводів на рак.

Враховуючи, що виживаність хворих залежить від стадії пухлинного процесу, ми проаналізували у порівняльному аспекті кумулятивну виживаність хворих Ш стадії у залежності від сімейного анамнезу на рак, оскільки це була найбільш численна група. У цій групі за період спостереження (2,5 роки) померло 50% хворих (рис. 5).

Рис. 5. Виживаність хворих на РЯ з різним сімейним онкологічним анамнезом.

Встановлено, що виживаність хворих з однаковою розповсюдженістю пухлинного процесу, але із родин з різним сімейним анамнезом щодо раку неоднакова. Виживаність хворих із обтяжених на рак родин має тенденцію до зменшення порівняно з такою у хворих без онкологічних хвороб у родоводах з найбільшою різницею показників 6- і 24-місячної виживаності (на 8 і 8,9%). Одержані дані свідчать, що протягом вказаних часових періодів необхідною є корекція тактики ПХТ у хворих на РЯ з обтяженим на рак сімейним анамнезом для оптимізації ефективності лікування, а фактор спадкової схильності необхідно враховувати для оцінки прогнозу виживаності.

Таким чином, на підставі комплексної оцінки результатів дослідження доведена роль спадковості у розвитку РЯ. Показано, що спадковий фактор, маркери проліферації і неоангіогенезу, які відображають біологічні властивості і гетерогенність злоякісного процесу, є показниками прогнозу РЯ. До чинників несприятливого прогнозу поряд з розповсюдженістю пухлинного процесу відносяться папілярна будова серозного РЯ, високі рівні експресії біомолекулярного маркера проліферації PCNA у пухлинних клітинах, патологічні мітози, підвищений рівеньVEGF у сироватці крові і його стабільність або збільшення після ПХТ, родинний анамнез відносно онкологічних хвороб (асоціації РЯ із злоякісними пухлинами органів жіночої репродуктивної системи або шлунково-кишкового тракту).

ВИСНОВКИ

У дисертації на підставі результатів клінічного, клініко-генеалогічного, імуноферментного та імуногістохімічного досліджень обґрунтовано і вирішено актуальну задачу онкології – значення спадкової схильності, проліферації і неоангіогенезу як факторів гетерогенності біологічних особливостей злоякісних епітеліальних пухлин яєчника, які впливають на прогноз пухлинного процесу.

1. Встановлена роль спадкового фактору у схильності до розвитку РЯ, що підтверджується збільшенням у родинах хворих сегрегаційної частоти злоякісних пухлин яєчника і органів жіночої репродуктивної системи, прямою кореляцією між злоякісними пухлинами у батьків і дітей (r=0,7050,052), первинно-множинними синхронними і метахронними пухлинами у пробандів.

2. Визначено і конкретизовано внесок спадкового фактору у загальну схильність до розвитку раку у родинах пробандів київської популяції, який складає 66,8%. Визначено підваріанти РЯ – спадковий (органоспецифічний) і у складі сімейного ракового синдрому Лінч-II з найбільш частими типами асоціацій РЯ і раку органів жіночої репродуктивної системи (39,8%) та шлунково-кишкового тракту (31,5% родин).

3. Встановлено достовірне збільшення рівня VEGF у сироватці крові хворих на РЯ порівняно з таким у здорових жінок та його залежність від розповсюдженості пухлинного процесу. Збільшення або стабільність рівня VEGF у сироватці крові хворих на РЯ після ПХТ є індивідуальним показником несприятливого прогнозу хвороби.

4. Показано, що експресія біомолекулярного маркеру проліферації PCNA і зміни мітотичного режиму є свідченням гетерогенності злоякісних епітеліальних пухлинах яєчника за проліферативним потенціалом, який залежить від гістологічної будови пухлин і має значення для оцінки ступеня злоякісності пухлинного процесу. Найбільший рівень експресії PCNA характерний для папілярних аденокарцином (59,33,7%), дещо менший – для цистаденокарцином (41,5 2,9%) і найменший - для псевдомуцинозного раку ( 32,2 3,5%). У серозних цистаденомах яєчника більший проліферативний потенціал характерний для пухлин з атипією клітин.

