Міністерство охорони здоров’я України

Національний медичний університет імені О.О.Богомольця

Ахрамєєва Наталія Володимирівна

УДК 578.835.15:578.72:616-006-092.4

ВПЛИВ ВІРУСІВ ПОЛІОМІЄЛІТУТА ЇХ БЕНТОНІТОВИХ ВАРІАНТІВ НА ПУХЛИННІ ПРОЦЕСИ В ЕКСПЕРИМЕНТІ

03.00.06 - вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата

біологічних наук

Київ - 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному медичному університеті

імені О.О.Богомольця МОЗ України.

Науковий керівник: Широбоков В.П., д.м.н., професор, член-кор. НАН та АМН України, заслужений діяч науки і техніки України, завідуючий кафедрою мікробіології, вірусології та імунології НМУ.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Рибалко Світлана Леонтьєвна, старший науковий співробітник, в. о. зав. лабораторією мікробіологічного контролю якості імунобіологічних препаратів Київського науково-дослідного інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського

доктор медичних наук, професор Гриневич Юрій Акимович, заслужений діяч науки, завідуючий експериментально-лабораторним відділом інституту онкології та радіології

Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Д.Шупика МОЗ України, м.Київ.

Захист відбудеться “ 20 “ травня 1999 р. о 13.30 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.003.01 при Національному медичному університеті ім. О.О.Богомольця за адресою: 252057, Київ-57, проспект Перемоги, 34, медико-профілактичний корпус, аудиторія №2.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця за адресою: Київ-57, вул.Зоологічна,3.

Автореферат розісланий “ 20 ” квітня 1999 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор О.П. Яворовський

Актуальність роботи

Онкологічні захворювання являються надзвичайно важливою медичною та соціальною проблемою. Зважаючи на це, експериментальне обгрунтування нових методів терапії пухлин лишається актуальним завданням. В теперішній час проводиться інтенсивний пошук нових підходів до лікування онкологічних захворювань (Е.В. Филоненко с соавт., 1998; V Bertone et al.,1997; T Schunck et al, 1998). Одним із таких методів є віротерапія. Питання про застосування вірусів в онкотерапії досліджується і дискутується вже протягом десятиріч - з моменту відкриття явища вірусного онкотропізму та онколізу.

Вивчення взаємодії вірусів та пухлин, як новий науковий напрямок, почав формуватися в 50-ті роки. Для віротерапії онкозахворювань випробовувались віруси різних таксономічних груп та вірусні вакцини - арбовіруси, аденовіруси, віруси герпесу, вірус вісповакцини, антирабічна вакцина з різними, часом суперечливими, наслідками. Але спектр вірусів, що можуть бути використані в практичній віротерапії, обмежується властивостями цих вірусів. Вони мають бути апатогенними чи малопатогенними для людини і спричиняти виражену туморінгібуючу дію. З цієї точки зору перспективними є ентеровіруси (ЕВ), які відносяться до родини Picornaviridae, роду Enterovirus (J.L. Melnick, 1996). Клінічну апробацію та практичне застосування ентеровірусів в онкологічній клініці розпочала М.К.Ворошилова (М.К. Ворошилова, 1986), яка створила ряд живих ентеровірусних вакцин, що використовувалися з 1958 року для імунізації ракових хворих з певним позитивним клінічним ефектом. Паралельно з 1960 року Муценієце А.Я. із співавторами (А.Я. Муцениеце, 1969; А.Я. Муцениеце, 1977; А.Я. Муцениеце с соавт., 1982) проводили експериментальні дослідження в цьому напрямку, в результаті яких було виявлено онкотропізм значного числа ентеровірусів до деяких пухлин людини і тварин.

Серед ЕВ особливо реальним для віротерапії є застосування вакцинних штамів вірусів поліомієліту (ВВПМ), тому, що вони є складовими компонентами живої поліомієлітної вакцини Себіна, яка використовується для масової імунізації людей (тобто являються безпечними), і, наряду з іншими ентеровірусами, проявляють онкотропні властивості (М.К Ворошилова, 1979). З огляду на те, що взаємодія вірусів та пухлин має дуже індивідуальний характер, перед тим як рекомендувати певні віруси для дослідження в онкологічній клініці необхідно різнобічно вивчити механізми їх впливу на розвиток пухлин та на організм в цілому.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. В роботі узагальнено результати досліджень, здійснених згідно з державними плановими темами МОЗ України, грантовими дослідженнями, які були проведені на кафедрі мікробіології. вірусології, імунології НМУ при фінансуванні МОЗ України, Державного комітету по боротьбі із СНІДом :

Тема: “Вплив живої поліомієлітної вакцини на імунну систему”

№ держеєстрації 0194V025378.

Тема: “Інтерференція між ентеровірусами та ретровірусами як можливий шлях профілактики СНІДу та СНІД-асоційованих інфекцій” № держеєстрації 0195V0145.

Метою роботи було експериментальне вивчення розвитку пухлин і процесів, що їх супроводжують, на фоні введення вакцинних поліовірусів та дослідження можливих механізмів онкомодулюючої дії останніх.

Завдання дослідження:

1. Вивчити вплив вакцинних поліовірусів на розвиток пухлин на прикладі:

·

· епідермоідної карциноми легень Льюіса (LL)

· вірусіндукованого лейкозу Раушера (LR)

2. Дослідити вплив на розвиток експериментальних пухлин бентонітових варіантів поліовірусів на прикладі ВВПМ II типу.

3. Визначити вплив вакцинних вірусів поліомієліту на деякі фактори неспецифічної резистентності організму мишей:

·

· синтез фактору некрозу пухлин

· функціональну активність нормальних кілерів

4. Вивчити ультраструктурні зміни в клітинах кісткового мозку у мишей з лейкозом Раушера та в пухлинній тканині тварин з епідермоідною карциномою легень Льюіса під впливом вакцинних поліовірусів

5. Порівняльно дослідити репродукцію вакцинних поліовірусів в органах та пухлинних тканинах тварин.

