КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Сенчило Наталія Василівна

УДК 579.861.2 – 8.097+616. 981.25-07

ТЕЙХОЄВА КИСЛОТА СТАФІЛОКОКА ТА ЇЇ ІМУНОБІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ

03.00.09. - імунологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі мікробіології та загальної імунології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Позур Володимир Костянтинович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка, кафедра

мікробіології та загальної імунології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший

науковий співробітник, Гавриленко

Тетяна Іллівна, Інститут кардіології

імені М.Д. Стражеска АМН України,

керівник відділу імунології.

доктор біологічних наук, старший

науковий співробітник, Мінченко

Жанна Миколаївна, Науковий центр

радіаційної медицини АМН України

завідуюча лабораторією імуногенетики

Провідна установа: Національний медичний університет

ім. О.О Богомольця МОЗ України, м. Київ

Захист відбудеться „20” квітня 2004 р. о ____ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:

03127, Київ, проспект Глушкова, 2, корпус 12, ауд.. 434

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий „19” березня 2004 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Молчанець О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Інфекційні захворювання людини та тварин стафілококової етіології належать до одних із найбільш поширених та небезпечних [Bone, 1999. Захворювання, викликані Staphylococcus аureus, мають високий ступінь летальності та різноманітні прояви у вигляді сепсисів, пневмоній, гнійних захворювань шкіри. Успішність лікування вказаних захворювань багато в чому залежить від своєчасної діагностики. На жаль, запропоновані раніше методи діагностики стафілококового сепсису недостатньо надійні внаслідок відносно низької чутливості і специфічності. Тому розробка методів ранньої і надійної діагностики стафілококової інфекції дуже актуальна на сьогодні.

Новітні дослідження імунобіологічних властивостей антигенів клітинної стінки стафілокока (пептидоглікан, білок А, тейхоєва кислота) показали, що макромолекулярна організація клітинної стінки, представників роду Staphylococcus біосинтез і структура її полімерів більш складні, ніж це уявляли раніше Наумова, Шашков, 1997.

Тейхоєві кислоти (ТК) належать до основних компонентів клітинної стінки (складають 10-60% її маси) грампозитивних бактерій, зокрема стафілококів, і мають різноманітну структуру. У зв'язку з потребами ветеринарної та медичної практики особливу увагу привертає вплив цих сполук на клітини, тканини та імунну систему теплокровних тварин і людини.

Хоча відомо, що тейхоєві кислоти відіграють важливу роль у патогенезі перебігу ряду інфекційних захворювань, їх вплив на різні ланки імунної системи вивчено дуже фрагментарно. Зокрема, остаточно не з`ясовано, яким чином ці кислоти пов’язані з регуляцією протипухлинної активності природних кілерних клітин. Детальне вивчення закономірностей імунної відповіді на тейхоєві кислоти, впливу останніх на неспецифічні фактори резистентності, з`ясування ролі спадковості при формуванні подібних реакцій необхідні для розробки методів спрямованої регуляції імунної відповіді при стафілококових інфекціях.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у межах науково-дослідної теми кафедри мікробіології та загальної імунології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка за програмою “Здоров`я людини”: “Модуляція та корекція імунної системи та імунного гомеостазу біологічними та хімічними факторами”, (номер державної реєстрації 0197U003569).

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було з`ясувати особливості імунної відповіді на тейхоєву кислоту Staphylococcus аureus, встановити роль спадкового фактору в формуванні імунної відповіді, а також визначити діагностичні можливості розробленої тест-системи із застосуванням ТК.

Для досягнення зазначеної мети були сформульовані такі задачі:

1. Отримати тейхоєву кислоту клітинної стінки Staphylococcus aureus та дослідити її основні фізико-хімічні характеристики.

2. Вивчити динаміку гуморальної імунної відповіді на тейхоєву кислоту Staphylococcus aureus у піддослідних мишей різних генетичних ліній.

3. Виявити вплив тейхоєвої кислоти на функціональну активність макрофагів та природних клітин-кілерів мишей.

4. Визначити вплив тейхоєвої кислоти на функціональний стан щитоподібної залози мишей при стафілококовій інфекції.

5. Розробити тест–систему на основі імуноферментного аналізу із застосуванням тейхоєвої кислоти Staphylococcus aureus для діагностики захворювань стафілококової етіології.

Об`єктом дослідження були тейхоєва кислота та антитіла проти неї.

Предметом дослідження були антигенні та імуногенні властивості тейхоєвої кислоти.

Матеріали і методи дослідження: за допомогою методу екстракції із інтактних клітин одержано препарати тейхоєвої кислоти клітинної стінки Staphylococcus aureus (штам Wood 46); застосовували традиційні імунохімічні методи, зокрема імуноферментний аналіз; метод приготування кон`югату пептиду з овальбуміном; іонообмінну хроматографію, а також цитологічні та мікроскопічні методи.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показана здатність тейхоєвої кислоти викликати явище “метаболічного вибуху” в перитонеальних макрофагах мишей.

