УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ

ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ

Позмогова Світлана Аркадіївна

УДК:619:616.98:579.873.21:57.083.32:636.5

ВИВЧЕННЯ ПРОТЕЇНОГЕННИХ КУЛЬТУР МІКОБАКТЕРІЙ

ТА РОЗРОБКА ТЕХНОЛОГІЇ ВИГОТОВЛЕННЯ

ТУБЕРКУЛІНУ (ППД) ДЛЯ ПТИЦІ

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Харків – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії вивчення туберкульозу Інституту

експериментальної і клінічної ветеринарної медицини Української

академії аграрних наук.

Науковий керівник

доктор ветеринарних наук Завгородній Андрій Іванович,

Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини

УААН, завідувач лабораторії вивчення туберкульозу.

Офіційні опоненти:

доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН Красніков

Геннадій Андрійович, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії патоморфології,

кандидат ветеринарних наук Сосницький Олександр Іванович,

Луганський національний аграрний університет Міністерства

аграрної політики України, доцент кафедри мікробіології та

фармакології.

Провідна установа. Одеський державний аграрний університет

Міністерства аграрної політики України , кафедра мікробіології і вірусології, м. Одеса.

Захист відбудеться “ 14 ” червня 2004 р.

о ----9.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01

в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини

УААН за адресою 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту

експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою:

61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83

Автореферат розісланий “ 7 ” травня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук БАБКІН А.Ф.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Основним завданням галузі птахівництва є забезпечення населення країни цінними, дешевими дієтичними продуктами харчування (м’ясо, яйця). Інтенсифікація галузі птахівництва, створення великих птахофабрик, а також фермерських господарств ставлять перед ветеринарною наукою і практикою завдання щодо розробки нових і удосконалення існуючих, більш специфічних систем діагностики, профілактики, заходів боротьби проти інфекційних захворювань, які б відповідали сучасному рівню організації птахівництва, були ефективні, прості і доступні для масового застосування.

Розвиток птахівництва в значній мірі стримується наявністю деяких інфекційних хвороб, серед яких велике значення має туберкульоз птиці, що завдає значних економічних втрат птахівництву, а також являє загрозу для здоров’я людей.

Для прижиттєвої діагностики туберкульозу птиці широко застосовується внутрішньошкірна алергічна проба з використанням туберкуліну (ППД) для птиці, який виготовляється за різними технологіями.

Завдяки проведеним в 60-70 роки широкомасштабним профілактичним та оздоровчим заходам птахопоголів,я України з 1972 року вважається благополучним щодо туберкульозної інфекції.

Проте, не зважаючи на досягнуті успіхи в боротьбі з туберкульозом птиці, прогноз з цього захворювання слід вважати обережним. Це в першу чергу пов’язано з тим, що до цього збудника туберкульозу сприйнятлива не тільки домашня птиця, але і близько 230 видів диких і синантропних птахів, в тому числі і зоопаркові. (Тузова Р.В., 1960, Ротов В.І., 1973, Рожнятовська О.І., 1979, Нечваль І.Т., 1985, Романенко В.П., 2001).

Дані літератури зарубіжних авторів свідчать про те, що в природних умовах від диких птахів, а також при спільному утриманні курей і свиней хворих туберкульозом, останні заражаються збудником цього захворювання (Щуревський В.Е., 1972, Солонеко А.А., 1978, Румачик І.І., 2001).

Реформування агропромислового комплексу в Україні та безконтрольний завіз конкурентних кросів птиці, гібридного молодняку, інкубаційного яйця можуть вплинути на епізоотичну ситуацію щодо туберкульозу птиці.

Необхідно враховувати, що Мycobacterium avium постійно циркулюють серед дикої птиці, і те, що існує велика кількість факторів передачі, які забезпечують постійну підтримку цього збудника в природі та створюють постійну загрозу зараження сприйнятливих до туберкульозу тварин і птахів.

Особливо це стосується індивідуального сектора та неспеціалізованих господарств, в яких свійська птиця на туберкульоз не досліджується, а тому дані ветеринарної статистики не дають навіть приблизного уявлення про фактичний стан їх благополуччя щодо туберкульозу птахів.

Інтенсивний розвиток підсобних і приватних господарств, де утримується птиця від одного до двох і більше років, широка торгівля нею, відсутність конкурентних кросів птиці і завезення гібридного молодняку в Україну, а також невиконання в повному обсязі профілактичних заходів може ускладнити стійке благополуччя в птахогосподарствах щодо туберкульозу.

У комплексі профілактичних заходів щодо туберкульозу птахів одне із провідних місць займає діагностика цього захворювання, яка проводиться алергічним методом із застосуванням туберкуліну (ППД) для птиці.

Для контролю в подальшому стійкого благополуччя птахогосподарств України щодо туберкульозу необхідно було розробити високоспецифічний, активний алерген та налагодити його промислове виробництво.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за темою: ”Вивчити особливості імунної реактивності, патогенезу у тварин, уражених мікобактеріями різної біологічної активності”, “Розробити систему заходів боротьби з туберкульозом сільськогосподарських тварин в умовах реформування тваринництва” (номери державної реєстрації 0197U000755; 0101 U001615).

Мета і задачі дослідження. Основна мета досліджень – виділити та дослідити протеїногенні культури мікобактерій збудника туберкульозу пташиного виду і розробити технологію виготовлення алергену (туберкуліну) для прижиттєвої діагностики туберкульозу птиці.

