ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ В.Н. КАРАЗІНА

Сєдова Крістіна Володимирівна

УДК 577.1: 582.279

МЕХАНІЗМИ КОМБІНОВАНОЇ СТІЙКОСТІ ДО ДІЇ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ І ВИСОКОЇ ТЕМПЕРАТУРИ

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації

на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в НДІ біології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор Божков Анатолій Іванович, Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України, м. Харків, директор НДІ біології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Перський Є.Е., Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України, м. Харків, завідувач кафедри біохімії

доктор біологічних наук, професор Бондаренко Т.П., Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків, завідувач відділом кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем

Провідна установа:

Ужгородський національний університет, кафедра генетики і фізіології рослин, Міністерство освіти і науки України, м. Ужгород

Захист відбудется “26 “ січня 2005 року о 15.15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна за адресою:

61077, м. Харків, пл. Свободи 4, ауд. 3-15

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи 4

Автореферат розісланий 23 грудня 2004 р.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з фундаментальних властивостей біологічних систем є їх здатність змінювати свої структурно-функціональні параметри у відповідь на постійні зміни умов середовища. Цю властивість називають адаптацією [Хайдарлиу, 1984]. Здатність до адаптації забезпечує еволюційний розвиток органічного світу, зміни у процесі онтогенезу і виживаність в екстремальних умовах середовища [Альтергот, 1981, Панин, 1983]. Можливість до адаптації у певних організмів різна, вона змінюється в процесі онтогенезу і залежить від сили та послідовності діючих на організм чинників [Альтергот, 1981]. Незважаючи на те, що адаптивні можливості живих організмів визначають практично всі їхні властивості, знання про механізми адаптогенезу фрагментарні. Це пов’язано зі складністю дослідження механізмів адаптації.

Завдяки класичним роботам [Александров, 1975, 1986; Kagi, Vallee, 1961; Ritossa, 1962] відомо, що у відповідь на різкі зміни температури і вмісту в середовищі іонів металів індукується синтез специфічних білків (стрес-білків). Однак не тільки білки забезпечують стійкість організму до екстремальних впливів. Можливо, гіперсинтез білків спричинює перебудову багатьох систем клітини й організму, що й сприяє формуванню адаптивних реакцій. Але ці важливі питання не були експериментально досліджені.

Одним з методів дослідження механізмів адаптації є розроблення адекватних експериментальних моделей. У лабораторії молекулярної біології НДІ біології Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна був отриманий новий штам зелених водоростей Dunaliella viridis, що резистентний до дії високої концентрації іонів міді [Божков, Голтвянский, 1998]. Мікроводорості роду Dunaliella, як і клітини тварин, не мають властивої для рослинних клітин клітинної стінки і можуть бути універсальною моделлю при дослідженні адаптогенезу.

Мабуть, одним із найменш вивчених питань адаптогенезу є механізм комбінованої стійкості, тобто стійкості до декількох чинників. Зокрема викликає певний інтерес вивчення стійкості клітин до дії іонів металів і високої температури. Дослідження стійкості до підвищеної температури клітин D.viridis, попередньо адаптованих до іонів міді, має велике теоретичне і практичне значення, тому що клітини Dunaliella є перспективним об’єктом сучасної біотехнології.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження провадилися в рамках науково-дослідної теми “Дослідження механізмів біоакумуляції мікроорганізмів та отримання нових штамів для використання в біотехнології” (шифр – 32_, № ДР 0103U004279) у відділі молекулярної біології і біотехнології НДІ біології Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна.

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було розроблення біологічної моделі комбінованої стійкості до високої температури та іонів міді клітин Dunaliella viridis й дослідження механізмів комбінованої стійкості.

Відповідно до мети були визначені головні завдання дослідження:

1. Визначення стійкості до підвищеної температури (40-45 °С) клітин D.viridis, що були попередньо адаптовані до високих концентрацій іонів міді;

2. Дослідження вмісту і складу білків у клітинах D.viridis у випадку адаптації клітин до високої концентрації іонів міді та дії високої температури;

3. Вивчення вмісту і складу нуклеїнових кислот у клітинах D.viridis у випадку адаптації клітин до високої концентрації іонів міді та дії високої температури;

4. Оцінювання морфофункціональних змін клітин D.viridis під час формування комбінованої стійкості до іонів міді та високої температури.

Об’єкт дослідження. Метаболізм білків і нуклеїнових кислот у клітинах D.viridis, стійкість культури клітин D.viridis до іонів міді та високої температури,.

Предмет дослідження. Метаболічні зміни у клітинах D.viridis, що забезпечують формування комбінованої стійкості клітин до іонів міді та високої температури.

Методи дослідження. Концентрацію нуклеїнових кислот та вміст білка визначали спектрофотометричними методами; швидкість синтезу білку визначали, використовуючи радіоактивні ізотопи; білки та РНК розділяли електрофоретично; вміст міді визначали на атомно-абсорбційному спектрофотометрі. У роботі використовували методи культивування клітин мікро водоростей і методи світової мікроскопії для визначення концентрації клітин.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше показано, що клітини D.viridis, що були попередньо адаптовані до високих концентрацій іонів міді (20 г/л CuSO4 ·  H2O), демонструють виражену стійкість і до високої температури (45 ?С; 2 хв).

