ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ім.Р.Є.КАВЕЦЬКОГО

ПОГРІБНИЙ ПЕТРО ВАСИЛЬОВИЧ

УДК: 616-006.04:577.218

ДЕФЕНСИНИ ТА РЕГУЛЯЦІЯ АКТИВНОСТІ РЕЦЕПТОРА ЕПІДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТУ В ПУХЛИННИХ КЛІТИНАХ ЛЮДИНИ

14.01.07 – онкологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України.

Науковий консультант - член-кореспондент НАН України, доктор медичних наук, професор Чехун Василь Федорович, директор Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України, завідувач відділу механізмів протипухлинної терапії;

Офіційні опоненти: - доктор біологічних наук, професор Гамалія Микола Федорович, завідувач відділу клітинної фотобіології і фотомодуляції пухлинного росту Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України, м. Київ;

- доктор медичних наук Вакуленко Галина Олексіівна, доцент кафедри онкології Національного медичного університету ім.О.О.Богомольця, м. Київ;

- член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор Малюта Станіслав Станіславович, завідувач відділу молекулярної генетики Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.

Провідна установа - Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького МОЗ України

Захист відбудеться “_14_” квітня 2004 р. о _13_ годині _30_ хвилин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України (03022, Київ, вул.Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім.Р.Є.Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий “____” березня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук Н.В.Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Злоякісна трансформація еукариотичних клітин є наслідком мультифакторних порушень процесів проліферації та контролю програмованої загибелі клітин. Дослідження білків/пептидів, що можуть брати участь у таких процесах, привернули увагу до антимікробних пептидів ссавців - дефенсинів. Дані останніх років свідчать про те, що ці пептиди є не тільки антибіотиками і важливими компонентами системи природженого імунітету, але багатофункціональними біомолекулами, які концентраційно-залежним шляхом можуть впливати на сигнальну трансдукцію та проліферацію клітин чи інгібувати синтез ДНК і викликати лізис клітин (Murphy et al., 1993; Jacob еt al., 1994; Kamisz еt al., 2003;). Однак, механізми такого впливу бета-дефенсинів залишаються недослідженими, а білки-мішені – неідентифікованими.

У 2002 році Biragyn et al. встановили, що бета-дефенсин-2 людини (hBD-2) може впливати на систему адаптивного імунітету і прямо активувати дендритні клітини. Як речовини з потужними ад’ювантними властивостями, дефенсини можуть впливати на здатність адаптивної імунної системи впізнавати фрагменти білків клітин, у тому числі пухлинних. У зв’язку з цим вони можуть бути використані у клініці не тільки як антибіотики для поверхневого застосування, але і як компоненти протипухлинних вакцин.

В той же час експресія дефенсинів в пухлинах людини залишається майже не дослідженою. Дані кількох груп вчених продемонстрували наявність гіперекспресії бета-дефенсинів 1 та 2 в новоутвореннях ротової порожнини людини та відсутність такої в пухлинах простати та нирки (Abico et al., 1999, Mizukawa et al., 2000, Savaki et al., 2002, Donald et al., 2003).

Для ефективного застосування дефенсинів в клінічній онкології необхідними є фундаментальні обґрунтування механізмів впливу цих антибіотиків на системи передачі сигналів в клітинах та ретельне вивчення особливостей їх експресії в новоутвореннях людини, а також можливий зв’язок дефенсинів з регуляцією активності рецептора епідермального фактора росту (ЕФРр). Відомо, що ЕФРр відіграє критичну роль як в нормальному, так і злоякісному рості клітин (Velu, 1990; Tsanatis et al., 2000). Порушення функціонування ЕФРр спостерігаються в пухлинах різних типів (Jacob et al., 1994). Згідно даних літератури, до таких порушень відноситься поява конститутивно активованих мутантів рецептора, гіперекспресія ЕФРр та його лігандів (ЕФР/ТФР-), що асоційовані з інвазивністю пухлин і впливають на їх чутливість до протипухлинних агентів (Tahara et al., 1996; Keloff et al., 1996; Hortobagyi, 2000; Tsanatis et al., 2000). У зв'язку з цим ЕФРр розглядається як молекулярна мішень для створення нових ефективних протипухлинних ліків, а використання специфічних інгібіторів кіназної активності ЕФРр - як новий потенційно ефективний напрямок в хіміотерапії онкологічних хворих (Raymond et al., 2000; Barton et al., 2001; Seymour, 2001). Дослідження ряду лабораторій світу протягом останніх років присвячені інтенсивному пошуку та розробці специфічних природніх і синтетичних інгібіторів протеїн тирозинкінази (ПТК) рецептора ЕФР (Mendelsohn, 1997; Mendelsohn et al., 2000; Ciardiello et al., 2001). Деякі такі сполуки, що продемонстрували високу антипроліферативну активність in vitro, зараз знаходяться у І-ІІІ фазах клінічних випробувань (Hirata et al., 2002).

У звязку з цим дослідження дефенсинів in vitro як можливих ефекторів активності кінази ЕФРр в пухлинних клітинах та особливостей їх експресії в новоутвореннях людини є важливим напрямком сучасної фундаментальної онкології, що може знайти застосування в практичній медицині.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Роботу виконано у відділі біології пухлинної клітини Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України. Робота виконана в рамках програм ДКНТ України, Міністерства України у справах науки і технологій (шифр 2/1297-97, № 0198U005252; шифр 02.04/04439, № 0198U005179) та в планах науково-дослідних робіт Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України, шифр проблеми 2.2.5.209, № 0198U001092).

Мета дослідження. Метою роботи було з’ясування ролі дефенсинів в аутокринній регуляції активності рецептора ЕФР в пухлинних клітинах людини.

Задачі дослідження:

1.

2.

3.

4.