Наукова новизна роботи.

В результаті проведених досліджень виявлено протективний онкомодулюючий ефект імунізації вакцинними поліовірусами на організм тварин з новоутвореннями. З’ясовано, що введення ВВПМ III типу найвиразніше впливає на розвиток лейкозу Раушера та карциноми Льюіса, обумовлюючи збільшення середньої тривалості життя (СТЖ) мишей та зменшення середньої маси пухлин (СМП) і середньої кількості метастазів. ВВПМ II типу позитивно впливає на мишей-носіїв саркоми S-180, обумовлює збільшення їх СТЖ та зменшення маси пухлин.

Вперше проведено порівняльне вивчення впливу ВВПМ на рівні вихідних популяцій та їх бентонітових варіантів відносно перебігу бластомних процесів. На прикладі ВВПМ II типу показано, що протективний ефект імунізації варіантом Абент+ тварин з S 180 та LL вищий, ніж при використанні вірусів вихідної популяції. Це може служити обгрунтуванням створення принципово нових препаратів на основі бентонітового варіанту Абент+ поліовірусів для застосування в терапії пухлин.

Проведено комплексну оцінку дії ВВПМ на імунологічні показники, що пов’язані з протипухлинним захистом. Встановлено, що вакцинні поліовіруси підвищують функціональну активність нормальних кілерів, індукують синтез інтерферону та фактору некрозу пухлин.

Теоретичне та практичне значення

Проведені дослідження доповнюють і поглиблюють існуючі уявлення про взаємодію вірусів і пухлин тому що:

·

· онкомодулююча дія ВВПМ доведена не лише на рівні вихідної вірусної популяції, а також на рівні бентонітових варіантів - з урахуванням дисоціації ентеровірусів на варіанти Абент+ та Абент в процесі репродукції. На прикладі ВВПМ II типу доведено, що варіант Абент+ (домінуючий компонент популяції) має більш виражений протективний ефект, ніж віруси вихідної популяції. Варіант Абент (мінорний компонент популяції вакцинних штамів поліовірусів), навпаки, зумовлює більш інтенсивний ріст пухлин.

Розроблена схема комплексної експериментальної оцінки впливу вірусів на розвиток пухлин, яку можна рекомендувати для проведення аналогічних досліджень в клінічних умовах.

Отримані результати доводять, що ВВПМ являються перспективними для подальшого вивчення їх терапевтичних можливостей в онкологічній клініці.

Особистий внесок здобувача. Експериментальне вивчення впливу поліовірусів та їх бентонітових варіантів на розвиток пухлин, дослідження факторів неспецифічно-го захисту тварин на фоні імунізації та тварин з пухлинами, виявлення розмноження поліовірусів в тканинах та органах мишей з використанням методу фотосенсибілізації вірусів здійснені безпосередньо автором роботи на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології НМУ. Дослідження ультраструктури пухлинних клітин та клітин кіст-кового мозку проведені в лабораторії електронної мікроскопії ЦНДЛ НМУ, консуль-тації та допомогу надавала проф. Стеченко Л.О., за що висловлюємо їй щиру подяку.

Апробація роботи.

Основні положення роботи були викладені на 10-му міжнародному конгресі з вірусології (Jerusalem, Israel, 1996), міжнародній науковій конференції, присвяченій 150-річчю з дня народження Мечникова (м. Харків, 1995), міжнародній науковій конференції “Морфологія - практичній ветеринарії та медицині” (м. Біла Церква, 1998), конференції, присвяченій 100-річчю від дня народження С.С.Дяченка (м. Київ, 1998).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 13 робіт, в тому числі 7 статей, представлених у виданнях, рекомендованих ВАК України.

Структура та обсяг роботи. Основний матеріал дисертації викладено на 169 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, 4 розділів власних досліджень, висновків, списку використаних джерел (186 вітчизняних та 96 іноземних). Дисертаційна робота ілюстрована 16 таблицями та 12 малюнками.

Основний зміст дисертації.

Матеріали та методи досліджень.

Для проведення досліджень були використані виробничі вакцинні штами вірусів поліомієліту І - LSс2аb, ІІ - P-712,ch 2аb та ІІІ - Leon12 аb типів, отримані з Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів АМН СРСР в 1983 році.

Вивчення онкомодулюючої дії цих вірусів проводили на таких експериментальних пухлинних моделях: саркома 180, епідермоідна карцинома легень Льюіса та вірусіндукований лейкоз Раушера, які були люб’язно надані ст.н.с. Л.І. Загоруйко та проф. О.І. Науменко (інститут радіології та експериментальної онкології ім. Є.Кавецького). Перещеплення пухлин та вивчення впливу вірусів на розвиток бластом проводили за класичними методиками, що використовуються для дослідження протипухлинних препаратів (Г.Аттаси с соавт., 1980). Експерименти для вивчення впливу поліовірусів на розвиток пухлин проводили за такою загальною схемою: здійснювали попередню імунізацію тварин вірусвмісним матеріалом, через 2 доби прищеплювали пухлини, в процесі розвитку бластоми проводили повторну імунізацію відповідними вірусами. Результати оцінювали за середньою масою пухлин (для цього мишей забивали та вилучали пухлини) та середньою тривалістю життя тварин. На моделі карциноми Льюіса визначали кількість метастазів.

