НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Новіцька Ольга Володимирівна

УДК 619:578.824.11:57.083

РОЗРОБКА ТЕСТ–СИСТЕМИ НА ОСНОВІ ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ АНТИТІЛ ПРОТИ ВІРУСУ СКАЗУ У СИРОВАТЦІ КРОВІ ТВАРИН

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному аграрному університеті Кабінету Міністрів України

Науковий керівник доктор ветеринарних наук, професор

Скибіцький Володимир Гурійович,

Національний аграрний університет,

завідувач кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор

Буряк Євген Іванович,

Одеський державний аграрний університет,

завідувач кафедри мікробіології та вірусології

кандидат ветеринарних наук, доцент

Постой Віктор Петрович,

Національний аграрний університет,

в. о. завідувача кафедри епізоотології та інфекційних хвороб

Провідна установа Сумський Національний аграрний університет, кафедра

вірусології, патологічної анатомії і ветсанекспертизи

Міністерства аграрної політики України, м. Суми

Захист дисертації відбудеться “15” червня 2004 р. о 10 год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус 3, ауд 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус 4, кімн. 41

Автореферат розісланий ” 14 ” травня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Міськевич С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Територія України нині є зоною стійкого неблагополуччя щодо сказу. Хвороба реєструється у всіх природно-географічних зонах країни, головним чином, серед лисиць, які складають 42% від загальної кількості тварин, що захворіли (Троценко З.Р., 2000, Бабкін М.В., 2001). Індикатором стану щодо сказу є напруга антирабічного імунітету у свійських та диких тварин, міграція яких сприяє постійній циркуляції вірусу у природі (Хрипунов Е.М., 2001). Дослідження рівня гуморального імунітету дозволяє контролювати, прогнозувати ситуацію щодо сказу та визначати ефективність антирабічної вакцинації тварин (Childs James E., 2000, Недосєков В.В., 2001).

Нині в Україні для виявлення антитіл проти вірусу сказу користуються лише методом віруснейтралізації на білих мишах. Проте, за рекомендаціями МЕБ та ВООЗ (2002), бажаними методами оцінки рівня антирабічних антитіл є реакція віруснейтралізації на клітинних культурах та ІФА. Останній є високоспецифічним, чутливим та надзвичайно оперативним методом, який дозволяє виявляти антитіла у великій кількості зразків за короткий термін – 4 – 6 годин.

В Україні не розроблено жодної тест-системи на основі ІФА, яка б дозволяла здійснювати серологічний скринінг рабічної інфекції, визначати рівень гуморального імунітету у тварин, що імунізовані проти сказу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота є складовою частиною комплексних досліджень за темою: “Розробка теоретичних основ та експериментальне обґрунтування біотехнології засобів діагностики та профілактики сказу” (номер державної реєстрації 0199U0025). Автором дисертації виконувалась робота у напрямку розробки засобів на основі ІФА для визначення антитіл проти вірусу сказу у сироватці крові тварин.

Мета і завдання досліджень. Основна мета роботи - розробка тест-системи на основі імуноферментного аналізу для визначення антитіл проти вірусу сказу у сироватці крові тварин.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі наукові завдання:

–

–

–

–

–

–

Об'єкт дослідження: вірус сказу, імуноферментний аналіз.

Предмет дослідження: культури клітин, культуральні та тканинні антигени вірусу сказу, імунопероксидазний конюгат, антирабічна сироватка крові, параметри постановки ІФА.

Методи дослідження. Поставлені в роботі наукові завдання вирішувались експериментально з використанням вірусологічних (культивування вірусу сказу, штам "Щелково-51К" у клітинних культурах ВНК 21/17 та НГУК-1), імунологічних (отримання антирабічної сироватки на кролях; активність отриманих сироваток визначали за методом Аtanasiu (1978) та непрямим методом ІФА з використанням кон’югату проти імуноглобулінів кроля), гематологічних (визначення кількості еритроцитів, лейкоцитів пробірковим методом з підрахунком в камері з сіткою Горяєва), біохімічних (визначення концентрації загального білка біуретовим методом (2000), білкових фракцій турбодиметричним методом (1991)), імунохімічних (кон’югацію рекомбінантного білка А Staphylococcus aureus проводили перйодатним методом, модифікованим Wilson et Nakanе (1978); чистоту отриманого кон’югату та рабічних антигенів перевіряли за допомогою електрофорезу (1985)), та статистичних (MS Excel для обробки цифрових даних з метою визначення достовірності змін показників та коефіцієнта корелятивних взаємозв'язків) методів досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні отримана високоспецифічна діагностична антирабічна сироватка крові кролів за розробленою нами методикою гіперімунізації, суть якої полягає у п’ятикратному введенні антирабічної вакцини КоКАВ на 1-, 3-, 7-, 14- та 30-у добу з додаванням ад’юванту ISA 25 на 1- та 14-у добу імунізації. Запропоновано методику концентрування вірусу сказу поліетиленеміном. Розроблено діагностичну тест-систему на основі непрямого варіанта ІФА із застосуванням кон’югату на основі рекомбінантного білка А Staphylococcus aureus, яка дозволяє виявляти антирабічні антитіла у сироватці крові різних видів тварин та визначати їх рівень у МО. Наукова новизна роботи підтверджена Деклараційним патентом України на винахід 64544 А 7 G01/N 33/00.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дисертаційної роботи використані при створенні тест-системи “ІФА-RABIES AB” (ТУУ 24.4.31404814–679–2002), впровадженої у практику ветеринарної медицини (“Настанова по застосуванню тест-системи діагностичної імуноферментної “ІФА-RABIES AB” для виявлення антитіл проти вірусу сказу у сироватці крові м’ясоїдних (собак, котів, лисиць, корсаків, вовків), свиней та великої рогатої худоби”, затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства АП України) а також при депонуванні лабораторного штаму “Щелково-51 К” вірусу сказу в Депозитарії Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів Міністерства АП України.