Комбінована стійкість до цих чинників зумовлена змінами в метаболізмі білків і нуклеїнових кислот; зокрема зменшувався вміст тотальних білків, знижувалася швидкість їх синтезу і змінювався спектральний склад водорозчинних білків. Уперше виявлено, що найбільші зміни під час формування комбінованої стійкості виявлялися у вмісті РНК клітин, що було пов’язано зі зменшенням кількості рибосом у клітині.

Формування комбінованої стійкості клітин D.viridis супроводжувалося змінами у складі високомолекулярних РНК клітини. Зокрема виявлялася фракція високомолекулярної РНК, що властива саме для такого стану клітини.

Термооброблення клітин D.viridis, чуттєвих до іонів міді, супроводжувалося пригнічуванням швидкості синтезу тотальних білків і зменшенням їх вмісту. Було показано, що у клітинах D.viridis, резистентних до іонів міді, термооброблення не зменшувало швидкості синтезу і вмісту тотальних білків у клітинах.

Дослідження засвідчили, що за умови дії термошоку збільшувався вміст РНК у клітинах мідьчутливого і мідьрезистентного штамів D.viridis. Найбільші зміни після термошоку у клітинах мідьрезистентної культури D.viridis спостерігалися у вмісті рибосомальної РНК. При інгибіюванні синтезу РНК актиноміцином D мідьрезистентна культура не виявляла стійкості до високої температури.

Висловлено робочу гіпотезу про кооперативний характер змін ряду метаболічних систем під час формування комбінованої стійкості. Також стійкість D.viridis до високої температури пов’язана з присутністю іонів міді у клітинах. Показано, що морфофункціональний стан клітин досить швидко змінювався за умови дії досліджуваних чинників.

Практичне значення отриманих результатів. Біомаса водоростей роду Dunaliella широко застосовується як харчовий додаток, багатий вітамінами (насамперед каротиноїдами), білками та мікроелементами. У цій роботі показано, що вміст білків і, особливо, РНК значною мірою змінюється під час формування комбінованої стійкості до іонів важких металів та високої температури. Це дозволяє одержувати біомасу Dunaliella зі зміненим складом, що важливо враховувати, використовуючи ці клітини. Одержання біомаси мікроводоростей зі зміненим складом може знайти застосування у виробництві харчових додатків.

Розроблена модель комбінованої стійкості клітин до іонів важких металів та високої температури може бути застосована в експериментальній роботі під час дослідження механізмів адаптогенезу. Отримана модель використовується в навчальній роботі біологічного факультету Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна, зокрема під час читання таких спецкурсів, як ”Біохімія водоростей”, “Об’єкти біотехнологій” і під час виконання курсових і дипломних робіт.

Особистий внесок здобувача. Самостійно опрацьовано наукову літературу та зроблено її огляд. Оцінювання первинної стійкості та адаптивних змін клітин, визначення вмісту білків і нуклеїнових кислот, поділення нативних білків і нуклеїнових кислот, дослідження впливу вмісту іонів міді в клітинах на стійкість культури до високої температури проведені самостійно. Дослідження швидкості синтезу білків проведені разом із науковим керівником. Статистичне оброблення отриманих результатів проведено самостійно. Аналіз та інтерпретація отриманих результатів проведені разом із науковим керівником.

Апробації результатів дисертації. Результати та основні положення роботи доповідалися на: студентській конференції “Каразінські читання” (Харків, 2002), науковій конференції “Актуальні проблеми біології в дослідженнях молодих учених Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна” (Харків, 2003), науковій конференції, присвяченій 180-річчю від дня народження Л.С. Ценковського (Харків, 2003), регіональній школі-семінарі молодих учених “Стрес і адаптація рослин: фізіологія, біохімія, генетика” (Харків, 2004) та на наукових семінарах у НДІ біології Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна.

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано три статті і двоє тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, 3-х розділів: огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень і їхнього обговорення, висновків, а також списку цитованої літератури з 151 найменування. Робота викладена на 102 сторінці друкованого тексту, вона містить 7 таблиць і 13 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Альгологічно чисту культуру Dunaliella viridis var. viridis f. euchlora IBASU-A N29 вирощували на рідкому середовищі Артарі в модифікації Масюк [Масюк, 1973], за умови цілодобового освітлення потужністю 6 клк на поверхні середовища, при температурі 28-30 °С. Мідьрезистентну культуру (CuR D.viridis) вирощували в присутності 20 г/л CuSO4 · 5H2O, що вносили під час кожного пересадження на свіже середовище.

Для оцінювання стійкості клітин водоростей до дії високої температури CuR D.viridis і мідьчутливий штам (CuS D.viridis) водоростей прогрівали на водяній лазні при температурі 45 °С, витримуючи їх 1,0; 1,5 і 2,0 хв. Для дослідження впливу теплового шоку на клітини CuS D.viridis і CuR D.viridis культуру витримували при 45 °С упродовж 1,5 хв. Після цього клітини культивували у стандартних умовах.