Для дослідження онкомодулюючого ефекту вірусів поліомієліту на рівні популяції попередньо отримували бентонітові варіанти Абент+ та Абент , на які дисоціюють ентеровіруси в процесі репродукції. Для селекції бентонітових варіантів із популяцій вірусів було застосовано спеціальний метод (В.П. Широбоков, 1977). Його принцип полягає в тому, що домінуюча частина популяції поліовірусів адсорбується на бентоніті при нейтральних або слаболужних рН, тому цей варіант одержав символ Абент +. Мінорна частина популяції - це віруси, які не адсорбуються на бентоніті при даних рН. Вони отримали назву варіант Абент. Для селекції використовували 0,5% суспензію гелю бентоніту, який додавали до вірусвмісного матеріалу (рН 7,2-7,6). Бен-тоніт з адсорбованими вірусами надалі використовували як джерело варіанту Абент+, а супернатант піддавався ще 6 виснаженням гелем бентоніту і містив варіант Абент. Потім проводили пасажі вірусів обох варіантів на клітинних культурах. Отриманий ві-русвмісний матеріал повторно обробляли бентонітом при рН 7,2-7,6 і концентрували.

Можливими механізмами впливу вірусів на перебіг бластомних процесів є прямий онколіз, обумовлений онкотропізмом і розмноженням вірусів в пухлинній тканині, а також вірусіндукована імуномодуляція.

З метою одержання доказів репродукції поліовірусів в пухлинах та інших орга-нах тварин був використаний феномен фотосенсибілізації ентеровірусів профлавіном (Г.А. Королева, 1980). Висловлюємо щиру подяку проф. Г.А.Корольовій за консуль-тації та надання препарату профлавіну. Оброблені профлавіном віруси набувають вла-стивість інактивуватися під дією світла. Це не генетичний феномен, тому на вірусне потомство він не розповсюджується. Популяцію вірусів перед імунізацією обробляють профлавіном. В процесі репродукції в організмі тварин нащадки оброблених профлавіном вірусів втрачають фоточутливість. Після виділення з органів частину матеріалу обробляли світлом і проводили порівняльне титрування. Виявлення інфекційних вірусів в частині ВВВМ, що була оброблена світлом, свідчить про репродукцію ентеровірусів в органах тварин. Виявлення інфекційних вірусів тільки в частині матеріалу, не обробленій світлом, свідчить про те, що це віруси вихідної популяції, тобто віруси, які лише проникали в тканини, але не розмножувалися в них. Для проведення експерименту тваринам-пухлиноносіям вводили оброблені профлавіном віруси. Виділення вірусів проводили через 48 годин після імунізації.

З огляду на те, що основну роль в протипухлинному захисті відіграють неспецифічні фактори, було досліджено вплив імунізації вакцинними поліовірусами інтактних мишей та тварин-пухлиноносіїв на такі показники як функціональна активність нормальних кілерів (НК), синтез фактору некрозу пухлин (ФНП) та інтерферону (ІФН). Для цього інтактним тваринам вводили віруси відповідного типу в кількості 1х107 ТЦД50. Через 1, 4, 7 та 14 діб після імунізації тварин забивали, брали кров та селезінки для подальших досліджень. З метою вивчення впливу поліовірусів на реактивність пухлиноносіїв тварин імунізували, через 24 години їм прищеплювали пухлини. Взяття матеріалу для досліджень здійснювали через 14 діб після інокуляції пухлинних клітин (LL та S 180) чи через 22 доби після введення вірусу лейкозу Раушера (VLR).

Визначення активності нормальних кілерів проводили колориметричним методом (Н.А. Кузовкова, 1991). Для цього використовували спленоцити мишей, які проявляють активність нормальних кілерів. Цю активність виявляли по цитотоксичній дії на чутливі клітини L-929. Оцінку цитолізу проводили з використанням вітального барвника, який вносили в культуру клітин-мішеней до обробки їх НК. Після руйнування частини клітин під дією NK з них вивільняється барвник. Методом спектрофотометрії визначали інтенсивність забарвлення культуральної рідини дослідних та контрольних проб (не оброблених спленоцитами) і оцінювали цитотоксичний індекс.

Визначення рівня ФНП в плазмі крові основане на виявленні цитолітичної дії ФНП по відношенню до чутливих клітин L-929. Для цього клітинну суспензію розливали в 96-лункові планшети і після 24 годин інкубації додавали актиноміцин та дослідні сироватки. Через 24 години інкубації в СО2-інкубаторі, зливали середовище, що містило зруйновані під дією ФНП клітини, і додавали 0,2% розчин крістал-віолету для забарвлення клітин, що залишилися в лунках. На спектрофотометрі визначали інтенсивність забарвлення та підраховували цитотоксичний індекс.

Для визначення інтерферону було використано 2 підходи: виявлення сироват-кового ІФН, індукованого поліовірусами та пухлинами і виявлення ІФН, синтезовано-го спленоцитами під дією індукторів (конканаваліну А - -ІФН та вірусу хвороби Нью-касла - -ІФН). Принцип методу полягає в тому, що ІФН справляє протективну дію по відношенню до клітин, інфікованих вірусами. Цей ефект оцінюють по нейтралізації ЦПЕ мінімум на 50%. Для визначення ІФН мишей застосовували загальноприйняту систему: культура клітин L-929 та вірус везікулярного стоматиту. Щиро дякуємо в. н.с. лаб. мікробіології та вірусології НДІ отолорінгології ім.П.І.Коломийченка, Кривохатській Л.Д. за люб’язне надання необхідних реактивів та консультативну допомогу.

Для електронно-мікроскопічних досліджень ультраструктури пухлинних клітин мишей використовували класичну методику приготування електронномікроскопічних препаратів. Матеріал фіксували у розчині OsO4 по Колфільду. Зразки зневоднювали в етанолі зростаючої концентрації, починаючи з 700 спирту, ацетону та заливали у суміш епону та аралдіту за загальновідомою схемою (В.Я.Карупу, 1984). Зрізи виготовляли на ультратомах LKB-Ш та Reichert і контрастували 2% розчином уранілацетату у 70% етанолі та цитратом свинця та вивчали в електронних мікроскопах ЕМВ-100Б, ЕМВ-100БР. Оцінку змін морфофункціональної організації клітин проводили згідно методам (А.П.Сорокин, 1989; R.Duke et al., 1996; S.Bergese et al., 1997).