5. Дослідити експресію генів ЕФРр та дефенсинів в лініях пухлинних клітин in vitro, встановити можливі функціональні взаємозв’язки між їх білковими продуктами.

6. Провести аналіз експресії генів ЕФРр та дефенсинів в клітинах пухлин шийки матки та вульви людини.

Об’єкт дослідження _прикріплені та суспензійні лінії клітин людини та тварин: А431 (епідермоїдна карцинома вульви людини), M-HeLa (карцинома шийки матки людини), КВ (епідермоїдна карцинома слизової оболонки порожнини рота людини), COLO320HSR (аденокарцинома товстої кишки людини), Mewo (злоякісна меланома людини), MCF-7 (фіброцистома молочної залози людини), U251 (гліобластома людини), CESS (В-клітини людини, трансформовані EBV), Molt-4 (Т-клітинний гострий лімфобластний лейкоз людини), Raji (лімфома Беркітта людини), Namalwa (лімфома Беркітта людини), Jurkat (Т-клітинна лімфома людини), СЕМ (Т-клітинний гострий лімфобластний лейкоз), клітинні сублінії А431/1522 і M-HeLa/1522, що отримано на основі ліній клітин А431 і M-HeLa в результаті їх трансфекції кДНК трансформуючого фактора росту типу ; та зразки хірургічно видалених тканин (умовно-нормальний та злоякісно трансформований епітелій вульви та шийки матки людини).

Предмет дослідження _експресія ЕФРр та дефенсинів на рівні мРНК та білку в злоякісно трансформованих епітеліальних клітинах людини.

Методи дослідження _для виділення та очищення білків та пептидів (ЕФР, ТФР-, hBD-2) в роботі було застосовано стандартні методи препаративної біохімії, переважно хроматографічні (гель-фільтрація, іонообмінна хроматографія, зворотньофазова хроматографія високого тиску), ультрацентрифугування; для дослідження отриманих препаратів використовували метод електрофорезу в градієнті поліакриламідного гелю; для дослідження проліферативних показників культивованих клітин та оцінки деяких показників трансфікованих клітинних субліній використовували радіоізотопні методи; для характеристики білків/пептидів та моноклональних антитіл застосовано імунохімічні методи дослідження (Вестерн-блот аналіз, ELISA, імуноблотинг, імунопреципітація); для вивчення експресії hBD-2 в пухлинах людини використовували імуногістохімічні методи дослідження; для дослідження біологічної дії ікЕФРр було застосовано функціональні, мікробіологічні, вірусологічні методи дослідження; для отримання клітинних субліній, що гіперекспресують ТФР- та для отримання рекомбінантного hBD-2 було застосовано генно-інженерні методи (клонування, трансфекція, експресія продукту в еукариотичних та бактеріальних клітинах); для характеристики продукту трансфекції, дослідження експресії мРНК різних генів, в тому числі hBD-2 та ЕФРр, використовували молекулярно-біологічні методи (виділення ДНК та РНК, рестриктний аналіз, Саузерн- та Нозерн-аналіз, полімеразна ланцюгова реакція, полімеразна ланцюгова реакція із зворотньою транскрипцією); для отримання анти-hBD-2–моноклональних антитіл використовували стандартну гібридомну технологію з використанням рекомбінантного hBD-2 в якості антигену.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше генно-інженерним шляхом отримано сублінії клітин А431/1522 та M-HeLa/1522, що гіперекспресують ТФР-. Досліджено особливості функціонування ЕФР-залежної системи контролю росту в цих клітинних сублініях. Показано, що гіперекспресія ТФР- в клітинах сублінії А431/1522 приводить до уповільнення проліферації цих клітин. Встановлено, що клітини А431/1522 продукують позаклітинно речовину, яка пригнічує активність кінази ЕФРр. Очищено інгібітор кінази ікЕФРр та встановлено, що ікЕФРр є пептидним антибіотиком людини - -дефенсином-2 (hBD-2). Вперше показано, що цей пептид має, окрім антимікробної активності, властивості інгібітора цитозольних та трансмембранних кіназ, цитолітичну та гемолітичну активності. Проведено аналіз експресії гена ікЕФРр (hBD-2) в пухлинних клітинах людини та досліджено її регуляцію in vitro. Вперше продемонстровано, що експресія гена hBD-2 є ТФР-/ЕФР-залежною, а білковий продукт цього гена пригнічує активність кінази ЕФРр. Проведено аналіз спектра дефенсинів, що експресуються в пухлинних клітинах вульви та шийки матки людини. Показано, що експресія гена hBD-2 є характерною для пухлин цієї локалізації та асоційована з гіперекспресією гена ЕФРр.

Практичне значення одержаних результатів. Дослідження є завершеною фундаментальною роботою, результати якої можуть бути використані в практичній онкології. Запропонована технологія отримання hBD-2 в препаративній кількості, що дозволить провести доклінічні випробування пептиду в якості антибіотика для поверхневого застосування або протипухлинного агента для лікування хворих з новоутвореннями жіночої репродуктивної системи. Отримані моноклональні антитіла до hBD-2, які є досконалим інструментом дослідження експресії цього пептиду в новоутвореннях людини.

Особистий внесок здобувача. Дисертанту належить ідея отримання генно-інженерним шляхом субліній клітин А431 та М-HeLa, що гіперекспресують ТФР-. Він дослідив біологічно-активні пептиди та білки, що продукуються цими клітинами. Автор самостійно провів біохімічні та імунохімічні дослідження пептиду з властивостями інгібітора кінази ЕФР-рецептора, генетичні дослідження експресії генів дефенсинів in vitro та в клінічному матеріалі. Автор самостійно аналізував весь отриманий матеріал, формулював усі положення та висновки роботи, готував до друку публікації, що відображають результати дисертації.