Число клітин в одиниці об’єму середовища під час пересівання та у процесі росту культур підраховували під мікроскопом у камері Горяєва [Владимирова, Семененко, 1962]. Контроль цілісності плазматичних мембран клітин водоростей оцінювали за фарбуванням клітин трипановим синім [Seglen, 1976].

Нуклеїнові кислоти з клітин виділяли шляхом лужного гідролізу для РНК і кислого – для ДНК [Губарь и др., 1986]. У гідролізатах визначали вміст нуклеотидів за поглинанням при 270 і 290 нм [Спирин, 1958].

Після гідролізу нуклеїнових кислот осад тотальних білків розчиняли в 1 N NaOH і визначали вміст білків за методом Лоурі [Lowry et al., 1957].

Для виділення фракції рибосом культуру центрифугували при 12000 g, 15 хв (для видалення мітохондрій і пластид). У супернатант вносили тритон – Х – 100 до кінцевої концентрації 1,5 % та інкубували 15 хв (для руйнування внутрішньоклітинних мембран), постійно перемішуючи (при 4 є?). Після завершення інкубації супернатант розводили 0,25 М сахарозою, приготовленою на 25 мМ Трис – НСl – буфері з 3 мМ ЕДТА (рН 7,5), до кінцевої концентрації тритону – Х – 100 0,5 % і у зразки вносили 1 M MgCl2 до кінцевої концентрації 0,05 М для агрегації рибосом. Отримані суспензії інкубували, постійно перемішуючи протягом 1 год, при 4 ?С, а потім центрифугували 22000g, 60 хв, при 4 ?С. Кількість рибосом визначали за вмістом у них РНК. Пострибосомальну фракцію вважали фракцією цитозолю.

Для виділення нативної РНК клітини відокремлювали від середовища центрифугуванням при 3000 g. 1 мл отриманого осаду клітин промивали дистильованою водою тричі. Клітини руйнували методом заморожування – відтавання. Вносили 10 мл розчину В (1 % ДСН; 10 мМ ЕДТА, рН 7,0 доводили оцтовою кислотою), 1мл розчину А (2 М CH3COONa, рН 7,0 доводили оцтовою кислотою) і 1мл гепарину, ретельно перемішуючи. До проб додавали 13 мл розчину хлороформ : фенол (1:2, v/v) та інкубували при 55 ?С 5 хв, потім проби охолоджували в льоді, центрифугували при 12000 g, при 4 ?С 20 хв. Водну фазу, що містить нуклеїнові кислоти, відбирали за допомогою шприца, зберігали в льоді, додавши йодацетамід до кінцевої концентрації 10-3 М. До інтерфази знову додавали 5 мл розчину В, 0,5 мл розчину А та 0,5 мл гепарину й повторювали екстракцію сумішшю хлороформ: фенол (1:2, v/v). Водні фази поєднували, додавали до них 2,5 обєми холодного етилового спирту. Залишали на холодові 12 год. РНК збирали центрифугуванням при 12000 g 20 хв. Надосадову рідину відкидали, до осаду додавали 5 мл 96 % етилового спирту і знову осаджували РНК центрифугуванням при 1200020 хв. Залишок спирту видаляли під вакуумом, а РНК розділяли методом електрофорезу в агарознім гелі.

Для виділення нативних тотальних білків клітини відокремлювали від середовища центрифугуванням при 3000 g 10 хв. Осад клітин промивали 1 М розчином сахарози тричі, 70етиловим спиртом тричі, сумішшю хлороформ: метанол (1:2,v/v) тричі. Доводили обєм проб до 2 мл буфером такого складу: 0,25 М Трис - HCl, 5 мМ ЕДТА, 0,05 М KCl, рН 7,6.

Для виділення водорозчинних нативних білків клітини відокремлювали від культурального середовища центрифугуванням при 3000 g 10 хв. Осад клітин промивали дистильованою водою. Клітини в осаді руйнували методом заморожування – відтавання. Додавали до осаду буфер такого складу: 0,25 М Трис - HCl, 5 мМ ЕДТА, 0,05 М KCl, рН 7,6 і фенілметилсульфонілфторид (ФМСФ) до 1 мМ. Проби центрифугували при 3000 g протягом 10 хв. До осаду знову додавали буфер і ФМСФ до 1 мМ. Центрифугували при 10000 g протягом 20 хв. Додавали етиловий спирт до 81 % на 12 год. Проби центрифугували при 3000 g протягом 10 хв. До осаду додавали 200 мкл буфера для виділення білків і ?-меркаптетанол до 5 %. Проби протягом 3 хвилин прогрівали на водяній лазні при 100 ?С. Відокремлювали надосадові, що містять білок, центрифугуванням при 3000 g протягом 10 хв.

Для електрофоретичного поділу білків використовували метод східчастого електрофорезу за Леммлі з ДСН у 12,5 % поліакриламідному гелі [Остерман, 1981].