Внаслідок аналізу оригінальних експериментальних даних вперше виявлено, що тейхоєва кислота за низьких і середніх концентрацій стимулює, а за високих - інгібує цитолітичну активність природних кілерних клітин мишей. Вперше проведений порівняльний аналіз модулюючого впливу тейхоєвої кислоти та стандартного стимулятора лімфоїдних ліній - форбол мирістат ацетату (ФМА) на вказані клітини. При сумісній дії цих речовин встановили їх дозозалежний інгібуючий вплив.

Досліджено динаміку гуморальної імунної відповіді на тейхоєву кислоту стафілокока у мишей різних генетичних ліній. У мишей лінії BALB/C виявлено низький рівень відповіді, а лінії С57BL - високий. Показано наявність взаємозв`язку між імунною і ендокринною системами, зокрема встановлено роль щитоподібної залози у розвитку імунної реакції піддослідних мишей на введення тейхоєвої кислоти.

Обґрунтованість і достовірність наукових положень, висновків і рекомендацій. Результати дисертаційної роботи одержані з використанням сучасних методичних підходів і статистичного аналізу, що зумовлює високу вірогідність наведених в дисертації наукових положень, висновків і рекомендацій.

Практичне значення роботи.

Розроблено тест-систему на основі імуноферментного методу для виявлення антитіл проти тейхоєвої кислоти у сироватці крові хворих на ендокардит стафілококової етіології, яка може бути застосована для ранньої діагностики вказаного захворювання. Дані про різноспрямованість реакцій щитоподібної залози мишей різних генетичних ліній на введення тейхоєвої кислоти можуть бути застосовані при розробці методів лікування аутоімунних захворювань, а про імуногенність цієї кислоти - для вдосконалення серологічної діагностики стафілококових захворювань людини.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою. Інформаційний пошук, опрацювання літературних джерел, розробка схеми експерименту, отримання експериментальних даних, їх узагальнення та інтерпретацію здійснено особисто автором. Підготовка публікацій за отриманими результатами, а також представлення результатів на наукових конференціях здійснені за участю наукового керівника.

Автор щиро вдячний співробітникам відділу молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О. В. Паладіна НАН України к.б.н. Д. В. Колибі і к.б.н. С. І. Романюк за допомогу в адаптації імуноферментного методу для дослідження динаміки гуморальної імунної відповіді мишей різних генотипів. Сироватки крові хворих на інфекційний ендокардит були отримані з Інституту грудної хірургії ім. М. Амосова НАН України, за що автор висловлює подяку д.м.н. А. М. Воробйовій. Сироватки хворих на гнійний гострий гайморит та отит були отримані з ЛОР відділення дитячої лікарні № 1 м. Києва за що автор дякує к.б.н. Т. В. Марушко.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені на всеукраїнській конференції студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, 2002); 8-му українському біохімічному з`їзді (Чернівці, 2002); науковій конференції студентів, аспірантів та молодих учених з молекулярної біології і генетики (Київ, 2001); науковій конференції молодих вчених Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, 2000).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 9 наукових праць, з яких 5 - статті у фахових журналах, 1 - окрема глава монографії “Тейхоєві кислоти бактерій та їхні біологічні властивості“, 3 - матеріали конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 141 сторінці машинописного тексту і складається з розділів “Вступ“, “Огляд літератури“, “Матеріали й методи досліджень“, “Результати досліджень та їх обговорення“, “Висновки “, “Список використаних джерел“, який містить 160 посилань. Робота містить 9 таблиць та 16 рисунків, 1 формулу.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з 5 підрозділів, які містять аналіз літературних даних про структуру тейхоєвих кислот, їх біологічні функції та антигенні властивості, перспективність застосування цих сполук у діагностиці захворювань стафілококової етіології.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Тейхоєва кислота була виділена з клітинної стінки Staphylococcus aureus штаму Wood-46 за методикою А. Р. Арчібальда [1975]. Очистку препарата проводили за допомогою іонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі [Шашков, 1997]. Тестування фракцій проводили за аналізом вмісту фосфору і світлопоглинанням при довжині хвилі 260 нм. Подальший аналіз препаратів тейхоєвої кислоти проводили за допомогою методів кислотного гідролізу та тонкошарової хроматографії [Стрешинская, Козлова, 1996].

Кисневозалежний метаболізм фагоцитуючих клітин визначали шляхом постановки тесту відновлення нітросинього тетразолію згідно методики [Muller, Rolland, 1989]. При дослідженні впливу тейхоєвої кислоти на протипухлинну цитолітичну активність природних кілерних клітин та специфічну протипухлинну активність лімфоцитів об`єктом дослідження була фракція лімфоцитів селезінки мишей [Фільчаков, 1998].

Цитотоксичний тест проводили в круглодонних планшетах для імунологічних досліджень за методикою А. П. Шпакової [2000].

Антисироватки одержували шляхом три- та п`ятиразової імунізації мишей ліній BALB/C та C57BL тейхоєвою кислотою та кон`югатом тейхоєва кислота – овальбумін в дозі 50 мкг на тварину за розробленою нами схемою. Кров у тварин забирали через 7 діб після першої, третьої та п`ятої імунізації, потім - через 14 діб і на 21-шу добу після імунізації. Титр і специфічність імунних сироваток визначали методом ELISA. Дослідження динаміки гуморальної імунної відповіді і визначення специфічних антитіл до тейхоєвої кислоти Staphylococcus aureus у сироватці крові хворих на інфекційний ендокардит, гайморит та отит також проводили за допомогою імуноферментного аналізу [Єгоров, 1991].