Апробація роботи. Матеріали роботи було представлено та обговорено на :

І-й науково-практичній конференції з проблем ВІЛ/СНІД (Київ, Україна, 1995); 7-му Європейському конгресі з Біотехнології (Ніца, Франція, 1995); Першому Європейському Симпозіумі Білкового товариства (Давос, Швейцарія, 1995); 8-му Європейському конгресі з біотехнології (Будапешт, Угорщина, 1997); Міжнародних курсах EMBO/FEBS/UNESCO ‘Молекулярні основи бактеріальної інфекції’ (Спецес, Греція, 1998); 26-му симпозіумі Федерації Європейського біохімічного товариства (Ніцца, Франція, 1999); ІІ з’їзді онкологів країн СНД “Онкологія 2000” (Київ, Україна, 2000); 18-му Міжнародному Конгресі з біохімії та молекулярної біології (Бірмінгем, Великобританія, 2000); 3-й Міжнародній конференції “ Mechanisms of cellular signal transduction and communication” (Львів, Україна, 2000); Міжнародному симпозіумі “Intracellular signalling in plant and animal systems (ISPAS)” (Київ, Україна, 2001); 10-му з’їзді онкологів України (Ялта, Україна, 2001); 4th Parnas Conference “Molecular mechanisms of cell activation: biological signals and their target enzymes (Вроцлав, Польща, 2002); IV науково-практичній конференції “Сучасні принципи діагностики та лікування візуальних форм генітального раку у жінок” (Львів, Україна, 2002).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладений в 35 публікаціях, в тому числі в 24 журнальних статтях у провідних фахових виданнях серед яких одна самостійна, та у 10 тезах матеріалів вітчизняних та міжнародних конгресів, конференцій, з’їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 284 сторінках машинописного тексту. Дисертація складається із вступу, 2 розділів огляду літератури, 9 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнень результатів досліджень, висновків і списку цитованої літератури. Дисертація містить 15 таблиць і 77 рисунки. Список використаних джерел включає 299 найменувань, з них 12 - на українській та російській мовах, 287 - на англійській мові.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. В експериментах було використано лінії клітин А431 (епідермоїдна карцинома вульви людини), M-HeLa (карцинома шийки матки людини) та клітинні сублінії А431/1522 і M-HeLa/1522, що отримані шляхом трансфекції ліній клітин А431 і M-HeLa ретровірусним вектором 1522. кДНК ТФР- розміром 1,3 т.н.п. в плазміді 1522 клоновано по сайтах рестрикції EcoR I. Всі клітини вирощували у середовищах DMEM або RPMI-1640, що містили 10% ембріональної телячої сироватки (ЕТС) (Gibco BRL, Великобританія) у насиченій вологою атмосфері з 5% СО2. Експресію кДНК ТФР- в сублініях клітин А431/1522 і M-HeLa/1522 по досягненні конфлюентного моношару індукували шляхом зміни середовища на таке, що не містить фенолового червоного з 1,5 - 3 мкМ CdCl2 , після чого клітини інкубували протягом 48 год без сироватки. Кондиційоване середовище (К-середовище) після інкубації клітин збирали для використання в подальших експериментах.

Для визначення антимікробної активності препаратів використовували культури бактерій і грибів, отримані з Української колекції мікроорганізмів Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. Реципієнтний штам E.coli HB101, трансформований рекомбінантною плазмідою 1522 (McGeady, 1989), був люб’язно наданий професором D. Salomon (Лабораторія біології та імунології раку, Національний Інститут Раку, Бетезда, США).

В дослідженнях використано клінічний матеріал після хірургічного видалення первинних пухлин вульви та шийки матки, отриманий у відділенні онкогінекології Інституту онкології АМН України (зав. науково-дослідним відділенням, професор Л.І.Воробьова). Досліджено післяопераційний матеріал 40 хворих ( 25 хворих на рак вульви та 15 на рак шийки матки). За клінічними та гістологічними ознаками пухлини були верифіковані як плоскоклітинний рак I-ої, II-ої та III-ої стадії. Визначення стадій проводили за класифікацією TNM (1997).

Для виділення та очищення білків та пептидів (ЕФР, ТФР-, інгібітор кінази ЕФРр (ікЕФРр)) в роботі застосовано стандартні методи препаративної біохімії, переважно хроматографічні, низькошвидкісне та ультрацентрифугування. Для дослідження отриманих препаратів використовували метод електрофорезу в градієнті поліакріламідного гелю, Вестерн-блот аналіз та радіоізотопні методи.

Очищення ТФР- проводили шляхом хроматографії на міні-колонці Sep-Pak C18 (Kumar, 1990) з подальшим використанням напівпрепаративної та аналітичної рідинної хроматографії високого тиску в оберненій фазі.

Для виділення ікЕФРр К-середовище клітинних культур центрифугували, ліофілізували та застосовували послідовність хроматографічних процедур, в яких критерієм відбору фракцій на проміжних стадіях очищення була наявність бактерицидної активності по відношенню до Bacillus subtilis. Активні фракції об’єднували, концентрували за допомогою міні-колонок Sep-Pak C18 та проводили послідовно гель-фільтрацію високого тиску на колонці ТSK-GEL Toyopearl HW-40 (Toyo Soda, Японія), рідинну хроматографію високого тиску в оберненій фазі (ОФ РХВТ) та рехроматографію на колонці Ultrasphere ODS 5m (Beckman, США). Гомогенність та чистоту отриманого препарату перевіряли методом електрофорезу в редукуючих умовах (Леммлі, 1970).

Для отримання 125І-ЕФР проводили йодування за методом Грінвуда (1963), використовуючи як зв’язуючий агент хлорамін Т. Радіоактивність осадів визначали на гамма-лічильнику ‘Гамма-1”(СРСР).