Швидкість синтезу білків оцінювали за рівнем включення мічених амінокислот у білок водоростей, вносячи в культуру клітин лейцин Н3 на 1 годину, після чого виділяли нативні білки. Для визначення питомої радіоактивності аліквоту вносили в діоксановий сцинтилятор (5 г 2,5-дифенілоксазолу, 250 мг 1,4-ди-5-феніл-2-оксазо-метазолу, 100 г нафталіну на 1000 мл діоксану). Радіоактивність визначали на спектрофотометрі LS-7800 (Beckman,USA). Питому радіоактивність розраховували на мг білка.

Для визначення вмісту іонів міді клітини мінералізували, для цього до осаду клітин додавали 0,3 мл 60 % HClО4, а через 12 годин вносили 0,3 мл 96 % H2SO4 і 0,3 мл 37 % HCl. Потім проби інкубували при температурі 160 ?С протягом 2 годин. Після охолодження до зразків додавали по 1 мл дистильованої води [Новиков и др, 1990]. У кінцевому зразку визначали вміст іонів міді на атомно-адсорбційному спектрофотометрі С-600 (Сумське НВО, Україна).

Отримані результати обробляли статистично: визначали стандартну помилку середнього [Лакин, 1990] та вірогідність різниці між вариантами [Гублер, 1978].

Результати роботи та їх обговорення

Стійкість мідьчутливої і мідьрезистентної культури Dunaliella viridis до високої температури (45 ?C)

Для визначення взаємозв’язку стійкості клітин до важких металів і високої температури досліджували реакцію CuS (культура, чуттєва до дії іонів міді) і CuR (культура, резистентна до дії іонів міді) штамів D.viridis на короткочасну дію високої температури (45 °С).

За умови стандартної температури культивування (26 – 28 ?С) обидва варіанти росли з однаковою інтенсивністю.

Якщо культура клітин CuS D.viridis прогрівалася до 45 ?C протягом 1,0 і 1,5 хв, то вона продовжувала рости, хоча і відставала за кількістю клітин від контрольної (не прогрітої) культури на 3,9 і 4,4 млн кл./ мл відповідно на 12 добу росту (рис. 1а). Прогрів CuS культури до 45 °С протягом 2,0 хв призводив до повної загибелі культури.

Ефект дії високої температури має дуже швидко реалізовуватися в часі. І справді, уже через годину після оброблення CuS культури температурою 45 °С протягом 1,0 і 1,5 хв гинуло близько 50клітин, а після 2,0-хвилинного оброблення – 90 % клітин.

Дослідження термостійкості клітин D.viridis, резистентних до дії іонів міді, показало інші особливості їхньої відповідної реакції порівняно з CuS штамом. Так, якщо CuR культура прогрівалася 1,0 хв до 45 °С, то кількість живих клітин через годину не змінювалася порівняно з контрольною культурою. Якщо прогрів здійснювали протягом 1,5 хв, то живими залишалися 66 % клітин, а після 2,0 хв оброблення – 62 %, проти 10у CuS штамі D.viridis. Культура CuR D.viridis після термооброблення протягом 1,0 хв росла майже так само, як і контрольна культура. Незначно відставала за швидкістю зростання культура, що прогрівалася до 45 °С протягом 1,5 і 2,0 хв (рис. 1b).

Рис. 1. Динаміка росту (у %) CuS (а) і CuR (b) штамів Dunaliella viridis після різного часу прогріву (45 °С ). Вихідна концентрація клітин у всіх варіантах була однаковою – 1,5 млн/мл (її приймаємо за 100 %)

1- контрольна культура (без термооброблення)

2- культура після 1,0-хвилинного прогріву

3- культура після 1,5- хвилинного прогріву

4- культура після 2,0- хвилинного прогріву

Тому, що вже через годину після термооброблення спостерігалося значне зменшення кількості клітин у культурі CuS штаму, можна припустити, що загибель клітин у культурі зумовлена швидким порушенням структури плазмалеми. Ступінь нативності плазматичної мембрани оцінювали з використанням барвника трипанового синього.

Було виявлено, що якщо у контрольній CuS культурі профарбовувалося до 1 % клітин, то через годину після термооброблення протягом 1,0; 1,5 і 2,0 хв кількість пофарбованих клітин була відповідно 4,7 ± 0,1; 6,4 ± 1,3 і 21,7 ± 2,1 %.

У той же час кількість клітин, пофарбованих трипановим синім, у культурі CuR штаму була лише 0,7 ± 0,1; 2,5 ± 1,0 і 2,6 ± 0,2 % через годину після термооброблення відповідно протягом 1,0; 1,5 і 2,0 хв, тобто прогріті культури CuR незначно відрізнялися від контролю.

Таким чином, плазматичні мембрани клітин CuR D.viridis мають більшу стійкість до дії високої температури, що виявляється в більшій стійкості клітин до дії температури.

Проведені дослідження підтвердили припущення, що зміни в клітинах відбувалися за короткий період часу після дії високої температури. У зв'язку з цим у наступній серії експериментів досліджували зміни кількості клітин у культурах CuS і CuR D.viridis і кількості рухливих клітин через 5, 20, 40 хв, 1, 2, 3, 24, 25 і 26 годин після термооброблення.

Клітини Dunaliella високо рухливі завдяки наявності в них джгутиків, однією з первинних реакцій клітини на несприятливі впливи може бути втрата їхньої рухливості.

Виявилося, що через 5 хв після термооброблення (45 °С; 1,5 хв) клітини CuS D.viridis втрачали рухливість (рис. 2). Через 20 хв 14 % клітин знову здобували рухливість, а до 40 хв рухливими ставали близько 60 % клітин. Надалі певна частина клітин знову втрачала рухливість, тобто виявлялася нелінійна зміна рухливості клітин з 5 хв до 26 годин після впливу (рис. 2).

Рис. 2. Кількість рухливих клітин CuS (1) і CuR (2) Dunaliella viridis після теплового шоку (45 є?, 1,5 хв). Концентрація клітин під час термооброблення складала 4,5 млн/мл

Разом із утратою рухливості термооброблення супроводжувалося загибеллю і руйнуванням частини клітин CuS D.viridis. Найбільшою мірою це виявлялося через 1-2 години після термооброблення (рис. 3). Починаючи з 2-х годин після впливу, кількість клітин лінійно зростала до 25-26 годин, не досягаючи, однак, вихідного рівня (рис. 3).

Рис. 3. Кількість клітин у культурах CuS (1) и CuR (2) Dunaliella viridis після теплового шоку (45 є?, 1,5 хв). Концентрація клітин під час термооброблення складала 4,5 млн/мл

Дія високої температури також впливала на рухливість клітин CuR D.viridis, однак цей ефект був виражений значно менше (рис. 2). Так, через 5 хв після термооброблення рухливими були до 40 % клітин, і вже через 20 хв вони знову відновлювали свою рухливість. При цьому загибель клітин CuR D.viridis не спостерігалася, як у випадку CuS штаму (рис. ). Можна стверджувати, що для CuR культури властива не тільки підвищена порівняно з CuS культурою первинна, або вихідна, стійкість, але і здатність швидко відновлювати рухливість і проліферативну активність клітин.

Вплив високої температури (45 ?C; 1,5 хв) на склад та вміст білків і нуклеїнових кислот у клітинах мідьчутливої та мідьрезистентної культури Dunaliella viridis

Для оцінювання механізмів комбінованої стійкості визначали вміст білків і нуклеїнових кислот у досліджуваних об’єктах.

Визначення вмісту і швидкості синтезу білків чуттєвих і резистентних до іонів міді клітин D.viridis показало, що вміст тотальних білків у клітинах CuR D.viridis був на 23 % менший порівняно з клітинами CuS D.viridis (табл. 1). Таке зменшення у вмісті тотальних білків клітин CuR D.viridis було зумовлено зменшенням у них швидкості синтезу білків (табл. 1).

Визначення вмісту білка у фракції цитозолю показало, що клітини CuS і CuR D.viridis не відрізнялися між собою за цим показником (табл. 1).

Таблиця 1

Вміст та питома радіоактивність тотальних білків; вміст білків цитозолю в клітинах CuS і CuR Dunaliella viridis у контрольному варіанті (без термооброблення) і через 14 діб після термооброблення (45 ?С; 1,5 хв)

Варіант

Експерименту | Вміст тотальних

білків, мкг/млн. кл. | Питома радіоактивність,

імп/хв ·1 мг | Вміст білків

цитозолю,

мкг/млн. кл. | CuS8,79±0,88 | 50743±310 | 2,58±0,15 | CuR6,79±0,99 | 37753±1902 ** | 2,35±0,16 | CuS після термооброблення | 6,30±0,70 * | 33536±919 * | 3,60±0,15 * | CuR після термооброблення | 5,70±0,90 * | 32995±2191 | 3,50±0,17 * |

P = 0,05; різниця вірогідна порівняно з показниками відповідного контролю - *

та CuS культури - **

Склад тотальних білків не різнився в клітинах CuS і CuR D.viridis. Визначення спектрального складу водорозчинних білків клітин Dunaliella виявило, що склад білків, екстрагованих із клітин CuR D.viridis, відрізнявся від складу білків CuS D.viridis. Зокрема у CuR клітин було менше білків з молекулярною масою близько 70 кДа, але з'являвся новий білок з молекулярною масою близько 35-40 кДа (рис. 4).

Кількість тотального білка в клітинах CuS D. viridis зменшувалася в 1,4 рази після термошоку, а в клітинах CuR D.viridis невелике зменшення було статистично невірогідним. Це підтверджується результатами дослідження швидкості синтезу тотальних білків. Термошок супроводжувався пригніченням інтенсивності синтезу білків у клітинах CuS D.viridis (у 1,5 рази) порівняно з контрольною (не обробленою температурою) культурою CuS D.viridis, у той час як у клітинах CuR D.viridis синтез білків залишався незмінним порівняно з контрольним варіантом, тобто резистентною культурою, не обробленою високою температурою (табл. 1).

