Національна академія наук України

Інститут фізіології ім. акад. О.О.Богомольця

ОРЛОВСЬКИЙ Максим Олександрович

УДК 616.379-008.64+616-008.922.1):
:577.175.8:(612.826.4+612.349.7+612.17)

Стан ХОЛЕЦИСТОКіНіН-синтезуючої СИСТЕМи ГіПОТАЛАМУСу
і РОЛЬ ХОЛЕЦИСТОКіНіНу-8 В РЕГУЛЯЦії еНДОКРИНної
ФУНКЦії ПіДшлункової залози В НОРМі та при експериментальному цукровому діабеті

14.03.04 – патологічна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Запорізькому державному медичному університеті

Міністерства охорони здоров‘я України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор
КОЛЕСНИК Юрій Михайлович,
Запорізький державний медичний університет,
ректор, завідувач кафедри патофізіології

Офіційні опоненти: член-кореспондент НАН та АМН України,
доктор медичних наук, професор
РЕЗНИКОВ Олександр Георгійович
завідувач відділу репродукції та адаптації
Інституту ендокринології та обміну речовин
ім. В.П.Комисаренка НАН України

доктор медичних наук,
МАНЬКОВСЬКИЙ Борис Микитович
заступник директора з наукової роботи
Українського науково-практичного центру
ендокринної хірургії, трансплантації ендокринних органів та тканин МОЗ України
завідувач відділом профілактики
та лікування цукрового діабету

Провідна установа: Національний медичний університет МОЗ України,
кафедра патофізіології, м.Київ

Захист дисертації відбудеться „22” червня 2004 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.198.01 при Інституті фізіології ім. акад. О.О.Богомольця НАН України (01024, Київ, вул.. акад. Богомольця, 4)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. акад. О.О.Богомольця НАН України (01024, Київ, вул.. акад. Богомольця, 4)

Автореферат розісланий „07” травня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Цукровий діабет у теперішній час являє важливу медичну і економічну проблему розвинених країн, та країн що розвиваються. За даними ВООЗ 150 мільйонів людей у світі зараз хворіє на цукровий діабет, а до 2025 року ця цифра має подвоїтися (WHO Fact Sheet N138, 2002). Найбільш важкою формою захворювання по кількості ускладнень, частоті інвалідизації та ступеню ризику для життя являється діабет 1 типу (Felig., Baxter.D., et al., 1995). Однак, на сьогодення єдиним ефективним методом лікування цього захворювання залишається замісна терапія інсуліном на протязі всього життя, що призводить до необхідності пошуку нових патогенетичних методів терапії діабету.

Розробка методів корекції цукрового діабету повинна в першу чергу ґрунтуватись на всебічному вивченні патогенезу захворювання. Даній проблемі в останній час приділяється багато уваги. Завдяки цьому стало відомо, що в фізіологічних умовах для стимуляції секреції інсуліну при відсутності дії інших гуморальних факторів необхідний рівень глікемії порядку 8-10 ммоль/л (Malm., Giaever., et al., 1993; Rasmussen., Zawalich.C., et al, 1990). В нормі велику роль в стимуляції секреції інсуліну грає холецистокінін (ХЦК), який виділяється при прийомі їжі ендокринними клітинами шлунково-кишкового тракту (Chen.Y., Roth.L., 2000) та сенсибілізує ?-клітини до більш низького рівня глікемії (Verspohl E.J., Herrmann K., 1996). При цукровому діабеті ?-клітини внаслідок ушкодження втрачають чутливість до глюкози (Heitmeier M.R., Scarim A.L., et al., 1997), і шлях активації секреції інсуліну під впливом ХЦК та інших нейропептидів стає основним (Kohert K.D., Axcrona M., et al. 1999).

В наш час накопичено ряд свідоцтв про важливу роль ХЦК як антидіабетичного фактора і регулятора вуглеводного гомеостазу (Колесник Ю.М., Абрамов А.В., 1998). Встановлено, що при перфузії підшлункової залози розчином, який містить ХЦК, у щурів в нормі відбувається стимуляція секреції інсуліну (Babb E.L., Tarpley J., et al., 1996); також спостерігається збільшення вмісту інсуліну в периферичній крові при внутрівенному введенні ХЦК здоровим волонтерам (Ahren B., et al., 1991). Генетичний дефект рецепторів ХЦК являється причиною розвитку спонтанного цукрового діабету та ожиріння у щурів (Takiguchi S., et al., 1997), а також виникнення важкої форми інсулінозалежного цукрового діабету у людини (Vionnet N., et al., 1997). З іншого боку, у хворих на цукровий діабет спостерігається збільшення концентрації ХЦК у крові натще (Mitsukawa T., et al., 1990). ХЦК являється одним з основних анорексичних гормонів, які обмежують споживання їжі. Його дія пов‘язана з активацією нейронів вентромедіального ядра гіпоталамуса – структури, яка вибірково пошкоджується при цукровому діабеті (Колесник Ю.М., Абрамов А.В., 1998). В цілому, при цукровому діабеті, як показано в роботах проф. Ю.М.Колесника, проф. А.В.Абрамова та інших авторів, відбувається зміна морфологічних та електричних показників активності нейронів і інших гіпоталамічних центрів регуляції вуглеводного гомеостазу, а також активація синтезу незрілої форми ХЦК.

Але, незважаючи на велику кількість експериментальних та клінічних даних про участь холецистокініну в патогенезі цукрового діабету, ряд питань залишаються невирішеними. Так, відсутні кількісні дослідження гіпоталамічної системи, синтезуючої біологічно-активну форму ХЦК – його октапептид (ХЦК_), а також немає даних про зміни продукції ХЦК_у гіпоталамусі при розвитку цукрового діабету. У літературі немає свідчень про вплив тривалих введень агоністів і антагоністів рецепторів ХЦК на ендокринну функцію підшлункової залози в нормі та при цукровому діабеті in vivo. Виходячи з цього, подальше вивчення ролі ХЦК та його рецепторів у регуляції ендокринної функції підшлункової залози в нормі і при цукровому діабеті слід вважати актуальним.