Для отримання препаратів плазматичних мембран з культивованих клітин використовували метод Payrastre (1991).

Визначення фосфокіназної активності білків клітин та препаратів плазматичних мебран проводили з використанням [32P]--АТФ за стандартними методиками (Иващенко, 1986). В ряді випадків після реакції фосфорилювання білки розділяли електрофорезом в поліакріламідному гелі, проводили перенос на нітроцелюлозні мембрани та використовували метод імуноблотингу (Вестерн-блот-аналіз) з застосуванням анти-фосфотирозинових антитіл.

Для Вестерн блотингу, що проводився за стандартною схемою, білки після електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності ДСН переносили на нітроцелюлозну мембрану (Schleicher&Schull, Німеччина) та проявляли з використанням 4-хлор-1-нафтолу, як субстрату для пероксидази, або набору реактивів ECL (Amersham, Англія).

Ковалентне зв’язування 125І-ЕФР проводили відповідно до протоколу Иващенко Ю.Д. (1986) з використанням зшиваючого реагента біссульфосукцинімідилсуберату (Pierce, США).

Електрофорез білків з додецилсульфатом натрію проводили у вертикальних пластинах, в системі буферів Леммлі (1970), в 7-22% або 15-22% градієнтних поліакриламідних гелях, використовуючи апарати “Біорух” (Україна). При необхідності візуалізації низькомолекулярних білків та пептидів зразки розділяли електрофоретично з використанням Тріс/Тріцинового буфера (Liu, 1999) або оцтової кислоти з додаванням сечовини (Остерман, 1983). Гелі після електрофорезу забарвлювали діамантовим синім Coomassie G250 або азотнокислим сріблом (Deutscher, 1990). Ізоелектричну точку пептидів визначали за стандартною методикою (Deutscher, 1990; Остерман, 1983).

Забарвлені поліакриламідні гелі висушували під вакуумом на апараті “Гель-1” (СРСР) і в випадках радіоактивно мічених зразків експонували від 20 хв до 5 діб (в залежності від активності проб) при -20оС з рентгенівською плівкою KODAK BioMax або KODAK XAR (Eastman Kodak, США) в касеті з підсилюючим екраном Hyperscreen (Amersham, Великобританія).

Визначення концентрації білку проводили за методом, розробленим Greenberg i Craddock (1982).

За основу при міченні клітин 35S-метіоніном та імунопреципітації було взято протоколи, запропоновані Weber та Gill (1984).

Для дослідження впливу ікЕФРр на активність цитозольних протеїнкіназ, для імунопреципітації протеїнкіназ і їх фосфорилювання in vitro за основу було взято протокол Law (1984).

Кількість та афінність молекул ЕФРр на поверхні клітин оцінювали за допомогою ПАП-методу (пероксидаза-антипероксидаза) з використанням моноклональних антитіл (МКАТ), вторинних кролячих антитіл проти Ig мишей та ПАП комплексу (Пинчук В.Г. и др. 1990). Аналіз та обробку препаратів проводили з використанням світлового мікроскопу і програми Statistika 3.0, яка дозволила проводити розрахунки для груп середніх (М) та похибок середніх арифметичних (м).

Для визначення гемолітичної активності ікЕФРр досліджували лізис еритроцитів в шарі агарози. Суспензію еритроцитів заливали у 70 мм пластикові чашки Петрі (Росія), після чого в шарі агарози пробивали лунки діаметром 3 мм, куди вносили тестований матеріал в серійному розведенні. Після інкубації при 30оС протягом 5 год вимірювали діаметр зон гемолізу і обчислювали залежність площі зони від логарифму концентрації ефектора.

Для оцінки впливу пептиду на проліферативну активність культивованих клітин застосовано варіант методу, основаного на включенні міченого тимідину в ДНК клітин, що використовується для визначення бласт-трансформації лімфоцитів згідно методу Тессенова (1979). Активність проб визначали на рідинному сцинцілляційному лічильнику Intertechnique SL-30 (Франція).

Дослідження впливу hBD-2 на крупноблочну фрагментацію геномної ДНК в пухлинних клітинах проводили, як описано в роботі Heller (1989).

Для отримання клонів клітин, що гіперекспресують ТФР-, було використано лінії клітин людини А431 та М-HeLa. Введення провірусної ДНК в клітини РА317 здійснювали методом електротрансфекції (Neumann, 1982; Агаркова, 1987) з подальшою селекцією клітин, що продукують рекомбінантні вірусні частинки. Клітини інфікували та проводили клонування і селекцію з G418 (Gibco, Великобританія).

Плазмідну ДНК виділяли шляхом екстракції сумішшю фенол-хлороформ (1:1), як описано Birnboim (1983). Препарат плазмідної ДНК зберігали в етанолі при -20оС.

ДНК-зонди мітили за допомогою набору для нік-трансляції та [32P]-dCTP (Amerscham,CША), враховуючи рекомендації фірми-виробника. Виділення фрагментів ДНК, що включили [32P] dNTP, проводили на хроматографічній колонці з сефадексом G-50. Радіоактивність зонду вимірювали за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника LS 30 (Intertechnigue, Франція).

Виділення сумарної РНК з культивованих клітин та післяопераційного матеріалу проводили за методом P.Chomczynski (1987). Концентрацію та ступінь чистоти зразку РНК визначали на спектрофотометрі Beckman DU-8B та в 1% агарозному гелі, що містив 20% формальдегіду.

Геномну ДНК виділяли за модифікованим методом Johns (1989).

Елюцію ДНК з поліакриламідних гелів проводили шляхом дифузії, з агарозних гелів – плавленням із застосуванням набору Gene Clean №3105 ( BIO 101, Inc., Канада) згідно з протоколом фірми-виробника. Очистку ДНК проводили стандартним фенол-хлороформним методом (Маниатис, 1984).