5. Встановлено зменшення медіани виживаності хворих на РЯ із обтяжених на рак родин до 18,2 міс. проти 24,6 міс. у хворих із родин без онкологічної патології. Виживаність хворих на РЯ Ш стадії із обтяжених на рак родин має тенденцію до зменшення порівняно з такою у хворих без онкологічних хвороб у родинах з найбільшою різницею показників 6- і 24-місячної виживаності (на 8 і 8,9%), що вказує на необхідність корекції тактики ПХТ у вказані часові інтервали.

6. Показниками несприятливого прогнозу у хворих на РЯ поряд із стадією пухлинного процесу є високі рівні VEGF у сироватці крові і експресії PCNA у пухлинах, порушення мітотичного режиму, папілярна будова пухлин, асоціації у родинах пробандів злоякісних пухлин по типу сімейного ракового синдрому, Одержані результати пропонується використовувати в онкологічній клініці при плануванні і проведенні ад’ювантної ПХТ хворим на РЯ з метою її оптимізації, а також для оцінки прогнозу хвороби.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. При комплексному обстеженні хворих на доброякісні і злоякісні новоутворення яєчника необхідними є клініко-генеалогічні дослідження для визначення спадкових варіантів раку чи у складі сімейного ракового синдрому, а також застосування імуногістохімічних і імуноферментних методів дослідження для характеристики біологічних особливостей пухлинного процесу.

2. Показники проліферативного потенціалу (експресія біомолекулярного маркеру проліферації PCNA і зміни мітотичного режиму) можуть застосовуватись у патоморфологічних лабораторіях онкологічних диспансерів для оцінки ступеню злоякісності пухлинного росту, а також з метою диференційної діагностики доброякісних і злоякісних епітеліальних пухлин яєчника.

3. Дослідження рівня VEGF у сироватці крові хворих на РЯ можна використовувати в онкологічній клініці для оцінки розповсюдженості пухлинного процесу.

4. У хворих на РЯ для оцінки прогнозу пропонується враховувати комплекс факторів - стадію пухлинного процесу, гістологічну будову пухлин, особливості їх проліферації, характер змін VEGF після ПХТ, обтяжений на рак сімейний анамнез.

5. Розраховані таблиці ризику виникнення раку у родинах хворих на РЯ є підставою для розробки принципів медико-генетичного консультування хворих з патологією органів жіночої репродуктивної системи.

Вважаю своїм приємним обов’язком висловити щиру подяку за допомогу у проведенні досліджень співробітникам Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України доктору медичних наук Л.А.Налєскіній, кандидату біологічних наук І.О.Лісняку, провідному інженеру Н.М.Глущенко.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІІ

1. Полищук Л.З., Несина И.П., Новак Е.Е. Рак яичника: генетические изменения и их связь с клиническими особенностями опухолевого процесса // Онкология.- 2002.- 4,№1.- С.9-14 (Особистий внесок дисертанта: здійснено підбір літератури та її аналіз, теоретичне узагальнення, підготовлена стаття до друку).

2. Налєскіна Л.А., Забарко Л.Б., Поліщук Л.З., Новак О.Є., Клеветенко М.П.,Захарцева Л.М., Романенко А.М. Комплексне визначення проліферативного потенціалу серозних новоутворень яєчника з урахуванням рівня експресії PCNA // Онкология.- 2002.-4, №3.- С.184-187. (Особистий внесок дисертанта: підбір клінічних спостережень, аналіз клінічних даних щодо віку, стадії пухлинного процесу, морфологічної будови, співставлення клінічних даних з експресією PCNA у пухлинних клітинах, формулювання висновків).

3. Новак О.Є.,