Особистий внесок здобувача. Всі дослідження проведені за безпосередньою участю здобувача. Особисто здобувачем проведено огляд та аналіз джерел наукової літератури за темою дисертації, виконання експериментальних досліджень та інтерпретації їх результатів, формулюванні наукових висновків, статистичну обробку отриманих результатів.

У процесі виконання ряду досліджень науково-консультативну допомогу надавали: д-р біол. наук Р.М. Чумак (Національний аграрний університет, м. Київ), канд. мед. наук Л.О. Антонова (НДІ епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського МОЗ України, м. Київ), З.Р. Троценко (Центральна державна лабораторія ветеринарної медицини Міністерства АП України).

Апробація роботи. Матеріали наукових досліджень доповідались та обговорювались на 4-х наукових конференціях професорсько-викладацького складу, наукових співробітників та аспірантів факультету ветеринарної медицини НАУ за 1999-2002 роки; на міжнародній науково-практичній конференції “Проблеми інфекційної патології тварин”, присвяченій пам’яті А.І. Собка (10-14 вересня 2001, Крим), на третій Міжнародній науково-практичній конференції “Біоресурси та віруси”(15 жовтня 2001, м. Київ).

Публікації. Основні положення дисертації викладено у 10 наукових працях, у тому числі п'яти статтях у фахових виданнях, означених переліком ВАК України, 4-х тезах матеріалів конференцій та одному патенті на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 110 сторінках комп’ютерного тексту, складається із вступу, 3-х розділів, висновків, пропозицій виробництву та бібліографічного списку, який включає 221 джерело, з них - 69 зарубіжних, містить 10 таблиць і 22 рисунки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

Роботу виконано на базі кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології НАУ. Окремі дослідження проведено у Центральній державній лабораторії ветеринарної медицини Міністерства АП України та в науково-дослідному інституті епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського Міністерства охорони здоров’я України.

У роботі були використані клітинні культури НГУК-1 та ВНК -21/17, вірус сказу (штами “Щелково-51 К”, ”Внуково-32”, “CVS” та “Овечий” ВДНКІ), а також тварини: 38 кролів породи шиншила масою тіла 1,5-2,0 кг віком 5-8 міс.; 3 000 білих нелінійних мишей масою тіла 9,0-12,0 г та дві вівці масою тіла 50 кг віком 8 міс.

Для отримання культурального рабічного антигену використовували вакцинний штам ”Щелково-51 К” вірусу сказу, який культивували у клітинних культурах ВНК-21/17 та НГУК-1 у ролерних умовах. Клітинну культуру із сформованим моношаром клітин заражали вірусом сказу (0,1-0,01 ЛД50/ клітину) та інкубували у ролерних умовах (1–2 об/хв). Титр вірусу визначали на 3-, 4- та 6-у добу культивування, заражаючи білих мишей різними розведеннями вірусовмісної суспензії. Отриманий матеріал заморожували та зберігали при –40 оС.

Вірус інактивували за допомогою гідроксиламіну (Sigma), додаючи його до вірусовмісної суспензії у концентрації 0,01 % та витримуючи в умовах кімнатної температури (18–20 оС) протягом 24 годин. Концентрування вірусовмісного рабічного матеріалу (культуральні рідини, що містили штами “Щелково-51К” і штами ”Внуково-32” та суспензія мозку, що містила штам “Щелково-51К”) з інфекційним титром вірусу сказу не нижче 106,0 ЛД50/0,03см3 здійснювали за допомогою поліетиленіміну. Вірусовмісний матеріал тричі заморожували-розморожували з наступним центрифугуванням при 3000 об/хв – 15 хв (400 g). Осад відкидали. До надосадової рідини додавали 50 %-й розчин поліетиленеміну з таким розрахунком, щоб кінцева концентрація його становила 0,005 %. Рідину ретельно перемішували та залишали на 2 доби при +40С. На наступному етапі вірусовмісний матеріал центрифугували при 4000 об/хв протягом 30 хв. Надосадову рідину відкидали. Осад суспензували у 9 % розчині NaCl. В нашій роботі матеріал концентрували у 50 разів.

Концентрований матеріал піддавали колонковій хроматографії на DEAE-toypearl. Елюцію проводили в лінійному градієнті натрію хлориду 0 - 0,4 М. 1 см3 концентрованого матеріалу суспендували у 1 см3 буфера 20мМ Tris, 1мМ ЕДТА, рН 7,5 і вносили у колонку. Елюат збирали пофракційно. Оптичну щільність отриманих фракцій визначали за допомогою спектрофотометра марки СФ-26 у діапазоні хвиль світла довжиною 300 – 240 нм. Відбирали фракції, які мали максимум поглинання при 280 нм та мінімум при 250 нм. Фракції, які містили найбільше специфічного рабічного антигену, піддавали електрофорезу в 12%-му поліакриламідному гелі та перевіряли у ІФА.

Часткове очищення антигену вірусу сказу, отриманного з концентрованої антирабічної вакцини, проводили за допомогою колонкової хроматографії на DEAE - toypearl за тією ж методикою, яка була використана під час отримання інших рабічних антигенів.

Для отримання антирабічної сироватки від кролів-донорів у якості антигенів застосовували концентровану антирабічну культуральну очищену інактивовану вакцину з штаму "Внуково-32" (КоКАВ) виробництва Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів (Москва), з індексом імуногенності > 2,5 МО та штам вірусу сказу “CVS” у вигляді 10%-ї суспензії мозку мишей з титром 104,625 ЛД50 /0,03 см3.

