української академії аграрних наук

ОРЕЛ Леонід Васильович

УДК 581.5:615.53:632.51:632.937

алелопатично активні сполуки бур'янІв

ТА наукові принципи розробки

фіторегуляторів

Спеціальність:03.00.16 – екологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

Київ - 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Селекційно-генетичному інституті УААН і ІТІ "Біотехніка" УААН.

Науковий консультант: | доктор біологічних наук, професор

Головко Ераст Анатолійович, завідувач відділу алелопатії Національного ботанічного саду імені М.М.Гришка НАН України | Офіційні опоненти:

доктор сільськогосподарських наук, професор

Бублик Людмила Іванівна, Інститут захисту рослин УААН, завідувач лабораторії аналітичної хімії пестицидів | доктор сільськогосподарських наук

Рахметов Джамал Бахлул Огли Національний ботанічний сад ім. М.М.Гришка НАН України, завідувач відділу нових культур | доктор біологічних наук

Швартау Віктор Валентинович, Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, старший науковий співробітник відділу фізіології дії гербіцидів

Провідна установа: | Уманський державний аграрний університет Міністерства аграрної політики |

Захист відбудеться "24" травня 2004 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.371.01 при Інституті агроекології та біотехнології УААН за адресою: 03143 м. Київ, вул. Метрологічна, 12

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Інституту агроекології та біотехнології УААН України за адресою: : 03143 м. Київ, вул. Метрологічна, 12.

Автореферат розісланий "20"квітня 2004 р.

В.о. Вченого секретаря

Спеціалізованої вченої ради, доктор сільськогосподарських наук | Тарасюк С.І. |

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В сучасному землеробстві України широко використовуються хімічні засоби захисту рослин, зокрема гербіциди, які призводять до змін екологічних умов, порушення консортивних відносин в біоценозах тощо. Потрапляючи в навколишнє середовище хімічні ксенобіотики по харчових ланцюгах накопичуються у біоті у значних концентраціях. Навіть якщо у воді, повітрі або грунті вони знаходяться у допустимих межах, то в живих організмах можуть нагромаджуватися у великих кількостях (А.В.Яблоков, 1988, М.І.Луньов, 1992, М.Фешбах, А.Френдлі, 1992).

Така екологічна ситуація вимагає розробки наукової теорії, яка б розкрила можливості опрацювання безпечних для довкілля засобів контролю чисельності бур'янів в посівах сільськогосподарських культур. Одним із шляхів створення таких екологічно безпечних засобів є використання алелопатично активних сполук вищих рослин.

Відомо, що рослини і мікроорганізми продукують велику кількість вторинних продуктів, багато з яких мають високу біологічну активність, володіють гербіцидною дією. Такі речовини можна використовувати як фітогербіциди. Вони також можуть служити моделлю для синтезу нових безпечних для довкілля препаратів (А.М.Гродзінський, 1965, 1973; Е.Райс, 1978; F.Macias, 2002; С.Bertin, 2002; Y.Fujii, 2002). Цим зумовлена актуальність проведених досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Наукові дослідження здійснювались за Державною науково-технічною програмою “Охорона навколишнього природного середовища” і проектом “Пошук і вивчення екологічно чистих біологічно активних речовин рослинного походження для боротьби з бур’янами” (реєстр. номер. 02.01.02/013-92). Тематика досліджень була складовою частиною планів науково-дослідних робіт Селекційно-генетичного інституту УААН (1987-1996 рр.) та ІТІ "Біотехніка" УААН (1996-2003 рр.).

Мета дослідження – теоретичний і експериментальний аналіз алелопатично активних сполук вищих рослин та обгрунтування можливості створення на їх основі фіторегуляторів з гербіцидною дією.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

1. На підставі вивчення алелопатичних взаємовідносин між рослинами в агрофітоценозах виявити рослини-донори природних сполук з гербіцидною дією.

2. Дослідити хімічний склад рослин-донорів для встановлення речовин, які відповідають за рістінгібуючу активність.

3. Розробити технологію отримання із рослин-донорів, зібраних в природних умовах, ефективних фіторегуляторів для захисту від бур'янів.

4. Розробити біотехнологію одержання калусної маси рослин-донорів методом культури тканин, як сировинного джерела для виробництва фіторегуляторів та опрацювати технологію їх використання.

5. Показати можливість отримання препарату з гербіцидною дією на основі синтетично відтвореної природної речовини.

Об'єкт досліджень – алелопатично активні види рослин і фіторегулятори з гербіцидною дією.

Предмет досліджень – алелопатична взаємодія між рослинами в агрофітоценозах, як теоретична основа для виявлення рослин-донорів речовин з рістінгібучими властивостями та шляхи розробки на їх основі фіторегуляторів для контролю чисельності бур'янів.

Методи досліджень – системний підхід до вивчення алелопатичної активності рослин за допомогою біотехнологічних, біохімічних та фізіологічних методів. Рослини вирощували в лабораторних і польових умовах за загальноприйнятими методиками.