Зв‘язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження, результати яких відображено в даній роботі, виконувались в рамках науково-дослідної роботи кафедри патофізіології Запорізького державного медичного університету “Роль пептидергічної системи гіпоталамусу в регуляції ендокринної функції підшлункової залози і стану міокарда в нормі та при цукровому діабеті і обґрунтування способів корекції її порушень за допомогою синтетичних нейрогормонів (експериментально-клінічне дослідження)” (№ держреєстрації 0198U004224).

Мета дослідження. Встановити закономірності реакції холецистокінінергичної системи гіпоталамусу при розвитку експериментального цукрового діабету та вплив багаторазових введень синтетичного агоністу (холецистокініну октапептиду) і антагоністу (проглюміду) рецепторів холецистокініну на ендокринну функцію підшлункової залози.

Задачі дослідження.

1. Дати характеристику гіпоталамічної холецистокінінергічної системи у щурів в нормі на основі кількісної оцінки продукції і секреції холецистокініну октапептиду нейронами ядер гіпоталамусу.

2. Описати зміни в гіпоталамічної холецистокінінергічної системи при розвитку експериментального цукрового діабету у щурів.

3. Вивчити ефекти багаторазових введень синтетичного холецистокініну октапептиду і антагоніста рецепторів холецистокініну проглюміду на показники вуглеводного гомеостазу та стан ?-, в- ? д_?літин панкреатичних острівців у щурів в нормі.

4. Вивчити ефекти багаторазових введень синтетичного холецистокініну октапептиду і антагоніста рецепторів холецистокініну проглюміду на показники вуглеводного гомеостазу та стан ?-, в- ? д_?літин панкреатичних острівців у щурів з експериментальним цукровим діабетом.

5. Порівняти ефекти та описати можливі шляхи реалізації дії різних шляхів введень холецистокініну октапептиду в нормі і при цукровому діабеті, визначити ефективність використання агоністів і антагоністів рецепторів холецистокініну при цукровому діабеті.

Об‘єкт дослідження: цукровий діабет

Предмет дослідження: холецистокінінергична система гіпоталамуса (кількість холецистокінін-8-синтезуючих нейронів і щільність розташування холецистокінін-8-імунопозитивних нервових волокон та закінчень, їх морфологія і вміст холецистокініну в них), показники вуглеводного гомеостазу (концентрація глюкози і інсуліну в крові), ендокринна функція підшлункової залози (кількість ?в- ? д-?літин у панкреатичних острівцях, вміст і концентрація в них гормонів), ефекти багаторазових введень синтетичного агоністу та антагоністу рецепторів холецистокініну.

Методи дослідження: при вивченні стану холецистокінінергичної системи гіпоталамусу і ендокринних клітин панкреатичних острівців було використано метод непрямої імунофлюоресценції, методи кількісного аналізу зображень в автоматичному та напівавтоматичному режимі, методи кореляційного і кластерного аналізу; показники вуглеводного гомеостазу вивчались з використанням біохімічних і радіоімуних методів; в усій роботі використовувались статистичні методи.

Наукова новизна отриманих результатів. В роботі вперше здійснене комплексне вивчення всіх компонентів холецистокінін-8-синтезуючої системи гіпоталамусу (велико- і дрібноклітиннх нейросекреторних і несекреторних нейронів, нервових волокон і закінчень). Отримані нові дані про морфологічний і функціональний стан холецистокінінергічної системи гіпоталамусу в нормі і при цукровому діабеті, які включають в себе оцінку активності утворення, накопичення і аксонального транспорту нейропептиду в різноманітних ядрах і суб’ядрах гіпоталамусу. Встановлено, що найбільший рівень утворення ХЦК-8 спостерігається в паравентрикулярному і дорсомедіальному ядрах гіпоталамусу, а найбільш інтенсивна холецистокінінергічна іннервація характерна для вентромедіального ядра і серединного піднесення гіпоталамусу.

Вперше встановлено факт розвитку недостатності утворення і аксонального транспорту ХЦК-8 у гіпоталамусі при експериментальному цукровому діабеті: в ранні терміни розвитку діабету в усіх структурах гіпоталамусу спостерігається зменшення і навіть практично повне зникнення ХЦК-8-синтезуючих нейронів, зниження вмісту ХЦК-8 в індивідуальних клітинах і зменшення щільності нервових закінчень, які містять ХЦК-8. Подальший розвиток діабету в ряді структур супроводжується підсиленням утворення, а також накопичення нейропептиду внаслідок уповільнення його виведення з тіл нейронів. У вентромедіальному, аркуатному ядрі гіпоталамусу і серединному піднесенні до кінця 3 і 5 тижня діабету повністю зникає матеріал, імунопозитивний до ХЦК-8.

Нами вперше показано, що вплив багаторазових внутрішньочеревних і внутрішньомозкових введень ХЦК-8 на ендокринну функцію підшлункової залози у щурів у нормі, відрізняється від описаних в літературі ефектів нейропептиду в гострих експериментах. Також встановлено, що механізми реалізації ефектів ХЦК-8 при різноманітних шляхах введень у тварин в нормі і при діабеті різноманітні.

В роботі доведено факт позитивної чинності введень синтетичного ХЦК-8 на ендокринну функцію підшлункової залози при цукровому діабеті. Вперше встановлено, що багаторазові кон‘юнктивальні інстиляції ХЦК-8 при цукровому діабеті здатні зменшувати діабетичну гіперфагію, гальмувати деструкцію ?-клітин, посилювати секрецію інсуліну і знижувати рівень глікемії в плазмі крові натще. Вивчена дія антагоніста рецепторів ХЦК проглюміда на ендокринну функцію підшлункової залози. Вперше показано, що блокада рецепторів ХЦК при цукровому діабеті не виявляє значного впливу на ендокринну функцію підшлункової залози, що може бути пов'язано з недостатністю утворення ендогенного холецистокініну.

Обґрунтування і вірогідність наукових положень, висновків і рекомендацій. Положення, висновки і рекомендації, викладені в роботі, засновані на:–

результатах експериментів, проведених на достатньому числі лабораторних щурів чистої лінії, розбитих на групи випадковим чином;–

використанні декількох контрольних груп;–

використанні узвичаєної стандартизованої стрептозоцинової моделі цукрового діабету, що найбільш наближена за своїми характеристикам до цукрового діабету 1 типу людини;–

застосуванні високочутливого засобу непрямої імунофлюоресценції, який дозволяє кількісно оцінювати продукцію гормонів і нейропептидів ендокринними клітинами і нейронами;–

використанні в дослідженні антитіл виробництва Peninsula Lab. (США) і Sigma-Aldrich (США), що мають відповідні сертифікати якості; сертифікованої апаратури – системи цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronic, Германію), апарату для виміру концентрації глюкози в крові One Touch II (LifeScan, США), а також ліцензійного програмного забезпечення (Kontron Vidas 5.5, Microsof Excel XP, Statsoft Statistica 6.0).–

застосуванні відповідних засобів статистичної обробки отриманих результатів, використанні для оцінки вірогідності міжгрупових відзнак t-критерію Ст‘юдента і критерію ?2 Пірсона для параметричних і непараметричних даних відповідно.

Наукове і практичне значення отриманих результатів. Результати проведених досліджень значно поширюють подання ролі холецистокініну в регуляції ендокринної функції підшлункової залози в нормі і при цукровому діабеті, що має важливе теоретичне значення для патофізіології, і практичне – для кліничної ендокринології і діабетології. Результати досліджень свідчать про виникнення при розвитку цукрового діабету недостатності гіпоталамічної холецистокінінергічної системи. Компенсація цих змін повинна бути необхідним компонентом ефективної терапії цукрового діабету.

У роботі проаналізовані можливі шляхи і механізми регуляції процесів синтезу і секреції гормонів ?-, в- ? д-?літин панкреатичних острівців синтетичними агоністом і антагоністом рецепторів ХЦК при різноманітних шляхах їх введень в нормі і при експериментальному цукровому діабеті.

Розроблений в даному дослідженні спосіб автоматичного аналізу імунофлюоресцентних зображень з наступною математичною класифікацією дозволяє давати оцінку інтенсивності процесів синтезу і секреції інсуліну ?-клітинами панкреатичних острівців, оцінювати дію інсулінстимулюючих речовин у дослідженнях in vivo, а також вивчати стан пептидергичних систем гіпоталамусу шляхом кількісної оцінки інтенсивності синтезу, транспорту і секреції нейропептидів нейронами мозку. Це може бути використано для оцінки функціонального стану гіпоталамічних регуляторних систем при патології, а також в практичній діяльності морфологів, гістологів і ендокринологів.

Актуальним для клінічної ендокринології і діабетології є використання синтетичних аналогів ХЦК-8 як засобу корекції недостатності гіпоталамічної ХЦК-8-синтезуючої системи з метою гальмування деструкції ?-клітин при діабеті, нормалізації паракриних взаємовідносин в острівках, збільшення рівня інсуліну в периферичній крові і зниження глікемії при цукровому діабеті. Особливий інтерес в цьому аспекті представляють кон‘юнктивальні інстиляції наномолярних кількостей синтетичного ХЦК-8, що, як показано в нинішньому дослідженні, при своїй простоті і малій інвазивності здатні знижувати діабетичну гіперфагію, гальмувати деструкцію ?-клітин, посилювати секрецію інсуліну і знижувати рівень глікемії в плазмі крові. Одночасно, в клінічній практиці слід з особливою обережністю застосовувати блокатор рецепторів ХЦК – проглюмід (що є препаратом, який використовується при лікуванні панкреатитів і виразкової хвороби) у пацієнтів з цукровим діабетом, ожирінням або порушеною толерантністю до глюкози.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено аналіз літератури, виконані всі експерименти на тваринах, дана характеристика холецистокінінергічній системі гіпоталамусу, розроблено спосіб класифікації ?-клітин панкреатичних острівців, проведено дослідження стану ендокринних клітин панкреатичних острівців в усіх експериментальних серіях і написані всі розділи дисертації. Спосіб вивчення стану холецистокінінергічної системи гіпоталамусу і ?- і ?-клітин панкреатичних острівців розроблений при участі професора кафедри патофізіології ЗДМУ А.В.Абрамова.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційного дослідження доповідались та обговорювались на Пленумі товариства патофізіологів України (Київ, 1998 р.), VI з‘їзді ендокринологів України (Київ, 2001 р.), науково-практичних конференціях „Актуальні аспекти ендокринних захворювань” (Харків, 1998 р.), „Сучасні напрямки розвитку ендокринології (другі Данилевські читання)” (Харків, 2003 р.), „Шляхи підвищення ефективності сучасної медицини” (Запоріжжя, 2003 р.), на засіданні сектору фізіології вісцеральних систем Інституту фізіології ім. акад. О.О.Богомольця (м. Київ, 2003 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 робіт, з них 1 – в іноземному журналі (Росія), 7 в вітчизняних журналах, включених в реєстр ВАК України; 1 робота опублікована без співавторів.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 186 сторінках, з них основний текст складає 161 сторінку. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та обговорення результатів досліджень, висновків і списку літературних джерел, який містить 365 праць, з них 30 – слов’яномовних авторів і 335 – англомовних. Дисертація ілюстрована 29 таблицями та 36 рисунками.

Основний вміст

Матеріал та методи досліджень. Дослідження проведено на 158 щурах-самцях лінії Вістар масою 250-300 г в осінньо-зимовий період. У всіх тварин вивчалися зміни ваги, споживання їжі і води, концентрація глюкози і інсуліну в крові. На 33 тваринах, поділених на три групи (інтактні, тварини з 3 та 5-тижневим діабетом), було досліджено зміни холецистокінін-синтезуючої системи гіпоталамусу при розвитку цукрового діабету. На інших тваринах в нормі та за умов цукрового діабету було досліджено стан ендокринної функції підшлункової залози при внутрішньочеревних, внутрішньомозкових і кон‘юнктивальних введеннях синтетичного холецистокініну октапептиду та внутрішньочеревних введеннях антагоністу його рецепторів проглюміду. Цукровий діабет моделювали одноразовим введенням стрептозотоцину (Sigma-Aldrich, США) в дозі 50 мг/кг внутрішньочеревно.