Для досягнення цієї мети були поставлені завдання: провести аналіз епізоотичної ситуації щодо туберкульозу в птахогосподарствах України та виділення культур мікобактерій пташиного виду від тварин і птиці; виділити культури мікобактерій із патологічного матеріалу; вивчити культурально-морфологічні, біохімічні, біологічні, протеїногенні властивості культур мікобактерій; розробити синтетичне живильне середовище для адаптації і культивування протеїногенних культур мікобактерій; виготовити з протеїногенних культур мікобактерій пташиного виду туберкулін очищений (ППД) для птиці і вивчити його властивості; розробити схему технологічних процесів виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для птиці в стандартному розчині.

Об’єкт дослідження: туберкульоз птиці та його діагностика.

Предмет дослідження: культурально-морфологічні та протеїногенні властивості культур мікобактерій, живильні середовища для культивування M.avium, виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для птиці, а також вивчення його діагностичної ефективності в дослідах на лабораторних тваринах і птиці.

Методи дослідження. При виконанні роботи використовували метод ретроспективного епізоотологічного аналізу, а також культуральні, біохімічні, біологічні, бактеріологічні, патологоанатомічні і статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше за останні роки проведено аналіз епізоотичної ситуації щодо туберкульозу птиці і виділення збудника туберкульозу пташиного виду від сільськогосподарських тварин та птиці.

Із патологічного матеріалу, від хворої на туберкульоз птиці, ізольовано протеїногенний штам збудника туберкульозу пташиного виду, який є перспективним для виготовлення туберкуліну, та вивчені його культурально-морфологічні, біохімічні та біологічні властивості.

Розроблено синтетичне живильне середовище для адаптації та промислового культивування протеїногенних культур мікобактерій, оптимальний режим автоклавування (102о – 60 хв.) та концентрування культурального фільтрату і стерилізуючої фільтрації туберкуліну.

Теоретично обґрунтовано та розроблено спосіб виробничого висіву протеїногенного штаму М.avium, який використовується при виготовленні туберкуліну (ППД) для птиці ( патент України № 62585 від 14.04.2003).

Розроблена технологічна схема біофабричного виробництва туберкуліну очищеного (ППД) для птиці, за якою виготовлено туберкулін, і в дослідах на лабораторних тваринах та птиці доказана його активність, специфічність, нешкідливість та відсутність сенсибілізуючих властивостей.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень використано при розробці нормативної документації на виготовлення, контроль та застосування туберкуліну очищеного (ППД) для птиці в стандартному розчині, яка затверджена Держдепартаментом ветеринарної медицини МАП України (26.02.2003р.).

Визначено протеїногенний штам збудника туберкульозу пташиного виду, придатний для виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для птиці, а також розроблені параметри технологічної схеми для промислового виготовлення цього алергену в умовах біофабрики. Запропоновано спосіб висіву туберкуліногенного штаму М.avium на синтетичне живильне середовище.

Особистий внесок здобувача. Основний обсяг експериментальних досліджень, аналіз отриманих результатів, їх статистичну обробку та узагальнення виконано дисертантом особисто. Визначення фенолу, гліцерину, хлористого натрію, загального білка у туберкуліні проводили спільно з провідним науковим співробітником лабораторії біохімії ІЕКВМ УААН, кандидатом біологічних наук Михайловою С.А., а виготовлення й контроль якості туберкуліну – з провідним науковим співробітником ІЕКВМ УААН, кандидатом ветеринарних наук Кассічем В.Ю.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались та обговорювались на звітних сесіях вченої ради ІЕКВМ УААН (м. Харків, 1999 – 2003 рр.) і науково-практичних конференціях: “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини - 80 років на передовому рубежі ветеринарної науки” (м. Харків, ІЕКВМ УААН, 2002 р), Міжнародній науково-практичній конференції по проблемам епізоотології інфекційних захворювань (м. Одеса, 2003 р.), ІІ-й конференції міжнародної асоціації паразитоцинологів (м. Луганськ, 2003 р.).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 5 наукових статей у фахових виданнях і отримано деклараційний патент на винахід.

Структура дисертації. Основний об’єм дисертації викладений на 142 сторінках комп’ютерного друку і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків, списку використаних літературних джерел і додатків. Роботу ілюстровано 20 таблицями, 8 рисунками. Список використаної літератури складає 348 джерел, у тому числі 99 іноземних авторів.

Матеріали та методи досліджень. Робота виконана в період з 1999 по 2003 рік у лабораторії вивчення туберкульозу Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини Української академії аграрних наук і Сумській державній біофабриці.

Захворювання птиці туберкульозом і виділення культур мікобактерій із патологічного матеріалу від тварин та птиці в господарствах України вивчали на підставі аналізу і узагальнення звітних даних Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини.

Бактеріологічне дослідження патологічного матеріалу від великої рогатої худоби і птиці проводили згідно з “Настановою по діагностиці туберкульозу тварин та птиці”, затвердженою ГУВ МСГП України 26 травня 1994 р.

У 11 виділених із патологічного матеріалу культур мікобактерій, а також одержаних шляхом селекції, вивчали такі основні їх властивості: швидкість і характер росту на щільному яєчному середовищі для культивування мікобактерій при температурах 25, 37, 45оС на МПБ; морфологію колоній (розміри, форму, консистенцію, характер поверхні); тінкторіальні властивості;

здатність утворювати пігмент на світлі та в темряві за методом Е. Кuвіса (1973);

стійкість до 5% хлористого натрію за методом D.Kestle et al.(1976); каталазну активність за методом С.Middlebrook (1954); реакцію редукції телуріту калію за методом J.Kulburn et.al.(1969); реакцію гідролізу твін-80 за методом G.Weyne (1962); амідазну активність за методом Taeguet et. al.(1967) в модифікації А.Б.Ільїної (1978).

Патогенні властивості у виділених культур мікобактерій вивчали в дослідах на 52-х морських свинках, 34-х кролях і 12-ти курях.

При вивченні культуральних, морфологічних, тінкторіальних і біохімічних властивостей у епізоотичних культур мікобактерій, які були виділені із біоматеріалу, та при їх ідентифікації для контролю використовували референтні штами мікобактерій М.bovis (шт.Vallee), М.avium, М.terrаe, М.triviale, М.nonchromogenicum, які знаходились у колекції лабораторії вивчення туберкульозу ІЕКВМ УААН.

Селекцію виділених культур мікобактерій пташиного виду (М.avium) проводили шляхом висіву їх у розведеннях від 10-1 до 10-6 на яєчне середовище для культивування мікобактерій.

Для адаптації культур мікобактерій пташиного виду і проведення досліджень застосовували живильні середовища: картопляно-гліцеринове середовище Павловського; сухе живильне середовище для культивування мікобактерій; середовище Сотона; синтетичне живильне середовище ЗКП-1; синтетичне живильне середовище ЗКП-1 з парафіновими дисками; картопляний відвар; синтетичне живильне середовище ЗКП-1 з картопляним відваром при співвідношенні 1:2; синтетичне живильне середовище з 0,5% твін-80.

Протеїн у культуральному фільтраті осаджували 50%-им водним розчином трихлороцтової кислоти (ТХО) до кінцевого вмісту її в фільтраті 4-8% і переосаджували насиченим розчином сірчанокислого амонію (1:1). У виготовленому напівфабрикаті туберкуліну визначали вміст загального білка за методом К,єльдаля (1960). У роботі також були використані “Сухий очищений туберкулін (ППД) для птиці” (серія №12, контроль №12, виготовлений 30.11.2002 р.); “Розчинник мікобактеріальних алергенів” (серія №14, контроль №14, виготовлений 25.05.98 р.) виробництва Курської біофабрики (Росія), а також експериментальні серії туберкуліну очищеного (ППД) для птиці у стандартному розчині, виготовлені нами із штаму М.avium ІЕКВМ УААН.

У кожній серії виготовленого туберкуліну очищеного (ППД) для птиці у стандартному розчині вивчали: зовнішній вид, однорідність розчину, концентрацію водневих іонів (рН-метр), вміст гліцерину (ареометр), хлористого натрію (Камишов В.С., 2000), фенолу (Антонов В.Л., Блік П.Н.,1971).

Стерильність туберкуліну визначали шляхом висіву – 5 см3 отриманого алергену на МПБ, МПА, МППБ і середовище Сабуро (ГОСТ 28085-89 СТ СЭВ 6280-88).

Визначення нешкідливості туберкуліну кожної серії проводили в дослідах на 5-ти білих мишах вагою 18-20 г, яким підшкірно вводили 0,25 см3 стерильного туберкуліну і спостерігали протягом 10-ти діб.

Специфічність препарату вивчали в дослідах на здорових морських свинках масою 350-500 г, і курях 8-10-ти місячного віку, які не реагували на туберкуліни для ссавців та птиці. Морським свинкам з лівого боку внутрішньо- шкірно в дозі 0,1 см3 вводили туберкулін виготовлених серій, а з правого боку - контрольний туберкулін для птиці. Кожній курці алергени вводили аналогічно в ліву і праву борідку. Облік реакцій на введені алергени у морських свинок проводили через 24 години, а у птиці - через 30-36 годин після введення туберкуліну.

Сенсибілізуючі властивості туберкуліну вивчали після триразового внутрішньошкірного введення в дозі 0,1 см3 /гол. з інтервалом 5 діб та через 15 днів після останнього введення туберкуліну. На дослідження кожної серії препарату було використано по 3 дослідні, а також по 3 контрольні морські свинки. Облік реакцій на місці введення туберкулінів визначали через 24 години після їх введення.

Визначення біологічної активності туберкуліну, виготовленого за розробленою технологією, в порівнянні з туберкуліном ППД для птиці Курської біофабрики в туберкулінових одиницях (ТО) проводили на здорових морських свинках-альбіносах, які були сенсибілізовані збудником туберкульозу пташиного виду (М.avium ІЕКВМ УААН) у дозі 3-4 мг суспензії в 0,5 см3 стерильного фізіологічного розчину. Перед введенням туберкулінів їх розводили 1:50 і 1:500, що еквівалентно 100 і 10 ТО в 0,1 см3.

Через 30 днів після сенсибілізації кожне окреме розведення алергенів (дослідні і контрольне) внутрішньошкірно вводили в дозі 0,1 см3 в депильовані ділянки шкіри з лівого і правого боку. Інтенсивність реакцій на місці введення алергенів у мм визначали через 24 години за формулою:

К = А : В . 50000, де

А – сума середніх діаметрів папул в ділянках введення дослідної серії туберкуліну.

В – сума середніх діаметрів папул на контрольну серію туберкуліну.

50000 – вміст ТО в 1 см3 основного розчину контрольної серії туберкуліну.

Крім цього, вивчення біологічної активності виготовлених серій туберкуліну в порівнянні з туберкуліном (ППД) для птиці виробництва Курської біофабрики проведено в умовах Сумської біофабрики на курях 8-10-ти місячного віку, які були одержані із благополучного щодо захворювання на туберкульоз птахогосподарства, та не реагували на туберкулін.

За 30 днів до початку експерименту курей розділили на п’ять дослідних груп по 15 голів у кожній і внутрішньовенно заразили зависсю живої культури М.avium ІЕКВМ УААН у дозі 1 мг/см3 стерильного фізіологічного розчину. Через 30 діб після введення мікобактерій дослідним курям внутрішньошкірно в ліву борідку вводили туберкулін дослідних серій, а в праву борідку - туберкулін для птиці Курської біофабрики у дозі 0,1 см3 . Облік реакцій проводили через 30-36 годин після введення туберкулінів шляхом порівняння товщини борідок у місці введення алергенів. Всього в дослідах було використано 193 морських свинок, 294 птиці (курей).

Експериментальні дані піддавали статистичній обробці за методом Ст,юдента-Фішера, а також за допомогою методу критеріїв знаків Z (Ашмарін І.П., Воробьов О.О.,1962, Лакін Г.Ф., 1990).

Результати досліджень

Вивчення епізоотичної ситуації з туберкульозу птахів в Україні. Аналіз звітних матеріалів свідчить про те, що захворювання птиці туберкульозом вперше було зареєстровано в 1947 році в шести областях України. При алергічному дослідженні в 1948 році – 51000 , 1949 – 89300 і 1950 – 226300 голів птиці в птахогосподарствах було виявлено, відповідно, 5,1%, 8,1% і 7,2% хворих на туберкульоз птахів у 1527 неблагополучних пунктах, розташованих у всіх областях України. За цей період (1948-1950 рр.) найбільшу кількість хворої на туберкульоз птиці зареєстровано у Житомирській – 20,4%, Чернігівській – 36,1%, Сумській – 20,8%, Вінницькій – 12,5%, Київській – 10,2%, Волинській - 53,9%, Рівненській – 16,1%, Харківській – 9,3% і Одеській областях – 8,7%.

Розповсюдження туберкульозу в птахогосподарствах було обумовлене значною концентрацією поголів’я птиці на обмежених виробничих площах, комплектацією птиці з господарств із невизначеною епізоотичною ситуацією на туберкульоз та порушенням правил їх карантину, невиконанням в повній мірі ветеринарно-санітарних вимог, діагностичних досліджень та іншими причинами.

Враховуючи складну епізоотичну ситуацію щодо туберкульозу птахів у 1951-1956 роках ветеринарними спеціалістами були вжиті заходи по профілактиці та оздоровленню неблагополучних пунктів від туберкульозної інфекції.

У результаті проведених заходів захворювання птиці туберкульозом зменшилось в три рази (з 7,2% у 1951 р. до 2,2% у 1956 р.), а в Рівненській, Тернопільській, Львівській, Харківській областях птахопоголів,я повністю було оздоровлене від туберкульозної інфекції.

Проте, у неблагополучних птахогосподарствах Вінницької, Хмельницької, Чернігівської областей туберкульозна інфекція носила стаціонарний характер. У господарствах Миколаївської, Житомирської, Сумської, Одеської областей, де оздоровчі і профілактичні заходи виконувались не в повному обсязі, виділялось від 3,1 до 5,4% хворих на туберкульоз курей від загальної кількості досліджених. Ці обставини явились підставою для розробки нових і удосконалення існуючих методів діагностики, профілактики і заходів боротьби з цим захворюванням.

Завдяки проведеним у 60-70-ті роки широкомасштабним заходам боротьби з цією інфекцією поголів’я птахогосподарств України у 1972 році було оздоровлено від туберкульозу. Починаючи з 1975 по 2003 роки контроль благополуччя птиці щодо туберкульозу проводиться ветеринарними фахівцями тільки на птахокомбінатах при плановому їх забої і при цьому в жодному випадку на розтині не було встановлено захворювання птиці туберкульозом.

Нами також проведено аналіз виділення культур мікобактерій пташиного виду із патологічного матеріалу, дослідженого в лабораторіях ветеринарної медицини України з 1976 по 1992 рік. При цьому встановлено, що із 1125 проб біоматеріалу, відібраного у 1980 році від підозрілих на туберкульоз курей, культуральним методом було виділено 90 культур збудника туберкульозу пташиного виду. За період з 1984-1986 роки кількість виділених культур збільшилась до 122-199. Незважаючи на зменшення кількості проб досліджуваного матеріалу за 12 років (1980-1992) із патологічного матеріалу від курей постійно виділяють мікобактерії цього виду.

Що стосується виділення М.avium від інших видів тварин, то за останні 17 років їх було виділено від великої рогатої худоби – 307 культур, свиней – 62 культури, про виділення культур M.avium із біоматеріалу від птиці за 1993-2003 рр. звітних даних не має.

Як видно із результатів проведеного епізоотологічного моніторингу, збудника туберкульозу пташиного виду виділяють від різних тварин та птиці, що може ускладнити епізоотичну ситуацію щодо туберкульозу в птахогосподарствах України.

Враховуючи ці обставини, а також для контролю стійкого благополуччя птахопоголів,я України щодо туберкульозу, необхідно проводити дослідження птиці племінних господарств-репродукторів на туберкульоз. Одним із найбільш ефективних методів прижиттєвої діагностики цього захворювання у птахів є алергічний метод із застосуванням туберкуліну для птиці. Однак, цей алерген біологічна промисловість України не виготовляє, що спричиняє в деякій мірі труднощі з його використання.

Для контролю благополуччя птахогосподарств щодо туберкульозу та забезпечення фахівців ветеринарної медицини цим алергеном необхідно виділити протеїногенні культури М.avium, розробити синтетичні живильні середовища для їх адаптації і культивування та розробити технологічну схему виготовлення цього алергену.

Виділення та ідентифікація культур мікобактерій. Культуральним методом досліджено 12 проб патологічного матеріалу від птиці, 1-ї індички і 35 проб від великої рогатої худоби, яка реагувала на туберкулін із благополучних щодо туберкульозу господарств. Первинний ріст колоній на живильному середовищі із біоматеріалу, відібраного від чотирьох курей, індички і шести корів, спостерігали на 21-30 добу.

При пересіві на щільне яєчне середовище виділені 11 культур мікобактерій в першій генерації виростали на 12-16-ту добу. Ізольовані культури мікобактерій відрізнялись за морфологічними, культуральними, біохімічними та біологічними властивостями. Так, шість культур мікобактерій добре росли в S- формі при температурі 370, 450С, не утворювали пігменту в темряві та на світлі. Мали позитивну реакцію з телурітом калію, нікотинамідом, піразинамідом, у пробірках з м,ясопептонним бульйоном утворювали придонний ріст, не росли на середовищі з 5%-им хлористим натрієм. Мали негативну каталазну активність, реакцію з сечовиною, Твін-80, добре суспендувались у фізіологічному розчині, обумовлювали сенсибілізацію морських свинок до туберкуліну для ссавців і птиці. Викликали септичну форму туберкульозу в кролів через 18-30 діб після внутрішньовенного введення в дозі 1,0 мг/см3 стерильного фізіологічного розчину та туберкульоз у курей на 32-65-ту добу після зараження, що і було підставою віднести їх до виду М.avium. Інші п’ять культур у першій генерації погано росли при температурі 25оС і добре росли при 37оС та зовсім не виростали при 45оС. У пробірках з МПБ утворювали придонний ріст у вигляді пластівців світло-сірого кольору, гідролізували Твін-80, мали позитивну каталазну, нікотинамідазну, пірозинамідазну активність. Не проявляли фотохромогенних властивостей, не росли на живильному середовищі з 5%-им хлористим натрієм, давали негативну реакцію з телурітом калію і сечовиною, були непатогенні для лабораторних тварин. Такі ж властивості були визначені і у референтного штаму М.nonchromogenicum, що дозволило вивчені нами культури віднести до нефотохромогенних атипових мікобактерій цього виду.

У подальшому для роботи були відібрані тільки культури збудника туберкульозу пташиного виду.

Селекція і адаптація культур мікобактерій (М.avium). Із бактеріальної маси шести культур М.avium, вирощеної на середовищі Павловського, готували завись на стерильному фізіологічному розчині з розрахунку 1 мг/см3 , після чого з зависі готували шість розведень - від 10-1_ до 10-6, які висівали на щільне яєчне середовище для культивування мікобактерій.

При культивуванні культури мікобактерій, які вивчались, в першій генерації добре росли при 37о С в S-формі на 10-16-й день в розведеннях 1:10-1 - 1:10-4 по всій поверхні середовища у вигляді гладеньких, блискучих, маслянистої консистенції колоній, світло - сірого кольору. В розведеннях 10-5 і 10-6 ці культури виростали на поверхні середовища окремими колоніями (10-50 колоній) з гладенькою, блискучою поверхнею, а в деяких пробірках виростали окремі колонії кратероподібної форми.

Після четвертого пасажу із поверхні живильного середовища відбирали окремі колонії і висівали на середовище Павловського для накопичення бактеріальної маси і адаптації їх на синтетичні живильні середовища.

Для адаптації протеїногенних культур мікобактерій в біологічній промисловості Польщі, Росії та інших країнах застосовують різні способи висіву та синтетичні живильні середовища. Однак, процес адаптації є трудомісткий і потребує від 70 до 90 днів.

Враховуючи ці обставини нами були виготовлені та випробувані шість варіантів живильних середовищ: синтетичне живильне середовище Сотона, картопляний відвар з 3%-им гліцерином, середовище ЗКП-1, ЗКП з картопляним відваром (1:2), ЗКП-1 з парафіновими дисками і 0,5% Твін-80.

При культивуванні культур мікобактерій збудника туберкульозу пташиного виду на цих середовищах у першому пасажі ріст колоній у вигляді плівки спостерігали на 10-15–ту добу на картопляному відварі з 3% гліцерину і середовищі ЗКП, яке вміщувало картопляний відвар (1:2). Через 25-30 діб після висіву плівка на поверхні цих середовищ потовщувалась та розташовувалась по всій поверхні середовища. В другому та третьому пасажі інтенсивність росту культур була значно кращою. Що стосується росту культур мікобактерій на інших середовищах, то тільки після третього пасажу на середовищі Сотона було відмічено ріст колоній у вигляді плівки. Культура М.avium-И-1 при культивуванні на живильних середовищах при триразовому пасажі виростала тільки на 30-40-й день на поверхні середовища ЗКП-1 з картопляним відваром у вигляді окремих колоній та тяжів, які звисали у товщу середовища.

Результати порівняльного випробування елективних властивостей живильних середовищ свідчать про те, що середовище ЗКП-1 з картопляним відваром (1:2) має найкращі ростові властивості, що дозволяє скоротити строки адаптування та швидше отримати якісний матричний розплід для виробничого культивування М.avium.

Вивчення протеїногенних властивостей культур мікобактерій. При виготовленні мікобактеріальних алергенів основним критерієм при виборі штамів є їх протеїногенність та біологічна активність виготовленого із них туберкуліну.

Визначення протеїногенних властивостей нами проведено у шести культур мікобактерій пташиного виду, які були виділені із патологічного матеріалу від підозрілої на туберкульоз птиці та реагуючої на туберкулін великої рогатої худоби.

Виділені культури мікобактерій висівали на синтетичне живильне середовище Сотона і культивували при температурі 380С. Через 50 днів, у вирощених культур, визначали накопичення бактеріальної маси і вихід протеїну.

Так, при першому пасажі інтенсивний ріст колоній спостерігали у культур М.avium К-1 і № 116. Накопичення бактеріальної маси через 50 діб культивування відповідно було 0,24+0,002%, 0,32 +0,06 і вихід білка 1,39+0,12, 2,93+0,01 мг/см3. Що стосується цих показників у чотирьох інших культур мікобактерій, то вони були в межах 0,15+0,03; 0,28+0,03% та 0,45+0,23, 2,06+0,05 мг/см3 відповідно.

У другому та третьому пасажі швидкість та інтенсивність росту 5-ти культур (М.avium К-1, К-2, 115, №166, №609), що вивчались, була значно вищою. Накопичення бактеріальної маси складало від 0,28 до 0,54%, а кількість загального білка від 2,02 до 4,6 мг/ см3.

Результати проведених досліджень свідчать про те, що не всі культури М.avium мали високі протеїногенні властивості.

Але, не дивлячись на це, в порівняльних дослідах було визначено, що культури мікобактерій М.avium-609, № 166, К-1 на протязі 50 діб культивування продукували білок в кількості від 3,03+0,10 до 4,60+0,33 мг/см3, що і було підставою для використання цих культур як перспективних для виготовлення туберкуліну очищеного для птиці.

Виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для птиці і вивчення його властивостей. Для виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для птиці нами були використані три культури М.avium – К-1, № 166, № 609, які були одержані шляхом селекції і адаптовані до синтетичних живильних середовищ. Кожну культуру мікобактерій вирощували на синтетичному живильному середовищі Сотона. Через 50 днів культивування вирощену бактеріальну масу автоклавували при температурах 1020С – 60 хвилин, 1200С – 180 хвилин, 1200С – 120 хвилин, а потім її відокремлювали від культурального фільтрату. В одержаний фільтрат додавали 50% розчин ТХО до вмісту її в фільтраті 4%, 6% і 8%. Одержаний білок розчиняли дистильованою водою (1:5) та переосаджували насиченим розчином сірчанокислого амонію з послідуючим центрифугуванням та розчиненням білка. Пермеат діалізували проти водопровідної води, а потім у напівфабрикат туберкуліну добавляли розчин хлористого натрію, фенолу, гліцерину до кінцевого їх вмісту 0,85+0,05, 0,3+0,1, 10,0+1,0% і піддавали стерилізуючій фільтрації через фільтр Зейтца.

Встановлено, що автоклавування бактеріальної маси при різних температурних режимах (1020С-60, 180хв.; 1200С -180 хв.) не впливає на вихід білка.

При 4%-ому вмісті ТХО у культуральному фільтраті вихід білка становив 150,6-280,2 мг, 6% - 210,8-390,1 мг, а при 8% - цей показник складав 240,3 – 570,3 мг, що на 90-290 мг більше, ніж при осадженні 4% ТХО.

Крім цього, в дослідах доведено, що вихід протеїну також залежить від протеїногенності культури, а не від кількості бактеріальної маси.

При визначенні активності препарату, виготовленого із культурального фільтрату М.avium № 166, на сенсибілізованих морських свинках встановлено, що цей туберкулін має біологічну активність 48051 ТО/мг, що і дозволило визнати його еквівалентним туберкуліну Курської біофабрики і, таким що відповідає вимогам (50000+10000 ТО) ГОСТ – 23881-79.

Туберкулін, який виготовлено із культури М.avium-609, мав у середньому біологічну активність на 31% (34558 ТО) нижче активності туберкуліну контрольної серії (м. Курск), а туберкулін із культури М.avium-К-1 – на 32% (32225 ТО) і нижчу активність на 15826 ТО в порівнянні з туберкуліном, виготовленим із М.avium-166.

Виготовлені туберкуліни були нешкідливі для білих мишей та не мали сенсибілізуючих властивостей.

У результаті проведених досліджень встановлено, що тільки туберкулін, виготовлений із М.avium-166, є специфічним і активним.

При комісійному міжлабораторному випробуванні виготовленої серії туберкуліну із М.avium № 166 було доведено, що цей препарат є стерильним, нешкідливим, специфічним, активним, не викликає сенсибілізації у морських свинок, а за фізико-хімічними властивостям відповідає ГОСТ–23881-79.

Штам М.avium ІЕКВМ УААН, який одержано шляхом селекції, зареєстрований в ДНКІБШМ як виробничий протеїногенний та видано паспорт.

Виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для птахів на Сумській біофабриці. Згідно розпорядження Головного Державного інспектора ветеринарної медицини України за № 638 від 09.07.2002 року на Сумській державній біофабриці за розробленою нами технологічною схемою було виготовлено три дослідні серії туберкуліну очищеного (ППД) для птиці в стандартному розчині та в відділі біологічного контролю біофабрики за 12 тестами визначали його якість.

За зовнішнім виглядом виготовлені серії туберкуліну являли собою прозору рідину світлокоричневого кольору без механічних домішок.

У туберкуліні серії №1 концентрація водневих іонів складала – 7,0, вміст білка - 0,63 мг/см3, хлористого натрію – 0,87%, гліцерину – 10,8%, фенолу – 0,3%, серії №2 – 0,6 мг/см3, 0,86%. 10,5%, 0,3 та серії №3 – 0,61 мг/см3, 0,87%, 10,5%, 0,3% відповідно

При вивченні стерильності (МПБ, МПА, середовище Кітт-Тароцці, Сабуро), нешкідливості (на 30 білих мишах), сенсибілізуючих властивостей (на 18 морських свинках) виготовлених серій туберкуліну встановлено, що препарат є стерильним, нешкідливим і не має сенсибілізуючих властивостей. У здорових морських свинок та курей при внутрішньошкірному введенні на місці введення туберкуліну алергічні реакції були відсутні, що свідчить про специфічність цього препарату.

Біологічну активність досліджених серій (1, 2, 3) туберкуліну визначали в дослідах на морських свинках, сенсибілізованих живою культурою збудника туберкульозу пташиного виду (М.avium ІЕКВМ УААН) у порівнянні з контрольною серією (№12) “Туберкуліну очищеного (ППД) для птиці”, Росія. Через 30 діб після інокуляції мікобактерій морським свинкам вводили внутрішньошкірно розведення 100, 10 ТО у 0,1 см3 туберкуліну контрольної серії та 3-х дослідних серій алергену.

При обліку реакцій (24 години) на перше і друге розведення туберкуліну контрольної серії сума інтенсивності алергічних реакцій складала 326 (176+150) мм, а сума інтенсивності реакцій на перше і друге розведення дослідної серії №1 складала 290,2 (158+132,2) мм. Сума інтенсивності реакцій у морських свинок у другому досліді на туберкулін контрольної серії складала 355 (225+130) мм, а дослідної серії №2 – 360(241+119) мм і таких показниках відповідно 267 (175+92,2) та серії №3 – 241 (160+81) мм.

При порівнянні показників інтенсивності алергічних реакцій контрольної серії туберкуліну з показниками інтенсивності реакцій на дослідні серії алергену по кожній групі тварин окремо біологічна активність туберкуліну серії №1 складала 44509 ТО мг, по серії №2 – 50704 ТО і серії №3 – 45100 ТО мг.

Таким чином, у результаті проведених досліджень встановлено, що виготовлені серії туберкуліну очищеного (ППД) для птиці в стандартному розчині в умовах Сумської біофабрики мали достатню біологічну активність, відповідали вимогам ГОСТ 23881-79 та Міжнародним нормам (50000+10000 ТО) для цього препарату.

Для підтвердження придатності виготовлених серій туберкуліну для діагностики туберкульозу у птахів нами була проведена перевірка активності туберкулінів у дослідах на птиці експериментально зараженій збудником туберкульозу пташиного виду (табл.).

Таблиця

Вивчення активності туберкуліну в дослідах на птиці.

Група | Кількість

дослідних

курей

(гол) | Реагували на туберкулін (гол) | Результати

дослідження | Дослідний | Контроль-

ний | Патолого-

анатоміч. | Бактеріо-логіч. |

Серія №1 | Серія

№ 2 | Серія

№ 3 | 1 | 15 | 15 | - | - | 15 | + | + | 2 | 15 | - | 15 | - | 15 | + | + | 3 | 15 | - | - | 15 | 15 | + | + |

- алерген не вводили, + результат позитивний.

Як видно з даних таблиці, у хворої туберкульозом птиці, внутрішньошкірні алергічні реакції були виражені як на дослідні серії, так і на контрольний туберкулін.

Алергічні реакції на введені препарати характеризувались гіперемією та припуханням сережок.

Вірогідної різниці в інтенсивності алергічних реакцій на дослідні і контрольний туберкуліни не було відмічено.

При патологоанатомічному дослідженні (60 днів) дослідних груп курей у внутрішніх органах (печінці) були знайдені характерні для туберкульозу ураження, а з відібраного біоматеріалу культуральним методом виділена культура М.avium.

Таким чином, результати проведених досліджень свідчать про те, що виготовлений туберкулін очищений (ППД) для птахів у стандартному розчині є активним і специфічним препаратом.

Не дивлячись на те, що в дослідах було доведено, що туберкулін є придатний для алергічної діагностики туберкульозу у птахів, але деякі технологічні процесі його виготовлення були трудомісткими, що впливало на собівартість алергену.

Враховуючи ці обставини нами надалі і були проведені дослідження для вирішення цих питань.

Розробка способу висіву М.avium на синтетичне середовище. У біологічній промисловості (для виробничого посіву) матричну культуру бичачого та людського виду висівають плівкою. Але застосування цього методу не завжди є виправданим, тому що при такому висіві 10-20% посівів бракують із-за проросту неспецифічної мікрофлори.

Для підвищення продуктивності праці операторів, зменшення собівартості готового продукту та автоматизації технологічних процесів ми застосували сифонний спосіб висіву матричної культури. Завись 10-денної матричної культури М.avium ІЕКВМ УААН висівали на 4 бутилі з середовищем Сотона в об’ємі 1, 2, 5, 10, 12 см3 і культивували при температурі 38,5 +0,5оСС.

Облік росту посівів враховували на протязі 50 діб. Контрольними були бутилі з посівами плівкою.

Через сім днів після висіву ріст колоній у вигляді плівки спостерігали у бутлях, де висівали по 5-12 см3 зависі М.avium сифонним способом. На 10-15-ту добу культивування плівка потовщувалась, поверхня її ставала бугристою, а на 30-40-у добу бактерійна маса осаджувалась на дно.

У бутилях, в які культуру висівали плівкою, первинний ріст колоній спостерігали тільки на 15-20-ту добу і тільки на 40-й день культивування плівка помітно потовщувалась і поступово осідала на дно.

Через 50 діб при сифонному способі висіву накопичення бактерійної маси у 1 літрі середовища в середньому становило 43,5+0,02 мг, а вихід білка 460,2 мг, тоді як при висіві плівкою ці показники не перевищували 40,65+0,02 та 458,5 мг відповідно.

Результати проведених досліджень свідчать про те, що сифонний спосіб висіву протеїногенного штаму М.avium у порівнянні з методом висіву плівкою є на 15-20% економічнішим і дозволяє механізувати виробничий посів матричної культури та є більш безпечним для здоров’я людей. На спосіб висіву туберкуліногенного штаму М.avium одержано деклараційний патент України за № 62585 від 14.04.2003 р.

Розробка синтетичного живильного середовища. Для культивування протеїногенних штамів мікобактерій використовують синтетичні живильні середовища, які відрізняються як за хімічним складом, так і за елективними властивостями. Так, А.А.Гриньов (1966) при порівняльному вивченні елективних властивостей живильних середовищ (Сотона, Ліннікової-Могилівського, УНДІЕВ-1,2, ВЛ2, Євглевського, Курської біофабрики) встановив, що для біофабричного виготовлення туберкуліну найбільш придатне середовище Сотона.

Разом з тим, слід зазначити, що використання його обмежено із-за того, що до складу його входять інгредієнти, які біологічна промисловість України не виготовляє.

Враховуючи ці обставини нами було виготовлено синтетичне живильне середовище із вітчизняних компонентів при мінімальному, оптимальному і максимальному співвідношенні інгредієнтів.

На виготовлені середовища сифонним способом висівали завись протеїногенного штаму М.avium ІЕКВМ УААН. Для контролю використовували середовище Сотона. Бутилі з посівами культивували при 38,5оС+0,5оС протягом 50 днів..

У результаті порівняльного вивчення елективних властивостей синтетичних живильних середовищ встановлено, що через 50 днів культивування шт. М.avium ІЕКВМ УААН на середовищі з мінімальним співвідношенням компонентів вихід бактеріальної маси з 1 літра середовища становив 230,0 мг, оптимальному – 255,0 мг, максимальному – 233,0 мг, а вихід загального білка відповідно – 380,0 мг, 569,2, 554,0 мг. Тоді як на середовищі Сотона ці показники складали 249,0 мг та 563,0 мг.

Результати проведених досліджень свідчать про те, що розроблене нами синтетичне живильне середовище з оптимальним співвідношенням компонентів має високі ростові властивості, що і дозволило впровадити його на Сумській біофабриці для промислового культивування протеїногенного шт. М.avium при виготовленні туберкуліну очищеного (ППД) для птиці.

Удосконалення схеми виготовлення туберкуліну для птиці. У процесі виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для птиці в стандартному розчині були виявлені деякі недоліки, які вагомо впливають на вихід готового продукту та його собівартість.

З урахуванням цього нами була удосконалена схема технологічних процесів (концентрація культурального фільтрату 1:7-1:9 первинного об’єму на установці УПВ-6, осадження білка 8% ТХО у культуральному фільтраті і стерилізуюча фільтрація алергену на установці Sartorius). Удосконалена технологічна схема представлена на рисунку.

За удосконаленою технологією було виготовлено дві серії туберкуліну (ППД) для птиці в стандартному розчині і проведено його комісійне виробниче випробування (наказ № 71 від 11.11.2002 р.).

У дослідах на лабораторних тваринах та птиці встановлено, що цей препарат є нешкідливим, специфічним, активним, у здорових тварин не викликає сенсибілізації і може застосовуватись для прижиттєвої діагностики туберкульозу птиці. Крім цього, використання сифонного способу висіву матричної культури, синтетичного живильного середовища, методу концентрування культурального фільтрату на