Як ад’ювант використовували мінеральне масло ISA-25 фірми “SEPPIC” (Франція). Гіперімунізацію кролів здійснювали у порівняльному аспекті за відомими та розробленими нами схемами із застосуванням ад’юванту. Кролів імунізували за такими схемами:

1 –дворазове введення КоКАВ на 1- та 21- добу у дозі 2 см3 внутрішньом'язово у ділянці стегна;

2 – п’ятиразове введення КоКАВ на 1-, 3-, 7-, 14- та 30-у добу у дозі 1 см3 внутрішньом'язово у ділянці стегна;

3 –чотириразове введення КоКАВ на 1-, 7-, 15- та 30-у добу у дозі 0,1 см3 внутрішньошкірно у 5 точок в області живота;

4 – чотириразове введення КоКАВ на 1-, 7-, 15-, 30-у добу у дозі 0,1 см3

внутрішньошкірно у п’ясневі та плюсневі м’якуші лапок та живіт.

5 – введення 0,5 см3 10%-ї суспензії “CVS” внутрішньом'язово у ділянці стегна на 1-у добу; на 3-, 6-у добу - по 0,5 см3 та на 10-, 17-у добу - по 1,5 см3 суспензії підшкірно у ділянці живота; на 50-й день внутрішньом'язово 2,5 см3 у ділянці стегна

6 – дворазове введення КоКАВ на 1- та 21-у добу у дозі 1 см3 з ад’ювантом ISA-25 (1:4), внутрішньом'язово у ділянці стегна;

7 – п’ятиразове введення КоКАВ на 1-, 3-, 7-, 14- та 30-у добу у дозі 1 см3 з додаванням ад’юванту ISA-25 (1:4) на 1- та 14-у добу, внутрішньом'язово у ділянці стегна.

Проби крові відбирали на 45-у добу після завершення імунізації та визначали титр і активність отриманих антирабічних сироваток у МО.

Для кон’югації використовували рекомбінантний білок А Staphylococcus aureus, отриманий з генноінженерно зміненого штаму E. сoli- суперпродуценту білка, який помічали пероксидазою хрону (RZ =2,9 – 3,0).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Результати порівняльного вивчення інтенсивності репродукції вірусу сказу (штам “Щелково-51 К”) на клітинних культурах НГУК-1 та ВНК-21/17. Зважаючи на ряд недоліків імуносорбентів, отриманих з мозкових вірусовмісних матеріалів, ми зосередились на розробці методики їх отримання на основі культуральних рабічних антигенів. Як клітинні культури були використані КК НГУК-1 та ВНК -21/17. На першому етапі названі культури клітин були адаптовані до доступних живильних середовищ. Оптимальним живильним середовищем для КК НГУК-1 виявилось комбіноване середовище: гідролізат лактоальбуміну з додаванням 10 % середовища 199 та 10 % сироватки крові великої рогатої худоби (ВРХ), 50 мкг/см3 гентаміціну сульфату (рН 7,2–7,4), а також середовище DMEM з 10% сироватки великої рогатої худоби та додаванням аналогічної кількості антибіотику при 37 оС. Клітинна культура ВНК 21/17 характеризувалася стабільним ростом, стійкістю до змін рН.

Рис. 1. Урожайність вірусу сказу штаму “Щелково -51 К” на клітинних культурах ВНК-21/17 та НГУК-1.

Невибагливість до поживних середовищ дозволяла використовувати різні субстрати, але найкраще КК росла на середовищі: суміш ГЛА/RPMI (3/1) з вмістом 10 % сироватки ВРХ.

На КК НГУК-1 максимальний титр штаму “Щелково-51 К” під час культивування не перевищував 2,5 – 3,0 lg ЛД50/0,03см3, тоді як на КК ВНК-21/17 титр вірусу зростав до 3 пасажу та становив 6,0 – 6,5 lg ЛД50/0,03 см3 (рис.1). Протягом 3 – 5 пасажів вірус стабільно накопичувався в титрі 5,8 – 6,5 lg ЛД50/0,03см3. На підставі отриманих результатів подальше культивування вірусу сказу, штаму “Щелково-51К”, ми здійснювали на КК ВНК-21/17.

Розробка методики гіперімунізації кролів з метою отримання антирабічних сироваток. Найбільш ефективним виявилось п’ятикратне введення КоКАВ з ад’ювантом ISA-25 на 1- та 14-у добу циклу імунізації (схема 7). Рівень віруснейтралізуючих антитіл у крові кролів, гіперімунізованих за цією схемою, становив 10,39±0,7 lоg2 ЕД50 (210 МО/см3) Схема 6 забезпечила отримання сироватки крові з титром 8,0±0,1 lоg2 ЕД50. П’ятикратне введення КоКАВ за схемою 2 забезпечило синтез віруснейтралізуючих антитіл у більш високих титрах, ніж дворазове введення вакцини (схема 1). Титри віруснейтралізуючих антитіл коливались у межах 6,21–6,61 lоg2 ЕД50 (1:74–1:98) та 5,81–6,01 lоg2 ЕД50 (1:49–1:65) відповідно. Введення 10%-вої мозкової суспензії вірусу сказу, штаму “CVS”, (схема 5) у зростаючих дозах індукувало на 45-у добу циклу імунізації продукцію антитіл у титрах 4,42–6,81 lоg2 ЕД50 (1:21–1:112). Внутрішньошкірне введення вакцини (схеми 3 і 4) виявилося неефективним – титри віруснейтралізуючих антирабічних антитіл порівняно зі схемою 2 були у 1,7 рази нижчими та становили 3,77±0,1 lоg2 ЕД50 (1:14).

Результати отримання імуноферментного кон’югату на основі рекомбінантного білка А Staphyloccocus aureus та визначення його робочого розведення. Кон’югацію рекомбінантного білка А Staphylococcus aureus здійснювали перйодатним методом, модифікованим Wilson et Nakanе (1978). Якість отриманого кон’югату визначали шляхом оцінки його активності та спектра сироваток крові тварин з якими він зв’язується.