Отже, термооброблення клітин D.viridis, чуттєвих до іонів міді, супроводжувалося пригніченням швидкості синтезу тотальних білків і зменшенням їхнього вмісту. У той же час у клітинах D.viridis, резистентних до іонів міді, термооброблення не зменшувало швидкість синтезу і вміст тотальних білків у клітинах.

Вміст білків цитозолю збільшувався практично однаковою мірою в CuS і CuR D.viridis після термошоку порівняно з контрольною культурою (табл. 1). Таке збільшення вмісту білків після термошоку свідчить про участь білоксинтезуючого апарата в адаптивній відповіді клітини на підвищену температуру.

Дія високої температури на клітини CuS і CuR D.viridis не впливала на спектральний склад тотальних і водорозчинних білків принаймні через 14 діб після впливу.

Можна вважати, що причиною зміни швидкості синтезу білка може бути зміна у синтезі РНК. У зв'язку з цим припущенням у наступній серії експериментів визначали вміст тотальної РНК, РНК рибосом і РНК цитозолю в клітинах CuS і CuR D.viridis.

Порівняльне дослідження CuS і CuR D.viridis показало, що вміст тотальної РНК у клітинах CuR D.viridis був в 1,6 рази менший порівняно з CuS D.viridis (табл. 2).

Таблиця 2

Вміст тотальної РНК, рибосомальної РНК и РНК цитозолю в клітинах CuS і CuR штамів Dunaliella viridis і через 14 діб після термооброблення (45°С, 1,5 хв) і в контрольних (без термооброблення) варіантах

Варіант експерименту | Вміст тотальної РНК, мкг/ млн. кл. | Вміст рРНК, мкг/ млн. кл. | Вміст РНК у цитозолі, мкг/ млн. кл. | CuS3,90 ± 0,35 | 0,047 ± 0,002 | 0,34 ± 0,04 | CuR 2,40 ± 0,13 ** | 0,027 ± 0,002 ** | 0,30 ± 0,04 | CuS після термооброблення | 6,60 ± 0,60 * | 0,072 ± 0,004 * | 0,52 ± 0,05 * | CuR після термооброблення | 3,80 ± 0,54 * | 0,072 ± 0,007 * | 0,48 ± 0,03 * |

P = 0,05; різниця вірогідна порівняно з показниками відповідного контролю - *

та CuS культури - **

Змінення вмісту тотальної РНК може бути зумовлено зміненням вмісту різних типів РНК у клітині. У наступній серії експериментів визначали вміст рибосом у клітинах D.viridis. Було виявлено, що вміст рибосом у CuR D.viridis в 1,7 рази менший порівняно з CuS D.viridis (табл. 2).

Визначення вмісту РНК у фракції цитозолю цих клітин показало, що він не різнився в CuS і CuR клітинах (табл. 2). Оскільки до складу РНК цитозолю входить переважно транспортна РНК і матрична РНК, можна думати, що основний внесок у зменшення вмісту тотальної РНК вносить фракція рибосом. З цього випливає, що адаптація D.viridis до іонів міді супроводжується зміненням або перебудуванням білоксинтезуючого апарата клітини.

Можливо, що виявлені зміни у вмісті РНК у клітинах D.viridis супроводжувалися зміненням швидкості синтезу ДНК цих клітин, або зміною плоїдності клітин.

Визначення вмісту ДНК у клітинах CuS і CuR D.viridis не виявило розходжень за цим показником (табл. 3).

Таблиця 3

Вміст тотальної ДНК в клітинах CuS і CuR Dunaliella viridis через 14 діб після термооброблення (45°С, 1,5 хв) і в контрольних (без термооброблення) варіантах

Варіант експерименту | Вміст ДНК, мкг/млн.кл. | CuS0,41 ± 0,03 | CuR0,39 ± 0,07 | CuS після термоброблення | 0,67 ± 0,07 * | CuR після термоброблення | 0,42 ± 0,03 |

P = 0,05; різниця вірогідна порівняно з показниками відповідного контролю - *

Отже, адаптація клітин до іонів міді не торкалася особливості накопичення ДНК, тобто плоїдність клітин CuR D.viridis, імовірно, залишалася незмінною.

У наступній серії експериментів визначали зміни цих же показників у клітинах CuS і CuR D.viridis через 14 діб після термошоку (45 °С; 1,5 хв).

Було виявлено, що вміст тотальної РНК, РНК рибосом і РНК цитозолю збільшувався принаймні на 14 добу після термошоку. Так, у CuS клітинах вміст тотальної РНК, РНК рибосом і цитозолю був збільшений в 1,7; 1,5 і 1,5 рази відповідно (табл. 2). У клітинах CuR D.viridis ці показники були збільшені відповідно в 1,6; 2,7 і 1,6 рази (табл. 2).

Отже, найбільші зміни після термошоку в CuR D.viridis спостерігалися у вмісті рРНК, а не мРНК, як можна було б очікувати. Раніше було показано, що вміст білка у клітинах CuR D.viridis після теплового шоку вірогідно не змінювався (табл. 1). Так, збільшення кількості рибосом не супроводжувалося збільшенням синтезу білка. Можна думати, що в клітинах CuR D.viridis після термошоку відбуваються структурні зміни на рівні білоксинтезуючого апарата.