Розробку тест-системи на основі імуноферментного аналізу [Єгоров, 1991] проводили у наведеній нижче модифікації.

Для розробки діагностичної тест-системи було опрацьовано оптимальні умови його проведення: оптимальні концентрації антигену, буферні розчин для його адсорбції, кількість антигену, що вносили в лунку (50 та 100 мкг). Було апробовано фосфатний та Na-бікарбонатний буферні розчини; концентрації антигену становили 1, 5 та 10 мкг/мл.

Імуноферментний аналіз проводили у 96-ти лункових плоскодонних планшетах. Антиген вносили в концентрації 5 мкг/мл у фосфатному буфері, рН=7,4 по 100 мкл в лунку та інкубували протягом години при 37С. Вільні місця зв`язування на планшетах блокували 1%-вим розчином бичачого сироваткового альбуміну (БСА) в фізіологічному розчині NaCl, забуференому фосфатами (ЗФР), рН=7,4 впродовж години при 37С. Після кожної інкубації планшети чотири рази відмивали 0,1%-вим розчином твіну-20 в ЗФР, рН=7,4 при перемішуванні. Потім вносили досліджувані сироватки крові, розведені у твін-фосфатному буфері (ТФБ) - 0,05%-вому розчині твіну-20 у ЗФР, по 100 мкл у лунку та інкубували впродовж години при 37С. На наступному етапі планшети відмивали, в описаному вище режимі, та вносили конюгат антитіл проти імуноглобулінів людини, мічений пероксидазою хріну, у робочому розведенні 1:800 (в ТФБ) по 100 мкл в лунку. Планшет інкубували протягом 2 год при 37С та знову відмивали. Далі для проявлення реакції вносили розчин хромоген-субстрату по 100 мкл в лунку, що містив 0,5 мг/мл ортофенілендіаміну і 0,013% перекису водню. Зупиняли реакцію внесенням 2М H2SO4 по 50 мкл в лунку. Реакцію реєстрували, вимірюючи оптичну густину розчину, за довжини хвилі 492 нм на приладі MR-508 Microelisa Auto Reader, Dynatech Product.

Для оцінки ефективності і специфічності розробленої діагностичної тест-системи було проаналізовано 60 зразків сироваток крові хворих на гнійний гострий гайморит та отит (30 осіб) і ендокардит (30 осіб). Для контролю дослідили зразки сироваток 30 здорових людей. Стафілококову етіологію захворювання встановлювали на основі клінічних спостережень, даних анамнезу і підтверджували виділенням клітин Staphylococcus aureus з урахуванням його патогенних властивостей. Функціональний стан щитоподібної залози оцінювали за методом [Киримов, 1994].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Вплив тейхоєвої кислоти на метаболічну активність перитонеальних макрофагів мишей in vitro.

При дослідженні впливу тейхоєвої кислоти Staphylococcus aureus на макрофаги перитонеального ексудату мишей in vitro нами встановлено, що обробіток фагоцитуючих клітин черевної порожнини інтактних мишей тейхоєвою кислотою у концентрації 50 мкг/мл підсилював метаболічну активність макрофагів у нестимульованому НСТ-тесті, збільшуючи активність, приблизно, вдвічі, порівняно з контролем. Нижчі концентрації кислоти (5 та 0,5 мкг/мл) вірогідно підвищували активність макрофагів перитонеального ексудату мишей порівняно з дозою 50 мкг (прямий дозозалежний ефект) (табл. 1.).

Таблиця 1

Дія тейхоєвої кислоти Staphylococcus aureus на функціональну активність макрофагів мишей in vitro.

Примітка * - вірогідно при р < 0,05

Тейхоєва кислота концентрацією 0,05 мкг/мл не викликала подальшого підвищення показників спонтанного НСТ-тесту. Аналогічні результати були отримані і при дослідженні стимульованих макрофагів. Разом із тим, при стимуляції ФМА спостерігали більш виражену активуючу дію тейхоєвої кислоти на макрофаги перитонеального ексудату, що супроводжувалось значним підвищенням функціонального резерву фагоцитуючих клітин. Із зниженням концентрацій тейхоєвої кислоти вірогідно підвищувались активність макрофагів перитонеального ексудату та функціональний резерв фагоцитуючих клітин мишей.

2. Вплив тейхоєвої кислоти на протипухлинну активність природних кілерних клітин та лімфоцитів мишей.

Згідно наших даних, тейхоєва кислота здатна змінювати цитотоксичний потенціал лімфоцитів з природною кілерною активністю. Так у концентраціях 0,005 та 0,05 мкг/мл, вона істотно підвищувала цитолітичну активність природних клітин-кілерів (рис. 1). Підвищення концентрації тейхоєвої кислоти до 0,5 мкг/мл супроводжувалось зниженням рівня цитолітичної активності (супресією) природних клітин-кілерів, приблизно, у 3 рази порівняно з контролем.