Молярне співвідношення між ферментом та білком А визначали за допомогою спектрофотометра, порівнюючи оптичну щільність (ОЩ) препарату при двох довжинах світлової хвилі та реєструючи максимуми світлопоглинання білка та ферменту. Використовували кон’югати з співвідношенням ОЩ 403 нм/ОЩ 280 нм у межах 0,3 – 0,5, оскільки вони мали максимальне робоче розведення (1/2500 ) та найнижчу фонову реакцію (фоновий рівень ОЩ у лунках сенсибілізованих БСА не перевищував 0,05 – 0,1).

Ферментативну активність кон’югату досліджували у прямій реакції з субстратом при стандартній концентрації білка А. Отриманий кон’югат за 20 хв реакції зафарбовував субстрат до ОЩ 1,5, що свідчило про достатню ферментативну його активність для ІФА (рис. 2). Активність отриманого кон’югату порівнювали з активністю комерційного кон’югату імуноферментного на основі білка А, поміченого пероксидазою хрону, виробництва інституту Пастера, Санкт-Петербург.

Рис. 2. Ферментативна активність імунопероксидазних кон’югатів на основі

білка А Staphyloccocus aureus.

Титр кон’югату визначали шляхом послідовних розведень до кінцевої точки прояву кольорової реакції у системі виявлення антитіл до білків вірусу гепатиту В людини. Позитивну реакцію обліковували у лунках, вкритих сироватками людей, які мали антитіла проти вірусу гепатиту. Як негативні контролі використовували лунки, які містили сироватку крові людей, вільну від цих антитіл. Лунки, вкриті лише розчином молока, слугували для визначення фонового рівня реакції. Результати титрування наведені у таблиці 1.

Таблиця 1

Результати титрування імуноферментного кон’югату

Розведення кон’югату |

ОЩ+* |

ОЩ -** |

КК *** |

ОЩ+/ОЩ-

1:100 | 2,54±0,032 | 0,33±0,002 | 0,1±0,001 | 7,72±0,115

1:200 | 2,63±0,019 | 0,28±0,001 | 0,06±0,002 | 9,39±0,086

1:400 | 2,67±0,017 | 0,27±0,002 | 0,06±0,001 | 10

1:800 | 2,41±0,009 | 0,23±0,006 | 0,05±0,002 | 10,63±0,323

1:1600 | 1,64±0,022 | 0,183±0,002 | 0,05±0,002 | 8,87±0,117

1:3200 | 0,97±0,015 | 0,11±0,003 | 0,02±0,001 | 8,91±0,251

1:6400 | 0,44±0,006 | 0,05±0,001 | 0,023 | 8,29±0,199

1:12000 | 0,24±0,002 | 0,04±0,001 | 0,017 | 6,71±0,168

Примітки: *– ОЩ сироваток людей, які містять антитіла до білка Cor HBs.

**– ОЩ сироваток людей, вільних від антитіл проти вірусу гепатиту.

***–ОЩ лунок, вкритих розчином 5 %-го сухого молока.

Титр отриманого кон’югату становив 1:12000.

Робоче розведення кон’югату знаходили за допомогою непрямого варіанта ІФА для визначення антирабічних антитіл у сироватках вакцинованих кролів. Планшети сорбували стандартним розведенням вірусу сказу (10 мкг/см3), після чого вносили позитивні та негативні сироватки кролів у розведені 1:10. Послідовні розведення кон’югату розпочинали з 1:1000 і завершували розведенням 1:25000. Позитивну реакцію обліковували у лунках, вкритих зразками сироватки крові кролів, яка містила антирабічні антитіла (ОЩ+). Негативними контролями були лунки, вкриті сироваткою крові кролів, вільною від антитіл проти вірусу сказу (ОЩ -).

За робочий титр кон’югату брали те розведення, яке мало найбільше значення відношення ОЩ+/ОЩ- при відносно низькому сигналі негативних сироваток. У даному випадку це становило 1:2000. Співвідношення між інтенсивністю позитивного та негативного сигналу становило 28:1 (табл. 2).

Таблиця 2

Результати визначення робочого розведення досліджуваного та комерційного кон’югатів

Розведення кон’югату | Досліджуваний кон’югат | Комерційний кон’югат

ОЩ+ | ОЩ- | ОЩ+/ОЩ- | ОЩ+ | ОЩ- | ОЩ+/ОЩ-

1:1000 | 1,444

±0,008 | 0,145

±0,003 | 9,967

±0,175** | 1,647

±0,002 | 0,143

±0,002 | 11,520

±0,110

1:1500 | 0,972

±0,003 | 0,079

±0,003 | 12,379

±0,388** | 0,968

±0,002 | 0,060

±0,003 | 16,199

±0,720

1:2000 | 0,858

±0,006 | 0,031

±0,002 | 28,286

±1,966 | 0,901

±0,004 | 0,033

±0,002 | 27,523

±1,741

1:2500 | 0,652

±0,002 | 0,028

±0,002 | 23,550

±1,768 | 0,729

±0,003 | 0,031

±0,003 | 24,194

±2,189

1:3000 | 0,432

±0,002 | 0,026

±0,002 | 16,799

±1,228 | 0,458

±0,002 | 0,026

±0,001 | 17,951

±1,027

1:3500 | 0,434

±0,002 | 0,030

±0,003 | 14,865

±1,279 | 0,433

±0,002 | 0,030

±0,002 | 14,573

±0,964

**– р<0,01.

Це свідчить про високу авідність кон’югату до білків сироватки кролів та вказує на адекватність його використання як реагенту в умовах, які контролювалися. Досліджуваний кон’югат за специфічністю до білків сироватки крові кролів та активністю не поступався комерційному.