У наступній серії експериментів визначалася спектральна характеристика нативної РНК клітин CuS і CuR D.viridis за допомогою електрофорезу в агарозному гелі (рис. 5).

У клітинах CuS культури під час поділу в агарозному гелі РНК виявлялася як одна смуга, якій властива РНК із фрагментами 450 – 500 п.н. (рис. 5, см. 3). У CuR культурі РНК виявлялася як дві фракції: з’являлася високомолекулярна смуга з фрагментами 600 п.н. (рис. 5, см. 5).

У наступній серії експериментів визначали зміни цих показників у клітинах CuS і CuR D.viridis після теплового оброблення. Було виявлено, що в клітинах CuS штаму склад нативних РНК залишається незмінним після термооброблення (рис. 5, см. 2). У тому випадку, якщо термообробленню піддавалися клітини CuR D.viridis, спостерігалися три фракції РНК, тобто з’являлася додаткова смуга порядку 800 п.н. (рис. 5, см. 4).

Отже, вплив іонів міді і підвищеної температури викликав появу нових високомолекулярних фракцій РНК. Можна вважати, що дія як іонів міді, так і високої температури супроводжувалася не тільки змінами в білоксинтезуючому апараті, але, імовірно, і в системі експресії РНК.

Визначення вмісту ДНК у клітинах CuS і CuR D.viridis через 14 діб після термошоку засвідчило, що він був збільшений у 1,6 рази в CuS D.viridis і не змінювався в CuR D.viridis (табл. 4). Можливо, у клітинах CuS D.viridis відбувалося порушення клітинного розподілу після термошоку, що дозволяє пояснити значне відставання культури CuS від CuR D.viridis за інтенсивністю росту після термошоку.

Підвищена температура (45 °С; 1,5 хв) спричинює значне збільшення вмісту тотальної РНК, рибосомальної РНК і РНК цитозолю в обох штамах. Однак стійкість до термошоку була більшою мірою виражена для CuR D.viridis і корелювала з великим збільшенням кількості рибосом, появою високомолекулярної РНК та стійкістю плазматичних мембран.

У наших експериментах було виявлено, що в клітинах, які мають більшу стійкість до стресових чинників, спостерігалася глибока перебудова в білоксинтезуючому апараті. Можна думати, що сама зміна вмісту РНК може виконувати якусь роль у формуванні стійкості. Для з’ясування ролі РНК у забезпеченні стійкості до високої температури використовували такі концентрації актиноміцину D, що інгибіювали синтез РНК.

Було виявлено, що на 7 добу після внесення в культуру актиноміцину D (0,6 мкг/10 млн клітин) вміст тотальної РНК залишався на рівні контролю (табл. 4).

Таблиця 4

Вміст РНК в клітинах CuR Dunaliella viridis через 7 діб після внесення актиноміцину D (0,6 мкг/10 млн. кл.) і після дії термошоку (45 °С ; 1,5 хв)

Варіант експерименту | РНК, мкг/млн кл.

CuR контроль | 2,4 ± 0,1 | CuR після термооброблення | 3,7 0,3 * | CuR +актиноміцин після термооброблення | 2,7 0,2 |

P = 0,05; різниця вірогідна порівняно з показниками контролю - *

Після термооброблення в клітинах CuR культури збільшувався вміст РНК, що корелювало з більшою стійкістю клітин (табл. 5). Стійкість культури виявлялася в збільшенні кількості клітин (рис. 6).

У тому випадку, якщо в культуру вносили актиноміцин D і прогрівали її до 45 °С 1,5 хв, то очікуваного збільшення вмісту РНК не спостерігалося і її кількість залишалася на рівні контролю – 2,7 мкг/млн кл. проти 2,4 мкг/млн кл. (табл. 5). При цьому культура, у якої не збільшувався вміст РНК у клітинах, не гинула, але й не зростала (рис. 6).

Отже, формування стійкості CuR D.viridis до високої температури супроводжувалося з індукцією синтезу РНК у клітинах.

Таким чином, стійкість клітин CuR D.viridis до високої температури має досить складний механізм, що пов’язаний із глибокою якісною і кількісною перебудовою генетичної і білоксинтезуючої систем, зокрема рівнем експресії генома, зміною складу білків і структурно-функціональних змін мембран. Імовірно, ці зміни мають виражений кооперативний і часовий характер.

Дослідження взаємозв’язку термостійкості клітин і вмістом іонів міді у них. Особливості збереження термостійкості після видалення іонів міді з клітин Dunaliella viridis

Можна вважати, що зв’язування іонів міді з білками може супроводжуватися зміненням стійкості цих білків і білкових комплексів, зокрема мембранних систем клітини, тому досліджували можливий взаємозв’язок між вмістом іонів міді в клітинах і їх стійкості до високої температури. Експеримент зводився до такого: якщо перевести клітини CuR D.viridis на добу на середовище, що не містить іонів міді, то клітини звільнюються від іонів міді. Оцінюючи термостійкість клітин, ‘багатих’ і ‘бідних’ іонами міді, можна визначити взаємозв'язок термостійкості з присутністю іонів міді в клітині. Але тому, що саме термооброблення може вплинути на швидкість звільнення клітин від іонів міді, ми визначали вплив термооброблення на вміст іонів міді в клітинах D.viridis.