Наукова новизна одержаних результатів:

·

·

·

·

·

·

·

Практичне значення одержаних результатів:

·

·

·

·

·

Особистий внесок здобувача. Дисертант сформував напрямок досліджень, розробив програму науково-дослідних робіт, проаналізував та інтерпретував експериментальний матеріал, зробив відповідні висновки. Особисто проводив польові та більшу частину лабораторних досліджень. В дисертації використані роботи, написані в співавторстві, в яких частка особистої участі складає 60-90%. Досліди по використанню культури тканин проводилися за участю к.б.н. Махновської М.Л., цитологічні дослідження – к.б.н. Сечняка О.Л. (Селекційно-генетичний інститут УААН), дослідження хімічного складу рослин-донорів – к.х.н. Колесника О.А. (Одеська національна академія харчових технологій), професорів В.Олешика і С.Бурди (Інститут добрив і грунтознавства, м.Пулави, Польща), токсикологічних досліджень – д. мед.н. Присяжнюка В.Е. (Український науковий гігієнічний центр), к.б.н. Жмінька П.Г. (Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І.Медведя), к.б.н. Карпюка Ю.М. (Селекційно-генетичний інститут УААН), що відображено у спільних публікаціях.

Автор висловлює сердечну подяку усім науковим співробітникам і лаборантам, які приймали участь в проведенні дослідів та за цінні поради і участь в обговоренні результатів досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались на засіданнях вчених рад Селекційно-генетичного інституту та ІТІ "Біотехніка" УААН, подавались у наукових звітах в координаційні центри та були оприлюднені в доповідях на наукових конференціях: "Онтогенетика вищих рослин" (17-18 жовтня 1989 р.), Кишинів; "Проблеми технологій виробництва пшениці, соняшника і польської квасолі" (20-22 червня 1990 р.), інститут пшениці, соняшника "Добруджа" (Болгарія); ІІ з'їзді Українського товариства фізіологів рослин (Київ, 1993 р.); International Symp. "Allelopathy in Sustainable Agriculture Forestry and Environment". University, Hisar, India, 1994; "Виробництво і застосування біологічних засобів захисту рослин від шкідників і хвороб, Одеса, 1994 р.; "Біоконверсія органічних відходів і захист навколишнього середовища", Київ, 1994 р.; "Szata roslinna Polski w procesie przemian", 26.06.-01.07.1995, Krakow, 1995; "Teoretychzne i practyczne aspekty allelopatii; 11-12 pazdziernika, Pulavy; juny, 1996.

Публікації. Результати роботи опубліковані в двох монографіях та у навчальному посібнику, 22 статтях у наукових журналах і збірниках, п'яти патентах на винаходи, 13 тезах.

Структура та обсяг роботи. Дисертація у вигляді рукопису складається із вступу, семи розділів, висновків, списку використаних джерел, який включає 371 назву, в тому числі 112 іноземних авторів та чотирьох додатків.

Зміст дисертації викладено на 268 сторінках машинописного тексту, включає 95 таблиць, 30 рисунків.

Зміст роботи

Огляд літератури

Цей розділ складається з восьми підрозділів, у яких наведено дані про хімічну взаємодію рослин в фітоценозах, перспективи застосування хімічного і біологічного методів для захисту від бур'янів, вплив виділень бур'янів на культурні рослини, взаємодію культурних рослин в агрофітоценозах, фітотоксичну дію пожнивних рештків в сівозмінах та молекулярно-генетичні механізми регуляції росту рослин. На підставі аналізу літературних джерел обгрунтовано необхідність і актуальність проведення досліджень по темі дисертації.

УМОВИ ПРОВЕДЕННЯ І МЕТОДИКИ ЗАПРОВАДЖЕННИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Грунтово-кліматичні умови проведення дослідів. Експериментальна частина роботи виконана протягом 1987-2003 рр.

Польові досліди проводились на полях елітно-насінницького дослідного господарства Селекційно-генетичного інституту "Дачна", Біляївського району і КСП ім. Щорса Березівського району Одеської області.

Грунт дослідної ділянки господарства "Дачна" – чорнозем південний. Вміст гумусу в орному шарі 4,3%. За структурним складом грунт характеризується різноманітністю орного горизонту, особливо його верхнього шару. Сума поглинутих основ в орному шарі складає 41,3-43,8 мг/100 г грунту, з них на катіони магнію приходиться 10-12, на катіони кальцію – 30-32 мг/100 г. Реакція водної витяжки слаболужна (рH 7,2). Кількість легкодоступних поживних речовин в орному шарі складає: легкогідролізуючого азоту (за Тюріним-Кононовою) – 3-4, доступного рослинам фосфору (за Чириковим) – 10-15, обмінного калію (за Чириковим) – 15 мг/100 г грунту. Грунт дослідного поля КСП ім. Щорса представлений чорноземом звичайним малогумусним, легкоглинистим. Вміст гумусу – 4%, рH водної витяжки – 7,0. Вміст азоту 1-1,5; фосфору - 4-5; обмінного калію – 2-4 мг/100 г грунту. Характеристика грунту в польових дослідах свідчить про типовість умов їх проведення.

Клімат району формується, в основному, під впливом атлантичних і середземноморських повітряних мас, що робить його помірно теплим і посушливим. Середньорічна температура повітря складає +10,3С. Посушливість клімату зумовлена не тільки недостатньою кількістю опадів (403 мм в середньому за рік), але і нерівномірним їх розподілом на протязі року. Середньорічна відносна вологість повітря достатньо висока і становить за рік 74%, яка часто в літній час понижується до 50-40%, а в окремі дні - до 30% і нижче.

Таким чином, клімат південно-західної частини степової зони України хоч і посушливий (гідротермічний коефіцієнт - 0,65-0,80), але для вирощування озимих культур він більш сприятливий, ніж для ярих. Гідротермічні ресурси в роки досліджень характеризувались великою різноманітністю. Особливо посушливими були періоди вегетації 1989, 1991, 1992, 1993, 1996 років, коли випало 268,4-358,9 мм опадів.