Нозерн- та Саузерн-блот-гібридизацію нуклеїнових кислот проводили згідно протоколу Маниатиса (1984) з використанням [32Р]-мічених зондів.

Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) проводили з використанням ПЛР буферу та термостабільної Taq-полімерази виробництва Fermentas (Литва) за принципом “Hot Start”. Аналіз ампліфікованої ДНК здійснювали використовуючи метод електрофорезу.

Послідовність олігонуклеотидних затравок добиралась за допомогою комп’ютерної програми Oligo з використанням даних про нуклеотидну послідовність генів, що досліджувались, та їх мРНК, отриманих з генетичного банку даних на Internet-сайті Американського Центру Біотехнологічної Інформації (www.ncbi.nlm.nih.gov). Оптимальні умови ампліфікації для кожної пари олігонуклеотидних затравок підбирались в експерименті на геномній ДНК людини, виходячи з теоретично передбачених за допомогою програми Oligo.

Реакцію зворотньої транскрипції (ЗТ-ПЛР) проводили в об’ємі 20 мкл з використанням набору для синтезу кДНК RevertAidTM, First Strand cDNA Synthesis Kit (№К1621, Fermentas, Литва). Синтезовану кДНК зберігали при 200С.

Для перевірки генетичної належності фрагментів ДНК, отриманих в результаті полімеразної ланцюгової реакції, проводили реакцію рестрикції з використанням ендонуклеаз рестрикції AluI, BstNI, DdeI, EcoRI, HaeIII, HincII, MspI (Маниатис, 1984).

Для аналізу виділеної та синтезованої в умовах ПЛР ДНК використовували методи електрофорезу в горизонтальному агарозному та вертикальному поліакриламідному гелях. Після проведення електрофорезу ДНК детектували в ультрафіолетовому світлі на трансілюмінаторі.

Антимікробну активність препаратів визначали за пригніченням росту бактерій в тонкому шарі агарози за модифікованим методом Hultmark (1983). Для визначення мінімальної інгібіторної концентрації ікЕФРр використовували серійні розведення досліджуваних пептидних зразків. Летальну концентрацію пептиду визначали екстраполяцією лінійної залежності на нульове значення площі зони лізису. Аналогічно тестували активність пептидів проти грибів, що висівали на сусло-агар.

Дослідження впливу вірусної інфекції на експресію генів дефенсинів in vitro проводили стандартним методом інфікування клітин А431 еталонним штамом аденовірусу 5 типу (Носач, 1982). Аналіз вірус-специфічних включень аналізували, використовуючи люмінісцентний мікроскоп МЛ-2 (ЛОМО, Росія).

Для клонування гена hBD-2 було обрано вектор pGEX-2T. Олігонуклеотидні затравки були наступного складу: 5` - gtgttggatccggtataggcgatcctgttacctg – пряма, 5` - tcttggaattctcatggctttttgcagcattttg – зворотня. Ампліфікацію фрагмента кДНК гена hBD-2 для клонування проводили на кДНК, отриманої в результаті ЗТ-ПЛР. Культивування бактерій, очистку плазмідної ДНК, реакції рестрикції та лігування, проводили за стандартними методиками (Маниатис, 1984). Для отримання продуцента рекомбінантного hBD-2, в складі химерного білку (злитого з глутатіон-S-трансферазою (GST), використовували штам E.coli XL-Gold. Відбір рекомбінантних колоній на наявність вставки фрагмента кДНК гена hBD-2 проводили шляхом скринінгу плазмідної ДНК методом ПЛР та рестриктним аналізом. Рекомбінантні плазміди просиквеновані з метою виявлення можливих помилок в послідовності кДНК гена hBD-2 та згідно сиквенсу відібрано клон, що використовувався в подальшій роботі.

Очистку рекомбінантного hBD-2 з лізату клітин E.coli XL-Gold, попередньо індукованих IПTГ, проводили шляхом афінної хроматографії на колонці з глутатіон-НT-сефарозою. Після протеолізу химерного білку тромбіном (Sigma, США), hBD-2 очищали методом іонообмінної хроматографії на колонці MonoSP.

Гібридому, що секретує моноклональні антитіла до hBD-2, отримано в результаті соматичної гібридизації спленоцитів мишей лінії BALB/c з клітинами мишиної мієломи SP2/0. Було використано варіант довгострокової імунізації із залученням рекомбінантного hBD-2. Через три доби після останньої імунізації проводили гібридизацію клітин селезінки з клітинами мієломи з використанням 50% поліетиленгліколю (PEG-1500) в 1мМ NaOH за методом Davidson R. тa Gerald P. (1978). Після селекції клітинних гібридів у ГАТ та ГТ середовищах скринінг продукції специфічних антитіл здійснювали методами ELISA та Вестерн-блотингу. Після клонування, реклонування і культивування in vitro було відібрано клон гібридоми, що активно продукує антитіла до hBD-2.

Імуногістохімічні дослідження проводили на парафінових зрізах за схемою непрямого методу виявлення антигенів із застосуванням авідин - біотинової системи та пероксидази в якості ферментної мітки згідно стандартних протоколів. Для блокування ендогенної пероксидази застосували 0,3 % розчин перекису водню протягом 30 хвилин, розведення антитіл _1/2000. Дослідження проводили за допомогою мікроскопу Axioplan (Zeiss, Німеччина) із застосуванням імерсійного об`єктиву (х100). Система вводу зображень складалася з відеокамери Sony DXC-151AP із композитним відеовиходом, плати відеовходу EZ Capture, комп`ютера Pentium III та програми аналізу зображень ImagePro (Media Cybernetic, США). Обробку даних проводили за допомогою програми Statistika 3.0.

Статистичну обробку результатів досліджень проводили в пакетах програм Origin 5.0 i GraphPad Prism 2.0. Цифровий матеріал, що наведено в дисертаційній роботі, підлягав варіаційно-статистичній обробці (Урбах, 1975). Результати вважали достовірними при коефіцієнті вірогідності Р 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Для створення експериментальних моделей регульованої експресії трансформуючого фактору росту in vitro було обрано лінії клітин А431 та М-HeLa, які відрізняються за кількістю рецепторів ЕФР (А-431 – 2х106 молекул ЕФРр/кл., М- HeLa – 105 ЕФРр/кл.). Для клонування використовували ретровірусний вектор 1522, що являє собою рекомбінантну конструкцію, до складу якої входить індуцибельний металотіонеїновий промотор миші (МТ-1), кДНК ТФР- людини та ген аміноглікозидфосфотрансферази, яка інактивує антибіотик G418. Селекцією на G418 було відібрано клони-продуценти ТФР-, які далі тестували в конкурентному варіанті радіорецепторного аналізу з використанням в якості ліганда [125І]-ЕФР. В результаті проведеного скринінгу було відібрано клони А431/1522-4 (далі – А431/1522) та M-HeLa/1522-25 (далі –M-HeLa/1522), що мали найменшу кількість вільних рецепторів ЕФРр.

Дослідження показали, що в геном клітин клону А431/1522 інтегровано не менш однієї копії гена ТФР-, експресія якого залежить від присутності в середовищі хлорида кадмію (оптимальна концентрація CdCl2 - 3 мкМ) і сягає максимуму на другу добу інкубації клітин з іонами кадмію. За таких умов спостерігається транскрипція гена ТФР- та його синтез. Рекомбінантний ТФР- (рТФР-) утворюється як в зрілій формі, що продукується позаклітинно, так і в формі недопроцесованого мембранозв’язаного попередника. Обидві ці форми є активними і здатні зв’язуватися з ЕФРр та активувати його аутофосфорилювання. Продукція рекомбінантного ТФР- призводить до зниження кількості ЕФРр на поверхні клітин та до прискорення процесів інтерналізації та екстерналізації молекул рецептора. Клітини клону А431/1522 експресують в К-середовище ТФР- в кількості близько 30-40 нг/млн клітин, що в 3-4 рази більше, ніж в клітинах вихідної лінії. Однак швидкість проліферації клітин А431/1522, що були індуковані іонами CdCl2, виявилась нижчою на 40% в порівнянні з неіндукованими клітинами (Рис.1а), а фосфорилювання ЕФРр та ряду білків знижено в 2 рази (Рис. 1б).

Рис. 1 а) включення [3Н]-тимідину в ДНК клітин А431 (1) та А431/1522 (2); б) фосфорилювання білків плазматичних мембран клітин А431 (трек 2) та А431/1522 (трек 4).

Ці дані дали підставу для припущення, що в клітинах А431/1522 за умов продукції рек-ТФР- індуковано експресію біологічно активної речовини з властивостями інгібітора кінази ЕФРр. У зв'язку з цим біохімічними методами досліджено компоненти К-середовищ клітин А431/1522 та M-HeLa/1522 і отримана фракція низькомолекулярних білків, аналіз яких показав, що клітини субліній А431/1522 та M-HeLa/1522 на відміну від вихідних клітин (А431, M-HeLa) за умов індукції експресії рТФР- позаклітинно секретують позитивно-заряджений гідрофобний пептид. Цей пептид здатний пригнічувати аутофосфорилювання рецептора ЕФР, має властивості мембранно-активної речовини і не проявляє ЕФР-конкурентної активності.

Здатність пептида інгібувати активність кінази рецептора ЕФР (ікЕФРр) вказували на можливість його потенційної спорідненості з дефенсинами – пептидними антибіотиками ссавців. Очистка пептидів на Sep-Pak C18 показала наявність в К-середовищі клітин сублінії А431/1522, індукованих іонами CdCl2, антимікробної активності як проти грам-позитивних (B.subtilis), так і грам-негативних (P.aeruginosa) мікроорганізмів (Рис.2).

Рис.2. Антимікробна активність К-середовища клітин А431/1522 проти В. subtilis (а) та P.aeruginosa (б) (лунки 1 – контроль; 2 – клітини, які не індуковані CdCl2,; 3 – клітини, які індуковані CdCl2).

Таким чином, це дослідження підтвердило спорідненість ікЕФРр з дефенсинами і дало підстави впровадити антимікробний тест Hultmark et al. на всіх стадіях очистки ікЕФРр для моніторингу цього пептиду. Беручи до уваги наведені в літературі схеми очищення антимікробних пептидів тварин, було відпрацьовано оптимальну схему виділення пептиду за допомогою хроматографічних методів. Ця схема передбачала такі етапи: 1) гель-фільтрація низького тиску; 2) хроматографія на міні-колонці Sep-Pak C18; 3) гель-фільтрація високого тиску; 4) рідинна хроматографія високого тиску в оберненій фазі (ОФ РХВТ) з наступною рехроматографією для повної очистки пептиду.

Після рехроматографії було отримано 3 фракції, що містили антимікробну активність та елюювались 62%-им, 65%-им та 67%-им ацетонітрилом. Інгібіторну активність проти кінази рецептора ЕФР реєстрували тільки у фракції, що елюювали 65%-ним ацетонітрилом (пік IІ) (Рис.3). Піки І та ІІІ, що були активними в тесті Hultmark et al., не інгібували активність кінази рецептора ЕФР.

Для ідентифікації піку І, одержаного після рехроматографії в оберненій фазі, було проведено його мас-спектрометричний аналіз. Порівняння результатів мас-спектрометричного аналізу піку I з опублікованими даними дозволили встановити, що отриманий нами антимікробний пептид є ідентичним до -дефенсину-1 людини (hBD-1).

Для ідентифікації пептиду піку II була з’ясована його часткова N-кінцева амінокислотна послідовність. В результаті проведених досліджень вдалося ідентифікувати послідовність перших семи N-кінцевих амінокислот Gly—Ile—Gly—Asp—Pro—Val—Thr, яка повністью відповідає відомій послідовністі -дефенсину-2 (hBD-2). Отримані результати дозволяють стверджувати, що пептид ІІ піку є ідентичним -дефенсину-2 людини з молекулярною масою 4,3 кДа.

Рис. 3. Профілі елюції при очистці ікЕФРр за допомогою ОФ РХВТ на колонці Pep-RPC 5/5 C2-C18 (a) і рехроматографії фракції Х на колонці Ultrasphere ODS (б); в – електрофореграма пептиду піку ІІ (трек 1; трек 2 – маркери молекулярної маси: 120, 97, 68, 43, 29, 18, 14, 12, 6 кДа).

Наступною задачею даної роботи було дослідження спектру біологічної активності пептиду ікЕФРр (далі – hBD-2). Для з’ясування можливої біологічної активності hBD-2 було досліджено його дію на бактерії, культивовані клітини та еритроцити людини в суспензії, вплив на активність протеїнкіназ, виділених з клітин, та на морфо-фізіологічний стан хромосомної ДНК еукаріотичних клітин. В усіх випадках було використано пептид, очищений рехроматографією в ОФ-РХВТ.

Для оцінки спектру антимікробної дії hBD-2 було визначено активність пептиду по відношенню до ряду грам-позитивних і грам-негативних бактерій і грибів. Отримані дані продемонстрували, що hBD-2 є токсичним для різних штамів грам-позитивних та грам-негативних бактерій в мікромолярному діапазоні концентрацій (Табл. 1). В диапазоні концентрацій 100 - 200 мкМ hBD-2 пригнічував ріст грибів Fusarium graminearum, Penicillium griseus, Mucor plumbum; фунгістатичної дії по відношенню до Candida albicans відзначено не було.

Таблиця 1

Антибактеріальна активність пептиду hBD-2

Назва штаму бактерії | Значення ІС, мкМ

Bacillus subtilis ATCC 6633 | 1,0 + 0,12

Bacillus subtilis ATCC 31029 | 1,2 + 0,14

Staphylococcus aureus P-209 | 1,5 + 0,14

Staphylococcus aureus ATCC 25923 | 1,2 + 0,14

Micrococcus luteus ATCC 10240 | 16,0 + 1,20

Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 | 3,6 + 0,22

Escherichia coli K12 ()? | 0,3 + 0,10

Escherichia coli ATCC 25922 | >150

Proteus vulgaris ATCC 13315 | 100 – 150

Далі було досліджено вплив hBD-2 на активність кінази рецептора ЕФР і на деякі цитоплазматичні кінази. Отримані дані показали, що пригнічення аутофосфорилювання ЕФРр в присутності hBD-2 має концентраційно-залежний характер, концентрація hBD-2, що дорівнює 2 х 10-7 М, призводить до зниження рівня аутофосфорилювання ЕФРр ~ в 2 рази (Рис.4).

Рис. 4. Залежність рівня фосфорилювання ЕФРр в препаратах плазматичних мембран клітин лінії А431 від концентрації hBD-2 в пробі.

Дослідження впливу hBD-2 на імунопреципітовані цитозольні та мембраноасоційовані протеїнкінази PKC,?? Lyn і Syk in vitro показали, що hBD-2 в концентрації 2 х 10-7 М пригнічує активність PKC на 91%, ізоформи Lyn з молекулярною масою 56 і 53 кД – на 70% і на 42%, відповідно, Syk – на 18%.

З даних літератури відомо, що всі пептидні антибіотики ссавців у певних концентраціях є токсичними. У зв’язку з цим було проведено тестування hBD-2 на гемолітичну активность, а також його впливу на проліферативну активність клітин лімфоцитарного походження. Були використані суспензійні культури клітин ліній Namalwa i Jurkat. Вплив hBD-2 на синтез ДНК в культивованих клітинах оцінювали за включенням тимідину, міченого тритієм, в клітини, що були інкубовані при різних концентраціях hBD-2 протягом 16 год.

Отримані дані показали, що в концентраціях 6-10-8 -5 х 10-7 М hBD-2 пригнічує синтез ДНК в культивованих клітинах, в концентраціях нижчих 5х10-8 М - стимулює проліферацію клітин, а в концентрації вищій ніж 5 х 10-6 М -викликає швидку загибель клітин in vitro. Більш того, 5 хв інкубація клітин А431 в присутності 5 мкМ hBD-2 призводила до крупноблочної фрагментації ДНК (появи фрагментів ДНК розміром приблизно 50 т.н.п.).

При дослідженні лізису еритроцитів людини було встановлено, що hBD-2 здатний викликати лізис еритроцитів в концентрації приблизно 10-7 М.

Результати досліджень довели, що трансформовані клітини в культурі продукують суміш пептидів з антимікробною активністю. Для дослідження транскрипції антимікробних пептидів, що продукуються в культурі клітин, та регуляції їх експресії необхідно було використовувати інші методи, які є більш точними та менш затратними, ніж біохімічні. За цих обставин надалі було застосовано сучасні генетичні методи дослідження, що дозволяють реєструвати експресію генів, – реакцію зворотньої транскрипції (ЗТ-ПЛР) та метод ланцюгової полімеразної реакції (ПЛР).

Для дослідження експресії генів дефенсинів, ЕФРр, ТФР- шляхом виявлення відповідної мРНК методом ЗТ-ПЛР було підібрано олігонуклеотидні затравки до кожного з досліджуваних генів та оптимальні умови їх ампліфікації (Табл.2).

Дослідження експресії генів дефенсинів в системі in vitro було проведено на 7 лініях пухлинних клітин, а саме А431, M-HeLa, Colo320HSR, Molt-4, CЕM, KB, U251. В пухлинних клітинах різного гістогенезу, що росли в культурі за стандартних умов культивації, було виявлено експресію таких генів: 1) HD-6 - в культурі клітин карциноми шийки матки людини M-HeLa; 2) hBD-1 та HD-6 - в культурах клітин епідермоїдної карциноми слизової оболонки ротової порожнини людини КВ та епідермоїдної карциноми вульви людини А431, а також в сублінії клітин А431/1522; 3) HD-5 - в культурі клітин аденокарциноми також в сублінії клітин А431/1522; 3) HD-5 - в культурі клітин аденокарциноми товстої кишки людини COLO 320HSR; 4) HD-6 - в культурах клітин Т-клітинного гострого лімфобластного лейкозу людини Molt-4 та CЕM; 5) HNP-1, HNP-3 - в культурі клітин гліобластоми людини U251.

Таблиця 2

Послідовності праймерів та розміри продуктів ПЛР та ЗТ-ПЛР

Ген | Послідовність праймера | Розмір продукту, п.н.

ПЛР | ЗТ-ПЛР

HNP-1, HNP-3 | 5-ccctcgccatccttgctgccatt

5-gcaagctcagcagcagaatgccca | 864 | 284

hBD-1 | 5-tgttgcctgccagtcgccatgag

5-tcacttgcagcacttggccttccc | 7186 | 225

hBD-2 | 5-gaagctcccagccatcagcc

5-gtcgcacgtctctgatgaggga | 1922 | 281

НР-4 | 5-ccccagccatgaggattatcgcc

5-ccatgccccttgttgagcctgaa | 784 | 198

HD-5 | 5-ccatcgccatccttgctgcca

5-ggactcacgggtagcacaacggc | 1196 | 224

HD-6 | 5-aggctgatgcccaggagcag

5-tggcaatgtatgggacacacga | 1194 | 280

ТФР- | 5-agtgcagacccgcccgtggct

5-agggcgctgggcttctcgtgc | 347

ЕФРp | 5-ctgct(c/g/t)aactgg(t/g)g(t/a)(g/a)t(g/a/c)ca(g/a)

at(a/t/c)gc(t/c/a)aaggg

5-atcatcca(a/g)ca(c/t)ttgaccat(g/c)a(t/c)catgta(a/g)ac(g/a)tc | 418

HPV | 5-cgtccmarrggawactgatc (P.E. №808-0011)

5-gcmcagggwcataayaatgg (P.E. №808-0012) | 450

G3PDH | 5-tgaaggtcggagtcaacggatttggt

5-catgtgggccatgaggtccaccac | 982

Визначення фрагментів кДНК дефенсинів лише після 40 циклів ампліфікації свідчило про невисокий рівень експресії цих генів в клітинах вищезгаданих ліній. Експресія гена HD-6 в клітинах СЕМ та Molt-4, а також експресія генів HNP-1 та HNP-3 в клітинах гліобластоми U251 була виявлена вперше в клітинах такого типу (Табл. 3).

На основі отриманих даних можна зробити припущення про дерегуляцію/блокування нормальної експресії генів дефенсинів в злоякісно трансформованих клітинах.

Таблиця 3

Експресія генів дефенсинів в культурах пухлинних клітин людини

Лінії клітин | Гени

HNP-1/3 | HBD-1 | HBD-2 | HP-4 | HD-5 | HD-6

A431 | - | + | - | - | - | +

M-HeLa | - | - | - | - | - | +

Colo320HSR | - | - | - | - | + | -

Molt-4 | - | - | - | - | - | +

CЕM | - | - | - | - | - | +

KB | - | + | - | - | - | +

U251 | + | - | - | - | - | -

Примітка: /+/ - наявність експресії гена

/-/ - експресії гена не зафіксовано

Згідно даних літератури рівень експресії генів б-дефенсинів та hBD-1 має конститутивний характер, а експресія гена hBD-2 є стимул-залежною і може бути індукована у відповідь на мікробну інфекцію внаслідок контакту з бактеріальними агентами чи ЛПС. У зв’язку з цим було проведено дослідження, що мало за мету встановлення впливу бактеріальних агентів на рівень експресії генів дефенсинів in vitro в лініях пухлинних клітин А431 та M-HeLa. Цими дослідженнями встановлено, що 6 годинна інкубація клітин А431 або M-HeLa з живими або стерилізованими кип’ятінням клітинами B.subtilis (2,5 x 109 клітин) призводить до індукції експресії мРНК hBD-2, але не впливає на рівні експресії генів hBD-1 та HD-6 в цих клітинах (Рис. 5).

Рис. 5. Експресія генів hBD-2 (а), hBD-1 (б), HD-6 (в) та G3PDH (г) в культурах клітин А431 за умов 6-год інкубації з стерилізованими кип’ятінням (трек 2 ) та живими клітинами (трек 3). Трек 1 – контроль (клітини А431).

Таким чином, отримані дані підтвердили, що експресія генів hBD-1 та HD-6 є конститутивною та не залежить від наявності зовнішніх стимулів, в той час як наслідком бактеріальної інфекціі є індукція експресії гена hBD-2, а вірусна інфекція не впливає на експресію цього гена.

Задачею даної роботи було також дослідити, як впливає вірусна інфекція на експресію генів дефенсинів in vitro. Дані літератури відносно противірусної дії дефенсинів малочисельні. В той же час найпоширеніші форми раку у жінок (а саме плоскоклітинний рак шийки матки та вульви), згідно