Визначення інтенсивності зв’язування імуноферментного кон’югату на основі білка А імуноглобулінами сироватки крові різних видів тварин перевіряли за допомогою прямого варіанта ІФА. Планшети сорбували сироваткою крові коней, великої рогатої худоби, свиней, лисиць, собак, бабака у розведені 1:10 на буфері 0,05 М Трис-НСl, рН 7,2–7,4. Тривалість сорбції становила 16 год при +4 оС. Після 4- кратного відмивання незв’язаних білків сироватки крові вносили кон’югат у розведені 1:2000 на розчині 5%-го сухого молока. Результати перевірки показали, що сигнали оптичної щільності у лунках із сорбованими сироватками крові коня, ВРХ та бабака (0,065±0,03, 0,087±0,01, 0,024±0,01 відповідно) вірогідно не відрізнялися від сигналу отриманого у лунках де був сорбований лише молочний розчин (р>0,05). У той же час сигнали ОЩ, отримані у лунках із сорбованими білками сироваток крові свиней, лисиць та собак становили 0,344±0,11, 0,220±0,18, 0,264±0,13 відповідно. Отримані результати свідчать про здатність досліджуваного кон’югату зв’язуватися імуноглобулінами сироватки крові тварин, що перевірялися.

Підбір твердого носія для постановки ІФА. Використовували планшети з полістиролу фірм-виробників:“Sarstedt”, “VEB MLW” Німеччина, “Nunc”Данія.

Порівняння адсорбуючих властивостей планшетів включало їх сенсибілізацію стандартним розведенням рабічного антигену (10 мкг/см3) та титрування в сенсибілізованих лунках специфічного до антигену кон’югату. Підбір планшетів проводили під час встановлення титру кон’югату на моделі виявлення антитіл до вірусу сказу. На підставі отриманих результатів, які наведені у таблиці 3, можна зробити висновок про те, що всі випробувані планшети можуть бути використані для приготування імуносорбенту тест-системи на основі ІФА для виявлення антитіл проти збудника сказу. Слід зазначити, що достовірної різниці адсорбуючих властивостей випробуваних планшетів встановити не вдалося (р>0,05).

Таблиця 3

Порівняння адсорбуючих властивостей планшетів

Розведення кон’югату | Оптична щільність при 492/620 нм у лунках планшетів:

“VEB MLW” | “Sarstedt” |

“Nunc”

ОЩ+ | ОЩ- | КК | ОЩ+ | ОЩ- | КК | ОЩ+ | ОЩ- | КК

1:100 | 2,54±

0,032 | 0,33±

0,002 | 0,1±

0,001 | 2,54±

0,03 | 0,4±

0,004 | 0,13±

0,002 | 2,61±

0,008 | 0,3±

0,003 | 0,17±

0,002

1:200 | 2,63±

0,019 | 0,28±

0,001 | 0,06±

0,002 | 2,58±

0,011 | 0,25±

0,001 | 0,09±

0,03 | 2,7±

0,005 | 0,25±

0,001 | 0,07±

0,003

1:6400 | 0,44±

0,006 | 0,05±

0,001 | 0,023 | 0,42±

0,003 | 0,06±

0,01 | 0,02±

0,001 | 0,5±

0,002 | 0,07±

0,002 | 0,02±

0,001

Примітки: ОЩ+– сироваток крові кролів, які містять антирабічні антитіла;

ОЩ- –сироваток крові кролів, вільних від антирабічних антитіл;

КК– ОЩ лунок, сорбованих молочним розчином.

Отримання рабічного концентрованого антигену. Підбір його оптимальної концентрації для сенсибілізації планшетів. Концентрований поліетиленіміном (у 50 разів) рабічний матеріал піддавали колонковій хроматографії на ДЕАЕ-toypearl. У найбільшій концентрації специфічний антиген виявився у пікових фракціях зібраних елюатів. Так, у фракціях КоКАВ концентрація специфічного білка сягала –1,4 мг/см3; у фракціях концентрованого культурального матеріалу (штам “Щелково-51 К”) – 1,5 мг/см3; у фракціях концентрованого культурального матеріалу (штам “Внуково-32”) – 0,8 мг/см3; у фракціях концентрованого мозкового матеріалу (штам “Щелково-51К”) –1,0 мг/см3. Пікові фракції перевіряли за допомогою електрофорезу (12 % ПААГ). Найбільш чистими виявилися концентрований культуральний матеріал (штам “Щелково-51 К”) та частково очищені фракції КоКАВ.

Визначення сенсибілізуючої дози отриманих антигенів проводили непрямим варіантом ІФА. Пікові фракції очищених антигенів сорбували у лунках полістиролового планшету в діапазоні концентрацій від 0,1 до 100 мкг/см3. Використовували антирабічні (позитивні) та вільні від таких антитіл (негативні) сироватки крові кролів. За стандарт приймали очищені фракції КоКАВ (табл. 4).