В цілому за період досліджень метеорологічні умови були типовими для зони.

Методи лабораторних та польових досліджень. Роботу розпочато нами з вивчення в лабораторних умовах дії водних витяжок із повітряно-сухої фітомаси органів рослин бур'янів на проростання насіння інших видів бур'янів і культурних рослин.

Видовий склад вищих рослин в сегетальних агроекосистемах уточнено за літературними матеріалами (Бур’яни України, 1970; Определитель высших растений Украины, 1987; Флора европейской части СССР, 1974-2002) та власними спостереженнями відповідно до монотипного стандарту і вимог Міжнародного кодексу ботанічної номенклатури (Международный кодекс, 1996).

Бур'яни збирали в фазу цвітіння. Кореневу систему рослин брали з глибини 0-20 см. Зібрані рослини висушували в затінку до повітряно-сухого стану. Потім кожний орган рослин окремо подрібнювали і настоювали у воді протягом 24 годин при +18…+20 С у темряві. Співвідношення між рослинним матеріалом і водою варюювало від 1:10 до 1:500.

Видами бур’янів, які використовувалися для тестування були: щириця звичайна (Amaranthus retroflexus L.), грицики звичайні (Capsella bursa-pastoris (L.) Medik), талабан польовий (Thlaspi arvense L.), кучерявець Софії (Descurainia sophia (L.) Webb ex Prantl) та інші. Із культурних рослин тест-видами були озима м'яка пшениця (Triticum aestivum L.) та озима тверда пшениця (Tr. durum Desf.), кукурудза (Zea mays L.), озимий і ярий ячмінь (Hordeum sativum Lessin.). Субстратом для пророщування насіння тест-видів були грунт і відповідно до поставлених завдань – фільтрувальний папір. Повторність дослідів три-восьмикратна. У дослідних варіантах використовували екстракти відповідних органів рослин певної концентрації, у контрольних лише воду. Пророщування проводили при +18…+20С. Підрахунок сходів у варіантах з культурними рослинами проводили через 7-10 діб, з бур'янами - через 10-20 діб.

Екстракти досліджених видів рослин забезпечували інгібування схожості насіння бур'янів у грунті на рівні 63,7-96,2%. З видами, які найбільш інгібували схожість насіння, продовжували роботу. Вивчено 11843 варіанти лабораторних дослідів із залученням екстрактів окремих видів рослин, а також 8792 варіанти з використанням сумішей екстрактів із різних видів.

Польові дослідження бур’янів і препаратів проводили згідно "Методических указаний по полевому испытанию гербицидов в растениеводстве". – ВИЗР.- М.: 1981. – 46 с, а також робіт (Марков М.В., Куликова Н.М., 1964; Туликов А.М., 1974; Доспехов Б.А., 1985).

Польові досліди в посівах озимої пшениці проводили на ділянках з обліковою площею 20 м2, повторність – п'ятикратна. Сівбу проводили сівалкою СН-16 з нормою висіву 5 млн. схожих зерен на 1га. Попередником була озима пшениця. Фіторегулятори в інгібуючій нормі (950 г/га) вносили за день до початку сівби пшениці, в стимулюючій – (300 г/га) за 10 днів до сівби. Безпосередньо перед сівбою проводився механічний обробіток грунту. На контрольних ділянках препарати не вносились. Контрольними були також ділянки, на яких весною, в фазу кущіння пшениці проводили обробку гербіцидом 2,4Д (амінна сіль) - 1,5 кг/га. Підрахунок сходів бур'янів проводили на фіксованих площадках розміром 0,25 м2 в чотирьох повторностях перед вступом пшениці у зиму, в кінці фази кущіння і в фазу молочно-воскової стиглості зерна.

В дослідах з кукурудзою (гібрид ОдМа 310) облікова площа ділянок була 25 м2, повторність – чотирикратна. Густота стеблестою – 30 тис. рослин на 1 га. Попередник – озима пшениця. Препарати вносили за день до початку сівби кукурудзи, а гербіциди - перед самою сівбою. Підрахунки бур'янів проводили на фіксованих площадках розміром 0,5 м2 в чотирьох повторностях у фазу трьох листків і фазу викидання волоті кукурудзи. Виробниче випробування проводили на ділянках площею 5 га, повторність – трикратна. Густота стеблестою 30 тис. рослин на 1 га. Для підрахунку рослин бур’янів рамку (0,5 м2) накладали по діагоналі ділянок в двадцяти точках.

Насіння бур'янів висівали весною по 1000 шт. кожного виду окремо на ділянках 1 м2 (4 рядки з міжряддями 20 см) на глибину 2 см. Повторність – чотирикратна. Схожість визначали через 10-20 діб.

Дію фітобафуму на різних типах грунтів досліджували в лабораторних умовах. Зразки грунтів відбирались з шару 0-15 см. В стандартні миски з зволоженими зразками грунтів висівалось насіння бур’янів (по 300 шт.) і культурних рослин (по 100 штук в одну миску). В дослідних варіантах вносили фітобафум, в контрольних - воду у відповідній кількості. Повторність досліду - чотирикратна.