Обробка природних кілерних клітин ФМА, а потім ТК за будь-якої з досліджених концентрацій призводила до зниження рівня цитолітичної активності ПКК порівняно з контролем (табл. 2). Одержані дані свідчать про дозозалежне пригнічення цитолітичного потенціалу ПКК, що мало зворотній характер: чим менша концентрація ТК, тим більший інгібуючий вплив, зумовлений обробкою лімфоцитів з природною кілерною активністю, спочатку ФМА, а потім ТК.

Рис.1. Вплив тейхоєвої кислоти на цитолітичну активність природних кілерних клітин.

Позначення: ЦІ – цитолітичний індекс (%); ПК – пухлинні клітини перещеплюваного асцитного раку мишей Ерліха; ПКК – природні кілерні клітини; ТК – тейхоєва кислота клітинної стінки Staphylococcus aureus штам Wood 46; ТК1 – ТК в концентрації 0,005 мкг/мл; ТК2 – ТК в концентрації 0,05 мкг/мл; ТК3 – ТК в концентрації 0,5 мкг/мл.

*р<0,01 відносно контролю **р<0,05відносно контролю.

При обробці природних клітин-кілерів ТК у різних концентраціях, а потім ФМА спостерігали подібний ефект, але із дещо підвищеним пригніченням рівня природної цитотоксичності лімфоцитів, що залежало від концентрації ТК, яку вносили в інкубаційну систему (табл. 3).

Таблиця 2

Модифікуючий вплив ФМА у поєднанні з ТК на протипухлинну активність природних кілерних клітин.

Примітка: ПК – пухлинні клітини перещеплюваного асцитного раку Ерліха; ПКК – природні кілерні клітини; ФМА – форбол мирістат ацетат; ТК – тейхоєва кислота клітинної стінки Staphylococcus aureus Wood 46; ТК 0,005 – ТК концентрацією 0,005 мкг/мл; ТК 0,05 – ТК концентрацією 0,05 мкг/мл; ТК 0,5 – ТК концентрацією 0,5 мкг/мл;

* р<0,05 відносно контролю.

Таблиця 3

Модифікуючий вплив ТК у поєднанні з ФМА на протипухлинну активність природних кілерних клітин.

Примітка: ПК – пухлинні клітини перещеплюваного асцитного раку мишей Ерліха; ПКК – природні кілерні клітини; ФМА – форбол мирістат ацетат; ТК – тейхоєва кислота, клітинної стінки Staphylococcus aureus Wood 46; ТК 0,005 – ТК концентрацією 0,005 мкг/мл; ТК 0,05 – ТК концентрацією 0,05 мкг/мл; ТК 0,5 – ТК концентрацією 0,5 мкг/мл;

* р<0,05 відносно контролю, ** р<0,01 відносно контролю.

У всіх випадках, навіть при найменшому супресивному впливові з боку комплексного застосування ТК та ФМА у різних комбінаціях, значення цитолітичного індексу були нижчими, порівняно з контролем, як і при окремій обробці ТК у низьких і середніх концентраціях та ФМА.

Таким чином, тейхоєва кислота, що була виділена з клітинної стінки Staphylococcus aureus штаму Wood 46, здійснює дозозалежний модулюючий вплив на цитолітичну активність ПКК: за низьких і середніх концентрацій вона стимулює, а за високих - пригнічує цю активність. За поєднаної дії ТК та ФМА спостерігали дозозалежний інгібуючий вплив, що мав зворотний зв`язок з концентрацією ТК.

Проведені експериментальні дослідження показали, що ТК клітинної стінки Staphylococcus aureus штаму Wood 46 притаманний імуномодулюючий вплив на специфічну протипухлинну активність лімфоцитів, спрямування якого визначає концентрація тейхоєвої кислоти. Так в низьких концентраціях (0,005 мкг/мл) ТК незначно стимулювала кілерну функцію лімфоцитів. Середні концентрації (0,05 мкг/мл) призводили до зниження цитолітичної активності лімфоцитів in vitro і лише за високих концентрацій (0,5 мкг/мл) значення цитолітичного індексу дещо зростало.

Таким чином, проведені дослідження показали, що ТК Staphylococcus aureus штаму Wood 46 виявляє імуномодулюючий вплив на специфічну протипухлинну цитолітичну активність лімфоцитів in vitro: за низьких (0,005 мкг/мл) та високих (0,5 мкг/мл) концентрацій ТК чинить імуностимулюючий, а за середніх – пригнічуючий вплив.

3. Дослідження динаміки гуморальної імунної відповіді на тейхоєву кислоту.

Нами встановлено, що тейхоєва кислота стимулювала утворення антитіл переважно у мишей лінії C57BL після три- та пятиразової імунізації. Так титр антитіл після триразової імунізації на 7-му добу становив 1:200, на 14- ту - зростав до 1: 800, а на 21-шу - спадав до 1:100 (рис. 2а). Повторна імунізація викликала істотне підвищення титру (рис.2б). Після пятиразової імунізації на 7-му добу цей показник становив 1:200; через 14 діб він зростав до 1:1600, що можна пояснити феноменом імунної памяті, в основі якого лежить здатність лімфоїдних клітин до підсиленої реакції на даний антиген при повторному контакті з ним; на 21-шу добу він становив 1:100.

