Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

Потапенко Євгеній Сергійович

УДК 616.092.18

Вплив змін лужно – кислотної рівноваги позаклітинного середовища на функціонування кальцієвих депо нейронів заднього рогу спинного мозку щурів

14.03.04 – Патологічна фізіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі загальної фізіології нервової системи

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник:

академік НАН України, доктор біологічних наук Костюк Платон Григорович

директор Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

зав. відділом загальної фізіології нервової системи (ЗФНС)

Офіційні опоненти:

- доктор медичних наук Соловйов Анатолій Іванович, головний науковий співробітник Інституту фармакології та токсикології АМН України;

- доктор біологічних наук Кришталь Микола Васильович, доцент кафедри патологічної фізіології Національного медичного університету ім.О.О.Богомольця.

Провідна установа:

Інститут ендокринології та обміну речовин ім.В.П.Коміссаренко НАН України, м.Київ.

Захист відбудеться ”_22_”___червня___” 2004 р. о ”_14_” годині на засіданні

Спеціалізованої вченої ради при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий ”_14___”__травня___” 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук ________________ Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Роль внутрішньоклітинних вільних іонів кальцію ([Ca2+]i), як вторинного посередника, визначається його здатністю до взаємодії з регуляторними білками клітини. Гомеостаз кальцію в клітині забезпечується динамічною взаємодією структур плазматичної мембрани та внутрішньоклітинних органел (мітохондрій, ендоплазматичного ретикулуму). Відносний внесок цих структур та взаємодія між ними відрізняється в клітинах різних типів та залишається в цілому маловивченою. Одним з таких маловивчених типів клітин є нейрони заднього рогу спинного мозку (DH нейрони). Ураження нервової системи виникають при багатьох захворюваннях та можуть розвиватись у вигляді різноманітних нейропатій, які супроводжуються порушеннями сенсорики у формі больових синдромів чи втрати чутливості, що, в свою чергу, може призводити до інвалідізації пацієнтів. Визначення етіології та дослідження патогенезу цих порушень є надзвичайно важливою проблемою як для дослідників, так і для практикуючих лікарів. Важливим фактором у розвитку патологій нервової системи є зміна такого інтегрального показника гомеостазу організму, як концентрація іонів водню (наприклад, кетоацидоз при цукровому діабеті), що може призводити до порушень у функціонуванні pH – чутливих Са2+-регулюючих систем. Дані про зміни у роботі ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) та мітохондрій DH нейронів при цих станах практично відсутні. Розширення наших знань про регуляцію концентрації Ca2+ у цитозолі ([Ca2+]i) в умовах позаклітинного алкалозу та ацидозу дозволить покращити наше уявлення про зміни, які відбуваються у нервових клітинах при різноманітних захворюваннях, що, в свою чергу, допоможе у пошуках шляхів корекції цих порушень. Аналіз участі, відносного внеску та взаємодії мітохондрій та ЕР, як основних учасників процесу підтримки кальцієвого гомеостазу та його порушень при алкалозі та ацидозі, є надзвичайно важливим та має незаперечний науковий інтерес та практичне значення.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукової програми відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: “Молекулярні механізми, відповідальні за специфіку функцій різних мозкових структур”.

Мета дослідження. Оцінка відносної участі кальційрегулюючих органел (мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму) у кальцієвій сигналізації та їхньої взаємодії у нейронах заднього рогу спинного мозку (вторинні сенсорні нейрони) в контрольних умовах та при позаклітинній ацидіфікації та алкалінізації.

Завдання дослідження.

· Виявити зміни базального рівня [Ca2+]i в умовах позаклітинної алкалінізації та ацидіфікації.

· Визначити участь мітохондрій у формуванні кальцієвого сигналу, викликаного деполяризацією та виведенням Ca2+ з кофеїн-чутливого депо ендоплазматичного ретикулуму DH нейронів.

· Визначити зв’язок між просторовим розташуванням мітохондрій та ЕР та участю цих структур у формуванні кальцієвих транзієнтів.

· Порівняти характеристики кальцієвих транзієнтів, викликаних деполяризацією 50mM розчином KCl в нейронах заднього рогу спинного мозку щурів в контрольних умовах та при позаклітинній алкалінізації та ацидіфікації.

· Визначити роль уніпортеру та Na+/Ca2+ обмінника мітохондрій у процесі змін базального рівня [Ca2+]i в DH нейронах при позаклітинному алкалозі та ацидозі.

· Визначити роль кофеїн-чутливого депо ЕР у змінах базального рівня [Ca2+]i в DH нейронах при позаклітинному алкалозі та ацидозі.

· Охарактеризувати процес взаємодії мітохондрій та ЕР при виникненні змін у базальному рівні [Ca2+]i в умовах позаклітинного алкалозу.

· Встановити внесок мітохондрій, ЕР та кальцієвих каналів цитоплазми у зміни амплітуди та кінетичних характеристик кальцієвих транзієнтів, викликаних деполяризацією 50mM розчином KCl в цих нейронах в умовах позаклітинної ацидіфікації та алкалінізації.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше був досліджений характер та кінетика участі мітохондрій та ЕР у кальцієвій сигналізації при наявності різних джерел надходження Ca2+ до цитозолю. Дістало подальший розвиток дослідження взаємодії між мітохондріями та ЕР та змін у їхньому функціонуванні при позаклітинній алкалінізації і ацидіфікації. Нами вперше був доведений вплив вивільнення Ca2+ з мітохондрій на виникнення кальцій-індукованого Ca2+ вивільнення (CICR, calcium induced calcium release) з ріанодинового депо ЕР.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Результати, отримані в цій роботі, мають теоретичне та практичне значення. Дослідження особливостей участі мітохондрій та ЕР у формуванні [Ca2+]i сигналу та змін у їхньому функціонуванні в умовах позаклітинного алкалозу та ацидозу в DH нейронах щурів дозволять розширити наше уявлення про механізми Ca2+ гомеостазу в контрольних умовах та при станах, що супроводжуються зсувами позаклітинного рН. Це, в свою чергу, поліпшить наше розуміння патогенезу порушень з боку нервової системи при різноманітних захворюваннях. Вивчення впливу різноманітних хімічних та фармакологічних речовин на функціонування внутрішньоклітинних систем, що підтримують кальцієвий гомеостаз, ставить питання про їхнє можливе використання при корекції його порушень у клінічній практиці.