Отримані експериментальні дані обробляли методом варіаційної статистики з визначенням критерію Ст’юдента (Минцер О.П., 1982).

Результати дослідження та їх обговорення.

При вивченні онкомодулюючої активності вакцинних вірусів поліомієліту встановлено, що всі 3 типи вірусів здатні впливати на розвиток експериментальних пухлин. Характер та інтенсивність дії залежить як від типу вірусу, так і від виду пухлини.

Дослідження, проведені на моделі саркоми 180 відображені в табл. 1.

Таблиця 1.

Вплив вакцинних поліовірусів на розвиток саркоми 180 у мишей.

Віруси | Середня маса пухлини | Середня тривалість життя

абсолютна

(Mm, г) | відносно контролю

(в %) |

абсолютна

(в добах) | відносно контролю

(в %)

без імунізації

(n=10) | 4,42 0,53 | 100 | 17,79 0,11 | 100

I тип (n=10) | 5,57 0,56

Р0,1 | 126 | 18,48 0,07

Р0,1 | 103

II тип, (n=10) | 2,21 0,35

Р0,02 | 50 | 25,84 0,72

Р0,05 | 144

III тип, (n=10) | 2,68 0,25

Р0,02 | 60,6 | 18,02 1,21

Р0,1 | 100,7

Примітка: P- рівень значущості по відношенню до контрольної групи (неімунізовані тварини).

Найбільший вплив на розвиток пухлини спричиняє ВВПМ II типу, імунізація яким викликає затримку росту саркоми, продовжує тривалість життя тварин на 44% і зменшує масу пухлин в середньому в 2 рази порівняно з контрольною групою. ВВПМ III типу сприяє зменшенню середньої маси пухлин в 1,65 рази, але не впливає на СТЖ. Дія ВВПМ I типу відрізняється тим, що він не лише не впливає на тривалість життя мишей, а навіть сприяє прискоренню росту пухлини та обумовлює збільшення її маси на 26 % порівняно з контролем.

Вплив вакцинних вірусів поліомієліту на перебіг карциноми Льюіса представлений в табл. 2.

Таблиця 2.

Вплив вакцинних поліовірусів на розвиток карциноми Льюіса у мишей

Віруси | Середня маса

пухлин | Середня кількість метастазів | Середня тривалість життя

абсолютна

(Mm, г) | відносно контролю

(в %) | абсолютна | відносно контролю

(в %) | абсолютна

(в добах) | відносно контролю

(в %)

без імунізації

(n=10) | 2,030,18 | 100 | 1,88 0,49 | 100 | 29,1 0,92 | 100

І тип

(n=10) | 1,66 0,31

Р0,1 | 81,8 | 2,88 0,62

Р0,05 | 153 | 27,2 1,9

Р0,1 | 93,5

ІІ тип

(n=10) | 1,360,24

Р0,05 | 67 | 1,44 0,33

Р0,05 | 76,6 | 33,7 0,56

Р0,02 | 115,8

ІІІ тип

(n=10) | 1,160,28

Р0,02 | 57,1 | 1,2 0,318

Р0,05 | 63,8 | 36,8 0,34

Р0,01 | 126,5

Примітка: P - рівень значущості по відношенню до контрольної групи (неімунізовані тварини).

Найвиразніший ефект спричиняє ВВПМ III типу - Leon,12ab, імунізація яким обумовлює зменшення середньої маси пухлини на 42,9 %, збільшення середньої трива-лості життя тварин на 26,5 % і зменшення кількості метастазів на 36,2 % порівняно з контролем. Імунізація мишей ВВПМ ІІ типу - P-712,ch 2ab теж обумовлює антиблас-томну активність по відношенню до карциноми і викликає зниження середньої маси пухлини на 33%, продовжує середню тривалість життя мишей-пухлиноносіїв на 15,8 % і зниження числа метастазів на 23,4 %. Вакцинний поліовірус I типу - LSc,2ab майже не впливає на ріст пухлини LL, але призводить до активації процесу метастазування в 1,53 рази.Несподіваний ефект спричиняє імунізація дослідних тварин асоціацією трьох типів поліовірусів. Такий вірусний препарат майже не впливає на масу пухлин мишей, але його супресивна дія на організм пухлиноносіїв проявляється в підсиленій індукції процесу метастазування - кількість метастазів для таких тварин становить в середньо-му 6,5 одиниць, що в 3,46 разів перевищує аналогічний показник в контрольній групі.

Дію поліовірусів на розвиток лейкозів було досліджено на моделі вірусіндукованого лейкозу Раушера – табл.3.

Таблиця 3.

Вплив вакцинних поліовірусів на середню тривалість життя мишей з лейкозом Раушера

Віруси | Абсолютна середня три-валість життя

(в добах) | Середня тривалість життя відносно контролю

(в %)

без імунізації (n=15) | 16,94 4,32 | 100

І тип (n=15) | 35,71 2,99 Р0,01 | 210,8

ІІ тип (n=15) | 26,04 1,24 Р0,05 | 153,7

ІІІ тип (n=15) | 144,93 3,29 Р0,001 | 855,5

Примітка: P- рівень значущості по відношенню до контрольної групи (неімунізовані тварини).

Аналіз одержаних результатів показує, що імунізація мишей ВВПМ I типу обумовлює збільшення СТЖ на 110,8% порівняно з контрольною неімунізованою групою. ВВПМ II типу викликає дещо менший ефект - СТЖ збільшується на 53,7%. Найвиразнішу протипухлинну активність має ВВПМ III типу. СТЖ тварин, яким вводили цей вірус, збільшувалася на 755,5% і складала 144,9 днів.