а б

Рис. 2. Динаміка рівня специфічних антитіл у сироватці крові після триразової (а) та п`ятиразової (б) імунізації мишей ліній C57BL та BALB/C тейхоєвою кислотою стафілокока в дозі 50 мкг.

При дослідженні імунної відповіді у мишей лінії ВАLB/C не вдалося виявити високих титрів антитіл, специфічних до тейхоєвої кислоти, навіть після 5-ти разової імунізації. Таким чином, дана кислота є слабким індуктором формування імунної пам яті у мишей цієї лінії.

Динаміка гуморальної імунної відповіді на конюгат тейхоєвої кислоти з овальбуміном після триразової імунізації була подібною до динаміки гуморальної відповіді на тейхоєву кислоту. При цьому конюгат проявляв більш виражені імуногенні властивості, ніж сама кислота (рис.3 а).

Нами встановлено, що титр антитіл до кон’югату на 7-му добу після триразової імунізації становив 1:400 із наступним підвищенням на 14-ту добу до 1:1600 та зі зниженням на 21-шу - до 1:200. Повторна імунізація мишей конюгатом овальбумін – тейхоєва кислота у дозі 50 мкг призводила до істотного підвищення рівня сироваткових антитіл. На 14-ту добу титр зростав до 1: 3200, а на 21-шу - знизився до 1:400 (рис.3 б).

а б

Рис. 3. Динаміка рівня специфічних антитіл у сироватці крові після триразової (а) та п`ятиразової (б) імунізації мишей ліній C57BL та BALB/C кон`югатом овальбумін-тейхоєва кислота стафілокока в дозі 50 мкг.

Узагальнення одержаних результатів свідчить про те, що тейхоєвій кислоті притаманні імуногенні властивості. До її антигенної дії високу чутливість виявили миші лінії С57BL, тоді, як миші лінії ВАLB/C – є низькочутливими.

4. Створення імуноферментної тест-системи на основі тейхоєвої кислоти Staphylococcus аureus для діагностики інфекційного ендокардиту, гаймориту та отиту стафілококової етіології.

За допомогою імуноферментного аналізу вияляли специфічні антитіла у 100% обстежених пацієнтів. Визначення титрів цих антитіл у сироватках показало, що у 25,4% хворих на стафілококовий ендокардит титр специфічних антитіл до тейхоєвої кислоти становив 1:200, у 11,1% – 1:400, у 33,3% - 1:800 та у 20% - 1:1600, у 10,2% - 1:3200 (рис. 4). У контрольній групі у 16,7% обстежених цей титр становив 1:25, у решти - 1:50.

На підставі аналізу вказаних даних було визначено середні титри антитіл у сироватці хворих на стафілококовий ендокардит - 1:1240 та здорових людей - 1:38 (рис. 5), і зроблено висновок, що для діагностики ендокардиту стафілококової етіології мають значення титри від 1:200 і вище.

Рис. 4

Рис. 4 Рис. 5

Рис. 4. Результати аналізу сироваток хворих на ендокардит за допомогою

імуноферментного аналізу.

Рис. 5. Середні титри антитіл до тейхоєвої кислоти Staphylococcus aureus у сироватці крові здорових осіб та хворих на стафілококовий ендокардит.

Досліджували можливість застосування запропонованої тест-системи для діагностики інших захворювань стафілококової етіології, зокрема гаймориту та отиту. При аналізі сироваток хворих на гайморит і отит тільки у 60% обстежених було виявлено специфічні антитіла, та визначено їх титр (рис. 6). Встановлено, що титр специфічних антитіл у 30% обстежених становив 1:100, у 18 % - 1:200 та у 12% - 1:400. У контрольній групі у 16,7% обстежених цей титр становив 1:25, у решти - 1:50. Середній титр антитіл (рис. 7) у контрольній групі становив 1:38, тоді як в групі хворих він сягав 1:233.

Рис. 6 Рис. 7

Рис. 6. Результати аналізу сироваток хворих на гострі гнійні гайморит та отит за допомогою імуноферментного аналізу

Рис. 7. Середні титри антитіл до тейхоєвої кислоти Staphylococcus aureus у сироватці крові здорових осіб і хворих на гайморит та отит стафілококової етіології.

Ці дані свідчать про те, що дана тест-система може бути застосована для діагностики гаймориту та отиту стафілококової етіології лише як допоміжна в комплексі з іншими методами.

Порівняльний аналіз титрів антитіл у різних піддослідних групах дозволив визначити межу чутливості розробленої тест-системи. Титр антитіл до тейхоєвої кислоти у сироватці крові здорових людей (контрольна група) коливався від 1:25 до 1:50 (в середньому - 1:38), а у хворих – в середньому становив 1:400 і коливався в межах від 1:300 до 1:1600. Саме цей рівень ми вважаємо діагностично значимим при захворюванні на ендокардит.