Особистий внесок здобувача. Експерименти з дослідження участі кальцієвих депо в регуляції [Ca2+]i у DH нейронах, змін у функціонуванні цих депо при позаклітинному алкалозі та ацидозі, а також їхньої взаємодії, проводились автором особисто. Експерименти з використанням електронмікроскопічних методів дослідження просторового розташування мітохондрій та ЕР відносно один одного та плазматичної мембрани проводились спільно з аспіранткою відділу цитології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця Гірник О. В. Обробка та статистичний аналіз результатів проводились автором особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались на: 1-му білатеральному Богомолець–Ненцкі симпозіумі, Сулейов, Польща, 2001; 3–му форумі Федерації Європейських Нейронаук, Париж, Франція, 2002; щорічній конференції Товариства Нейронаук, Орландо, США, 2002; 2–му білатеральному Богомолець–Ненцкі симпозіумі, Київ, 2002; 3–й конференції українського біофізичного товариства, Львів, 2002; конференції фізіологічного товариства Угорщини “Оксидативний стрес та клітинна сигналізація”, Будапешт, Угорщина, 2003; VI конгресі нейронаук IBRO, Прага, Чехія, 2003, а також на семінарах сектору молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця, Київ, Україна у 2001–2003 роках.

Публікації. Результати досліджень опубліковані у п’яти наукових статтях та п’яти тезах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 217 найменувань. Робота викладена на 145 сторінках та ілюстрована 33 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність дослідження відносної участі кальційрегулюючих органел (мітохондрій та ЕР) у [Ca2+]i сигналізації та їхньої взаємодії у DH нейронах в контрольних умовах та при позаклітинній ацидіфікації та алкалінізації, сформульована мета та задачі дослідження, наведені відомості про наукову новизну, практичну цінність та апробацію отриманих результатів, публікацію матеріалів дисертації.

Розділ 1 ”Огляд літератури” присвячений висвітленню відомих аспектів процесу кальцієвого гомеостазу у нервових клітинах, взаємодії між кальцієвими депо та кальцієвими каналами плазмалеми. Охарактеризовані нейрони заднього рогу спинного мозку та структури, що приймають участь у [Ca2+]i сигналізації, а також їхні фармакологічні властивості. Висвітлені особливості функціонування цих структур в умовах зсувів позаклітинної концентрації H+ та розглянуті стани, що до них призводять. Критично проаналізовано протиріччя в результатах наукових робіт та обґрунтовано актуальність дослідження впливу змін кислотно-лужної рівноваги позаклітинного середовища на функціонування кальцієвих депо в нейронах заднього рогу спинного мозку щурів.

Для досягнення поставленої мети у розділі 2 ”Матеріали та методи дослідження” описано використання наступних методичних підходів:

· виділення гостроізольованих нейронів заднього рогу спинного мозку щура;

· флуоресцентний метод вимірювання внутрішньоклітинної концентрації іонів Ca2+;

· метод електронної мікроскопії ділянки тканин тонких зрізів спинного мозку, що відносяться до заднього рогу спинного мозку;

· статистична обробка отриманих результатів з використанням стандартних методів аналізу.

Виділення гостроізольованих нейронів заднього рогу спинного мозку щура. В дослідах використовувались 11-денні самці білих щурів лінії Вістар. Процедура декапітації щура проводилась у відповідності з вимогами НАН України по використанню експериментальних тварин. Після виділення поперекового відділу спинного мозку та видалення його оболонок проводилось нарізання тонких поперечних зрізів (300мкм) за допомогою вібратому (Campden Instruments LTD, Велика Британія). Вирізані ділянки заднього рогу піддавались послідовній ферментній обробці у розчині ACSF, що містив 0,2мг/мл пронази Е (Calbiochem, США) на протязі 12 хвилин та 0,05мг/мл протеази Х типу (Sigma, США) на протязі 10 хвилин. Окремі клітини отримувались за допомогою м’якого піпетування з використанням піпеток різного діаметру на протязі декількох хвилин.

Флуоресцентний метод вимірювання внутрішньоклітинної концентрації іонів Ca2+. Свіжоізольовані DH нейрони інкубували протягом 30 хв. при температурі 37?С в розчині, що містив 10мкМ Indo-1AM. Після цього клітини тричі відмивались чистим зовнішньоклітинним розчином і залишались в темряві при кімнатній температурі на 30-40 хвилин для деестерифікації Indo-1AM. Збудження флуоресцентного зонду здійснювалось при довжині хвилі 360нм за допомогою відповідного фільтру. Реєстрація емісії проводилась у двох діапазонах: 395-410нм (F400) та 490-510нм (F500) за допомогою фотопомножувачів. Сигнали з фотопомножувачів подавали на вхід аналогового ділителя DIV100 (Burr Broun, США), який в реальному масштабі часу обчислював співвідношення флуоресцентних сигналів на двох довжинах хвиль: R=F400/F500. Це співвідношення є пропорційним до [Ca2+]i, та не залежить від концентрації зонду в клітині. Для обчислення [Ca2+]i нами використовувалась формула Грінкевича:

[Ca2+]i = Kd B (R - Rmin)/(Rmax - R),

де Kd-константа дисоціації індикатору з Ca2+; B-коефіцієнт, що визначається оптичними характеристиками установки та дорівнює відношенню F5000/F500s (F5000-інтенсивність флуоресценції Indo-1 за відсутності Ca2+, F500s–інтенсивність флуоресценції Indo-1 при насичуючій концентрації Ca2+.