Досліди по вивченню характеру впливу фітобацину на ріст рослин зернових культур проводились в лабораторних умовах з використанням озимої м'якої пшениці (Альбатрос одеський), озимої твердої пшениці (Гордеіформе 915/89, Леукурум 1586/88), озимого ячменю (Росава) і ярого ячменю (Одеський 115). Насіння пророщували в паперових пакетах, які поміщались в водний розчин фітобацину (концентрація оптимальна для застосування в польових умовах) при температурі +18…+22С і освітленні 1500 лк/м2. Контрольні пакети поміщались в водопровідну воду. Тривалість досліду 10 діб. Повторність - чотирикратна. В кінці досліду вимірювали довжину першого листочка і корінця.

Токсикологічні дослідження фіторегуляторів проводили в віварії СГІ використовуючи зерно з дослідних посівів кукурудзи (ОдМа 310) і озимої м'якої пшениці (Альбатрос одеський). Кормову цінність зерна вивчали на лабораторних тваринах (білих щурах) лінії Вістор за загальноприйнятими методиками.

Токсикологічні дослідження препарату цирзеїн проводили в Українському науковому гігієнічному центрі, препарату алметид в Інституті екогігієни і токсикології ім. Л.І.Медведя (м. Київ).

З метою розробки біотехнології виробництва фіторегуляторів з калусної маси та поживних середовищ вивчалась можливість використання методу культури тканин із застосуванням поживного середовища Мурасіге-Скуга.

Методи хімічних досліджень. А. Дослідження ліпідних сполук. Як об'єкт досліджень ліпідного складу використовувались надземні частини рослин осоту рожевого і суріпиці звичайної в повітряно-сухому стані. Матеріал попередньо подрібнювали на лабораторному гомогенізаторі і екстрагували з метою виділення суми вільних і зв'язаних ліпідів з використанням методики (E.I.Bligh, W.J.Dyer, 1959),основу якої складає екстракція сумішшю хлороформ-метанол. Точність визначення – 3%.

Розподіл ліпідів на класи здійснювали за допомогою колоночної хроматографії на силікагелі. Тонкошарову хроматографію використовували для визначення групового складу ліпідів. Кількісне визначення гомогенних груп ліпідів проводили за допомогою методики, яка включає їх елюювання з пластин розчинником і окислення маси ліпідів біхроматним реагентом з наступним спектрофотометричним визначенням (А.В.Богатський і інші, 1980). Дослідження жирнокислотного складу ліпідів здійснювали методом газорідинної хроматографії.

Б. Дослідження поліфенольних сполук. Загальна схема виділення і очистки фенольних сполук наведена на рис. 1. Виділення фенольних сполук із повітряно-сухого рослинного матеріалу (осоту і суріпиці) проводили за допомогою колонки 300х3,9 мм з ліхросорбом RP-18 фірми Merck, яку використовували в режимі градієнтного елюювання (D.Starck et al, 1980). Елюати груп поліфенольних речовин збирали з використанням автоматичного колектора фракцій.

Зібрані в ході попереднього розподілу фракції концентрувались на ротаційному випаровувачі і знову наносились на колонку з ліхросорбом RP-18 і піддавались ВЕРХ-розподілу з використанням елюотропних сумішей (ацетатний буфер (рН 3,0) – ацетонітрил (H.Colin et al, 1989). У випадку фенольних сполук суріпиці більш придатною виявилась елюотропна суміш вода-діоксан, рекомендована в роботі H.Colin et al (1989).

Результати розподілу кожної із фракцій двохкоординатним самописцем реєструвались в вигляді хроматограм. Після фракціювання фенольних сполук рослинних екстрактів методом ВЕРХ було проведено тонкошаровохроматографічний розподіл вищезазначених фракцій з наступним тестуванням інгібуючої активності фенольних сполук (S.Burda et al, 1995). Одержані дані документували з використанням комп'ютерної графіки.

Ідентифікацію фенольних сполук здійснювали спектроскопічними методами, структурним аналізом і хімічними визначеннями. УФ-спектроскопія була використана при визначенні основної структури флавоноїдів, числа і положення гідроксильних груп і залишків цукрів. Спектри в ультрафіолетовій області знімали на реєструючому спектрофотометрі.

Зважаючи на близькість (а іноді і збіг) смуг поглинання як в довгохвильовій, так і короткохвильовій областях УФ-спектра ряду фенольних сполук нами для їх ідентифікаційної диференціації були використані комплексоутворюючі і іонізуючі реагенти, визначались батохромні та гіпсохромні зсуви. ІЧ-спектри знімали на приладі UR-20 в таблетках з KBr.

Для визначення загального складу фенольних речовин використовували модифікований метод Свена і Хілліса (1964) на основі окислення фенольних сполук реагентом Фоліна з наступним фотоелектроколориметричним визначенням інтенсивності одержаного комплексу при 725 нм.

Рис. 1. Загальна схема виділення і очистки екстрактів фенольних сполук з

рослинних матеріалів

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Пошук видів рослин-донорів з гербіцидною дією, дослідження їх рістінгібуючих властивостей щодо бур'янів та хімічного складу

Перші дослідження впливу водних екстрактів із повітряно-сухої маси бур'янів на схожість насіння різних видів рослин проведено в модельних лабораторних дослідах. Тестування показало, що найбільше зниження схожості насіння (28,8-41,3%), зокрема щириці звичайної і грициків звичайних, зафіксовано при застосуванні екстрактів з листків і суцвіть осоту рожевого, суцвіть суріпиці звичайної, стебел і листків рутки лікарської (рис. 2).