Визначення рівня антитіл до тейхоєвої кислоти в сироватках крові хворих різних груп показало, що діагностично значимі титри (>1: 400) зустрічаються переважно у групі хворих на стафілококовий ендокардит (79,9%), однак виявлені і у частини (12,0%) хворих на гайморит та отит. Низькі значення титрів антитіл до тейхоєвої кислоти (<1: 400) були виявлені у 85% здорових людей та у 43,4% хворих на гайморит та отит.

5. Вплив тейхоєвої кислоти на функціональний стан щитоподібної залози мишей ліній C57BL та BALB/C.

Внаслідок введення інактивованої культури Staphylococcus aureus мишам обох ліній спостерігали виражену гіперемію кровоносних судин та зміни мікрострукрури щитоподібної залози (інфільтрати, які містили лімфоцити, нейтрофіли та інші форменні елементи крові) порівняно з контролем. Фолікули залоз мали гетерогенну структуру; в їх порожнинах зареєстрована резорбція колоїду. Встановлено, що у мишей лінії BALB/С, порівняно з тваринами контрольної групи, вірогідно зменшена висота секреторного епітелію (відповідно 2,90 та 3,97 мкм) і збільшений діаметр фолікулів (відповідно 17,90 та 14,02 мкм ).

У мишей лінії C57BL розміри фолікулів загалом виявились дуже варіабельними, хоча простежена тенденція до їх збільшення, а виведення колоїду з фолікулів було більш інтенсивним без істотного зростання секреції останнього. Висота тиреоїдних ендокриноцитів (3,80 мкм) та діаметр фолікулів (15,90 мкм) були дещо збільшені порівняно з ендокриноцитами мишей лінії BALB/С та контролем (відповідно 3,24 та 14,07 мкм).

Введення тейхоєвої кислоти суттєво змінило мікроструктуру щитоподібних залоз обох ліній мишей, що проявлялося у вираженій гіперемії судин, змінах у фолікулах, утворенні ділянок інфільтрації тиреоїдної паренхіми сегментоядерними лейкоцитами. Крім того, у мишей лінії BALB/С у фолікулах щитоподібної залози виявили оточені сполучною тканиною некротичні острівці. Висота тиреоїдних ендокриноцитів (3,01 мкм) була меншою, ніж у контролі (3,97 мкм), а діаметр фолікулів (15,70 мкм) - дещо збільшений (14,02 мкм у контролі). Таким чином, стан щитоподібної залози вказує на розвиток її функціонального виснаження. Реакція на введення тейхоєвої кислоти розвивалася аналогічно такої на аутоімунний тиреоїдит.

Після введення тейхоєвої кислоти фолікули щитоподібної залози мишей лінії C57BL збільшились в діаметрі в середньому до 18,3 мкм, що вірогідно більше, ніж у контрольних тварин, мишей лінії BALB/С і тварин, яким вводили інактивовану культуру стафілококів. Висота тиреоїдного епітелію була невелика (у середньому 2,38 мкм) та вірогідно нижча, ніж у мишей контрольних груп. Клітини фолікулярного епітелію мали еліпсоїдну форму та містили гіперхромні ядра, а ядерця не виявлялися. На відміну від цього, фолікули мишей лінії BALB/С були кулястої форми, з більш-менш вираженими ядерцями. У порожнинах фолікулів зареєстровані невеликі кількості колоїду та резорбційні вакуолі.

Таким чином, дослідження щитоподібної залози мишей двох ліній, що відрізнялися ступенем відповіді на введення тейхоєвої кислоти, дозволили виявити різноспрямовані реакції: лінії BALB/C - за типом аутоімунного тиреоїдину, лінії С57BL – гострого гнійного тиреоїдиту.

Висновки.

1. Тейхоєва кислота, виділена з клітинної стінки Staphylococcus aureus штаму Wood 46, проявляє імуногенні властивості. Динаміка гуморальної відповіді піддослідних тварин на вказану кислоту залежить від спадкових властивостей: рівень реакції мишей лінії С57BL був високий, а лінії ВАLB/C – низький.

2. Тейхоєва кислота проявляє дозозалежний модулюючий вплив на цитолітичну активність природних кілерних клітин: за низьких і середніх концентрацій вона чинить стимулюючий вплив, а за високих - пригнічуючий.

3. Встановлено дозозалежну дію тейхоєвої кислоти на функціональну активність макрофагів без прямої токсичної дії на клітини. Показано, що найбільший ефект справляла доза 0,5 мкг/мл.

4. Ступінь та характер відповіді щитоподібної залози мишей на введення тейхоєвої кислоти залежить від спадкових особливостей: у тварин лінії BALB/C реакція на введення тейхоєвої кислоти відбувалася за типом аутоімунного тиреоїдиту, у лінії С57BL - гострого гнійного тиреоїдиту.

5. У сироватках крові хворих на ендокардит, гайморит та отит стафілококової етіології були виявлені різні рівні антитіл до тейхоєвої кислоти. Середній титр цих антитіл у сироватках крові хворих на ендокардит становив 1:1240, на гайморит та отит – 1:233.

6. Розроблена на основі імуноферментного аналізу оригінальна діагностична тест–система виявилась ефективною для визначення специфічних антитіл до тейхоєвої кислоти у сироватках крові хворих на інфекційний ендокардит.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Позур В.К., Сенчило Н.В., Пасічник І.П. Тейхоєві кислоти бактерій та їхні біологічні властивості // Биополимеры и клетка. – 2000. – Т. 16, № 4. – С. 260-269. (Особисто дисертантом здійснені підбір та аналіз даних літератури).