Електронмікроскопічне дослідження. Для електронної мікроскопії ділянки тканин тонких зрізів спинного мозку, що відносяться до заднього рогу, фіксувались у розчині 3% глутаралдегіду та 4% параформальдегіду у 0,1М фосфатному буфері (рН 7,4) на протязі 1 години. Після цього тканини промивались фосфатним буфером та фіксувались в осмії на протязі 1 години. Після трьох подальших промивок у фосфатному буфері зразки були дегідратовані методом серійної промивки у розчинах з концентрацією етанолу, що зростала, проходячи через градуйований ацетон–суміш EPON та залишалась у ньому на ніч. Потім зразки були імплантовані до желатинових капсул. Тонкі секції (1–2мкм) були пофарбовані у водному уранілацетаті та цитраті свинцю. Отримані секції досліджувались за допомогою електронного мікроскопу JEM-100C.

Електрофізіологічні вимірювання. Фізіологічний розчин, що використовувався для виділення спинного мозку та отримання ізольованих клітин заднього рогу містив (у мМ): NaCl 125; KCl 5; CaCl2 2,5; MgSO4 1,5; NaHCO3 25; KH2PO4 1,6; глюкоза 10, рН 7,35, при постійному оксигенуванні сумішшю 5%CO2+95%O2. Базовим позаклітинним розчином, що використовувався для перфузії експериментальної камери та приготування всіх інших позаклітинних розчинів був модифікований розчин Тироде наступного складу (у мМ): NaCl 140, KCl 2, MgCl2 2, CaCl2 2, HEPES 10, глюкоза 10, рН 7,35. Деполяризуючий розчин містив (у мМ): NaCl 92, KCl 50, MgCl2 2, CaCl2 2, HEPES 10, глюкоза 10. Безкальцієвий фізіологічний розчин отримували шляхом заміни CaCl2 у базовому розчині на MgCl2, а також додаванням хелатора Ca2+–EGTA у концентрації 2мМ. Для відтворення позаклітинного алкалозу та ацидозу проводилась ізоосмолярна заміна у модифікованому розчині Тироде NaCl на NaOH та HCl відповідно. Значення рН позаклітинного розчину при алкалозі та ацидозі складали 8,8 та 6,0 відповідно. Іndo-1АМ була отримана від компанії Molecular Probes, (Eugene, США), всі інші солі та реагенти - від компанії Sigma-Aldrich Chemie GmbH. (Deisenhofen, ФРН). Всі числові значення результатів досліджень приводились у вигляді середнього значеннясередньоквадратичне відхилення (SEM). Після кожного результату приводиться значення числа експериментів (n), яке є кількістю досліджених клітин. Достовірність статистичних відмінностей для двох груп результатів експериментів визначалась за допомогою Ст’юдент-тесту (Т-тесту). Критерієм достовірності відмінностей було вибране значення P<0,05. Якщо величина Р була значно нижче, це вказувалось спеціально (наприклад Р<0,001). Час напівспаду [Ca2+]i сигналу обчислювався за допомогою формули:

t0,5 = t(max)-t(max)/2,

де t(max) – поточний час в точці максимума сигналу; t(max)/2–час, за який величина [Ca2+]i зменшувалась до значення, що дорівнює половині амплітуди сигналу.

Величина залишкового рівня [Ca2+]i на 60 секунді визначалась за формулою:

R60=([Ca2+]60/[Ca2+]peak)·100% .,

де [Ca2+]peak–максимальна амплітуда сигналу; [Ca2+]х–величина амплітуди сигналу через х секунд після досягнення максимальної амплітуди сигналу.

У третьому розділі ”Результати досліджень” експериментально визначені особливості кальцієвої сигналізації у нейронах заднього рогу спинного мозку, кінетичні властивості внутрішньоклітинних кальцієвих депо в залежності від джерела надходження Ca2+ до цитозолю та досліджений зв’язок цих властивостей з просторовим розташуванням мітохондрій та ЕР, вплив змін рН позаклітинного розчину на [Ca2+]i сигналізацію у цих нейронах.

Кальцієва сигналізація у вторинних сенсорних нейронах щурів у контрольних умовах. Концентрація [Ca2+]i у цитозолі нейронів заднього рогу спинного мозку у контрольних умовах (базальний рівень) складала 663нМ (n=33). Кальцієвий сигнал, викликаний деполяризацією нейронів був викликаний за допомогою аплікації розчину, що містив 50мМ КСl (гіперкалієвий розчин). Деполяризація, викликана його прикладанням на протязі 5 секунд, призводила до виникнення потужного транзієнтного підвищення концентрації [Ca2+]i. Кальцієвий транзієнт при цьому мав фазу швидкого наростання від базального рівня до величини у 53851нМ (n=21) на протязі 5секунд та більш повільну фазу спаду. Найбільш інтенсивне зниження концентрації [Ca2+]i відбувалось у перші 5 секунд фази спаду. Потім його швидкість поступово зменшувалась, досягаючи базального рівня на протязі 30–60сек (рис.1).

Рис.1.Внутрішньоклітинний кальцієвий сигнал, викликаний деполяризацією цитоплазматичної мембрани DH нейрону гіперкалієвим розчином ().

При меншому часі деполяризації (3 cекунди) Ca2+ транзієнт досягав меншої амплітуди, а характер спаду наближався до лінійного. При збільшенні часу деполяризації до 10 секунд амплітуда [Ca2+]i транзієнту не зростала. Натомість, відбувалось зниження концентрації [Ca2+]i ще до закінчення деполяризації після невеликого у часі плато. При збільшенні часу деполяризації характер фази спаду транзієнта не змінювався. Спостерігалось лише незначне збільшення часу, необхідного для повернення концентрації Са2+ до базального рівня. При повторній деполяризації амплітуда другого транзієнту недостовірно знижувалась до 492±48нМ (на 8,5%; n=19).