Бентонітові варіанти за впливом на пухлинні процеси принципово відрізняються один від одного, про що свідчать результати, представлені в табл.4.

Таблиця 4.

Вплив генетичних варіантів вакцинного поліовірусу ІІ типу на розвиток експериментальних пухлин

Віруси | Саркома 180 | Карцинома Льюіса

середня маса

пухлин | середня маса

пухлин | середня кількість метастазів

абсолютна

(Mm, г) | відносно контр.

(в %) |

абсолютна

(Mm, г) | відносно контр.

(в %) |

абсолютна | відносно контр.

(в %)

без імунізації

(n=15) | 3,2 0,16 | 100 | 3,67 0,17 | 100 | 2,4 0,51 | 100

вихідна популяція (n=15) | 1,46 0,11

Р10,001 | 45,6 | 2,86 0,19

Р0,01 | 77,9 | 1,6 0,3

Р0,1 | 66,7

варіант Абент+

(n=15) | 0,9 0,16

Р10,001

Р20,02 | 28,1 | 2,03 0,11

Р10,001

Р20,01 | 55,3 | 0,7 0,21

Р10,02

Р20,05 | 29,2

варіант

Абент

(n=15) | 6,9 0,17

Р10,001

Р20,001 | 215,6 | 5,43 0,25

Р10,001

Р20,001 | 147,9 | 4,9 0,32

Р10,01

Р20,001 | 204,1

Примітка: P1- рівень значущості по відношенню до контрольної групи (неімунізовані тварини), P2 – рівень значущості по відношенню тварин, імунізованих вірусами вихідної популяції (в межах пухлинної моделі).

У мишей, яких імунізували варіантом Абент+, середня маса саркоми була в 3,6 рази нижчою ніж в контрольній групі та в 1,6 рази меншою, ніж у тварин, яким вводили віруси вихідної гетерогенної популяції. Аналогічні показники були отримані і на моделі карциноми Льюіса. Варіант Абент+ зумовлював зниження середньої маси пухлини майже в 2 рази і зменшення метастазів у 3,43 рази порівняно з контрольними тваринами. Тварини з саркомою 180, які одержали варіант Абент, мали пухлини в 2,16 рази більші за контрольні. Порівняно з середньою масою пухлин мишей, імунізованих вихідним вірусом і варіантом Абент+ , цей показник збільшувався в 4,6 і 7,5 рази відповідно. Подібна тенденція спостерігається і при дослідженнях на мишах з карциномою. Так, варіант Абент зумовлює підвищення у мишей середньої маси пухлини на 47,9% порівняно з контролем і на 89,8% у порівнянні з тваринами, імунізованими вірусами вихідної популяції. Кількість метастазів у тварин, що отримали варіант Абент , перевищує також аналогічний показник у контрольних тварин та мишей, імунізованих вихідною популяцією, в 2,04 та 3,1 рази відповідно. Одержані дані переконливо свідчать про те, що варіант Абент+ відрізняється від варіанту Абент вираженою протипухлинною дією та має більш значний антибластомний ефект, ніж поліовіруси вихідної популяції. Варіант Абент, спричиняє протилежний ефект, він обтяжує перебіг пухлинних процесів, незалежно від їх виду. Отже, звільнення популяції від варіанту Абент благотворно впливає на реалізацію антибластомних потенцій поліовірусів.

Ми уявляли собі можливі механізми протипухлинної дії поліовірусів як взаємодію деяких факторів. По-перше, здатність поліовірусів до проникнення та розмноження в тканинах пухлин, тобто онколітична дія. По-друге, активація неспецифічної резистентності організму та факторів протипухлинного імунітету.

Для визначення онкотропних властивостей поліовірусів застосовували метод фотосенсибілізації вірусів профлавіном. На прикладі І та ІІ типів доведено, що вакцинні віруси поліомієліту здатні не лише до проникнення, але й до розмноження в пухлинних клітинах. В тканинах як саркоми, так і карциноми репродукція вакцинних поліовірусів відбувається більш інтенсивно ніж в контрольних тканинах. Вибрана модель карциноми Льюіса передбачає введення пухлинних клітин в м`язову тканину задньої лапи миші, де і відбувається розвиток первинної пухлини. Тому, при виділенні вірусів із бластоми за контроль правила друга інтактна лапа тварини. Результати вивчення онкотропізму поліовірусів представлені на рис.1.

Рис.1. Репродукція вакцинних поліовірусів в пухлинних тканинах та органах мишей.

Цифрами позначена кількість вірусів на 1 грам тканини.

Згідно результатам, одержаним на моделі саркоми і карциноми, виразний онкотропізм притаманний поліовірусам як І, так і ІІ типу. Але протективна протипух-линна дія доведена лише для ВВПМ ІІ типу. Кількість виділеного із пухлини поліові-русу II типу незначною мірою перевищує кількість вірусу I типу. Тому, виходячи лише з онкотропних властивостей, не можна пояснити різницю між впливом на розвиток пу-хлини ВВПМ I та II типів. Онкотропізм та розмноження поліовірусів в клітинах пухли-ни можливо не являється єдиною причиною їх антибластомної активності. Різниця між рівнем репродукції вірусів I та II типів незначна, але кількість вірусних нащадків, виді-лених із клітин саркоми ((1,80,0025)х104 та (2,60,077)х104 – для І та ІІ типів відповідно) на порядок перевищує кількість нащадків, що виділені із карциноми ((3,80,048)х103 та (4,60,074)х103 для І та ІІ типів відповідно). Тобто, по відношенню до саркоми 180 ВВПМ активніше проявляють свої онкотропні властивості, ніж до карциноми. Це підтверджує той факт, що, загалом, саркоми більш чутливі до ентеровірусів, ніж пухлини епідермального походження (Гарклава Р.Р., 1977). Не можна виключати можливості того, що наявність інфекційного вірусу в пухлинних клітинах призводить до певної зміни їх антигенних характеристик, тобто обумовлює гетерогенізацію пухлинної тканини, роблячи її більш імуногенною і чутливою до специфічних імунних факторів реактивності організму. Як відомо пухлинні клітини є слабкими антигенами (Косяков П.Н. и др., 1985), тому підсилення їх імуногенності може бути значущим фактором, що потенціює власні сили організму до протипухлин-ного захисту. В представленій роботі наводяться дані, що підтверджують імуноорганотропізм поліовірусів і доводять здатність поліовірусів до репродукції в органах імунної системи, таких як тимус і селезінка (рис.1). Отже, ВВПМ можуть реалізувати свої імуномодулюючі властивості при безпосередньому розмноженні в клітинах імунних органів, зокрема викликаючи підсилення продукції ІФН.