Таблиця 4

Результати визначення оптимальної концентрації антигену для сенсибілізації планшета “VEB MLW”

Концентрація антигену, мкг/см3 | Антиген 1 | Антиген 2 | Антиген 3 | Антиген 4

ОЩ+ | ОЩ- | ОЩ+ | ОЩ- | ОЩ+ | ОЩ- | ОЩ+ | ОЩ-

0,1 | 0,106±

0,003** | 0,059±

0,002** | 0,072±

0,003** | 0,090±

0,003** | 0,097±

0,001** | 0,127±

0,002** | 0,136±

0,003 | 0,201±

0,003

0,2 | 0,148±

0,002** | 0,126±

0,003* | 0,196±

0,003** | 0,122±

0,002 | 0,237±

0,012** | 0,085±

0,002** | 0,760±

0,031 | 0,103±

0,004

1 | 0,159±

0,002** | 0,053±

0,004** | 0,739±

0,003** | 0,153±

0,001** | 0,716±

0,002** | 0,149±

0,003** | 0,321±

0,003 | 0,149±

0,003

2,5 | 0,243±

0,003** | 0,068±

0,003** | 0,979±

0,004** | 0,196±

0,002** | 1,413±

0,007** | 0,181±0,004** | 0,656±

0,002 | 0,276±

0,003

10 | 0,180±

0,003** | 0,073±

0,002** | 1,500±

0,040** | 0,197±

0,002** | 2,483±

0,018** | 0,217±0,004** | 0,916±

0,003 | 0,110±

0,006

100 | 0,406±

0,006** | 0,303±

0,002** | 0,824±

0,003** | 0,336±

0,003** | 3,244±

0,089** | 0,327±0,002 | 1,305±

0,009 | 0,325±

0,013

Примітки:

ОЩ+– антирабічна сироватка кроля у розведені 1:40;

ОЩ-– негативна сироватка кроля у розведені 1:10;

Антиген 1 – концентрований антиген з мозкової тканини вівці, штам “Щелково-51К”;

Антиген 2 – концентрований антиген з культуральної рідини, штам “Внуково-32”;

Антиген 3 – концентрований антиген з культуральної рідини, штам “Щелково-51К”;

Антиген 4 – очищені фракції КоКАВ.

Найбільш придатним для використання в ІФА виявився рабічний антиген з культуральної рідини (штам “Щелково-51 К”) у концентрації специфічного білка 10 мкг/см3 (максимальне значення відношення ОЩ+/ОЩ- становило 11,44). Зниження концентрації антигену (2,5 мкг/см3) призводило до неспецифічної адгезії кон’югату, підвищення (100 мкг/см3) – до неспецифічного зв’язування кон’югату з іммобілізованим білком, що викликало підвищення фонового рівня реакції.

Вплив температури та тривалості інкубації на адсорбцію рабічного антигену на твердому носії (полістиролових планшетах). Інтенсивність сорбції рабічного антигену на планшетах вивчали в залежності від температури (4 – 37 оС) та тривалості інкубації (1 – 16 год). Концентрація антигену була однаковою та становила 10 мкг/см3 (табл. 5).

Наведені у таблиці 5 дані свідчать, що температура та тривалість інкубації впливають на інтенсивність сорбції рабічного антигену на твердому носії. Найбільш виразна адсорбція спостерігається протягом 16 год. при +4 оС і + 28 оС та протягом 3-х год інкубації при +32 оС і +37 оС.

Таблиця 5

Вплив температури та тривалості інкубації антигену на рівень виявлення (титр) антирабічних антитіл у сироватці крові.

Температура інкубації антигену, 0С | Тривалість інкубації антигену, год | Титр сироватки в ІФА (log2 розведення) | ОЩ+/ОЩ-

+4 | 1 | 1:160 (7,07±0,25**) | 3,1±0,53

3 | 1:640 (9,07±0,25**) | 2,4±0,25

16 | 1:1280 (10,32) | 2,45±0,31

+28 | 1 | 1:160 (7,57±0,25**) | 2,35±0,12

3 | 1:320 (8,32) | 2,92±0,59

16 | 1:1280 (10,07±0,25) | 3,06±0,63

+32 | 1 | 1:640 (9,32**) | 2,68±0,42

3 | 1:1280 (10,07±0,25) | 2,47±0,35

16 | 1:640 (9,07±0,25**) | 2,84±0,65

+37 | 1 | 1:640 (9,32**) | 3,83±0,59

3 | 1:1280 (10,57±0,25) | 2,82±0,46

16 | 1:640 (9,57±0,25*) | 2,428±0,28

Примітки: *р<0,05, **р<0,01.

Враховуючи інтенсивність адсорбції та зручність виконання цього етапу постановки реакції, ми надали перевагу адсорбції антигену при +4 оС протягом 16 год.

Визначення оптимальної тривалості інкубації сироватки на планшеті, сенсибілізованому рабічним антигеном. У сенсибілізовані антигеном (10 мкг/см3 специфічного білка) лунки планшета вносили сироватки крові вакцинованих кролів з різною кількістю антирабічних антитіл, у розведеннях 1:10 – 1:200000. Тривалість інкубування при +37 оС варіювала від 30 хв до 2 год (табл. 6).

Таким чином, у найбільш високому титрі антитіла, специфічні щодо вірусу сказу, виявляються після інкубації досліджених сироваток протягом однієї години при + 37 оС. Цей режим і був відібраний нами в процесі конструювання тест-системи.

Таблиця 6

Рівні виявлення антитіл проти вірусу сказу в залежності від часу взаємодії адсорбованого антигену з антитілами досліджуваних зразків сироватки крові кролів

Тривалість інкубації сироваток при +370С, год | Титр антитіл в ІФА (log2 розведення)

Сироватка* | ОЩ+/ОЩ- | Сироватка** | ОЩ+/ОЩ-

0,5 | 1:20(4,07±0,25) | 2,46±0,12 | 1:102400 (16,39±0,25) | 2,33±0,18

1 | 1:40(5,07±0,25) | 2,9±0,5 | 1: 204800(17,39±0,25) | 2,59±0,14

1,5 | 1:40 (5,32) | 2,15±0,43 | 1: 204800 | 2,5±0,21

2,0 | 1:20 (4,32) | 2,94±0,16 | 1: 204800 | 2,32±0,22

Примітки:

*– сироватка крові, яка містить 3,77±0,1 lоg2 ЕД50 специфічних антирабічних антитіл;

**– сироватка крові, яка містить 10,39±0,7 lоg2 ЕД50 специфічних антирабічних антитіл.

Результати розробки непрямого варіанта ІФА для визначення антитіл проти вірусу сказу. Як компоненти тест-системи були взяті специфічна антирабічна сироватка крові кроля, очищений та концентрований рабічний антиген на базі штаму “Щелково-51 К” вірусу сказу, імуноферментний кон’югат на основі рекомбінантного білка А Staphylococcus aureus. Обґрунтування методик отримання компонентів тест-системи базується на основі власних досліджень, викладено вище.

Імуноферментний аналіз проводили на мікротитраційних полістиролових планшетах фірм “Sarstedt”, “VEB MLW” Німеччина, “Nunc” Данія. На першому етапі рабічний антиген (10 мкг/см3) в 0,01 М карбонатно-бікарбонатному буфері, рН 9,6, сорбували в лунках планшета протягом 16 год при +4 0С. Неадсорбований антиген видаляли шляхом триразового відмивання розчином 0,01М фосфатно-сольового буфера, рН 7,2–7,4, з 0,05 % Tween-20 (щоразу залишаючи розчин для відмивання на 1–2 хв). Після відмивання позбавлялися вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу. Потім вносили у лунки розчин 5 %-го сухого молока і витримували 30 хв при кімнатній температурі (18–20 0С) після чого здійснювали 4-разове відмивання та позбавлялися зайвої вологи.

На другому етапі вносили референс-сироватку і досліджувані сироватки крові у розведеннях, починаючи з 1/10 і закінчуючи 1/1280, та вільну від антирабічних антитіл (негативний контроль) сироватку у розведені 1/10. Сироватки розводили на 5 %- му розчині сухого молока. Кожне розведення дублювали у 2 лунках. Інкубували протягом 1 год при +37 0С. Вміст лунок видаляли, планшети 6 разів відмивали та позбавлялися зайвої вологи.

На третьому етапі в лунки планшет вносили пероксидазний кон’югат у робочому розведені на 5 %- му розчині сухого молока та витримували протягом 40 хв при +37 0С. Вміст лунок видаляли, планшети відмивали 6 разів та позбавлялися зайвої вологи.

Для візуалізації реакції вносили субстратну суміш (0,04 % орто-фенілендиаміну на фосфатно-цитратному буфері, рН 5,2, з 0,04 % Н2О2). Інкубували 20 хв без доступу світла при кімнатній температурі. Кольорову реакцію зупиняли додаючи по 50 мкл/лунку 2 М Н2SО4.

Оцінку результатів проводили за допомогою спектрофотометра при довжині хвиль світла 492 нм відносно 620 нм. Постановку ІФА вважали коректною в разі, коли середнє значення ОЩ у лунках з негативним контролем (КЇ ) було не вище 0,15; середнє значення ОЩ у лунках з позитивним контролем (К+) у розведенні 1/10 не нижче 0,4; середнє значення ОЩ у лунках з кон’югатом (КК) не вище 0,1. Результати тестування вважалися позитивними, якщо значення ОЩ досліджуваного зразка було більше значення ОЩ КЇ +0,1. Всі інші результати вважали негативними. Для визначення активності досліджуваних сироваток в Міжнародних одиницях (МО) (показник імунності), будували калібрувальний графік референс-сироватки, на якому по осі ордината відкладали ОЩ референс-сироватки та досліджуваних сироваток, а по осі абсциса – розведення референс-сироватки, які відповідали певним одиницям внутрішнього стандарту. Сироватки крові тварин з активністю нижче 0,5 МО/см3 вважалися не імунними (МЕБ, 2002).

За допомогою розробленої тест-системи на основі ІФА було досліджено 117 зразків сироваток крові від 38 кролів, імунізованих проти сказу (штами “Внуково-32”, “СVS”), 85 зразків сироваток крові собак, імунізованих різними вакцинами та однієї підозрілої на сказ собаки, а також зразки сироваток від 60 лисиць, 10 зразків сироваток від свиней, одна сироватка від бабака, 13 зразків сироваток людей, які отримали антирабічну допомогу.

Визначення рівня антитіл в ІФА порівнювали з активністю та титром віруснейтралізуючих антитіл, визначених за допомогою реакції нейтралізації (РН) на білих мишах. Крім виявлення антирабічних антитіл і визначення їх титру, визначали також активність зразків сироваток у МО за допомогою стандартної сироватки.

При аналізі результатів титрування зразків сироваток вакцинованих кролів у РН та у ІФА, ми констатували, що при порівнянні чутливості РН на білих мишах з чутливістю розробленого варіанта ІФА, останній не лише не поступається за чутливістю реакції нейтралізації, а й значно її перевищує (до 260 разів). Хоча при зростанні показників титру антитіл у ІФА підвищувались і показники титру відповідних антитіл у РН на білих мишах, прямолінійної кореляції між ними ми не встановили (r=0,84). На нашу думку, це відбувається за рахунок визначення не лише віруснейтралізуючих антитіл, як це відбувається у РН, а й антитіл з іншою характеристикою, кількість яких у різних сироватках коливається.

Аналіз кривих титрування сироваток, які містять різну кількість специфічних антитіл, дозволяє лише констатувати той факт, що досліджувані сироватки вірогідно відрізняються (або ні) від контрольної (негативної) сироватки і містять антирабічні антитіла. Але відповісти на питання, чи дійсно кожна з досліджуваних сироваток містить антитіла захисного рівня, особливо, коли титр антитіл невисокий, неможливо. До того ж, побудова повної кривої титрування для кожної досліджуваної сироватки є трудомісткою процедурою, яка потребує значних витрат реагентів. У зв’язку з цим пропонується аналізувати дослідні сироватки в одному розведенні. Це, в свою чергу, дозволяє однозначно трактувати результати аналізу та, у методичному відношенні, значно простіше. Для цього у систему нами введено калібрувальну криву, яка відображає концентрацію антитіл в одиницях, еквівалентних відповідно до значень розведень позитивної контрольної сироватки (рис. 3).