Але в результаті тестування їх рістінгібуючої активності в умовах грунту (рис. 3) виявлено, що у більшості випадків інгібуючий ефект значно знизився. Суттєву рістінгібуючу активність на проростання насіння щириці звичайної, грициків звичайних, талабану польового, кучерявця Софії в умовах грунту мали тільки екстракти з листків і суцвіть осоту рожевого, суцвіть суріпиці звичайної, стебел і листків рутки лікарської. Особливістю дії зазначених екстрактів в умовах грунту був селективний інгібуючий ефект на бур'яни і майже повна відсутність впливу на схожість пшениці і кукурудзи.

З метою встановлення природи сполук, що відповідають за проявлення екстрактами із рослин-донорів рістінгібуючої активності нами здійснено дослідження хімічного складу осоту і суріпиці. При цьому з рослин-донорів були отримані ізольовані класи сполук (поліфенольні сполуки, білки та вільні амінокислоти, моно- та олігосахариди, ліпорозчинні речовини). Тестування цих окремих класів хімічних речовин дозволило зробити висновок, що рістінгібуючу активність мали тільки фракції, що містили суму фенольних сполук і ліпорозчинних речовин.

Отримані нами дані збігаються з наведеними в літературних джерелах відомостями про наявність рістінгібуючої активності у певної групи фенольних і ліпідних сполук (В.І.Кефелі, 1981; Т.Гудвин, Е.Мерсер, 1986; П.А.Мороз, 1996; В.П.Грахов, 1999). В зв'язку з цим, при вивченні хімічного складу рослин-донорів акцент було зроблено саме на ті класи речовин, які показали наявність рістінгібуючої активності.

Загальний вміст ліпідів (на суху масу) склав в осоті – 7,15, а в суріпиці – 4,3%. Класи ліпідів знаходились у таких співвідношеннях – нейтральні ліпіди (52-72%), гліколіпіди (25-38%), фосфоліпіди (5-10%). При вивченні групового складу було ідентифіковано 16 груп нейтральних ліпідів, п'ять груп гліколіпідів і п'ять груп фосфоліпідів, з'ясовані їх масові частки. У складі жирних кислот ідентифіковано шістнадцять жирних кислот складу С12-С28, серед яких домінуючими були чотири: лінолева, пальмітинова, олеїнова і ліноленова.

Тестування рістінгібуючої активності ліпідних фракцій рослин-донорів показало, що в початковій концентраціїї вони забезпечували повне інгібування проростання насіння щириці. При розбавленні вихідних екстрактів у 8 разів спостерігалось різноманітне проростання насіння. Зокрема гліколіпіди забезпечували проростання 3,3 і 7,6%, фосфоліпіди - 16,7% щодо осоту рожевого і 10,2% щодо суріпиці звичайної. Під впливом нейтральних ліпідів схожість насіння щириці була високою (84,3-91,2%). При використанні аліроксу схожість насіння знижувалась до 2,4%. Проведене дослідження дало можливість розпізнати хімічну природу ліпорозчинних речовин-носіїв рістінгібуючої активності та встановити шляхи виділення найбільш активних фракцій. Але практична відсутність розчинності цих речовин у воді ускладнює використання їх як складової частини в гербіцидних препаратах, які зручно вносити у грунт в водних розчинах. Тому у практичному відношенні більший інтерес становлять фенольні сполуки, які добре розчиняються у водних розчинах.

Вивчення хімічного складу фенольних сполук показало, що їх вміст в рослинах-донорах досить високий: в осоті – 5625 мг/100 г, а в суріпиці – 4770 мг/100 г сирої маси. У кількісному відношенні переважали флавоноли і лейкоантоціани. Вміст інших груп (коричні кислоти, фенолокислоти, кумарини, катехіни та ін.) коливався від 50 до 150 мг/100 г.

Тестування рістінгібуючої активності фракцій фенольних сполук, одержаних при розподілі екстрактів осоту та суріпиці методом обернено-фазової ВЕРХ на колонці з носієм RP-18, показало, що найбільшу рістінгібуючу активність (95-100%) відносно проростання насіння щириці звичайної мали фракції елюйовані водою і 50%-ним метанолом, 30%-ним метанолом (екстракт осоту) і 70%-ним метанолом (екстракт суріпиці). Таким чином, це дослідження дозволило виявити локалізацію груп фенольних сполук, які є основними носіями рістінгібуючих властивостей.

З метою встановлення індивідуальних фенольних сполук, які відповідають за проявлення рістінгібуючої активності, було використано метод тонкошаровохроматографічного тестування. Результати тестування показали, що в екстрактах осоту міститься ряд фенольних сполук, які мають значний рівень рістінгібуючої активності (n-оксибензойна, n-кумарова, хінна кислоти, ацетилметоксибензальдегід та ін.).

В екстрактах суріпиці ідентифіковано також сполуки зі значним рівнем рістінгібуючої активності: салігенін, ацетованілон, корична, n-оксибензойна і кумарова кислоти, апігенін та інші.

Слід зазначити, що досліджувані рослини-донори мали різноманітний склад фенольних сполук, серед яких певна кількість є досить рідкісними і раніше були виявлені лише в окремих видах рослин (сколімозид, цинарозид, астрагалінкумарат та ін.), що свідчить про унікальність хімічного складу рослин-донорів.