Було виявлено, що клітини CuS D.viridis, які культивуються на середовищі без додаткового внесення іонів міді, містили близько 0,020 мкг Cu2+/1 млн клітин. У тому випадку, якщо культура CuS D.viridis піддавалася термообробленню, то через 7 діб у клітинах затримувалося в 2 рази менше іонів міді (табл. 5). Отже, саме термооброблення спричинювало зменшення вмісту іонів у клітинах.

У тому випадку, якщо визначали вміст іонів міді в клітинах, що завжди ростуть на середовищі з 20 мг/л CuSO4 · 5H2O, тобто CuR D.viridis, то в них виявлялося в 57 разів більше іонів міді, ніж у CuS D.viridis (табл. 6). Якщо клітини CuR D.viridis піддавалися термообробленню в такому ж режимі, то вміст міді в їхніх клітинах також зменшувався, однак у набагато меншому ступені (у 1,2 рази) порівняно з CuS клітинами.

Таблиця 5

Вміст іонів міді в клітинах CuR Dunaliella viridis через добу після пересівання на середовище, що не містило іонів міді та дії теплового шоку, а також через 7 діб після температурного оброблення (45 ?С; 1,5 хв)

P ? 0,05; різниця вірогідна порівняно з показниками відповідної культури без термооброблення - *

Отже, термооброблення меншою мірою індукувало звільнення іонів міді з клітин CuR D.viridis порівняно з CuS D.viridis. Це може бути непрямим підтвердженням наявності позитивного зв'язку між вмістом іонів міді в клітинах і їхньою термостійкістю.

Якщо клітини CuR D.viridis пересаджувалися на середовище, що не містить іонів міді, і через добу в них визначали вміст іонів міді, то виявилося, що він зменшувався в 5 разів порівняно із звичайними клітинами CuR D.viridis (табл. 5), але все одно був у 10 разів більшим, ніж у CuS клітинах. Якщо ці клітини були піддані термообробленню (45 °С; 1,5 хв), то через 7 діб вміст міді залишався практично таким же (табл. 5).

У наступній серії експериментів визначали динаміку росту CuR клітин, 'багатих' і 'бідних' іонами міді після термооброблення клітин цих культур.

У попередніх експериментах було показано, що CuR D.viridis, яка містить високу кількість іонів міді (1,14 мкг/млн кл.), зростала після термооброблення (рис. 7).

Рис. 7. Динаміка росту CuR Dunaliella viridis після того, як їх було пересаджено на середовище із вмістом 20 мг/л сірчанокислої міді (1) та на середовище, що не містить сірчанокислої міді (2). Через добу обидва варіанти піддавали термообробленню (45 ?С; 1,5 хв).

У тому випадку, якщо культура CuR D.viridis містила невелику кількість іонів міді, то вона дещо перевершувала культуру з високим вмістом іонів міді (рис. 7).

Отже, якщо культура CuR D.viridis звільнялася від іонів міді протягом доби, то це не впливало на її подальшу стійкість до термооброблення. Тобто можна зробити висновок, що термостійкість клітин не корелювала із вмістом іонів міді, а була зумовлена метаболічною перебудовою на рівні експресії генома, структурно-функціональних змін білоксинтезуючого апарата та інших компонентів клітини.

Для рішення питання тривалості збереження індукованої термостійкості культивували клітини CuR D.viridis у середовищі, що не містить іонів міді, 2, 4 і 6 доби.У першій серії експериментів визначали збереження стійкості клітин CuR D.viridis до дії іонів міді після повторного внесення сірчанокислої міді в культуру. Для цього CuR культуру центрифугували і до осаду додавали свіже середовище Артарі, що не містило іонів міді. Культуру CuR D.viridis витримували без сірчанокислої міді 2, 4 і 6 сут і знову осаджували. До осаду додавали середовище, що містить 20 мг/л CuSO4 · 5H2O, і контролювали динаміку росту. Було виявлено, що якщо в культуру через 2 доби росту без міді знову вносили CuSO4 · 5H2O, то вона продовжувала зростати саме так, як зростала культура CuR D.viridis без пересіву на чисте середовище. Збільшення часу культивування CuR D.viridis на середовищі без міді до 4 і 6 діб із наступним пересіванням цих клітин на середовище з 20 мг/л CuSO4 · 5H2O не призводило до втрати резистентності до високої концентрації іонів міді.

Якщо клітини CuR D.viridis культивувалися 2, 4 або 6 діб на середовищі, що не містить іонів міді, і піддавалися термообробленню, то їхній ріст інгибіювався, а на 4-5 добу такі культури гинули (рис. 8).

У тому випадку, якщо через 2, 4 або 6 діб культивування CuR D.viridis на середовищі без міді знову вносили 20 мг/л CuSO4 · 5H2O і піддавали термообробленню