2. Позур В.К., Сенчило Н.В. Вплив тейхоєвих кислот на метаболічну активність макрофагів in vitro за показниками НСТ-тесту // Вісн. Київ. ун-ту ім. Тараса Шевченка. сер. Біологія. – 2002. – Вип. 37. – С. 147-149. (Особисто дисертантом сформульована загальна ідея, здійснені підбір та аналіз даних літератури).

3. Сенчило Н.В., Романюк С.І., Колибо Д.В., Позур В.К. Гуморальна імунна відповідь на тейхоєву кислоту стафілокока у мишей ліній C57BL та BALB/C // Доп. Нац. акад. наук України. – 2002. – № 3. – С. 171-174. (Особисто дисертантом сформульована загальна ідея, здійснені підбір та аналіз даних літератури, проведені експериментальні дослідження з одержання тейхоєвої кислоти, розробки ТІФА, дослідження рівнів антитіл до ТК, серологічні дослідження сироваток, статистична обробка та аналіз отриманих даних, сформульовані висновки).

4. Позур В.К., Данілова О.В., Сенчило Н.В. Вплив тейхоєвої кислоти золотавого стафілокока на секреторну активність щитоподібної залози мишей // Вісн. Київ. ун-ту ім. Тараса Шевченка. сер. Біологія. – 2002. – Вип. 38. – С. 68 – 71. (Особисто дисертантом проведені експериментальні дослідження, їхні статистична обробка, аналіз та узагальнення, сформульовані висновки роботи).

5. Сенчило Н.В., Олішевський С.В., Позур В.К. Вплив тейхоєвої кислоти стафілокока на цитолітичну активність природних кілерних клітин // Биополимеры и клетка. – 2003. – Т.19, № 3. – С. 238-241. (Особисто дисертантом проведені експериментальні дослідження, їхні статистична обробка, аналіз та узагальнення, сформульовані висновки роботи).

6. Позур В.К., Сенчило Н.В. Тейхоєві кислоти бактерій та їхні біологічні властивості. В кн.: // Структура і біологічна активність бактер. біополімерів (під ред. Позура В.К.). – К.: ВПЦ Київ. ун-тет, 2003. – С. 51- 82. (Особисто дисертантом здійснені підбір та аналіз даних літератури).

7. Олішевський С.В., Сенчило Н.В. Позур В.К. Модулюючий вплив тейхоєвої кислоти стафілокока на цитолітичну активність природних кілерних клітин // Тези 2-ї Всеукр. конф. студ. та аспір. „Біологічні дослідження молодих вчених на Україні (23-25 квітня, Київ).” – 2002. – Вип.1. – С. 36-37. (Особисто дисертантом проведені експериментальні дослідження, їхні статистична обробка, аналіз та узагальнення, сформульовані висновки роботи).

8. Senchylo N.V., Pozur V.K. The dynamic of the humoral immunity on the staphylococcus Teichoic acid in the mouse lines C57BL and BALB/C // Conf. for students, PhD students and young scientists on molecul. biol. and genetics (20-22, 2001, Kyiv, Ukraine). – Abstracts book. – 2001. – P.61.(The general idea formulacion as well as selection and analisis of the relevant references were performed personally by the dissertant).

9. Сенчило Н.В., Олішевський С.В., Позур В.К. Модифікаційний вплив тейхоєвої кислоти з клітинної стінки Staphylococcus aureus Wood 46 на протипухлинну активність природних кілерних клітин // Мат-ли 8-го Укр. біохім. з`зду ( 1-3 жовтня 2002 р., м. Чернівці, Україна). – Укр. біохім. журн. – 2002. – Т. 74, № 4б (додаток 2). – С. 168. (Особисто дисертантом проведений аналіз результатів експериментів, сформульовані висновки роботи).

АНОТАЦІЯ

Сенчило Н.В. Тейхоєва кислота стафілокока та її імунобіологічна активність. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю – 03.00.09 – імунологія. – Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, Київ 2004.

У дисертаційній роботі представлено результати вивчення тейхоєвої кислоти клітинної стінки Staphylococcus aureus штаму Wood 46 та її імунобіологічної активності.

Показано, що тейхоєва кислота здатна викликати явище “метаболічного вибуху” в перитонеальних макрофагах мишей. Встановлено, що ця кислота за низьких і середніх концентрацій стимулює, а за високих – інгібує цитолітичну активність природних кілерних клітин, тобто чинить дозозалежний модулюючий вплив.

Отримано нові дані по вивченню динаміки гуморальної імунної відповіді на тейхоєву кислоту стафілокока у мишей різних генетичних ліній. Встановлено, що миші лінії BALB/C мають низький, а лінії С57BL – високий ступінь специфічної імунної реакції. Це сприяє розширенню уявлень про імуногенність тейхоєвої кислоти, свідчить про можливість її використання для удосконалення серологічної діагностики стафілококових захворювань.