Рис. 3. Калібрувальна крива визначення активності антирабічних антитіл у МО/см3 (щоразу будується власна калібрувальна крива).

Підібрані раніше розведення позитивної контрольної сироватки дозволяють за інтенсивністю сигналу зразка у розведенні 1:10 визначати активність антирабічних антитіл у сироватках вакцинованих тварин у МО/см3 лише в одному розведенні. Це дозволяє збільшити кількість зразків сироваток, які можна дослідити на одному планшеті до 80.

При дослідженні за допомогою розробленої тест-системи зразків сироваток крові лисиць, специфічні щодо вірусу сказу антитіла виявляли лише у 36 % від загальної кількості обстежених тварин. Сигнали оптичної щільності значної кількості досліджених проб сироватки були нижче рівня негативної контрольної сироватки або знаходилися у “сірій зоні”. Лише у незначної частини (?12 %) досліджених сироваток антирабічні антитіла коливались у діапазоні 0,25–0,5 МО/см3 (рис. 4).

Під час аналізу залежності титру сироваток крові собак, лисиць та людей у ІФА і їх активності у МО було відмічено, що в достатньо широкому діапазоні концентрацій в подвійних логарифмічних координатах спостерігається лінійна залежність (пряма кореляція) сигналу (у МО/см3) від оптичної щільності (ОЩ) (r=0,89) (рис. 5). При цьому активність сироваток з титром в ІФА 1:10–1:30 була нижча за 0,5 МО/см3.

Рис. 4. Результати визначення антирабічних антитіл у сироватках крові лисиць за допомогою розробленої тест-системи.

Рис. 5. Кореляція результатів кількісного титрування антирабічних антитіл і значень МО/см3 антирабічних сироваток.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації теоретично та експериментально обґрунтовано розробку специфічної та чутливої тест-системи на основі непрямого варіанта імуноферментного аналізу для визначення антитіл проти вірусу сказу у сироватках крові тварин, яка дозволяє визначати рівень гуморального імунітету у тварин та здійснювати, у комплексі з іншими заходами, контроль рабічної інфекції.

2. Розроблено методику концентрування та очищення рабічного антигену (штам "Щелково-51 К") на основі застосування поліетиленіміну, що дозволило отримати імуносорбент - компонент тест-ситеми для виявлення антирабічних антитіл.

3. Підібрано клітинну культуру ВНК-21/17 та визначено умови культивування, які забезпечують урожайність штаму “Щелково-51 К” вірусу сказу у титрі не нижче 5,8 – 6,0 lg ЛД50/0,03 см3; інфекційний титр вірусу в процесі пасажування поступово зростав (до 3-го пасажу) і до 5-го пасажу був на рівні 5,8 – 6,5 lg ЛД50/см3.

4. Розроблено методику отримання високоактивних і специфічних антирабічних сироваток на кролях. П’ятикратне введення антирабічної вакцини КоКАВ (на 1-, 3-, 7-, 14- та 30-у добу) з ад’ювантом ISA-25 (на 1- та 14-у добу) забезпечує синтез антитіл проти вірусу сказу на рівні 10,39±0,7 lоg2 ЕД50.(210 МО/см3).

5. Встановлено високу імуностимулюючу активність та мінімальну реактогенність для кролів ад’юванту ISA-25. Застосування ад’юванту у дозі 25 % від об’єму введеного рабічного білка сприяє підвищенню титру антитіл проти вірусу сказу у сироватках крові кролів на 2–3 log2; ад’ювант не впливає на фізіологічні, гематологічні та біохімічні показники у гіперімунізованих тварин, не викликає будь-яких помітних реакцій та утворень у місці його введення.

6. Відпрацьовано параметри постановки непрямого варіанта твердофазного ІФА в процесі виявлення антитіл проти вірусу сказу у сироватках крові тварин. Як імуносорбент найбільш оптимальним виявився концентрований рабічний антиген (концентрація специфічного білка становить 10 мкг/см3), отриманий з матеріалів клітинної культури ВНК 21/17, інфікованої штамом “Щелково-51 К” вірусу сказу; найбільш повна адсорбція антигену на полістиролових планшетах відбувається при +4 оС протягом 16 год; оптимальний термін інкубації сироваток з сорбованим рабічним антигеном становить 60 хв при + 37 оС; найбільш чіткі результати постановки непрямого варіанта ІФА в процесі виявлення антитіл проти вірусу сказу тварин мають місце при використанні поміченого пероксидазою хрону кон’югату на основі білку А Staphyloccocus aureus у робочому розведенні 1:2000.

7. Розроблена тест-система на основі імуноферментного аналізу для визначення антитіл проти вірусу сказу у сироватках крові тварин, яка за специфічністю не поступається реакції нетралізації на білих мишах, а за чутливістю значно перевищує її (до 260 раз); розроблена НТД на виготовлення та настанова із застосування тест-системи діагностичної імуноферментної “ІФА-RABIES AB” для виявлення антитіл проти вірусу сказу у сироватці крові тварин.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

З метою вирішення проблеми сказу на території України:

- налагодити постійний контроль за циркуляцією вірусу сказу серед популяцій чутливих тварин та здійснювати у неблагополучних щодо сказу регіонах вакцинацію диких і свійських тварин;

- забезпечити контроль рівня імунітету до сказу у популяціях диких тварин, які визначені резервуаром збудника у конкретному регіоні, та, в разі, коли показники активності сироваток крові нижче 0,5 МО/см3 здійснювати ревакцинацію антирабічними вакцинами.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Новіцька О.В., Івасюнько Н.П. Удосконалення культивування