Кальцієві сигнали, викликані активацією IP3 –чутливого депо ендоплазматичного ретикулуму. Для того, щоб визначити наявність на сомі гостроізольованих DH нейронів активних метаботропних пурінорецепторів (Р2YR), використовувалась аплікація 200мкМ АТФ у безкальцієвому позаклітинному розчині. Це не призводило до збільшення концентрації [Ca2+]i у 100% нейронів (n=100), в той час як аплікація АТФ у нормальному розчині Тироде призводила до виникнення [Ca2+]i транзієнтів у 39 з 76 клітин з амплітудою 78,817нМ (рис.2).

Рис.2.Кальцієвий транзієнт, викликаний аплікацією АТФ (АТР) у розчині з нормальним вмістом кальцію та відсутність такого у безкальцієвому вільного розчині (). Кожному прикладанню АТФ передувала гіперкалієва деполяризація ().

Kальцієві транзієнти, викликані аплікацією АТФ у нормальному розчині Тироде, були опосередковані активацією іонотропних пурінорецепторів та надходженням Ca2+ з позаклітинного середовища, а не вивільненням з депо ЕР.

Кальцієві сигнали, викликані активацією ріанодин–чутливого депо ендоплазматичного ретикулуму. Позаклітинна аплікація 30мкМ кофеїну викликала транзієнтне підвищення рівню [Ca2+]i з амплітудою 7013нМ (n=19), яке залежало від ступеня наповненості кальцієвого депо ЕР. Після гіперкалієвої деполяризації та викликаного нею перезаповнення депо ЕР за допомогою механізму SERCA (sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Са2+-ATPase) аплікація кофеїну викликала кальцієвий транзієнт вже значно більшої амплітуди (208,523нМ) (n=19, Р<0,001) (рис.3). Кофеїн–індукований кальцієвий транзієнт характеризувався швидким

Рис.3.Кофеїн–індуковане вивільнення іонів кальцію з депо ендоплазматичного ретикулуму. Ефект перезаповнення ендоплазматичного ретикулуму.

зростанням та повільнішим спадом [Ca2+]i. В серії з кількох послідовних аплікацій кофеїну (без попереднього перезаповнення депо ЕР) кожен наступний транзієнт менший за амплітудою за попередній, а 6–7 аплікація вже не викликає підвищення рівню [Ca2+]i. Преаплікація кофеїну також призводить до зниження амплітуди транзієнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією DH нейронів. Це пов’язане з послабленням ефекту CICR з ЕР через зменшення концентрації Са2+ в ньому.

Роль мітохондрій у кальцієвій сигналізації. Наступні досліди проводились виходячи з припущення про те, що мітохондрії, як депо кальцію, відіграють певну роль в амплітуді та кінетиці спаду деполяризаційного кальцієвого транзієнту та кофеїн-iндукованого підвищення [Ca2+]i.

Вплив уніпортеру мітохондрій на амплітуду та кінетику кальцієвих сигналів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією. Для дослідження впливу мітохондрій на [Ca2+]i ми використовували позаклітинну аплікацію СССР–протонофору, що у концентрації 1-10мкМ викликає руйнування протонного градієнту на внутрішній мембрані мітохондрій та блокує роботу мітохондріального уніпортеру, що призводить до порушення акумулювання цитозольного кальцію та підвищення концентрації [Ca2+]i (рис.4). Середня амплітуда підвищення [Ca2+]i при прикладанні

Рис.4.Підвищення [Ca2+]i при аплікації 10мкМ СССР

СССР становила 14334нМ (n=34). Максимальне значення амплітуди досягалось на 8,91,8сек. Кінетика кальцієвого сигналу при цьому характеризувалась відносно швидким ростом та початковою фазою спаду, що переходила у платоподібне зниження рівню [Ca2+]i, який за декілька хвилин досягав базального рівня. R60 становив 50,7%. При деполяризації клітини на фоні аплікації 10мкМ СССР відбувалось додаткове підвищення [Ca2+]i, амплітуда якого достовірно перевищувала (на 9,5%) величину кальцієвого транзієнту у контрольних умовах, досягаючи величини 590,747нМ (Р<0,05) (n=15). Крім того, відбувалось уповільнення фази спаду транзієнту, особливо виражене на протязі його перших кількох десятків секунд (рис.5). У DH нейронах t0,5 деполяризаційного кальцієвого

Рис.5.Співставлені внутрішньоклітинні кальцієві транзієнти, викликані гіперкалієвою деполяризацією в контролі (тонка лінія) та на фоні прикладення мітохондріального протонофору СССР (товста лінія).

транзієнта зріс з 81сек у контрольних умовах до 152сек на фоні СССР (n=15, Р<0,001). Ці результати можуть свідчити про те, що мітохондрії активно захоплюють Ca2+ у проміжок часу, що відповідає максимальній амплітуді кальцієвого транзієнту, та виводять назад до цитозолю в період спаду транзієнту. Для перевірки цього припущення СССР аплікувався через 3 секунди після закінчення деполяризації (рис.6А). Це призводило до виникнення відносно

Рис.6.СССР–індуковане підвищення [Ca2+]i на спаді деполяризаційного транзієнту:

A – на початку фази спаду транзієнту.

В – в кінці фази спаду транзієнту.

невеликого додаткового підвищення рівня [Ca2+]i. Але, якщо аплікація СССР відбувалась у час, що відповідав нижній частині фази спаду транзієнту (коли рівень [Ca2+]i наближався до базального), це призводило до появи потужного підвищення концентрації Ca2+ у цитозолі (рис.6B). Середня амплітуда СССР–індукованого підвищення [Ca2+]i складала 7822нМ (n=11) на 3 секунді після закінчення деполяризації та 30972нМ (n=15) в кінці фази спаду транзієнту. Через 2 хвилини після повернення [Ca2+]i до базального рівня амплітуда СССР–індукованого підвищення [Ca2+]i становила 14334нМ (n=34). Додаткове підвищення [Ca2+]i у цих експериментах пояснюється порушенням динамічної рівноваги між процесами захоплення Ca2+ за допомогою механізму уніпортеру, робота якого заблокована СССР, та його виведенням до цитозолю Na+/Ca2+ обмінником. Для того, щоб більш точно оцінити кінетику участі уніпортеру мітохондрій у кальцієвій сигналізації, були побудовані графіки, що являли собою усереднене значення 15 індивідуальних кальцієвих транзієнтів (деполяризаційних транзієнтів, деполяризаційних транзієнтів на фоні СССР та різниці між ними, яка власне і відображає внесок уніпортеру мітохондрій), нормалізованих до 100% (рис.7). Мітохондрії певною мірою

Рис.7.Захват та виведення кальцію мітохондріями. Порівняння деполяризаційних кальцієвих транзієнтів, зареєстрованих до (тонка лінія) та після (пунктирна лінія) аплікації 10 мкМ СССР. Товстою лінією показана різниця між ними.

обмежують амплітуду кальцієвого транзієнту, викликаного деполяризацією, загальмовуючи початкову фазу даного транзієнту та призводячи до появи плато. Очевидно, що концентрація Ca2+ у мітохондріях зростає під час наростання та (більшою мірою) під час спаду транзієнту. Виведення кальцію з мітохондрій відбувається повільно на протязі кількох хвилин після майже повного повернення [Ca2+]i до базального рівня та не призводить до значних його коливань, очевидно, компенсуючись іншими механізмами, що відповідають за виведення Ca2+ з цитозолю.

Вплив Na+/Ca2+ обмінника мітохондрій на амплітуду та кінетику кальцієвих сигналів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією. Для дослідження механізмів виведення Ca2+ з мітохондрій до цитозолю за участю Na+/Ca2+ обмінника та його впливу на кальцієву сигналізацію використовувався його блокатор тетрафенілфосфоніум (ТРР+). Аплікація ТРР+ сама по собі не призводила до зміни базового рівня [Ca2+]i, що свідчить про відсутність помітної ролі Na+/Ca2+ обмінника у спокої. Деполяризація нейронів на фоні прикладання 25мкМ розчину ТРР+ призводила до транзієнтного підвищення [Ca2+]i з дещо меншою амплітудою, ніж при відсутності ТРР+ (амплітуда деполяризаційних транзієнтів недостовірно знижувалась з 54242нМ до 51539нМ) (n=8, Р>0,05). Це свідчить про те, що у проміжок часу, який відповідає максимальній амплітуді кальцієвого транзієнту накопичення Ca2+ мітохондріями через механізм уніпортеру ще не надто потужне. Натомість, деполяризація на фоні ТРР+ призводила до достовірних змін у фазі спаду [Ca2+]i транзієнтів (t0,5). Так, якщо у контролі ця величина складала 3,80,4сек, то на фоні ТРР+ 2,80,2сек (n=8, Р<0,01). R60 достовірно зменшувався з 14,3% у контролі до 3,2% у присутності ТРР+ (n=8, P<0,0001) (рис.8). Таким чином,

Рис.8.Вплив блокатора Na+/Ca2+ обмінника мітохондрій ТРР+ на кальцієві транзієнти, викликані гіперкалієвою деполяризацією.

саме робота Na+/Ca2+ обмінника значною мірою визначає час, необхідний для відновлення базального рівня [Ca2+]i після деполяризації, потужність роботи обмінника залежить від концентрації кальцію у мітохондріях, що, в свою чергу, залежить від роботи мітохондріального уніпортеру.

Вплив пор з перехідною проникністю (РТР) мітохондрій на амплітуду та кінетику кальцієвих сигналів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією. Кальцієві транзієнти, викликані гіперкалієвою деполяризацією в контролі та на фоні блокатора РТР циклоспоріна А (100мкМ), достовірно не відрізнялись за амплітудою та кінетикою спаду, що вказує на незначний внесок цього механізму у процес виведення Ca2+ з мітохондрій до цитозолю в цих умовах.

Вплив уніпортеру мітохондрій на амплітуду та кінетику кофеїн–індукованих кальцієвих сигналів. Вивільнення Ca2+ з ЕР до цитозолю викликалось шляхом активації ріанодинових рецепторів. Для цього використовувалась позаклітинна аплікація 30мМ кофеїну. Амплітуда кофеїн–індукованих кальцієвих транзієнтів складала у контролі 20823нМ та 32355нМ на фоні прикладання СССР (n=19, Р<0,05). Аплікація 10мкМ СССР на спаді кофеїн–індукованого Ca2+ транзієнту викликала додаткове підвищення [Ca2+]i, аналогічне такому на спаді деполяризаційного транзієнту. Також СССР–індуковане підвищення [Ca2+]i зберігалось за умов його аплікації у безкальцієвому розчині. Таким чином, підвищення [Ca2+]i не було викликане входом кальцію з позаклітинного середовища. Для того, щоб більш точно оцінити внесок уніпортеру мітохондрій у кінетику кальцієвого сигналу, викликаного активацією ріанодинових рецепторів, були побудовані графіки, що являли собою усереднене значення 10 індивідуальних кальцієвих транзієнтів: кофеїн–індукованих транзієнтів, кофеїн–індукованих транзієнтів на фоні прикладання СССР та різниці між ними (що відображала внесок уніпортеру мітохондрій у цей процес) (рис.9), нормалізовані до 100%.

Рис.9.Захват та виведення Ca2+ мітохондріями під час його вивільнення з депо ендоплазматичного ретикулуму. Порівняння усереднених кофеїн–індукованих кальцієвих транзієнтів, зареєстрованих до (тонка лінія) та після (переривчаста лінія) аплікації 10 мкМ СССР (нормалізовано до 100%). Товстою лінією показана різниця між ними.

Взаємодія між кальцієвими депо. У випадку з кальцієвим сигналом, викликаним входом Ca2+ через кальцієві канали, захват Ca2+ мітохондріями починався з 8–ї секунди та досягав свого максимуму на 12–13 секунді після початку деполяризації. Процеси вивільнення [Ca2+]i з мітохондрій через механізм Na+/Ca2+ обмінника починали переважати процес його захвату уніпортером в середньому на 26–28 секунді, коли рівень [Ca2+]i у цитозолі знижувався до 9–11% від його максимального значення (рис.7). У випадку з кальцієвим сигналом, викликаним вивільненням кальцію з депо ЕР шляхом активації ріанодинових рецепторів, захват Ca2+ мітохондріями починався з 3–ї секунди та досягав свого максимуму на 5–7 секунді з часу початку аплікації кофеїну. Процес вивільнення [Ca2+]i з мітохондрій через механізм Na+/Ca2+ обмінника починав переважати процес його захвату уніпортером в середньому на 22–23 секунді з початку деполяризації, коли рівень [Ca2+]i у цитозолі знижувався до 17–19% від максимального значення (рис.9). У випадку вивільнення Ca2+ з депо ЕР мітохондрії значно швидше включаються у процес захвату [Ca2+]i та виведення його назад до цитозолю, ніж у випадку з входом Ca2+ через кальцієві канали при деполяризації. Нами було припущено, що ці відмінності можуть бути пов’язані з особливостями у просторовому взаєморозташуванні мітохондрій та ЕР.

Електронна мікроскопія ділянок тканин тонких зрізів заднього рогу спинного мозку.

Відносна кількість мітохондрій у цитозолі була 0,720,04мкм–2 (n=23). При цьому щільність розташування мітохондрій у примембранному шарі цитозолю (1мкм) була значно меншою–0,550,05мкм–2 (n=23, P<0,05). Вивчення отриманих знімків показало також наявність щільного взаєморозташування мітохондрій відносно трубочок ЕР (рис.10). Вищенаведені матеріали можна представити у вигляді наступної схеми (рис.11). Затримка у роботі мітохондрій під час входу з позаклітинного середовища порівняно з таким при кофеїн–індукованому

Рис.10.Електронмікроскопічний знімок дільниці клітини заднього рогу спинного мозку. На знімку позначені: N–ядро клітини; М–мітохондрії; ЕР–трубочки ендоплазматичного ретикулуму. Стрілкою позначене місце щільного розташування мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму.

вивільненні кальцію з ЕР може бути пояснена їхньою низькою щільністю у примембранному шарі відносно цитозольної. В той же час, щільне розташування мітохондрій та трубочок ЕР полегшує захват мітохондріями Ca2+, що вивільнюється з ЕР під дією кофеїну.

Рис.11.Участь мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму у кальцієвій сигналізації у вторинних сенсорних нейронах.

Зміни у роботі внутрішньоклітинних кальцієвих депо у вторинних сенсорних нейронах при алкалінізації. Алкалінізація позаклітинного середовища сама по собі не викликала значних змін базального рівня [Ca2+]i у 10 досліджених нейронах. Така сама алкалінізація після деполяризації клітин гіперкалієвим розчином, викликала значне транзієнтне підвищення [Ca2+]i в усіх досліджених клітинах з середньою амплітудою 73,810нМ (n=32). Кальцієві транзієнти при цьому мали складну форму: після початкового швидкого підйому спостерігалось плато, яке зберігалось на протязі всього часу алкалінізації. Після заміни рН розчину на фізіологічний (рН=7,35), рівень [Ca2+]i швидко (на протязі декількох секунд) повертався до базального (рис.12). Порівняння Ca2+ транзієнтів, викликаних гіперкалієвою

Мал.12. Вплив алкалінізації позаклітинного середовища на внутрішньоклітинну концентрацію іонів кальцію в нейронах заднього рогу спинного мозку. Порівняння ефектів аплікації лужного розчину Тироде (¦) перед та після гіперкалієвої деполяризації нейрона.

деполяризацією плазматичної мембрани при рН позаклітинного середовища 7,35 та 8,8, не виявило достовірних відмінностей у їхній амплітуді та кінетиці. Так, амплітуда деполяризаційних кальцієвих транзієнтів становила 50719нМ та 52626нМ (n=16, Р>0,05) при рН позаклітинного середовища 7,35 та 8,8 відповідно. Час від початку деполяризації до максимуму амплітуди транзієнта - 4,50,38с та 4,80,37с (n=16, Р>0,05) відповідно. T0,5 транзієнту становив 3,70,54с та 4,40,56с (n=16, Р>0,05) відповідно. Таким чином, алкалінізація не змінює ефективність активації Са2+ каналів плазмалеми.

Зміни у функціонуванні ендоплазматичного ретикулуму. Аплікація 30мМ кофеїну на протязі 5 секунд (після попередньої деполяризації) викликала транзієнтне підвищення рівня [Ca2+]i на 22339нМ (n=9). Така сама аплікація кофеїну в умовах, коли клітина на протязі 2 хвилин знаходилась у алкалінізованому розчині, викликала транзієнт з амплітудою 13414нМ (n=9, P<0,01) (рис.13). Після

Рис.13.Кофеїн–індуковані [Ca2+]i транзієнти () у нейронах заднього рогу спинного мозку у контрольних умовах та під час позаклітинної алкалінізації (¦).

відмивання клітини у розчині Тироде з рН 7,35 на протязі 2 хвилин амплітуда кофеїн–індукованих транзієнтів повністю відновлювалась та становила 24755нМ (n=6). Попереднє спустошення кальцієвого депо ЕР 10мМ кофеїну на протязі 1 хвилини (рис.14) призводило до практично повного блокування подальшого підвищення [Ca2+]i в результаті позаклітинної алкалінізації (n=6) (рис.14). Перша

Рис.14.Амплітуди викликаних алкалінізацією [Ca2+]i транзієнтів (¦) після попередньої преаплікації 10мМ кофеїну () та після перезавантаження кальцієвого депо ендоплазматичного ретикулуму за допомогою гіперкалієвої деполяризації.

аплікація розчину Тироде з рН=8,8 в серії з двох аплікацій повинна була спустошити кальцієве депо ЕР. Як видно з рисунку 15, повторна аплікація розчину з рН 8,8 викликала лише незначне підвищення [Ca2+]i. Перезаповнення кальцієвого депо ЕР в результаті деполяризації мембрани нейрону призводило до відновлення амплітуди

Рис.15. Вплив повторної позаклітинної алкалінізації на кальцієві транзієнти. Амплітуди [Ca2+]i транзієнтів, викликаних алкалінізацією у серії з двох послідовних аплікацій розчину Тироде з рН 8,8 та після перезаповнення ендоплазматичного ретикулуму в результаті гіперкалієвої деполяризації (¦).

та кінетики кальцієвих транзієнтів, викликаних алкалінізацією. Преаплікація 500нМ іономіцину, який призводить до вивільнення Са2+ з усього ЕР за рецепторнезалежним механізмом приводила до майже повного зникнення викликаних позаклітинною алкалінізацією кальцієвих транзієнтів (n=12) (рис.16).

Рис.16. Вплив преаплікації іономіцину на викликані алкалінізацією [Ca2+]i транзієнти. Амплітуди викликаних алкалінізацією [Ca2+]i транзієнтів (¦) у контролі та після преаплікації 500нМ іономіцину ().

Зміни у функціонуванні мітохондрій. Преаплікація 10мкМ СССР значною мірою змінювала амплітуду та кінетику кальцієвих сигналів, викликаних алкалінізацією. Амплітуда транзієнта знижувалась до 172нМ, або на 77% (n=13, Р<0,001). Форма сигналу ставала хвилеподібною, без чіткого піку та плато. Через кілька секунд рівень базального [Ca2+]i повністю відновлювався, не зважаючи на алкалінізацію, що продовжувалась (рис.17). За 1–2 хвилини після переміщення клітини у розчин

Рис.17.Вплив преаплікації СССР на викликані алкалінізацією [Ca2+]i транзієнти. Амплітуди викликаних позаклітинною алкалінізацією [Ca2+]i транзієнтів (¦) у контролі, після преаплікації 10мкМ СССР () та після відмивання у розчині з рН 7,35.

Тироде з фізіологічним рН амплітуда та кінетика кальцієвих сигналів, викликаних прикладанням лужного розчину, повністю відновлювалась. Отже, попередження акумуляції Ca2+ мітохондріями має критичне значення для появи цитозольного кальцієвого сигналу, викликаного алкалінізацією DH нейронів. Для перевірки участі Na+/Ca2+ обмінника мітохондрій у виведенні Ca2+ до цитозолю та його впливу на кальцієву сигналізацію при алкалінізації використовувався його блокатор ТРР+. Преаплікація 25мкМ ТРР+ не викликала достовірних змін у амплітуді та кінетиці кальцієвих сигналів, викликаних алкалінізацією (n=11).

Зміни у роботі внутрішньоклітинних кальцієвих депо у вторинних сенсорних нейронах при позаклітинній ацидіфікації. Аплікація розчину Тироде з рН=6.0 викликала складні зміни базального [Ca2+]i у DH нейронах. У 23 з 33 досліджених клітин одразу після зниження позаклітинного рН рівень [Ca2+]i підвищувався на 24,47,8нМ, що продовжувалось на протязі 5–7сек та змінювалось його зниженням нижче базалього рівня у 31 з 33 клітин на 13,52нМ (20,8% від базального рівня). Це зниження [Ca2+]i зберігалось протягом всього часу аплікації закисленого розчину (до 10 хвилин). Повернення рН позаклітинного розчину до фізіологічного значення (рН=7,35) призводило до швидкого (на протязі декількох секунд) відновлення рівню [Ca2+]i (рис.18, ліва частина). Цей ефект міг бути відтворений в одній клітині багаторазово. Для визначення джерела змін базального рівня цитозольного [Ca2+]i, подібні експерименти було проведено в безкальцієвому розчині. В цих умовах ацидіфікація викликала практично ідентичні зміни у [Ca2+]i (рис.18, права частина). Тобто, вхід кальцію через плазматичну мембрану не впливає безпосередньо на розвиток змін у базальному [Ca2+]i при ацидозі.

Рис.18.Зміни базального рівня цитозольного [Ca2+]i, викликані позаклітинною ацидіфікацією (рН=6,0) () при фізіологічній концентрації кальцію у позаклітинному розчині та при його відсутності.

Зміни кальцієвого сигналу, викликаного деполяризацією. Дослідження впливу ацидіфікації на кальцієві транзієнти, викликані гіперкалієвою деполяризацією показали, що на її фоні відбувається значне та статистично значиме зниження амплітуди [Ca2+]i транзієнтів до 45,921,2нM у порівнянні з 48324нM у контрольних умовах (n=12, P<0.05) (рис.19). Після повернення клітин до

Рис.19. Зміни у амплітуді та кінетиці деполяризаційних [Ca2+]i транзієнтів, викликаних аплікацією гіперкалієвого розчину (^) перед позаклітинною ацидіфікацією, на її фоні () та після відмивання у розчині з нормальним рН.