Співвідношення фенольних сполук в кожному виді рослин-донорів були різними. Проте, в проявленні рістінгібуючої активності, очевидно, велику роль відіграють синергетичні ефекти, що зумовлені сполуками, які містяться навіть в порівняно невеликих кількостях. Фізико-хімічні дослідження фенольних сполук, відповідальних за прояв екстрактами осоту та суріпиці рістінгібуючих властивостей, дали можливість встановити певний зв'язок між структурними особливостями цих сполук і рівнем їх рістінгібуючої активності. Встановлення взаємозв'язку між структурними особливостями фенольних сполук та рівнем рістінгібуючих властивостей є теоретичною основою цілеспрямованого синтезу штучних аналогів природних інгібіторів росту бур’янів, які б мали високу активність, низьку токсичність та швидко і специфічно втілювались в ланцюг метаболічних процесів росту і легко інактувалися без забруднення природних екосистем.

Розробка фіторегуляторів, дослідження їх біологічної ефективності, токсико-цитологічних особливостей та персистентності

З метою розробки фіторегуляторів здійснювали дослідження дії сумішей екстрактів із різних органів рослин-донорів (рис. 4) на проростання насіння різних видів бур'янів. Максимальне зниження схожості забезпечувала суміш листків осоту і суцвіть суріпиці у масовому співвідношенні компонентів 1:1 (схожість бур’янів коливалась на рівні 9,5-14,5%). Екстракт вищезазначеної суміші рослинної сировини було запропоновано використовувати як фіторегулятор, який одержав назву фітобацин. Дослідження різних норм фітобацину в грунті показало (рис. 5), що він забезпечував значне інгібування схожості насіння бур'янів, особливо при застосуванні норми 950 г/га. Малі норми внесення стимулювали проростання бур'янів.

Визначено, що оптимальною нормою цього фіторегулятора для стимуляції схожості є 300 г/га. Ефект стимулювання проростання насіння бур'янів під впливом невисоких норм регулятора може мати суттєве практичне значення, наприклад, використовуватися для провокування схожості бур'янів перед сівбою культурних рослин з наступним їх знищенням. На схожість пшениці фітобацин значно не впливав (зниження схожості становило в середньому 4,4%), що свідчить про наявність видоспецифічної дії.

Крім того, запропоновано використовувати екстракт із суміші суцвіть суріпиці і суцвіть осоту (2:1) теж як новий фіторегулятор з назвою фітобацин-2, який при такому співвідношенні компонентів забезпечував інгібування на рівні 93,2-97,7%.

Фіторегулятор, який було одержано на основі суміші надземних частин осоту і рутки лікарської у співвідношенні 1:1,5 дістав назву фітобафум.

Дослідження фіторегуляторів в польових умовах показало (рис. 6), що рістінгібуюча активність фітобацину-2 і, особливо, фітобафуму, відносно тестованих видів бур'янів була вища, ніж у фітобацину.

Вивчення фіторегуляторів в посівах пшениці (рис. 7) показало, що фітобацин забезпечував зниження забур'яненості на 20-48 %, фітобацин-2 – на 56-73 %, а фітобафум – на 62-82 %.

В посівах кукурудзи (рис. 8) запропоновані композиції мали теж суттєву ефективність. Зокрема фітобацин знижував забур'яненість залежно від виду бур'яну і року дослідження на 45-82%, фітобацин-2 - на 65-85 %, а фітобафум – на 72-86 %.

Наведені дані свідчать, що найбільшу ефективність проти бур'янів як в посівах пшениці, так і в посівах кукурудзи, мав фітобафум. Врожайність зерна м'якої пшениці (рис. 9) за три роки у варіанті з фітобацином перевищувала середню врожайність з контрольних ділянок на 3,2 ц/га, з фітобацином-2 – на 4,0 ц/га, а у варіанті з фітобафумом – на 4,6 ц/га. Апробація фіторегуляторів в посівах кукурудзи показала, що вони забезпечували підвищення врожайності зерна на 2,5-2,7 ц/га (табл. 1).

Таблиця 1

Врожайність зерна кукурудзи гібриду ОдМа 310 при застосуванні фіторегуляторів, ц/га

Варіант | Роки | Середнє | до контролю

1989 | 1990 | 1991 | 1992

Контроль (без обробки) | 34,3 | 41,7 | 38,9 | 36,6 | 37,8 | 0,0

Алірокс | 37,4 | 44,4 | 41,4 | 39,6 | 40,7 | + 2,9

Фітобацин | 36,8 | 44,0 | 41,2 | 39,7 | 40,4 | + 2,6

Фітобацин-2 | - | - | 40,9 | 40,2 | 40,5 | + 2,7

Фітобафум | - | - | 41,0 | 39,6 | 40,3 | + 2,5

НІР.05 | 1,85 | 2,08 | 1,69 | 2,31 | 2,14

Для можливості ширшого застосування фіторегуляторів вивчали їх вплив на схожість насіння культурних рослин і основних видів бур'янів у грунті в лабораторних умовах. В результаті досліджень виявлено, що вони по-різному діють на схожість сільськогосподарських культур. (табл. 2). Найбільш стійкими до дії фіторегуляторів виявились озима пшениця, озиме жито (Secale cereale L.), ярий ячмінь, овес (Avena sativa L.), кукурудза, просо (Panicum miliaceum L.), сорго (Sorgum sacсharatum (L.) Moench.), соняшник (Helianthus annuus L.). Схожість їх насіння – 94,7-98,8%. Схожість озимого ячменю знизилась до 75,0-80,3 %, гречки (Fagopyrum esculentum Moench.) – 72,2-81,3%, гороху (Pisum sativum L.) – 74,7-86,4 %, квасолі (Phaseolus vulgaris L.) – 70,0-75,0 %, буряків кормових (Beta vulraris L. var. crassa) – 86,9-88,7 %, буряків цукрових (Beta vulraris L. var. saccharifera) – 88,5-91,4 %. Значно знизилась схожість люцерни (Medicago sativa L.) – до 24,5-31,3 %, сої (Glycine hispida (Moench.) Maxim.) – 42,7-51,0 % і овочевих культур.