Досліджено вплив тейхоєвої кислоти на щитоподібну залозу мишей. Отримані дані можуть бути використані при розробці технологій лікування багатьох захворювань, викликаних грампозитивними бактеріями, а також для встановлення етіології ряду аутоімунних захворювань щитоподібної залози.

Розроблено та апробовано ефективну діагностичну тест-систему на основі імуноферментного аналізу для визначення специфічних антитіл до тейхоєвої кислоти в сироватках хворих на інфекційний ендокардит стафілококової етіології.

Ключові слова: тейхоєва кислота, антигенні властивості, імунобіологічна активність, стафілококова інфекція, природні кілерні клітини.

АННОТАЦИЯ

Сенчило Н.В. Тейхоевая кислота стафилококка и ее иммунобиологическая активность. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности – 03.00.09 – иммунология. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2004.

Инфекционные заболевания человека и животных стафилококковой этиологии принадлежат к наиболее распространенным и опасным [Bone, 1999. Заболевания, вызванные Staphylococcus аureus, сопровождаются высокой летальностью и характеризуются разнообразными проявлениями в виде сепсисов, пневмоний, гнойных заболеваний кожи, пищевых отравлений. Качество лечения этих заболеваний в значительной степени зависит от своевременной диагностики. К сожалению предлагаемые ранее методы диагностики стафилококкового сепсиса недостаточно надежны вследствие относительно низкой чувствительности и специфичности. Поэтому разработка методов ранней и надежной диагностики стафилококковой инфекции сегодня очень актуальна.

Диссертация посвящена изучению особенностей иммунного ответа на тейхоєвую кислоту Staphylococcus аureus, выяснению роли наследственного фактора в ее формировании, а также определению диагностических возможностей разработанной тест-системы.

Установлено, что тейхоєвая кислота, выделенная с клеточной стенки Staphylococcus aureus штама Wood 46, проявляет иммуногенные свойства.

Показано, что тейхоевая кислота способна вызывать эффект “метаболического взрыва” в перитонеальных макрофагах мышей. Установлено, что эта кислота при низких и средних концентрациях стимулирует, а при высоких – угнетает цитолитическую активность естественных киллерных клеток, то есть оказывает дозозависимое модулирующее влияние.

Получены новые данные по изучению динамики гуморальной имунной реакции на тейхоєвую кислоту стафилококка у мышей разных генетических линий. Установлено, что мыши линии BALB/C имеют низкую, а линии С57BL – высокую степень специфической иммунной реакции. Это расширяет уровень знаний об иммуногенности тейхоєвой кислоты, свидетельствует о возможности ее использования для усовершенствования серологической диагностики стафилококковых заболеваний.

Исследовано влияние тейхоєвой кислоты на щитовидную железу мышей. Полученные данные могут быть использованы при разработке технологий лечения многих заболеваний, вызванных грамположительными бактериями, а также для определения этиологии ряда аутоиммунных заболеваний щитовидной железы.

В сыворотках крови больных на эндокардит, гайморит и отит стафилококковой этиологии были определены разные уровни антител к тейхоєвой кислоте. Средний титр этих антител в сыворотках крови больных на эндокардит был равен 1:1240, на гайморит и отит – 1:233.

Разработана и апробирована эффективная диагностическая тест-система на основе иммуноферментного анализа для определения специфических антител к тейхоевой кислоте в сыворотках больных на инфекционный эндокардит стафилококковой этиологии.

Ключевые слова: тейхоевая кислота, антигенные свойства, иммунобиологическая активность, стафилококковая инфекция, естественные киллерные клетки.

ABSTRACT

N.V. Senchylo. Staphylococci teichoic acid and its immunobiological activity. – Manuscript.

Thesis for obtaining a degree of candidate of biological sciences. Speciality: 03.00.09 – immunology. Taras Shevchenko National University of Kyiv, Kyiv, 2004.

The thesis presents the results of an investigation of the cell wall teichoic acid of Staphylococcus aureus of the strain Wood 46 and its immunobiological activity.

The teichoic acid is shown to be capable of provoking "metabolic explosion" in the peritoneal macrophages of mice. The acid is found to stimulate under low and medium concentrations, and inhibit under high concentrations, the cytolytic activity of the natural killer cells, i. e. produces a dose-dependant modulating effect.

New data on the dynamics of humoral immune response to staphylococci teichoic acid in mice of various genotypes have been obtained. It has been demonstrated that the rate of specific immune response of mice of the line BALB/C is low, whereas those of mice of the line С57BL is high. This fact helps expand our knowledge of the immunogenity of teichoic acid and determine possibilities of its application for the purpose of improving of serological diagnostics of staphylococcus-caused diseases.

The influence of teichoic acid on the thyroid gland of mice has been revealed. The data obtained can be useful in developing technologies of treatment of different infective diseases caused by gram-positive bacteria, as well as in tracing the ethiologies of a set of autoimmune diseases of the thyroid gland.

An effective diagnostic test-system based on ELISA has been developed and tested. The system allows defining specific antibodies to teichoic acid in the serum of patients suffering from infective endocarditis caused by staphylococci.

Key words: teichoic acid, antigenic properties, immunobiological activity, staphylococcus infection, natural killer cells.