середовища з фізіологічним рН на протязі 90 секунд амплітуда деполяризаційних кальцієвих транзієнтів відновлювалась до 88,412% від контрольного значення (n=14). Час зростання кальцієвого транзієнту до максимального значення не відрізнявся достовірно в контрольних умовах та при ацидіфікації (9,20,5сек та 9,70,7сек відповідно) (n=14, Р>0,05). Разом з тим, t0,5 при цьому збільшувався з 8,91,2сек у контролі до 11,41,1сек при ацидозі (n=14, Р<0,05).

Зміни у функціонуванні мітохондрій. З вищенаведених результатів випливає те, що деякі внутрішньоклітинні механізми, що приймають участь у кальцієвій сигналізації, стають більш активними, що призводить до посиленого виведення Ca2+ з цитозолю під час деполяризації та, відповідно, до більш потужного їх вивільнення до цитозолю після закінчення деполяризації. Це призводить до трансформування фази спаду транзієнту у подовжене плато (рис.19). Щоб перевірити припущення про внесок мітохондрій у ці зміни, 10мкМ СССР був аплікований перед деполяризацією плазматичної мембрани та ефект було порівняно з ефектом від аплікації СССР перед ацидіфікацією та мембранною деполяризацією. Фази спаду транзієнтів при цьому ставали майже ідентичними за кінетикою, а довготривале плато повністю зникало. Порівняння кривих, наведених на рис.20 та 21 демонструє практично повну відсутність впливу ацидозу на зміни [Ca2+]i за умови блокування уніпортеру мітохондрій СССР.

Рис.20.Співставлені гіперкалієві деполяризаційні [Ca2+]i транзієнти, зареєстровані у контрольних умовах (товста чорна ліния) та після позаклітинної ацидіфікації (рН=6,0) (сіра лінія). Різниця між обома кривими наведена нижче (тонка чорна лінія). Усереднене значення 14 індивідуальних транзієнтів, нормалізованих до 100%.

Рис.21.Співставлені гіперкалієві деполяризаційні [Ca2+]i транзієнти, зареєстровані після преаплікації 10мкМ СССР (товста чорна ліния) та після позаклітинної ацидіфікації (якій також передувала преаплікація 10мкМ СССР) (сіра лінія). Різниця між обома кривими наведена нижче (тонка чорна лінія). Усереднене значення 12 індивідуальних транзієнтів, максимальна амплітуда яких була нормалізована до 100%.

Зміни у функціонуванні ендоплазматичного ретикулуму. Іншою структурою, яка може приймати участь у змінах внутрішньоклітинної Ca2+ сигналізації при ацидіфікації, може бути ЕР. Для того, щоб визначити роль ЕР у цих змінах, була проведена серія експериментів з аплікацією 30мМ розчину кофеїну (після попередньої гіперкалієвої деполяризації). Ефект аплікації кофеїну в контрольних (рН=7,35) умовах та в умовах попередньої ацидіфікації на протязі 2 хвилин порівнювався на основі їх амплітуд та кінетики кофеїн–індукованих [Ca2+]i транзієнтів. Не було виявлено достовірних розбіжностей у амплітудах та кінетиці кофеїн–індукованих [Ca2+]i транзієнтів (174,46,3нМ у контрольних умовах та 158,65,1нМ при попередній ацидіфікації) (n=10, Р>0,05).

Обговорення результатів. Запропонована робота присвячена комплексному вивченню Ca2+ сигналізації у DH нейронах, зокрема оцінці кінетичних характеристик процесів, пов’язаних з участю мітохондрій та EР в регуляції Ca2+ гомеостазу у клітинах при наявності різних джерел надходження Ca2+ до цитозолю у контрольних умовах, а також зміни при позаклітинній алкалінізації та ацидіфікації. У дослідженнях з використанням блокаторів мітохондріального Ca2+ захвату реєструвались значні порушення у кінетиці виведення цитозольного Ca2+ після його попереднього підвищення при надходженні з позаклітинного середовища. Разом з тим, участь мітохондрій у формуванні Ca2+ сигналу в умовах, коли джерелом його підвищення було вивільнення з депо EР, залишалась недослідженою. Питання впливу просторового розташування мітохондрій та EР на Ca2+ сигналізацію вивчається на протязі останніх кількох років, в основному, на секреторних клітинах та міозитах, та знаходиться у стадії початкових досліджень. Враховуючи подібність амплітуди та кінетики деполяризаційних Ca2+ транзієнтів, а також величини базального [Ca2+]i від одного нейрона до іншого, можна говорити про наявність у них потужних та точних механізмів, направлених як на формування Ca2+ сигналу, так і на підтримання базального рівня [Ca2+]i. Аплікация СССР призводить до значного підвищення [Ca2+]i, що вказує на існування градієнту концентрації Са2+ на внутрішній мембрані мітохондрій, та свідчить про те, що мітохондріальна концентрація кальцію ([Ca2+]m) у спокої вища за цитозольну. Активне захоплення Ca2+ мітохондріями починається з 8–ї секунди від початку деполяризації, досягаючи максимальної потужності на 12–13 секунді, що відповідає періоду зростання [Ca2+]i транзієнту та верхній частині фази спаду, проявляючи властивості потужного Ca2+ депо. Робота мітохондрій під час фази росту транзієнту призводить до деякого зниження його амплітуди, а у фазі спаду–до прискорення повернення [Ca2+]i до базального рівня. Вивільнення [Ca2+]i з мітохондрій за допомогою механізму Na+/Ca2+ обмінника починає переважати його захват уніпортером в середньому на 26–28 секунді, коли рівень [Ca2+]i знижується до 9–11% від його максимального значення (відповідало перевищенню базового рівня на 50–60нМ) та значною мірою визначає час, необхідний для повернення [Ca2+]i до базального