Ідентифікацію тіл нейронів, нервових волокон і закінчень, які містять ХЦК_, здійснювали в серійних зрізах гіпоталамусу засобом непрямої імунофлюоресценції з використанням моноклональних антитіл виробництва Sigma-Aldrich (США). Аналіз зображень здійснювався за допомогою мікроскопу Axioscop (ZEISS, Німеччина) і програмно-апаратного комплексу VIDAS (Kontron Elektnonik, Німеччина). У серійних фронтальних зрізах товщиною 14 мкм було досліджено структури медіобазального і латерального гіпоталамусу. Приналежність ідентифікованих ХЦК-8-імунопозитивних об'єктів структурам гіпоталамусу визначали за допомогою стереотоксичного атласу мозку щурів (Paxios, 1985). При цьому визначали кількість тіл нейронів, щільність розташування нервових волокон і закінчень з ХЦК-8 і обчислювалися їх денситометричні ознаки (в умовних одиницях імунофлюоресценції – ОІФ). На підставі цих даних робили висновки про активність утворення, накопичення і аксонального транспорту холецистокініну.

Для введень було вибрано дози ХЦК-8, які відповідають його фізіологічним рівням в біологічних рідинах тварин (Kastel P.L. et al., 2000). Контрольним групам нормальних і діабетичних щурів для введень використовували 0,9% р-ну NaCl. Введення здійснювали на протязі 10 днів один раз на добу в вечірній час. Введення у діабетичних щурів починали наприкінці 3 тижня від індукції діабету.

Ендокринна функція підшлункової залози вивчалася шляхом імунофлюоресцентного виявлення інсуліну, глюкагону і соматостатину в клітинах панкреатичних острівців з наступним автоматичним аналізом отриманих зображень і визначенням кількості клітин кожного типу в площі зрізу острівця, площі імунопозитивного матеріалу в цих клітинах (в мкм2), його концентрації і неоднорідності (в ОІФ). в-?літини панкреатичних острівців на підставі отриманих числових характеристик поділяли на фази секреторного циклу за допомогою оригінальної методики (Kolesnik Y. M., Orlovsky M. A., 2002).

Математичну і статистичну обробку результатів досліджень проводили на ПК з використанням програмних пакетів Excel XP (Microsoft Corp., США) і STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., США). Для кожного вивчаємого параметру перевіряли відповідність до закону нормального розподілу, після чого вичисляли значення середньої арифметичної (M), дисперсії (?2) і помилки середньої (m). Перевірку вірогідності змін середніх здійснювали з використанням t-критерію Ст‘юдента (tst). Вірогідними вважали ті зміни, для яких рівень імовірності статистичної помилки першого роду (p) був менший за 5%.

Результати досліджень та їх обговорення. В мозку біологічно-активна восьмиамінокислотна форма холецистокіна утворюється в результаті синтезу молекули прогормону і її наступного багатостадійного протеолізу. В подальшому, весь комплекс цих біохімічних процесів ми будемо скорочено називати синтезом холецистокініну.

Нами встановлено, що у інтактних тварин основним місцем синтезу ХЦК-8 є паравентрикулярне ядром (ПВЯ), в різноманітних суб‘ядрах якого міститься майже половина всього гіпоталамічного нейропептиду (рис. 1). На другому місці по вмісту ХЦК-8 ідуть дорсомедіальне (ДМЯ), супрахіазматичне ядро (СХЯ) і латеральне гіпоталамічне поле (ЛГП). В меншій кількості нейропептид синтезується нейронами супраоптичного (СОЯ) і аркуатного ядер (АрЯ).

Нейрони СОЯ, АрЯ та більшості суб‘ядер ПВЯ здійснюють вивільнення нейросекрету в кров. Згідно з класичними уявами, сформованими в роботах (Sharer., 1978; Поленов А.Л., 1968 Алешин Б.В., 1971), ці ядра називаються нейросекреторними (див. рис. 1). В них синтезується більша частина гіпоталамічного холецистокініну. Нейрони інших ядер гіпоталамусу здійснюють секрецію холецистокініна в синапсах інших структур мозку, і в подальшому будуть називатися несекреторними.

Рис. . Розподіл ХЦК_імунопозитивного матеріалу між досліджуваними структурами гіпоталамусу.

В нейросекреторних ядрах до кінця третього тижня розвитку діабету спостерігалася однотипна реакція, яка проявлялося у вірогідному зменшенні кількості холецистокінін-8-синтезуючих нейронів. Це, як видно на приведених мікрофотографіях (рис. 2), супроводжувалось зменшенням вмісту нейропептида в тілах нейронів. До закінчення п'ятого тижня розвитку патологічного процесу кількість ХЦК-синтезуючих нейронів знов зростала, причому в ряді структур вірогідно вище початкових значень. З іншого боку, при цьому відбувалося збільшення відношення вмісту ХЦК в тілах нейронів до його вмісту в аксонах. В більш ранніх роботах (Колесник Ю.М., Абрамов А.В., 1998) було встановлено, що при діабеті в цих ядрах збільшується вміст попередника ХЦК-8. На нашу думку, це свідчить про порушення процесингу і аксонального транспорту синтезуємого холецистокініну з тіл нейронів в області його секреції.

Рис. . ХЦК_імунопозитивний матеріал в гіпоталамусі в області ПВЯ (А, Б) і серединного підвищення (В, Г) у щурів в нормі та при експериментальному цукровому діабеті.

Наше припущення знайшло своє підтвердження при вивченні серединного підвищення – місця секреції нейропептидів в портальний кровообіг гіпофізу. З цієї області у вивчаєми періоди діабету зникали волокна і нервові закінчення з ХЦК_, в той час як у нормальних щурів вони виявлялися у великій кількості (див. рис. 2). Таким чином, ми можемо зробити висновок, що цукровий діабет призводить до порушення синтезу, аксонального транспорту і секреції холецистокініну нейросекреторними структурами гіпоталамусу.

Реакція несекреторних ядер гіпоталамусу на розвиток цукрового діабету була подібна до реакції нейросекреторних ядер: в цих структурах значно знижувалася кількість холецистокінін-8-синтезуючих нейронів. До кінця п'ятого тижня цукрового діабету спостерігалася активація синтезу холецистокініна-8 в супрахіазматичному, передньому дрібноклітинному суб‘ядрі паравентрикулярного ядра і в латеральному гіпоталамічному полі, однак паралельно з цим відбувалося подальше пригнічення аксонального транспорту нейропептиду.

У інтактних щурів у вентромедіальному ядрі гіпоталамусу (ВМЯ) холецистокінін_синтезуючі нейрони ідентифіковані не були, однак нами було виявлено велике число холецистокінінергичних нервових закінчень, які щільно покривають тіла нейронів. Згідно літературним даним (Liberge M., Arruebo P., et al., 1990), джерелом холецистокінінергічної іннервації ВМЯ служать здебільшого несекреторні структури гіпоталамуса. Ослаблення утворення і виведення холецистокініну в цих структурах при діабеті поєднувалось з повним зникненням холецистокінін-8- імунопозитивних нервових закінчень з вентромедіального ядра.

Таблиця 1

Зміни стану холкцистокінін-8-синтезуючої системи гіпоталамусу при розвитку експериментального цукрового діабету

Структури гіпотала-мусу | Кількість нейронів з ХЦК-8 структурі | Відношення вмісту ХЦК_в тілах нейронів до вмісту в волокнах

Інтактні тварини | Діабет, 3_тиж. | Діабет, 5_тиж. | Інтактні тварини | Діабет, 3_тиж. | Діабет, 5_тиж.

СХЯ | 66±11 | одиничні | 15±3*# | 1,71±0,27– | 21,04±4,84*

СОЯ | 31±4 | одиничні | 6±1*# | 4,43±0,93 | 14,99±2,25* | 5,22±1,15#

пк-ПВЯ | 32±4 | немає | 27±4* | 4,30±0,64– | 15,85±3,96*

мк-ПВЯ | 89±13 | 7±1* | 122±16*# | 4,92±1,08 | 4,69±1,17 | 17,40±3,83*#

зк-ПВЯ | 11±1 | немає | 65±8* | 2,02±0,44– | 17,35±3,30*

пм-ПВЯ | 126±27 | 13±2* | 95±13*# | 4,97±0,84 | 5,69±1,31 | 14,85±2,67*#

мм-ПВЯ | 380±72 | 49±6* | 181±28# | 5,44±0,98 | 3,63±0,65 | 21,04±3,37*#

дм-ПВЯ | 7±1 | немає | 18±3* | 3,12±0,72– | 23,65±3,55*

пв-ПВЯ | 76±15 | 18±3* | 119±17*# | 3,13±0,63 | 2,35±0,59 | 14,43±3,46*#

ЛГП | 9±1 | немає | 7±1 | 0,14±0,02– | 2,36±0,59*

ДМЯ | 439±71 | 38±6* | немає | 29,59±6,21 | 4,02±0,97*–

Примітки: * – вірогідні зміни (p ,05) по відношенню до групи інтактних тварин; # – вірогідні зміни (p ,05) по відношенню до тварин з 3_тиж. діабетом.

У попередніх дослідженнях було встановлено факт пошкодження і загибелі нейронів вентромедіального ядра при цукровому діабеті, що є причиною виникнення гіперфагії (Колесник Ю.М., Василенко Г.В., и др., 1996). Встановлене в нинішній роботі порушення холецистокінінергичної іннервації ВМЯ може також бути причиною розвитку гіперфагії і загибелі нейронів цієї структури.

Внутрішньочеревні введення ХЦК-8 призводили до вірогідного зниження споживання їжі експериментальними тваринами. Анорексія, яка спостерігається при цьому, вірогідніше, формувалася по описаному в літературі шляху (gerary N., Smith G.P. et al., 1996), який включає в себе активацію рецепторів аферентних волокон блукаючого нерву і висхідну передачу збудження на нейрони солітарного тракту і вентромедіального ядра гіпоталамусу. Внутрішньомозкові введення ХЦК-8, як і внутрішньочеревні, призводили до формування тривалої анорексії, однак механізми її розвитку при цьому шляху введення вірогідніше були іншими. Оскільки введена нами доза ХЦК-8 була недостатня для активації периферичних рецепторів, ефект нейропептида можна пояснити активацією центральних рецепторів, розташованих в ядрах гіпоталамусу, а також в структурах дна IV мозкового шлуночка. Іншим ефектом, що спостерігався під час внутрішньочеревних і при внутрішньомозкових введеннях ХЦК-8, було вірогідне зниження концентрації інсуліну в крові, добре видиме на наведених графіках. Згідно існуючим відомостям (Babb E.L., Tarpley J., et al., 1996), дія ХЦК-8 in vitro на ?-клітини призводить до підсилення секреції інсуліну. Протилежна дія ХЦК-8 в наших дослідженнях, враховуючи відсутність зростання глікемії, вірогідніше являла собою фізіологічну реакцію організму тварин на анорексію.

Рис. . Вплив багаторазових введень агоністу і антагоністу рецепторів холецистокініну на показники вуглеводного гомеостазу нормальних щурів.

В результаті багаторазових внутрішньочеревних введень блокатора рецепторів ХЦК проглюміду у щурів вірогідно зростало середньодобове споживання їжі, що служило об'єктивним підтвердженням ефективності вибраної нами дози в відношенні блокади чинності ендогенного холецистокініну. В крові спостерігалося вірогідне збільшення рівня глікемії натще, що могло відбуватися як внаслідок виникнення гіперфагії, так і ослаблення секреції інсуліну ?-клітинами. Враховуючи, що ХЦК в нормі сенситизують ?-клітини до глюкози (Verspohl E.J., Herrmann K., 1996), послаблення секреції інсуліну при тривалих введеннях проглюміду може бути пояснене блокадою чинності ендогенного ХЦК-8 і зниженням порога чутливості ?-клітин до глюкози.

Розвиток цукрового діабету протягом трьох тижнів від введення стрептозотоцину супроводжувався прогресивним збільшенням глікемії і зниженням концентрації інсуліну в крові (табл. 2). В подальшому, до закінчення п'ятого тижня значущих змін в параметрах вуглеводного гомеостазу не відбувалося. В острівцях до цього терміну спостерігалося значне зменшення кількості ?-клітин і збільшення кількості ?-клітин.

В крові у тварин з цукровим діабетом під впливом введень ХЦК-8 відбувалося зниження концентрації глюкози з 23.6 до 7.8 ммоль/л. Нами також спостерігалось вірогідне, практично дворазове, збільшення концентрації інсуліну, внаслідок підсилення його синтезу і секреції в ?-клітинах. Інсуліностимулюча дія внутрішньочеревних введень ХЦК-8 імовірно пов'язана з прямою активацією його рецепторів на ?-клітинах. Відомо, що при цукровому діабеті внаслідок аутоімунного запалення в панкреатичних острівцях в значній мірі знижується чутливість ?-клітин до глюкози із-за порушення її метаболізму в мітохондріях під впливом локально синтезуємого оксиду азоту і цитокінів (Heitmeier M.R., Scarim A.L., et al., 1997). Як показали дослідження інших авторів, ХЦК-8 при цукровому діабеті володіє спроможністю відновлювати чутливість ?-клітин до глюкози (Kohert K.D., Axcrona M., et al. 1999). Можливі механізми цієї дії можуть полягати не тільки в зміні метаболізму ?-клітин, але і в зменшенні внутрішньоострівцевої продукції оксиду азоту і цитокінів (Meng A.H., Ling Y.L., et al., 2002).

Внутрішньомозкові введення, також ефективно, як і внутрішньочеревні, збільшували концентрацію інсуліну в крові. Бо ХЦК-8, який вводили у шлуночок мозку, не може в достатній кількості проникати в кровообіг, спостерігаємий ефект не зв'язаний з прямою дією на рецептори в панкреатичних острівцях. Отже, ми можемо припустити, що в основі подібної дії нейропептиду при обох шляхах введення лежать різноманітні механізми. Ми припускаємо, що підсилення секреції інсуліну при внутрішньомозкових введеннях пов'язане з активуючою дією ХЦК-8 на структури гіпоталамусу і моторне ядро блукаючого нерву. Можливо, що в умовах функціональної недостатності холецистокінінергичної системи гіпоталамусу при цукровому діабеті, введення екзогенного ХЦК-8 здатні виявляти замісну дію і створювати умови для компенсації центральних механізмів регуляції ендокринної функції підшлункової залози.

Таблиця 2

Зміни стану холкцистокінін-8-синтезуючої системи гіпоталамусу при розвитку експериментального цукрового діабету

Серії експериментальних досліджень | Зміни спожи-вання їжі, % | Концен-трація інсуліну в крові, нмоль/л | Рівень глікемії, ммоль/л | Кількість клітин в площі зрізу панкреа-тичних острівців

б | в | д

Інтактні тварини | 0,0% | 130,0 ± 3,5 | 3,54±0,23 | 20 ± 1 | 33 ± 4 | 4±1

Діабет, 3 тижня | +65,0% * | 73,8 ± 8,9 * | 21,56±1,65* | 20 ± 1 | 15 ± 2* | 6±1*

Діабет, 5 тижнів | +72,1% * | 57,0 ± 5,5 * | 24,94±2,70* | 26 ± 2* | 5 ± 1* | 6±1*

ХЦК_, вн.- чер.– | 21,3% *# | 92,6 ± 11,8 *# | 7,81±2,24*# | 20 ± 2# | 6 ± 1* | 12±1*#

ХЦК_, вн.-мозк.– | 17,5% *# | 92,3 ± 12,1 *# | 14,4±2,8*# | 17 ± 1* | 4 ± 1* | 7 ± 1*

ХЦК_, кон. інст.– | 11,8% *# | 71,0 ± 7,6 *# | 16,2±2,2*# | 20 ± 1# | 11 ± 1*# | 7 ± 1*

Проглюмід, вн-чер. | +13,0% *# | 51,4 ± 9,6 * | 22,98±1,32* | 22 ± 1# | 5 ± 1* | 6±1*

Примітки: * – вірогідні зміни (p ,05) по відношенню до групи інтактних тварин; # – вірогідні зміни (p ,05) по відношенню до тварин з 3_тиж. діабетом; вн._чер. – внутрішньочеревні введення, вн.-мозк. – внутрішньомозкові введення; зміни споживання їжі для груп з 3- та 5-тиж. діабетом вказані по відношенню до інтактних тварин, в інших групах – до тварин з 3-тижневим цукровим діабетом.

Враховуючи дані літератури про існування рецепторів холецистокініну на сітківці ока, активація яких поєднана зі збільшенням імпульсної активності нейронів гіпоталамусу (Луцик П.В., Калихевич В.Н. и др., 1986), нами проведене дослідження ефектів кон‘юнктивальних інстиляцій нейропептиду. В наших дослідженнях для кон‘юнктивальних інстиляцій ми використали ту ж дозу холецистокініну, що й для внутрішньомозкових введень.

В результаті інстиляцій у тварин з експериментальним цукровим діабетом спостерігалось вірогідне зменшення споживання їжі, сопоставиме за величиною з ефектом від внутрішньомозкових введень. Причиною зниження споживання їжі могла бути активація центру насичення в вентромедіальному ядрі гіпоталамусу. Як нами було показане раніше, в цьому ядрі при цукровому діабеті відбувається порушення секреції ендогенного холецистокініну.

При кон‘юнктивальних інстиляціях холецистокінін також ефективно як і при центральних введеннях знижував рівень глікемії і збільшував концентрацію інсуліну в крові. У панкреатичних острівцях при інстиляціях відбувалося вірогідне збільшення кількості ?-клітин.

Рис. . ?-клітини панкреатичних острівців у щурів з експериментальним цукровим діабетом (А) та при кон‘юнктивальних інстиляціях ХЦК_щурам з діабетом (Б).

Механізм дії ХЦК при кон‘юнктивальних інстиляціях можливо пояснюється компенсацією недостатності утворення ендогенного ХЦК-8 в ядрах гіпоталамусу, які беруть участь у регуляції ендокринної функції підшлункової залози.

Проглюмід при цукровому діабеті не викликав вірогідних змін в споживанні їжі, концентрації інсуліну в крові і кількості ?-клітин в панкреатичних острівцях. На наведених фотографіях ви бачите, що введення проглюміду не впливали на процес деструкції ?-клітин і синтез інсуліну в них. Відсутність ефектів при введенні проглюміду, на нашу думку, є підтвердженням недостатності синтезу ендогенного холецистокініну при цукровому діабеті.

ВИСНОВКИ

1. Особливості стану холецистокінінергічної системи гіпоталамусу в динаміці розвитку цукрового діабету вивчені недостатньо, а дані про її роль в регуляції ендокринної функції підшлункової залози відрізняються неповнотою і суперечливістю.

2. Рішення поставленої проблеми здійснювалось шляхом комплексної оцінки стану холецистокінін-8-синтезуючої системи гіпоталамусу в нормі та в динаміці розвитку експериментального цукрового діабету, яка включала картування холецистокінін-8-синтезирующих нейронів, характеристику процесів утворення, накопичення і виведення холецистокініна-8, а також введення синтетичного холецистокініну-8 і блокатора його рецепторів проглюміду з наступним вивченням ?-, в- ? д-?літин панкреатичних острівців.

3. Найбільший сумарний вміст холецистокініну-8 і найбільша кількість холецистокінін-8-синтезуючих нейронів виявлено в області медіального дрібноклітинного суб‘ядра паравентрикулярного ядра гіпоталамусу і в області дорсомедіального ядра гіпоталамусу. У вентромедіальному і аркуатному ядрах гіпоталамусу, латеральной ретрохіазмальної області і серединному піднесенні у щурів в нормі ідентифікуються лише холецистокінін-8-імунопозитивні нервові волокна і закінчення.

4. Формування експериментального цукрового діабету до кінця 3 тижня поряд з деструкцією панкреатичних острівців і зниженням секреції інсуліну супроводжується зменшенням кількості холецистокінін-8-синтезуючих нейронів, зменшенням щільності розташування холецистокінін-8-імунопозитивних волокон нервові закінчення в усіх структурах гіпоталамусу, що вивчалися. В подальшому, до кінця 5 тижня спостерігається збільшення кількості холецистокінін-8-синтезуючих нейронів, однак при цьому відбувається порушення виведення нейропептиду по аксонам. Недостатність утворення і виведення холецистокініну_в гіпоталамусі призводить до порушення центральної регуляції секреції інсуліну і споживання їжі при цукровому діабеті

5. Холецистокінін-8 у нормальних тварин при різних шляхах введень (внутрішньочеревні, внутришньомозкові, кон‘юнктивальні) викликає розвиток анорексії, а антагоніст рецепторів холецистокініну проглюмід – гіперфагії. При внутрішньочеревних введеннях холецистокініну-8 спостерігається зниження секреції інсуліну, при внутришньомозкових і кон‘юнктивальних – зниження секреції інсуліну і глюкагону, а також збільшення рівня глікемії.

6. Багаторазові внутрішньочеревні, внутришньомозкові і кон‘юнктивальні введення холецистокініну-8 тваринам з експериментальним цукровим діабетом призводять до зменшення гіперфагії, підсилення секреції інсуліну ?-клітинами, зменшенню кількості ?-клітин у панкреатичних острівцях і гальмуванню продукції глюкагону в них, що веде до збільшення концентрації інсуліну в крові і зниженню глікемії. Багаторазові введення проглюміду у щурів з експериментальним цукровим діабетом не виявляють значущої чинності на ендокринну функцію підшлункової залози і не викликають вірогідних змін концентрації інсуліну і глюкози в крові.

7. Розвиток експериментального цукрового діабету супроводжується формуванням функціональної недостатності холецистокінін-8-синтезующчої системи гіпоталамусу, що призводить до порушення холецистокінінергічних механізмів регуляції харчової поведінки і ендокринно функції підшлункової залози. Заміщення недостатності утворення ендогенного холецистокініну-8 шляхом введень синтетичного нейропептиду сприяє поліпшенню ендокринної функції підшлункової залози і зниженню тяжкості патологічного процесу. Висока ефективність і неінвазивність кон‘юнктивальних інстиляцій синтетичного холецистокініну-8 робить її перспективним засобом медикаментозної корекції цукрового діабету.

СПИСОК НАУКОВИХ РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Kolesnik Y.M., Orlovsky M.A. Image analysis system for quiantitative immunofluorescence measurements // Microscopy and Analysis.– 2002.– _____

2. Орловский М.А. Роль рецепторов холецистокинина в патогенезе сахарного диабета (экспериментальное исследование с проглюмидом) // Запорожский медицинский журнал.– 2003.– № .– С.7_.

3. Колесник Ю.М., Орловський М.О., Абрамов А.В., Жулинський В.О. Ефекти кон’юнктивальних інстиляцій холецистокініну 26-33 на ендокрину функцію підшлункової залози в нормі та при цукровому діабеті 1 типу // Фізіологічний Журнал.– 2003.- Т.49, №4.- С. 72-80.

4. Колесник Ю.М., Орловский М.А., Абрамов А.В. Состояние синтеза октапептида холецистокинина 26-33 в гипоталамусе у крыс при экспериментальном сахарном диабете // Запорожский медицинский журнал.– 2003.– № .– С.4_.

5. Колесник Ю.М., Орловский М.А., Абрамов А.В., Лебедь Ю.В. Состояние нейроэндокринной системы гипоталамуса, участвующей в контроле эндокринной функции поджелудочной железы при развитии экспериментального сахарного диабета // Акт. питання фармацевтичної та медичної науки та практики.– 2003.– Вип. 11.– С.217-225.

6. Колесник Ю.М., Орловский М.А., Абрамов А.В. Метод количественной оценки активности процессов синтеза и секреции инсулина в ?-клетках островков Лангерганса // Морфология.– 2002.– Т.122, №5.– С.70-73.

7. Колесник Ю.М., Орловский М.А., Абрамов А.В. Роль холецистокинина октапептида в регуляции эндокринной функции поджелудочной железы в норме и при экспериментальном сахарном диабете 1 типа // Запорожский медицинский журнал.– 2001.– № .– С.20_

8. Донецк

9. Колесник Ю.М., Орловский М.А., Абрамов А.В., Жулинский В.А. Сравнительная характеристика эффектов холецистокініна при различных способах введения нормальным и диабетическим крысам // Запорожский медицинский журнал.– 2001.– № .– С.11_.

10. Колесник Ю.М., Орловский М.А. Современные представления об анатомо-физиологических особенностях островков Лангерганса и механизмах их деструкции при сахарном диабете 1 типа // Запорожский медицинский журнал.– 2000.– Т.3, № .– С.3-11.

11. Абрамов А.В., Орловський М.О., Колесник Ю.М. Ефекти хронічного введення холецистокініну на ендокринну функцію острівкового апарату підшлункової залози у інтактних щурів та щурів з експериментальним діабетом // Матеріали пленуму товариства патофізіологів України / Фізіол. журн.– 1998.– Т.44, №3.– С.203.

12. Колесник Ю.М., Абрамов А.В., Орловський М.О. Вплив хронічного введення холецистокініну на функціональний стан ендокринних клатин підшлункової залози при єкспериментальному цукровому діабеті // Матеріали VI з‘їзду ендокринологів України / Ендокрінологія.– 2001.– Т.6, додаток.– С.138.

13. Орловский М.А., Абрамов А.В. Роль холецистокініна в регуляции эндокринной функции поджелудочной железы у интактных и диабетических крыс // Актуальні аспекти ендокринних захворювань / Матер. наук. практ. конф.– Харків.– 1998.– С. 34-35

14. Колесник Ю.М., Абрамов А.В., Жулинский В.А., Орловский М.А., ВасиленкоГ.В. Современные методические подходы к изучению нейроэндокринных взаимодействий // Сучасні напрямки розвитку ендокринології (другі Данилевські читання). / Матеріали науково-практичної конференції. Харків, 2003.– С.98-100.

15. Орловский М.А., Колесник Ю.М. Изменение синтеза холецистокинина в медиобазальном гипоталамусе у крыс при развитии экспериментального сахарного диабета // Архив клинической и экспериментальной медицины.– 2003.– Т.12, №1 (прил.).– С.74

АНОТАЦІї:

Орловський М.О. Стан холецистокінін-синтезуючої системи гіпоталамусу і роль холецистокініну-8 в регуляції ендокринної функції підшлункової залози в нормі та при експериментальному цукровому діабеті.– Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04 – патологічна фізіологія. Інститут фізіології ім. акад. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2004.

Дисертація присвячена вивченню стану холецистокінін-синтезуючої системи гіпоталамусу, а також впливу введень синтетичного агоніста і антагоніста рецепторів холецистокініну на ендокринну функцію підшлункової залози в нормі і при експериментальному цукровому діабеті.

Встановлено, що найбільший рівень утворення холецистокініну-8 спостерігається в паравентрикулярному і дорсомедіальному ядрах гіпоталамусу, а найбільш інтенсивна холецистокінінергічна іннервація – в вентромедіальном ядрі і серединному підвищені гіпоталамусу. Вперше показано, що розвиток експериментального цукрового діабету супроводжується формуванням функціональної недостатності холецистокінін-8-синтезуючої системи гіпоталамусу. Встановлено, що багаторазові введення синтетичного холецистокініну_сприяють поліпшенню ендокринної функції підшлункової залози і зниженню важкості патологічного процесу.

Ключові слова: холецистокінін октапептид, експериментальний цукровий діабет, гіпоталамус, панкреатичні острівці, проглюмід, введення нейропептидів.

Орловский М.А. Состояние холецистокинин-синтезующей системы гипоталамуса и роль холецистокинина-8 в регуляции эндокринной функции поджелудочной железы в норме и при экспериментальном сахарном диабете.– Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04 – патологическая физиология. Институт физиологии им. акад. А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 2004.

Диссертация посвящена изучению состояния холецистокинин-синтезирующей системы гипоталамуса, а так же влияния введений синтетического агониста и антагониста рецепторов холецистокинина на эндокринную функцию поджелудочной железы в норме и при экспериментальном сахарном диабете.

Решение поставленной проблемы осуществлялось путем комплексной оценки состояния холецистокинин-8-синтезующей системы гипоталамуса в норме и в динамике развития экспериментального сахарного диабета, включающей картирование холецистокинин-8-синтезирующих нейронов, характеристику процессов образования, накопления и выведения холецистокинина-8, а так же введения синтетического холецистокинина-8 и блокатора его рецепторов проглюмида с последующим изучением ?-, в- ? д-?леток панкреатических островков.

В работе установлено, что наибольший уровень образования холецистокинина_наблюдается в паравентрикулярном и дорсомедиальном ядрах гипоталамуса, а наиболее интенсивная холецистокининергическая иннервация характерна для вентромедиального ядра и срединного возвышения гипоталамуса.

Впервые показано, что развитие экспериментального сахарного диабета сопровождается формированием функциональной