Розроблені фіторегулятори проходили апробацію на різних видах бур’янів (табл. 3), що дало можливість зробити висновок про їх суттєву рістінгібуючу активність проти щириці звичайної та щириці лободовидної (Amaranthus blitoides S.Watson.), кучерявця Софії, талабану польового, грициків звичайних, свербиги східної (Bunias orientalis L.), березки польової (Convolvulus arvensis L.), осоту рожевого (зменшення схожості насіння в 5-20 разів). При цьому фітобацин-2 і фітобафум діяли ефективніше, ніж фітобацин.

Дослідження впливу фітобацину на зернові культури в лабораторних умовах на штучних поживних середовищах показали, що різні сорти пшениці і ячменю при використанні цього препарату знизили схожість на 10-33%. Зафіксовано також і значне зменшення довжини кореня (в 2-5 разів). Визначення ступеню інгібування росту коренів в лабораторних умовах може бути одним із біологічних тестів скринінгу природних і синтетичних регуляторів росту.

Таблиця 2

Лабораторна схожість насіння сільськогосподарських культур

під впливом фіторегуляторів, %

Культура | Сорт,

гібрид | Контроль | Фіто-бацин | Фітоба-цин-2 | Фітоба-фум

Озима пшениця м'яка | Альбатрос одеський | 98,71,1 | 98,21,2 | 97,40,4 | 97,01,7

Озима пшениця тверда | Айсберг | 98,41,4 | 96,71,8 | 95,52,3 | 95,5+2,4

Озиме жито | Нива | 98,21,3 | 97,40,7 | 98,01,0 | 96,32,1

Тритикале кормовий | Простір | 96,9+0,8 | 95,82,1 | 96,4+0,9 | 94,1+0,8

Озимий ячмінь | Росава | 94,30,9 | 78,43,4 | 80,32,4 | 75,02,3

Ярий ячмінь | Одеський 100 | 98,40,7 | 98,80,9 | 97,21,5 | 96,20,6

Овес | Мирний | 98,41,1 | 97,91,3 | 95,01,2 | 97,00,8

Кукурудза | ОдМа 310 | 98,40,9 | 98,31,6 | 98,10,7 | 98,61,1

Просо | Миронівське 51 | 97,61,4 | 96,52,5 | 94,72,4 | 95,21,0

Сорго | Сатурн | 98,72,1 | 97,01,9 | 98,21,0 | 97,40,8

Суданська трава | Чорноморка | 98,51,0 | 96,62,0 | 94,42,2 | 98,01,2

Гречка | Астра | 95,11,8 | 75,71,4 | 81,33,2 | 72,23,1

Соняшник | Одеський 96 | 98,00,4 | 97,81,0 | 96,21,9 | 96,82,0

Соя | Чарівниця степу | 89,01,9 | 42,72,8 | 51,03,1 | 47,40,6

Горох | Топаз | 94,02,0 | 86,41,3 | 74,72,8 | 82,62,2

Квасоля | Красноградська 244 | 88,31,2 | 71,23,3 | 75,01,7 | 70,03,1

Люцерна | Радуга | 87,02,3 | 24,52,0 | 31,32,6 | 28,22,9

Еспарцет | Південноукраїнський | 90,31,7 | 62,22,4 | 72,23,0 | 63,41,3

Буряки кормові | Екендорфський жовтий | 94,71,6 | 88,71,7 | 86,91,5 | 87,23,0

Буряки цукрові | Ялтушківський однонасінний | 95,02,2 | 89,22,3 | 91,42,0 | 88,52,4

Морква | Шантене сквирська | 84,81,5 | 51,21,9 | 64,81,7 | 57,72,7

Томати | Факел | 78,91,4 | 48,43,4 | 43,72,2 | 38,21,5

Огірки | Росинка | 84,52,3 | 56,04,1 | 60,21,8 | 51,12,4

Редиска | Червона з білим кінчком | 90,81,9 | 66,32,3 | 56,43,2 | 44,81,7

Кріп | Грибовський | 84,82,7 | 43,11,8 | 50,72,9 | 47,52,5

В той же час, вплив фітобацину на ріст листків озимого і ярого ячменю був слабким (інгібування 16-20%) і, практично, не проявлявся у озимої м'якої та твердої пшениці.

Таким чином, нами встановлена міжвидова специфічність стійкості ростових процесів в коренях і листках досліджуваних злакових культур в лабораторних умовах.