Основну роль в протипухлинному захисті організму відіграють неспецифічні фактори (Дейчман Г.И., 1984). Велике значення має інтерферон, активність НК і МФ, продукція ФНП. ІФН та ФНП мають не лише пряму пухлиноцидну активність, але й регулюють взаємодію імунокомпетентних клітин, яка визначає форму-вання імунної відповіді. Наведені в роботі експерименти ще раз підтверджують, що ві-руси в свою чергу впливають на синтез цих цитокінів і, відповідно, модулюють імунну реактивність організму.

Було проведено вивчення інтерферонового статусу, активності нормальних кілерів та продукції сироваткового фактору некрозу пухлин у інтактних мишей на фоні імунізації ВВПМ, а також порівняння рівня неспецифічного захисту мишей-пухлиноносіїв, імунізованих вакцинними поліовірусами та неімунізованих.

Вакцинні поліовіруси здатні впливати на інтерфероновий статус організму, який характеризує функціональний стан лімфоідних клітин крові (табл.4).

Таблиця 4.

Вплив вакцинних поліовірусів на показники неспецифічної реактивності.

Віруси | Терміни дослідження

1 доба | 4 доба | 7 доба | 14 доба

показники сироваткового інтерферону (міжнародні одиниці)

I тип

(n=21) | 146,512,88

Р<0,001 | 133,325,76

Р<0,001 | 213,325,76

Р<0,001 | 33,33,22

P>0,1

II тип

(n=21) | 240,025,76

Р<0,001 | 266,725,76

Р<0,001 | 586,651,53

Р<0,001 | 93,312,88

Р<0,01

III тип

(n=21) | 133,312,88

Р<0,001 | 146,512,88

Р<0,001 | 240,025,76

Р<0,001 | 86,619,32

Р<0,02

без імуніз.

(n=21) | 33,33,22

показники сироваткового фактора некрозу пухлин (цитотоксичний індекс в %)

І тип

(n=21) | 15,20,16

Р<0,01 | 18,50,32

Р<0,001 | 13,20,17

Р>0,1 | 12,11,13

Р<0,1

ІІ тип

(n=21) | 18,80,81

Р<0,01 | 23,10,65

Р<0,001 | 14,80,16

Р<0,01 | 12,50,15

Р<0,1

ІІІ тип

(n=21) | 14,10,80

Р<0,1 | 20,91,29

Р<0,001 | 14,00,81

Р<0,1 | 13,60,80

Р<0,1

без імуніз.

(n=21) | 11,60,97

показники активності нормальних кілерів (цитотоксичний індекс в %)

І тип

(n=21) | 50,00,58

Р<0,001 | 39,60,39

Р<0,01 | 66,20,56

Р<0,001 | 17,70,50

Р<0,001

ІІ тип

(n=21) | 62,10,48

Р<0,001 | 58,60,57

Р<0,01 | 73,20,75

Р<0,001 | 27,20,49

Р<0,001

ІІІ тип

(n=21) | 47,40,58

Р<0,001 | 40,00,38

Р<0,001 | 59,30,96

Р<0,001 | 33,30,42

Р<0,001

без імуніз.

(n=21) | 36,60,69

Примітка: P- рівень значущості по відношенню до групи неімунізованих тварин.

Найактивнішим індуктором ендогенного ІФН являється ВВПМ II типу. Максимальний титр сироваткового ІФН при поліовірусній індукції спостерігається на 7 добу і перевищує рівень ІФН інтактного організму в 17,62 разів. Індукція відзначається з 1 доби спостереження і для ВВПМ II становить 240,025,76 МО, що перевищує аналогічні показники для інших ВВПМ. Взагалі, кількість ІФН в крові мишей, імунізованих цим вірусом, перевищує його кількість у тварин, яким вводили інші ВВПМ. Продукція цього цитокіну спленоцитами під дією індукторів in vitro свідчить про здатність лейкоцитів синтезувати ІФН. З огляду на те, що ВХН являється індуктором В-лімфоцитів, а мітоген Кон А - індуктором клітин Т-системи, можна за переважною продукцією -та -інтерферону опосередковано судити про активність В- і Т-ланок імунітету взагалі. Спленоцити мишей, імунізованих поліовірусом ІІІ типу, продукують -ІФН в титрах, які перевищують аналогічну активність спленоцитів інтактних мишей в 1,82-8,01 разів. Найвищі титри -інтерферону індукує ВВПМ II типу. Попередня імунізація тварин вакцинним поліовірусом I типу незначною мірою сприяє підвищенню синтезу -інтерферону і після незначної стимуляції пригнічує синтез -ІФН. На основі наведених даних можна зробити висновок, що ВВПМ II типу зумовлює як виділення ІФН в кров, так і стимулює Т-ланку імунітету. Вірус ІІІ типу, крім підвищення рівня ІФН в сироватці крові, викликає активацію В-лімфоцитів.