Таблиця 3

Дія фіторегуляторів на схожість насіння бур'янів (% до контролю)

Вид | Фітобацин | Фітобацин-2 | Фітобафум

Плоскуха звичайна | 64,72,3 | 70,43,4 | 58,22,7

Мишій зелений | 68,3+4,1 | 72,12,8 | 65,63,3

Свинорий | 86,63,8 | 92,35,0 | 80,72,2

Пирій повзучий | 76,62,4 | 81,04,1 | 68,93,8

Щавель кінський | 38,12,0 | 33,41,7 | 30,02,9

Гречка витка березковидна | 24,82,8 | 30,03,1 | 22,73,4

Гречка татарська | 21,51, 1 | 20,82,3 | 14,21,4

Лобода біла | 27,32,2 | 22,41,5 | 19,92,0

Щириця звичайна | 31,20,8 | 4,72,1 | 3,61,6

Щириця лободовидна | 28,02,1 | 10,21,0 | 7,70,9

Сокирки польові | 34,52,4 | 28,93,3 | 31,31,3

Чистотіл звичайний | 19,32,8 | 24,71,7 | 17,12,0

Мак дикий | 32,83,1 | 28,31,8 | 18,82,4

Кучерявець Софії | 14,02,9 | 6,21,1 | 3,81,3

Суріпиця звичайна | 18,90,8 | 22,82,5 | 25,71,8

Гірчиця польова | 27,03,0 | 21,32,9 | 23,32,6

Хрінниця крупковидна | 19,02,3 | 15,71,7 | 20,02,8

Талабан польовий | 49,93,4 | 24,94,2 | 11,42,2

Грицики звичайні | 42,65,1 | 18,62,5 | 7,81,3

Свербига східна | 22,52,4 | 17,70,8 | 9,62,1

Березка польова | 34,02,0 | 18,23,3 | 11,41,8

Злинка канадська | 20,02,2 | 22,31,9 | 16,92,6

Чорнощир звичайний | 27,73,0 | 21,52,4 | 21,81,4

Галінсога дрібноквіткова | 33,21,0 | 19,02,2 | 12,21,9

Триреберник непахучий | 18,72,1 | 14,42,4 | 17,51,2

Осот рожевий | 22,23,4 | 16,31,8 | 9,11,1

В грунті фітобацин на ріст коренів і ростків озимої м'якої пшениці майже не впливав, але викликав зменшення довжини коренів та ростків щириці звичайної в 6-8 разів (табл. 4).

Має практичне значення синтетичне відтворення природної діючої речовини і розробка на її основі препарату для контролю чисельності бур'янів. Розроблена технологія синтетичного відтворення виділеної з осоту рожевого сполуки з суттєвою гербіцидною активністю - 3-ацетил-6-метоксибензальдегіду і створено препарат алметид. Штучно синтезований 3-ацетил-6-метоксибензальдегід та природний є ідентичними, оскільки речовина не містить асиметричних атомів вуглецю, а отже не є оптично активною.

Таблиця 4

Вплив фітобацину на ріст озимої м'якої пшениці (Альбатрос одеський) і щириці звичайної в грунті

Варіант | Пшениця | Щириця звичайна | довжина проростка (мм) | довжина кореня (мм) | довжина проростка (мм) | довжина кореня (мм) | Контрольний | 2984,2 | 862,4 | 411,9 | 241,5 | Дослідний | 2953,7 | 822,4 | 71,1 | 30,4 | % до контролю | 99 | 95 | 17 | 12 |

Дослідження алметиду як грунтового препарату (норма витрати 0,8 кг/га) показали, що він забезпечував зниження забур'яненості такими бур'янами, як грицики звичайні, лобода біла, щириця звичайна на 50,5-83,3 %. Обробка цим препаратом сходів бур'янів (норма витрати 0,6 кг/га) забезпечила ефективність на рівні 72,3-97,7%. Польові державні дослідження алметиду (1999-2003 рр.) довели, що він є ефективним засобом захисту посівів ярого ячменю та озимої пшениці від основних дводольних бур'янів. Висновком біолого-господарської експертизи за біологічними показниками рекомендований до реєстрації в Україні. Висновком державної санітарно-епідеміологічної експертизи МОЗ погоджено ТУ на виробництво дослідної партії алметиду. Гербіцидний ефект препарату може бути пов'язаний з блокуванням розщеплення крохмалю. 3-ацетил-6-метоксибензальдегід має два атоми кисню просторово розміщених приблизно так само, як і в місці напівацетального зв'язку у ланцюгу молекули крохмалю, тому молекула діючої речовини конкурентно з молекулами крохмалю зв'язується водневими зв'язками з активним центром альфа-амілази. Ці зв'язки виявляються міцнішими за зв'язки активного центру альфа-амілази з крохмалем, тому процес його розщеплення блокується.

Препарат є біло-сірий кристалічний порошок з розміром частинок 1-10 мкм. Температура плавлення +140-143 С. Помірно леткий. Стабільність зберігання при температурі +18-20 С два роки.

Токсикологічні особливості фіторегуляторів. Вивчення токсикологічних властивостей алметиду (Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І.Медведя) показали, що він відноситься до 4 класу небезпеки. ЛД50 при пероральному надходженні в організм білих щурів (рис. 10); мишей та морських свинок становить більше 5000 мг/кг. Комулятивні властивості препарату виражені слабко. Він не володіє сенсибілізуючими властивостями і не викликає подразнення слизових оболонок ока.

Токсикологічними дослідженнями фіторегуляторів доведено, що хімічний склад контрольних і дослідних зразків кукурудзи і пшениці із застосуванням фітобацину практично не відрізнявся (табл. 5), а систематичне згодовування лабораторним тваринам зерна з ділянок де вносився фітобацин, а також пшениці з 1%-ною добавкою препарату показало відсутність істотної різниці в приростах ваги тварин у порівнянні з контролем. Те ж саме відмічено і при вивченні токсичності фітобафуму.

Дослідження органів травлення тварин, що вживали препарат, показали відсутність їх враження. Експериментально доведено, що фітобацин не викликає загибелі основних видів твердокрилих комах.

Рис. 10. Середня маса тіла білих щурів при гострій пероральній дії препарату алметид.

Таблиця 5

Вплив фітобацину на