ВВПМ, які являються активними індукторами ІФН, проявляють виразну антибластомну активність. Це може бути обумовлено як безпосередньою антипроліферативною дією інтерферону на пухлинні клітини, так і здатністю його активувати імуноцити. За даними літератури, обробка макрофагів інтерфероном підсилює продукцію інтерлейкіну-1, який діє на нормальні кілери, стимулюючи їх онколітичні потенції (Уманский В.С., 1986). Крім того, ІФН здатний безпосередньо активувати НК (Петров Р.В., 1994). Це узгоджується з результатами наших досліджень, про те, що імунізація кожним із трьох типів поліовірусів активує цитотоксичність нормальних кілерних клітин мишей (табл.4). ВВПМ II типу, який виявився найвиразнішим індуктором інтерферону, сильніше за всіх активував НК.

З літератури відомо, що фактор некрозу пухлин у невеликих кількостях необхідний для адекватної імунної відповіді взагалі і протипухлинної зокрема. Незначне підвищення кількості ФНП, який індукують всі три типи вакцинних поліовірусів (табл.4), сприяє активації протипухлинного імунітету. З огляду на те, що одним із основних продуцентів і одночасно реципієнтів ФНП є макрофаги, можна судити і про активність цих клітин, які відіграють велику роль в протипухлинному захисті організму. Крім того, ФНП підсилює проникливість ендотелію і індукує хемотаксис моноцитів, нейтрофілів та інших імуноцитів в тканини, що сприяє неспецифічному цитолізу пухлинних клітин (Суслов А.П., 1990).

Визначення показників неспецифічної резистентності у мишей з пухлинами показало, що неопластичний процес викликає супресію імунореактивності організму (табл.5).

Таблиця 5.

Вплив поліовірусів на фактори неспецифічного захисту у мишей з експериментальними пухлинами

Вірус | Актив-ність НК | Рівень ІФН | Рівень ФНП

S

Саркома 180

без імунізації

(n=21) | 26,20,42 | 1173,3103,3 | 36,63,22 | 23,33,22 | 39,71,78

ВВПМ ІІ типу

(n=21) | 37,40,61

Р<0,001 | 266,725,76

Р<0,001 | 93,312,88

Р<0,001 | 73,36,44

Р<0,001 | 27,40,86

Р<0,001

Епідермоідна карцинома легень Льюіса

без імунізації

(n=21) | 17,60,57 | 2346,0103,1 | 33,33,22 | 6,673,22 | 49,91,29

ВВПМ ІІІ типу

(n=21) | 30,340,49

Р<0,001 | 533,351,53

Р<0,001 | 133,325,76

Р<0,001 | 30,03,22

Р<0,001 | 31,70,97

Р<0,001

Лейкоз Раушера

без імунізації

(n=21) | 20,70,37 | 1066,7103,1 | 36,63,22 | 16,73,22 | 29,11,45

ВВПМ ІІІ типу

(n=21) | 32,30,50

Р<0,001 | 373,351,53

Р<0,001 | 266,725,76

Р<0,001 | 33,33,22

Р<0,02 | 19,00,81

Р<0,001

Примітки: 1

·

· , - титр - та -інтерферонів, що продукуються in vitro спленоцитами, обробленими відповідними індукторами

2. Цифрами в таблиці представлено:

Ш

Ш показники фактору некрозу пухлин та активність нормальних кілерів (значення цитотоксичного індексу в %)

3. P- рівень значущості по відношенню до групи неімунізованих тварин.

Вона виражалася в пригніченні цитотоксичної активності нормальних кілерів. У мишей-пухлиноносіїв відбувався підсилений синтез ендогенного інтерферону (табл.5), який служить поганою прогностичною ознакою стосовно розвитку патологіч-ного процесу і призводить до пригнічення клітинного імунітету, що виражається в зни-женні здатності спленоцитів до продукції - та -ІФН (Земсков В.М., 1983). Імунізова-ні ВВПМ тварини-пухлиноносії мали більш високі показники цитотоксичної активнос-ті НК-клітин. У них зменшувався рівень сироваткового інтерферону, що також є пози-тивним моментом (Ершов Ф.И., 1996), відновлювалась здатність індукованих сплено-цитів синтезувати in vitro - та -ІФН. Імунізація мишей з бластомами обумовлювала зниження кількості циркулюючого ФНП, тоді як неімунізовані тварини мали патологічно високі рівні цього цитокіну. Цей факт має важливе значення, оскільки відомо, що саме невисокі концентрації ФНП стимулюють процес активації імуноцитів і необхідні для регуляції різних субпопуляцій імунокомпетентних клітин, тоді як висока кількість може викликати ушкодження тканин, шок і навіть летальний кінець (Aggarwall B., 1995).

Виходячи з результатів проведених експериментів, ми прийшли до заключення, що провідними механізмами, що лежать в основі модуляції поліовірусами перебігу бластомних процесів, являється активація протипухлинних неспецифічних факторів захисту організму.

Електронно-мікроскопічні дослідження підтверджують здатність поліовірусів розмножуватися в клітинах пухлин. Згідно одержаним результатам, імунізація мишей-пухлиноносіїв активує процес міграції макрофагів в пухлинну тканину, що сприяє регресії пухлинної тканини. Проведені дослідження показали, що у мишей з лейкозом Раушера, імунізованих вакцинним поліовірусом ІІІ типу, ушкодження клітин кісткового мозку були не такими значними, як у неімунізованих тварин.

Висновки.

1. Доведено, що імунізація мишей вакцинними штамами вірусів поліомієліту впливає на перебіг експериментальних пухлин. В залежності від типу вірусів і виду пухлин цей вплив може проявлятися як в гальмування, так і в стимуляції бластомного процесу.

2. Вакцинний поліовірус ІІ типу - P-712,ch 2аb, проявляє виразну протипухлинну активність по відношенню до всіх трьох використаних в роботі моделей пухлин мишей:

·

· спричиняє зниження середньої маси епідермоідної карциноми легень Льюіса на 37%, підвищення середньої тривалості життя на 15,8% та зменшення кількості метастазів в 1,3 рази.

· обумовлює збільшення середньої тривалості життя при лейкозі Раушера на 53,7%.

3. Імунізація вакцинним поліовірусом ІІІ типу – Leon12 аb, має протективну дію відносно перебігу двох вивчених бластомних процесів у мишей:

·

· при лейкозі Раушера призводить до збільшення середньої тривалості життя в 8,5 рази

4. На прикладі вакцинного поліовірусу І типу - LSс2аb, доведено, що вірусна імунізація може обумовлювати стимуляцію пухлинного росту:

·

· кількість метастазів у мишей з карциномою Льюіса, яким вводили вірус І типу, збільшувалось в 1,53 рази.

Подібний ефект виявлено при введенні мишам препарату, що складався з усіх трьох штамів вакцинних поліовірусів.

5. Популяція поліовірусів неоднорідна за впливом на пухлинний процес: бентонітовий варіант Абент+ відрізняється від вихідної популяції виразнішим протипухлинним ефектом, варіант Абент, навпаки, обтяжує перебіг бластомного процесу. Це доведено на прикладі поліовірусу ІІ типу -

·

· варіант Абент стимулює пухлинний процес - середня маса саркоми збільшується на 115,6 %, карциноми на 47,9% та кількість метастазів підвищується в 2 рази.

6. ВВПМ проявляють виразні онкотропні властивості, вони здатні до репродукції в пухлинах, що доведено з використанням методу фотосенсибілізації вірусів профлавіном. Середня концентрація вірусів в пухлинах становить від (3,80,048)х103 до (2,60,077)х104 ТЦД50/г тканини.

7. Вакцинні поліовіруси є сильними імуномодуляторами. Протективна антибластомна активність ВВПМ по відношенню до саркоми 180, карциноми Льюіса та лейкозу Раушера у мишей обумовлена модуляцією факторів неспецифічної протипухлинної резистентності.

·

·

Список опублікованих праць за темою дисертації.

1. Корнюшенко О.М., Широбоков В.П., Ахрамєєва Н.В. Імуноорганотрпізм вірусів поліомієліту // Журнал АМН України.- 1997.- т.3, №2.- С.291-299.

2. Корнюшенко О.М., Широбоков В.П., Ахрамєєва Н.В., Сичова В.В., Шилов М.В. Взаємодія ентеровірусів з імунною системою // Доповіді НАН України.- 1997.- №6.- С.181-183.

3. Ахрамєєва Н.В. Вивчення імунологічних механізмів онкопротективної дії вакцинних поліовірусів // Вісник проблем біології і медицини.- 1998.- №23.- С.53-55.

4. Ахрамєєва Н.В., Широбоков В.П. Вплив поліовірусів на розвиток експериментальних пухлин // Вісник проблем біології і медицини.- 1998.- №24.- С.19-22.

5. Широбоков В.П., Амосова К.М., Корнюшенко О.М., Ахрамєєва Н.В. та ін. Роль ентеровірусів в неінфекційній патології // Проблеми медицини.- 1998, №3.- С.20-25.

6. Ахрамеева Н.В., Широбоков В.П. Корнюшенко О.Н. Влияние полиовирусов на опухолевый процесс // International Journal on Immunoreabilitation.- 1997.- №4.- С.148.

7. Ахрамєєва Н.В., Корнюшенко О.М., Кривохатська Л.Д. Вплив вакцинних поліовірусів на показники неспецифічної резистентності організму мишей // Актуальні питання медичної мікробіології та вірусології. Збірник праць до 100-річчя дня народження С.Дяченка.- Київ:- 1998.- С. 91-95.

8. Ахрамєєва Н.В., Широбоков В.П., Стеченко Л.А. Ультраструктурна перебудова пухлинної тканини під дією онкотропних поліовірусів // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету.- 1998.- вип.6., част.2- С.3-5.

9. Корнюшенко О.М., Широбоков В.П., Ахрамєєва Н.В., Андрієнко Т.В., Козак І.А. Ультраструктурні зміни органів імунної системи під впливом вірусів поліомієліту // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету.- 1998.- вип.6., част.1- С.30-33.

10. Сичова В.В., Широбоков В.П., Корнюшенко О.М., Ахрамєєва Н.В. Особливості імунопатогенезу експериментальної стафілококової інфекції на фоні імунізації вірусами поліомієліту// Укр. наук.-мед. молод. журн.- 1997.-№1-2.-С.22-25.

11. Achramejeva N., Kornjushenko O., Shirobokov V. The inhibition of growth of the experimental tumours by Entheroviruses and its possible mechanism // Abstract 10th International congress of virology.- Jerusalem, Israel.- 1996.- P.239.

12. Shirobokov V., Sitchova V., Kornjushenko O., Shilov M., Achramejeva N. Polioviruses as immunomodulators // Abstract 10th International congress of virology.- Jerusalem, Israel.- 1996.- P. 238.

13. Широбоков В. П., Корнюшенко О.М., Ахрамеєва Н. В., Сичова В. В., Костюк О. В. Імунотропізм вірусів поліомієліту // Тези доп. Міжнар. наук. конф., присв. 150-річчю з дня народженн Мечникова.- Харків.- 1995.- С. 159.

Анотація

Ахрамєєва Н.В. Вплив вірусів поліомієліту та їх бентонітових варіантів на пухлинні процеси в експерименті. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук