МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ШУЛЬЦ НАТАЛІЯ ВІКТОРІВНА

УДК 616.142-008.64-036.12-085.22:57.086.3:611.018.63

МОРФОЛОГІЯ ПОРУШЕНЬ ОБМІНУ КАЛЬЦІЮ В СКОРОТЛИВОМУ МІОКАРДІ ПРИ МОДЕЛЮВАННІ ХРОНІЧНОЇ ІШЕМІЧНОЇ ХВОРОБИ СЕРЦЯ ТА ЇХ МЕДИКАМЕНТОЗНА КОРЕКЦІЯ

14.03.02 – патологічна анатомія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті кардіології ім. акад. М.Д. Стражеска АМН України та на кафедрі патологічної анатомії Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України.

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор

Гавриш Олександр Семенович,

Інститут кардіології

ім. акад. М.Д. Стражеска АМН України,

керівник відділу патоморфології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Колєсова Надія Арнольдівна, НДЛЦ Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України, завідуюча лабораторією метаболічного і структурного аналізу;

доктор медичних наук, професор Терещенко Валентина Павлівна, Інститут екологічної патології людини, директор.

Провідна установа

Харківський державний медичний університет, кафедра патологічної анатомії, МОЗ України, м. Харків.

Захист відбудеться “ 3 ” лютого 2005 р. о __13.30_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 при Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця (03057, м. Київ-057, пр. Перемоги, 34).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця(03057,м.Київ-057, вул. Зоологічна, 1).

Автореферат розісланий “_25__” __грудня_ 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор Грабовий О.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ішемічна хвороба серця (ІХС) у структурі смертності населення економічно розвинутих країн займає одне із перших місць (М.И. Лутай, 1994; В.Ф. Москаленко, 2001; Н. Eriksson, 1995). За даними Європейського кардіологічного товариства найбільша В Європі смертність від ІХС відмічається в країнах СНД, де вона складає 54,5-55,6% у жінок і 54,8-59,0% - у чоловіків, зберігаючи при цьому тенденцію до збільшення (Л.Г. Воронков, 1996; К.И. Иванов, 1998; В.Г. Яновский, 1998; P.G.). Високий відсоток зниження працездатності, інвалідізації та смертності примушує шукати ефективніші шляхи боротьби з даною патологією (Ю.Н. Беленков, 2000; В.О. Бобров, 2001; B. Massie, 1996).

Загальновідомо, що патогенез ІХС визначається невідповідністю надходження кисню і субстратів метаболізму по вінцевих артеріях до міокарда і потребою останнього в них.

Рецидивуючі напади ішемії міокарда - обов’язкові компоненти ІХС обумовлюють його пошкодження, що призводить до перерозподілу функціонального навантаження між кардіоміоцитами (КМЦ), спричиняючи компенсаційну гіпертрофію, виснаження, атрофію і загибель останніх (із-за неадекватного кровопостачання) з подальшим розвитком серцевої недостатності (В.А. Алмазов, 1997; О.С. Гавриш, 2000; В.В. Горбачев, 1999).

Накопичені на теперішній час дані свідчать про те, що за цих умов скоротливий міокард стає однією із головних мішеней цитотоксичного впливу біогенних амінів загального та місцевого походження, які через рецепторний апарат КМЦ активують цАМФ-залежний механізм надходження екзогенного Са2+ в саркоплазму зі всіма несприятливими наслідками надлишку некомпартменталізованого катіона в ішемізованій клітині (В.З. Ланкин, 2000; Л.Т. Малая, 1996; J. Hunter, 1999; E. Kiss, 1995). Порушення кальцієвого гомеостазу КМЦ визначають основний механізм їхньої альтерації при стресорних впливах (О.С. Гавриш, 1999; Л.В. Кондракова, 1998). Одночасно атерогенна дисліпопротеїдемія, що модифікує біомембрани, сама по собі також є фактором, який змінює транспортно-трофічне забезпечення, ультраструктуру, біоенергетику і кальцієвий гомеостаз КМЦ (Л.С. Мхитарян, 1994).

У кінцевому підсумку, кожен напад ішемії міокарда залишає більш або менш глибокий слід у вигляді зворотніх і незворотніх дистрофічних порушень, що потребує додаткової активності механізмів пластичного забезпечення функції вентрикулярних КМЦ (Л.М. Непомнящих, 1991; E. Takashi, 1998). Деструктивні та адаптаційні зміни, що виникають в міокарді при хронічній коронарній недостатності, обумовлюють розвиток його структурно-функціональний поліморфізм (Р.И. Соколова, 1999; R. Schlant, 1998).

Енергетичний дефіцит внаслідок ішемічного пошкодження мітохондрій, який поєднується з прямим модифікуючим впливом гіперхолестеринемії на цитомембрани, сприяє зміні фундаментальних властивостей сарколеми, аж до порушення її бар’єрно-транспортної функції. Це є визначальним щодо необоротної альтерації КМЦ при черговому епізоді коронарної недостатності (Н.Н. Орлова, 1996; А.В. Шабалин, 1999). Досвід клініко-експериментальних досліджень, що свідчить про ефективність фармакологічних засобів, які обмежують надходження Са2+ в клітину при ішемії, підтверджує цю точку зору (Д.М. Аронов, 2000; Л.И. Ольбинская, 1999; Б.А. Сидоренко, 1998). Однак, механізми кардіопротекторної дії цих ліків до кінця не розкриті. У зв’язку з цим потребує подальшого і більш поглибленого дослідження морфофункціональна перебудова КМЦ (першочерегово глікокалікса і плазмолеми) в експериментах із відтворенням провідних чинників патогенезу ІХС – атерогенної дисліпопротеїдемії і рецидивуючих коронарних нападів. Актуальною також лишаються верифікація структурних еквівалентів коригуючого впливу фармакологічних препаратів, котрі використовуються для запобігання критичного перевантаження КМЦ Са2+.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідна науковим пріоритетам Інституту кардіології ім. М.Д.Стражеска АМН України “Вивчити зміни рецепторного апарата і структурно-функціонального стану мембранних систем кардіоміоцитів, клітин судинної стінки і формених елементів крові при стресі й експериментальному атеросклерозі”, номер державної реєстрації UА 01008383 і Національного медичного університету (НМУ) ім. О.О.Богомольця, зокрема НДР кафедри патологічної анатомії НМУ, “Вивчити структурні основи та патогенез найбільш актуальних захворювань з метою визначення закономірностей їх розвитку шляхом створення навчальної та контролюючої комп’ютерної програм” (№ державної реєстрації 0197 U 004560).

Мета та задачі дослідження. Мета - вивчити морфологію вентрикулярних КМЦ при моделюванні хронічної ІХС, визначити ознаки порушення обміну кальцію в них, проаналізувати кардіопротекторний вплив препаратів з властивостями -блокаторів (обзидан) і антагоністів Са2+ (фіноптин) при цій патології.

Задачі дослідження:

1. Вивчити вплив провідних патогенетичних чинників хронічної ІХС – хронічної коронарної недостатності й атерогеної дисліпопротеїдемії – на структуру скоротливого міокарда експериментальних тварин.

2. Проаналізувати обумовлені хронічною ІХС морфофункціональні зміни органел, які відповідають за метаболізм Са2+ у вентрикулярних КМЦ: сарколеми, саркоплазматичної сітки, мітохондрій.

3. Вивчити тривалий вплив фіноптину та обзидану на структуру скоротливого міокарда інтактних тварин.

4. Дослідити і зіставити кардіопротекторний вплив фіноптину та обзидану на ультраструру, кальцієвий метаболізм, енергетичне та пластичне забезпечення функції КМЦ при їх профілактичному використанні за умов змодельованої патології.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше при моделюванні хронічного поєднаного впливу провідних патогенетичних чинників ІХС – хронічної коронарної недостатності і атерогеної дисліпопротеїдемії – визначено морфологічні ознаки порушення Са2+-зв’язуючої здатності сарколеми, саркоплазматичної сітки (СПС) і мітохондрій, які передують критичному підвищенню проникності сарколеми та необоротному пошкодженню клітини.

Доведено, що за даних умов порушення бар’єрних властивостей сарколеми реалізується після зниження концентрації некомпенсованих від’ємних зарядів ГАГ в глікокаліксі, перерозподілу та імобілізації Са2+ на плазмолемі, які поєднуються з вираженою структурною і функціональною гетерогенністю елементів СПС та різкими коливаннями спорідненості до Са2+ різних мітохондрій. Отримано пріоритетні свідчення на користь того, що зміни Са2+-зв’язуючої спроможності мітохондрій і корелюючі з цим порушення енергетичного забезпечення функції КМЦ негативно впливають на контрактильну здатність останніх ще до розвитку в них альтеративних змін.

Встановлено, що при змодельованій хронічній ІХС дискоординація основних ланок системи регуляції електролітного обміну кардіоміоцитів (сарколеми, СПС, мітохондрій) є важливим чинником серцевої недостатності. Розширено існуючі уявлення про компенсаційно-пристосувальні механізми робочих клітин міокарда до нових умов їх функціонування.

Аргументовано доцільність медикаментозної стабілізації сарколеми антагоністами кальцію і зменшення адренорецепторного впливу за допомогою -блокаторів, як протективних заходів у патогенетичному вимірі рецидивуючіої коронарної недостатності, яка визначає клініку хронічної ІХС. Вперше документовано, що кардіопротекторний ефект препаратів цих груп полягає не тільки в оптимізації електролітного обміну КМЦ, а й у покращенні енергетичного забезпечення їх пластичних функцій, загалом нормалізуючи скоротливу здатність міокарда.

Об’єкт дослідження – скоротливий міокард кролів.

Предмет дослідження – морфологічні зміни вентрикулярних КМЦ при моделюванні хронічної ІХС та її корекції фіноптином й обзиданом.

Методи дослідження. Використано системний підхід, який передбачає застосування комплексу гістологічних, гістохімічних, електронномікроскопічних та морфометричних методів. Для обєктивізації отриманих даних їх обробляли за допомогою статистичного пакету Microsoft Word XL – 2000.

Практичне значення одержаних результатів. Прикладне значення мають виявлені і систематизовані морфофункціональні зміни в мембранах органел, які забезпечують кальцієвий обмін КМЦ; зафіксовані порушення Са2+-зв’язуючого потенціалу сарколеми, СПС, мітохондрій. Отримано нові дані про механізми запобігання надлишку некомпартменталізованого кальцію у вентрикулярних КМЦ шляхом медикаментозного впливу, зокрема - за допомогою найчастіше використуємих препаратів із групи антагоністів кальцію і -блокаторів: фіноптину та обзидану.

Отримані відомості про сутність механізмів перебудови скоротливого міокарда при хронічній коронарній недостатності і атерогеної дисліпопротеїдемії слугують подальшому розвитку патогенетично обгрунтованих підходів до профілактики і лікування ІХС.

Результати роботи впроваджено у повсякденну діяльність Інституту кардіології ім. М.Д.Стражеска АМН України та навчальний процес кафедри патологіческої анатомії НМУ ім. Богомольца.

Особистий внесок здобувача. Дисертант брала безпосередню участь у розробці методології наукового пошуку, проаналізувала профільну літературу, здійснила експериментальні дослідження, інтегрувала результати всіх відгалужень наукового пошуку. Разом із науковим керівником сформулювала основні висновки та рекомендації роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації обговорені на: VI-ому Національному конгресі кардіологів України (Київ, 2000); науковій конференції, присвяченій 100-річчю від дня народження А.І.Свиридова (Київ, 2000); а також документовані у матеріалах Української науково-практичної конференції “Сучасні проблеми кардіології та ревматології – від гіпотез до фактів” (Київ, 2001); об’єднаному пленумі правлінь українських наукових товариств кардіологів, ревматологів і кардіохірургів з міжнародною участю “Серцева недостатність – сучасний стан проблеми” (Київ, 2002).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи висвітлені у 10 наукових праць: в тому числі – у 5 наукових статтях у виданнях, рекомендованих ВАК України, а також у матеріалах 5 конгресів та наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Основний текст роботи викладено на 106 сторінках машинопису, дисертація ілюстрована рисунками, таблицями. Складається із вступу і 6 розділів: огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, з розділів результатів власних досліджень, обговорення одержаних результатів та висновків. Список використаної літератури налічує 333 джерела вітчизняних та зарубіжних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Експерименти проводили на 73 кролях вагою 2,5-3,5 кг, із яких 10 тварин склали контрольну групу.

Хронічну ІХС відтворювали на 20 тваринах, за моделлю, що поєднує вплив провідних патогенетичних чинників цього захворювання - рецидивуючої коронарної недостатністі і гіперхолестеринемії (атерогенна дієта, що містить 0,25 г/кг холестерину на добу та внутрішньовенно щодобово вазопресин у дозі 0,2-0,3 од/кг на добу на протязі 1 місяця) (Р.А. Фролькіс, 1985) Порушення ліпідного складу сироватки крові контролювали, визначаючи вміст холестерину за Іlca і тригліцеридів за Carlson, Ignatovska.

Для визначення дії фіноптину й обзидану на міокард інтактних тварин препарати вводили внутрішньоочеревинно протягом 1 місяця 1 раз на добу (по 10 тварин у кожній групі). Дози препаратів не перевищували їх клінічних добових норм (фіноптин – 0,4 мкг/кг, обзидан – 250 мкг/кг) (М.Д. Машковский, 1997).

Зміни в міокарді при застосуванні фіноптину й обзидану за умов хронічної коронарної недостатності та дисліпопротеїдемії досліджували відповідно на 11-ти і 12-ти тваринах. Препарати вводили за 10-15 хвилин до ін’єкції вазопресину, так само і в тій же дозі, що й інтактним тваринам.

По закінченні експерименту перед вилученням серця з грудної клітини тварин наркотизували етаміналом натрію (50,0 мг/кг). Зразки тканини міокарда лівого шлуночка брали одразу після припинення скорочень серця за відповідною методикою (А.С. Гавриш з співавт., 1986). Для гістологічних досліджень їх фіксували у 10% розчині нейтрального формаліну та занурювали у парафінові блоки. Гістотопограми серця зафарбовували гематоксиліном та еозином, за Ван Гізон. Для виявлення пошкоджень міокарда зрізи забарвлювали за методиками за Лі та Рего, а також досліджували фізикооптичним методом на інтерференційно-поляризаційному мікроскопі МРІ-5.

Для електронної мікроскопії зразки з різних ділянок стінки лівого шлуночка фіксували в ізотонічному 4% розчині параформу на 0,1 М фосфатному буфері (рН 7,2-7,4) і дофіксовували в забуференому 1% розчині OsO4 з додаванням сахарози, проводили дегідратацію у спиртах та ацетоні та поміщали у блоки із суміші епону і аралдиту (В.Я. Карупу, 1984). Напівтонкі та ультратонкі зрізи виготовляли на приладі LKB-8800111 (Швеція), контрастували солями важких металів (уранілацетат і цитрат свинцю) за Рейнольдсом, які, відповідно, забарвлювали метиленовим синім-основним фуксином, або контрастували солями важких металів (Б. Уіклі, 1975).

Електронногістохімічно виявляли розподіл і концентрацію некомпенсованих від’ємних зарядів глікозаміногліканів (ГАГ) глікокалікса (реакція зв’язування феризоля за Б. Ветцель) (Г. Гайер, 1974); концентрацію і розподіл Са2+ в КМЦ за допомогою N,N-нафтолоілгідроксиламіна натрію (НГА) (A. Zechmeister, 1978); Са2+-зв’язуючий потенціал сарколеми (реакція з іонізованим лантаном) (G.A. Langer, 1972); бар’єрні властивості сарколеми з використанням дрібнодисперсних маркерів таніна (H. Nunes-Duran, 1980) і колоїдного лантана (В.Г. Шаров, 1981). Дослідження і фотографування об’єктів, проводили в електронному мікроскопі ПЭМ-125 (Україна).

При морфометричному дослідженні встановлювали об’єми, щільність й об’ємні співвідношення міофібрил, мітохондрій, СПС, Т-тубул КМЦ (Г.Г. Автандилов, 1990), а також визначали коефіцієнт енергетичної ефективності мітохондрій (КЕЕМ) (В.С. Пауков, В.Ф. Фролов, 1982). Цифрові дані обробляли з використанням статистичного пакета Microsoft Word XL-2000.

Результати власних спостережень і їх обговорення. Тривале введення фіноптину інтактним тваринам суттєвих відхилень у структурі міокарда не викликало. Як і у контролі, сарколема КМЦ була непроникною для дрібнодисперсних електронощільних маркерів - лантану і таніну. Базальна мембрана - дещо потовщена, часто з невеликими пластівчастими відкладеннями на поверхні. При використанні феризоля її поверхневий шар контрастувався краще, ніж звернутий до плазмолеми. Загальна концентрація некомпенсованих від’ємних зарядів глікокалікса порівняно з контролем дещо зростала за рахунок розподілу маркера по всій його товщині. Інтенсивність контрастування глікокалікса в тестах з НГА дещо знижувалась, а загальна площа відкладень маркера у зрізі була більшою, ніж в контролі.

Різноспрямовані зміни при контрастуванні глікокалікса НГА й іонізованим лантаном могли розцінюватися як свідчення блокування фіноптином реакційно-здатних груп зі зниженням реального рівня депонування Са2+ на 5-7%. Плазматична мембрана зберігала звичайну чіткість контурів. Сформовані нею мікропіноцитозні везикули розподілялись підкреслено нерівномірно, слабко взаємодіяли з плазмолемою. Невеликі скупчення везикул чергувались із досить значними зонами їх відсутності. Специфічний електронощільний осад, що відповідає локалізації Са2+, мав на плазмолемі, як в контролі, гомогенний характер, та утворювався в такій же кількості, однак розподіл його був дещо менш рівномірним. Результати тестів з іонізованим лантаном та НГА - подібні до отриманих в інтактних тварин. Елементи Т-системи КМЦ зазнавали помірної дилатації. Втім, електронногістохімічний аналіз не визначив суттєвих відмінностей морфофункціональних властивостей сарколеми вільної поверхні клітини та її Т-тубул.

Таблиця 1

Об’ємна щільність та кількісне співвідношення органел КМЦ при тривалому введені тваринам фіноптину щодо аналогічних показників

інтактних кролів (n=20)

№ | Досліджуваний показник | Групи експериментальних тварин

Контрольна | Введеня фіноптину

1 | Vvмф (%) | 61,98±0,69 | 56,64± 1,62*

2 | Vvмх (%) | 26,23±1,27 | 27,87±1,27

3 | Vvспс(%) | 2,27± 0,09 | 2,53± 0,09*

4 | Vvт (%) | 1,73± 0,11 | 1,53± 0,11

5 | Vvмх/Vvмф (%) | 0,450±0,050 | 0,492±0,050

6 | Vvспс/Vvмф (%) | 0,036±0,0002 | 0,044± 0,0002*

7 | Vvт/Vvмф (%) | 0,0300±0,0030 | 0,027±0,0030

8 | КЕЕМ(%) | 100,0±1,84 | 96,00± 02,33*

Приміткі:

Vv - об’ємна щільність ; Мф - міофібрили; Мх - мітохондрії;

СПС - саркоплазматична сітка; Т - Т-система;

КЕЕМ - коефіцієнт енергетичної ефективності мітохондрій;

* - показник достовірно відрізняється від контролю.

Мембрана помірно дилятованих канальців і цистерн СПС на всьому протязі у площині зрізів зберігала природну неперервність. Вона чітко контурувалась на звичайних електронограмах і добре маркірувалась при реакціях з НГА, що відповідає збереженню їх Са2+-кумулюючої здатності. Конфігурація вставних дисків помітно ускладнювалась, їх інтердигітації збільшувались, а щілина між інтеркальованими поверхнями суміжних КМЦ інколи часто була заповнена таніном. При використанні НГА відмічалось підвищення контрасту в ділянці нексусів.

Мітохондрії більшості КМЦ знаходились в конденсованому, енергезованому стані, відносно рівномірно і чітко контрастувались НГА, що відображало високий рівень їх Са2+-зв’язуючої здатності майже до 97-99%. Під сарколемою, іноді в аксіальних відділах клітин, подекуди спостерігались явища локальної десинхронізації міофібрил. Іноді виявлялись дрібні поодинокі фокуси лізису протофібрил і гідратації саркоплазматичного матриксу з напруженням елементів цитоскелету, що фіксують сарколему на рівні Z-ліній.

Контури ядер ускладнювались, в каріоплазмі переважав еухроматин. В гіпертрофованих ядерцях домінував гранулярний компонент. У саркоплазмі часто зустрічались фрагменти гранулярної ендоплазматичної сітки, накопичувались моно- і полірибосоми, відмічалось їх асоціювання з пошкожденими протофібрилами. Зрушення в ядерно-рибосомному комплексі КМЦ відображали збільшену активність пластичних процесів, а відсутність необоротних змін в клітинах засвідчує повну адекватність рівня внутрішньоклітинної регенерації.

Порівняно з контролем, об’ємна щільність та кількісне співвідношення ультраструктурних компонентів КМЦ не змінювалась (таб.1).

Згідно отриманих нами даних тривале введення обзидану інтактним тваринам також не спричиняло суттєвих змін морфофункціонального стану КМЦ. На гістотопограмах у поляризованому світлі не зафіксовані ознаки порушення їх скоротливої функції та суто дистрофічні зміни. Розташування м’язових волокон, форма і розміри клітин, які утворюють їх, були такими, як і в інтактних тварин.

Сарколему вільної поверхні КМЦ і Т-тубул вкривав відносно рівний шар глікокалікса завтовшки 40-60 нм, який зберігав свою звичайну тонкофібрилярну структуру. Некомпенсовані від’ємні заряди, що виявляються феризолем, локалізувались, як і в контролі, переважно у його зовнішньому шарі. Розподіл електронощільного осаду, котрий маркує Са2+ при реакції з НГА, як і дані про Са2+-зв’язуючий потенціал глікокалікса, отримані при використанні іонізованого лантану, також відповідали контрольним, і складали 97-99%.

Плазмолема чітко контрастувалась солями важких металів, зберігаючи свою тришарову будову, однак численність мікропіноцитозних пухирців зменшувалась, що, очевидно, пов’язане із зміною її пластичності. Вона залишалась повністю непроникною для колоїдного лантану і таніну. Останні виявлялись в інтерстиції, гирлах Т-тубул, осаджувались на глікокаліксі, інфільтруючи його, але не потрапляли у саркоплазматичний матрикс. Результати визначення розподілу Са2+ і Са2+-зв’зуючого потенціалу плазмолеми за допомогою НГА та іонізованого лантана склали 97-98% і мало відрізнялись від контролю.

Об’ємно-просторові взаємовідносини органел та особливості ультраструктури КМЦ кролів, які отримували обзидан свідчать про підвищення ефективності процесів енергоутворення і функціональної спроможності. Так, розподіл мітохондрій не відрізнявся від контролю, переважна кількість органел перебувала у конденсованому стані, їх співвідношення з міофібрілами збільшувалось, а у КЕЕМ утворювався певний резерв (табл.2). Інтенсивніше, ніж у контролі, контрастування цих органел при використанні НГА документувало підвищення їх Са2+-кумулюючої здатності на 3-5% щодо автентичних показників інтактних тварин.

Канальці СПС були помірно дилятовані, їх об’ємна щільність зростала, однак інтенсивність контрастування з НГА дещо знижувалась. Це відповідає збереженню вихідного рівня Са2+-зв’язуючої здатності вказаної органели. В саркоплазмі визначалась значна кількість рибосом і гранул -глікогену. Ядерний хроматин розподілявся дифузно, в ядерцях переважав гранулярний компонент. В перинуклеарній зоні зустрічались фрагменти пластинчастого комплексу, поодинокі лізосоми, причому їх вторинні форми були значно рідшими, ніж первинні.

Згідно отриманих даних, тривале введення фіноптину й обзидану інтактним тваринам не спричиняло пошкодження КМЦ. Аналіз морфофункціонального стану скоротливого міокарда засвідчив здатність фіноптину збільшувати товщину шару глікокаліксу, підвищуючи загальну концентрацію некомпенсованих від’ємних зарядів, та блокувати частини Са2+-зв’язуючих локусів плазмолеми.

Морфофункціональний стан вентрикулярних клітин міокарда при застосуванні обзидану дозволяє констатувати енергозберігаючий ефект препарату, а також дає підстави визначити можливий його вплив на пластичність цитомембран, зокрема, плазмолеми. Внаслідок цього створюються сприятливі передумови відносно співвідношення катаболічних і пластичних процесів у клітині та покращення морфофункціональних характеристик СПС, енергозабезпечуючого і контрактильного апаратів КМЦ, що повинно сприяти підвищенню резистентності міокарда до коронарної недостатності.

Таблиця 2

Об’ємна щільність та кількісне співвідношення органел КМЦ при тривалому введені кролям обзидану щодо автентичних показників у інтактних тварин (n=20)

№ |

Досліджуваний показник | Групи експериментальних тварин

Контрольна | Введеня обзидану

1 | Vvмф (%) | 61,98±0,69 | 55,99±0,69*

2 | Vvмх (%) | 26,23±1,27 | 27,16±1,27

3 | Vvспс(%) | 2,27± 0,09 | 2,32± 0,09*

4 | Vvт(%) | 1,73±0,11 | 1,59±0,11

5 | Vvмх/Vvмф (%) | 0,450±0,050 | 0,485±0,050

6 | Vvспс/Vvмф (%) | 0,036±0,0002 | 0,041±0,0002*

7 | Vvт/Vvмф (%) | 0,0300±0,0030 | 0,028±0,0030

8 | КЕЕМ(%) | 100,0±1,84 | 98,00± 01,03*

Примітки:

Vv - об’ємна щільність ; Мф - міофібрили; Мх - мітохондрії;

СПС - саркоплазматична сітка; Т - Т-система;

КЕЕМ - коефіцієнт енергетичної ефективності мітохондрій;

* - показник достовірно відрізняється від контролю.

При моделюванні хронічної ІХС в міокарді спостерігались інтерстиціальний набряк і нерівномірне кровонаповнення, відмічались гіпертрофія, атрофія ознаки імовірної дистрофії КМЦ. Зустрічались клітини з вираженим перинуклеарним набряком, явищами футлярного міоцитолізу, зернисто-глибчастого розпаду, а також мікрофокуси заміщення загиблих КМЦ сполучною тканиною.

Сарколема вільної поверхні і Т-тубул робочих клітин міокарда змінювались односпрямовано. На глікокалікс нашаровувались пухкі аморфно-фібрилярні субстанції, що скупчувались в інтерстиції. Часто він піддавався розпушенню, рарифікації з дрібновогнищевим розсіюванням речовини й оголенням плазмолеми, а реакція з феризолем виявляла у різній мірі виражене зниження концентрації некомпенсованих від’ємних зарядів ГАГ. Абсолютне значення об’ємної щільності Т-системи, як і відношення цього показника до об’ємної щільності міофібрил достовірно знижувались (табл.3).

Тести з іонізованим лантаном, який (внаслідок більш високої, ніж у Са2+, хімічної активності) здатний виявити не лише локуси реального, а і потенційно можливого зв’язування Са2+, підтверджують загальне зниження Са2+-зв’язуючої спроможності глікокалікса порівняно з контролем на 22%. Це дає підстави для припущення, що поряд із дисоціацією власне речовини, порушення депонування ним Са2+ зумовлене частковою блокадою його реакційноздатних груп іншими катіонами.

На відміну від глікокалікса, ультраструктура плазматичної мембрани зберігалась краще. Вона лише в окремих випадках втрачала чіткість контурів і зазнавала мікроконфігураційних змінах. За даними реакції з НГА кальцієва ємність плазмолеми знижувалась на 17% щодо контролю, а її специфічне контрастування часто набувало переривчастого характеру. Бар’єрні функції сарколеми у КМЦ переважно збережені і лише в окремих необоротно пошкоджених клітин саркоплазматичний матрикс, міофібрили і частина мітохондрій після обробки таніном інтенсивно контрастувались солями важких металів.

Елементи канальцевого відділу СПС зазвичай були нерівномірно дилятовані, а цистерни – деформовані або вакуолізовані. Об’ємна щільність органели вірогідно збільшувалась порівняно з контролем (табл.3). Внаслідок явищ вогнищевої фрагментації і лізису мембрана СПС не завжди зберігала чіткість контурів. У просвітах канальців поряд із електроннопрозорою рідиною виявлялись осміофільні та НГА-позитивні субстанції, внутрішню поверхню вакуолізованих цистерн інкрустував тонкий електроннощільний осад. При реакції з НГА (і в скороченому стані, і при релаксації міофібрил) в СПС визначались зони як підвищеної спорідненості до Са2+, так і її значного зниження. В цілому Са2+-зв’язуюча спроможність СПС становила близько 73% від контролю. Обмеження функціональних можливостей органели часто поєднувались з морфологічними проявами дискинезії контрактильного апарату КМЦ.

Мітохондрії розподілялись на майже зі збереженими морфофункціональними властивостями, з частковою деструкцію крист, та практично зруйновані, співвідношення між якими в певній мірі відповідало ступеню адаптованості КМЦ до нових умов функціонування. Пошкодження внутрішньої мембрани мітохондрій - її фрагментація та гомогенізація зменшували число крист і, відповідно, КЕЕМ на 20% від контролю (табл.3). Інтенсивність специфічного контрастування окремих мітохондрій при реакції з НГА коливалась в значно ширшому діапазоні, ніж в контролі, а їх загальна Са2+-зв’язуюча здатність, як найбільш ємного внутрішньоклітинного депо Са2+, зменшувалась майже на 26% порівняно з контролем.

Значна кількість мітохондрій піддавалось мієліноподібній трансформації (вочевидь - через посилення оксидативних процесів). Разом з тим компенсаційна проліферація призводила до накопичення різноманітних за формою, об’ємом та кількістю крист гіпоплазованих органел, що досить часто супроводжувалось формуванням їх компактних скупчень, які досягали значного об’єму і “витискали” інші органели.

Збільшення частки пошкоджених мітохондрій у клітині обов’язково поєднувалось з іншими проявами альтерації КМЦ: значним зниженням концентрації цитогранул, деформацією канальців, вакуолізацією цистерн і пошкодженням мембрани СПС, порушенням Са2+-зв’язуючої здатності органел і водного балансу клітини, прогресуючим лізисом міофібрил, формуванням контрактур, а в окремих випадках – патологічним підвищенням проникності сарколеми, що виявлялось за допомогою таніна або колоїдного лантана і відповідало необоротному пошкодженню всієї клітини.

Перебудова структури контрактильного апарату КМЦ також відрізнялась неоднорідністю, а в об’ємно-просторових співвідношеннях мітохондрій і контрактильного апарату КМЦ з’являлись помітні відхилення від норми (табл. 3). Окрім явищ діскінезії та перескорочення міофіламентів, поширеним варіантом їх пошкодження був диференційований лізис, а інколи – й тотальне розплавлення протофібрил з утворенням більш - менш значних зон, виповнених електронопрозорою рідиною, цитогранулами та іншими органелами, тоді об’ємна щільність міофібрил вірогідно знижувалась (табл.3).

Перебудова об’ємно-просторових співвідношень міофибрил та органел, що забезпечують їх функцію, погіршувала енергетичні процеси та електролітний обмін, що визначають ефективність механічної функції КМЦ. На цьому тлі закономірно утворювались поодинокі, а інколи і дрібні множинні “дисеміновані” контрактури, спостерігались явища внутрішньоклітиного лізису, які часто супроводжувались гіпергідратацією саркоплазми. Розплавлення міофіламентів і контрактури часто комбінувались, вказуючи на спільність своїх патогенетичних механізмів. Поширеність цих пошкоджень та відкладення електронощільних гранул фосфату Са2+ в матріксі мітохондрій визначали важкі порушення його обміну із незворотними для КМЦ наслідками.

Таблиця 3

Об’ємна щільність та кількісне співвідношення органел КМЦ

при моделюванні хронічної ІХС

№ | Досліджуваний показник | Групи експериментальних тварин

Контрольна | ГХЕ+ХКН

1 | Vvмф (%) | 61,98±0,69 | 44,11± 1,62*

2 | Vvмх (%) | 26,23±1,27 | 29,95± 4,55

3 | Vvспс(%) | 2,27± 0,09 | 2,77±0,09*

4 | Vvт (%) | 1,73± 0,11 | 1,13±0,13*

5 | Vvмх/Vvмф (%) | 0,450±0,050 | 0,740± 0,150

6 | Vvспс/Vvмф (%) | 0,036±0,0002 | 0,0630± 0,0060*

7 | Vvт/Vvмф (%) | 0,0300±0,0030 | 0,0260± 0,0030

8 | КЕЕМ (%) | 100,0±1,84 | 80,66± 11,03*

Примітка:

Vv - об’ємна щільність ; Мф - міофібрили; Мх - мітохондрії;

СПС - саркоплазматична сітка; Т - Т-система;

КЕЕМ - коефіцієнт енергетичної ефективності мітохондрій;

*- показник достовірно відрізняється від контролю.

Напруження регенераційних процесів, обов’язкове за цих умов для структурного і функціонального збереження КМЦ, призводило до збільшення ядер, які набували витягнутої форми, наближаючись до прямокутної. Їхні контури були ускладнені численними поверхневими і глибокими складками із зяючими порами. Хроматин розташовувався нерівномірно. В гіпертрофованих, збільшених за кількістю, ядерцях переважав гранулярний компонент. Навколоядерна зона багатьох КМЦ була зайнята мітохондріями, а ядро часто зміщувалось з аксіальних відділів під сарколему. Полі- і рибосоми, які разом з гранулами глікогену виявлялись повсюдни, накопичувались навколо мітохондрій й асоціювались з пошкодженими протофібрилами. Показником інтенсифікації пластичних процесів також були гіперплазія і вакуолізація елементів гранулярної ендоплазматичної сітки та комплекса Гольджі.

Зростання деструктивних явищ в КМЦ супроводжувалось набряком ядра з розплавленням контурів нуклеолеми, просвітленням каріоплазми, розширенням зони гетерохроматину. Ядерця втрачали свій гранулярний компонент, підпадали фрагментації та колапсу, а в саркоплазмі значно зменшувався вміст рибосом.

Перебудова КМЦ під впливом факторів, що визначають патогенез ІХС – дисліпопротеїдемії і рецидивуючих нападів коронарної недостатності - знижують резистентність клітин до пошкоджуючого впливу аж до зриву адаптаційних можливостей.

Таким чином, відповідно до отриманих нами даних та сучасних уявлень коронарогенні пошкодження вентрикулярних КМЦ, насамперед, пов’язані з надлишком в клітинах некомпартменталізованного Са2+. Згідно з цим в клінічній практиці для захисту міокарда при даній патології найчастіше використовуються антагоністи кальцію і -блокатори (Е.И. Чазов, 1992; Е. Браунвальд, 1995). В наших дослідженнях зміни міокарда кролів з “хронічною ІХС”, які отримували фіноптин, були значно меншими ніж у нелікованих тварин: при застосуванні методик Лі або Рего знижувалась кількість його дисемінованих дрібновогнищевих пошкоджень, в поляризованому світлі зменшувались явища діскінезії скоротливого апарату КМЦ.

При електронномікроскопічних дослідженнях патологічне підвищення проникності сарколеми, що виявляється таніном або колоїдним лантаном, верифікувалось рідше, аніж без фармвпливу. В більшості КМЦ прослідковувались суттєві позитивні відмінності, однак основні тенденції їх перебудови були такими, як і при моделюванні суто хронічної ІХС. Проте зони розпушення, рарифікації і розсіювання глікокалікса з оголенням плазмолеми зустрічались лише в поодиноких необоротно пошкоджених клітинах. В інших його шар нерівномірно потовщувався зі збереженням своєї звичайної структури, а аніонні групи, що реагують з феризолем, виявлялись як на зовнішній поверхні, так і в його товщі. Їх загальна концентрація збільшувалась майже на 12 % порівняно з нелікованими тваринами, що визначає зростання кальцієвої ємності головного зовнішньоклітинного депо цього катіона.

Тести з НГА та іонізованим лантаном підтверджують часткове відновлення вмісту Са2+ і Са2+-зв’язуючої спроможності глікокалікса, яка підвищувалась на 14% відносно спостережень із суто моделюванням патології. Разом з тим, відносно низька інтенсивность його контрастування з НГА порівняно з непропорційним збільшенням рівню електронощільного осаду при використанні іонізованого лантана, вказували на “виключення” значної частини некомпенсованих від’ємних зарядів ГАГ з процесу депонування Са2+ із-за їх блокування якимись іншими агентами з катіонними властивостями.

Ультраструктура плазмолеми була принципово відповідною такій у випадках тривалого введення інтактним тваринам фіноптину. Плазматична мембрана, як правило, зберігала чіткість контурів. Сформовані нею мікропіноцитозні везикули розподілялись нерівномірно, на відносно великих локусах були відсутні або майже взаємодіяли із плазмолемою. Інтенсивність специфічного контрастування плазмолеми при використанні НГА знижувалась, але електронощільні відкладення, що визначають локалізацію Са2+, розподілялись рівномірніше, ніж у нелікованих тварин. Разом з тим, ділянки переривчастого маркування зустрічались частіше і були більш протяжними. В цілому, Са2+-зв’язуюча здатність плазмолеми, при застосуванні фіноптину порівняно з “хронічною ІХС” без фармкорекції, зростала на 14-15%, залишаючись на 3-4 % нижче від відповідних показників у контрольних тварин.

Таким чином, під впливом фіноптина Са2+-зв’язуюча здатність плазмолеми і глікокаліксу змінюються різноспрямовано. Збільшення останнього показника вірогідно компенсаційного характеру.

Мітохондрії більшості КМЦ лікованих фіноптином тварин утворювали дрібноосередкові проліферати між міофібрилами, а інколи - й об’ємні компактні скупчення, що суттєво порушували загальну структуру клітини. Значну їх долю складали поліморфні, гіпоплазовані мітохондрії, подекуди з дефектами зовнішньої мембрани, явищами фрагментації, гомогенізації частини крист. Однак, завдяки помітному збільшенню об’ємної щільності цих органел в КМЦ вірогідно зростав і КЕЕМ до 91%, щодо нелікованих тварин (табл.4). Покращення ж морфофункціонального стану мітохондріального апарату, документоване при задіяні фіноптину, уможливлювало підвищення його сумарної Са2+-акумулюючої здатності на 14% порівняно з суто моделюванням хронічної ІХС.

Таблиця 4

Об’ємна щільність та кількісне співвідношення органел КМЦ тварин при моделюванні хронічної ІХС з та без введення фіноптину

щодо контрольних показників (n=30)

№ | Досліджуваний показник | Групи експериментальних тварин

Контрольна | ГХЕ+ХКН | ГХЕ+ХКН+фіноптин

1 | Vvмф (%) | 61,98 ± 0,69 | 44,11± 1,62* | 56,38± 1,62**#

2 | Vvмх (%) | 26,23 ± 1,27 | 29,95± 4,55 | 27,52±1,27

3 | Vvспс(%) | 2,27 ± 0,09 | 2,77±0,09* | 2,41± 0,09**#

4 | Vvт (%) | 1,73 ± 0,11 | 1,13±0,13* | 1,43±0,13#

5 | Vvмх/Vvмф (%) | 0,450 ± 0,050 | 0,740±0,150 | 0,488± 0,150

6 | Vvспс/Vvмф (%) | 0,036 ±0,0002 | 0,063±0,006* | 0,042± 0,0060**

7 | Vvт/Vvмф (%) | 0,030 ±0,003 | 0,026±0,003 | 0,0253±0,0030

8 | КЕЕМ (%) | 100,0 ± 1,84 | 80,66 ±11,03* | 91,00±04,77

Примітки: Vv - об’ємна щільність ; Мф - міофібрили; Мх - мітохондрії; СПС - саркоплазматична сітка; Т - Т-система; КЕЕМ - коефіцієнт енергетичної ефективності мітохондрій; * - показник достовірно відрізняється від контролю; ** - показник достовірно відрізняється від ГХЕ+ХКН; # - показник достовірно відрізняється від контролю.

В СПС зафіксована нерівномірна дилятація канальців і вакуолізація цистерн, але конфігураційні зміни, осередкова фрагментація і лізис її мембрани майже не спостерігались. При реакції з НГА патологічна гетерогенність різних фрагментів органели помітно пом’якшувалась, а Са2+-зв’язуюча здатність її елементів відносно спостережень з “хронічної ІХС” збільшувалась на 13%.

Контрактильний апарат КМЦ зазнавав таких же змін, як і при моделюванні хронічної ІХС без корегуючого впливу фіноптину, але обсяги їх ставали помітно меншими. На тлі нерівномірної гіпертрофії або атрофії міофібрил спостерігались поодинокі і множинні мікрофокальні перескорочення саркомерів, окремі локуси лізису протофібріл, що свідчать про лише часткове відновлення електролітного таенергетичного гомеостазу КМЦ. Значні контрактури або зони поширеного розплавлення органел зустрічались у поодиноких випадках - при необоротному пошкодженні КМЦ.

Покращення електролітного обміну при застосуванні фіноптину сприятливо впливало і на пластичне забезпечення функції клітин. У більшості КМЦ зростала концентрація рибосом та полірибосом, в той час як явища гіпертрофії і гіперплазії ШЕР і комплексу Гольджі зменшувались разом з кількістю вторинних лізосом.

Тривале застосування -блокатора обзидану за умов хронічної коронарної недостатності та дисліпопротеїдемії справляло добре виражений кардіопротекторний ефект. Ознаки дисфункції скоротливого апарату КМЦ були виражені помітно слабше, ніж у нелікованих тварин, рідше зустрічались дисеміновані мікрофокальні пошкодження міокарда, зменшувалась виразність гіпертрофії й атрофії робочих клітин.

Коливання товщини шару, електронної щільності і концентрації некомпенсованих від’ємних зарядів глікокалікса, що виявляються феризолем, наочно наближались до контролю. Втім, як свідчать тести з використанням іонізованого лантана, розподіл Са2+ втрачав звичайну рівномірність, що вірогідно пов’язане з блокуванням частини пунктів його зв’язування іншими субстанціями. Разом із дисоціацією речовини глікокалікса це знижувало його Са2+-депонуючу здатність до 89% від контролю, що, однак, суттєво менше, ніж у нелікованих тварин, де цей показник становив 78%.

Плазмолема зберігала тришарову структуру і чіткість контурів, добре контрастувалась солями важких металів. При реакції з НГА електронощільні відкладення, які відповідають локалізації Са2+, зберігали гомогенний характер, але розподілялись менш рівномірно, ніж у тварин, які тривалий час отримували обзидан. Проте загальний рівень Са2+-зв’язуючої здатності плазмолеми наближався до 93-94%.

Стабілізуючий вплив обзидану на сарколему поєднувався з ускладненням конфігурації інтердигітацій горизонтальних сегментів та обмеженням зон “випрямлення” вставних дисків. Однак інколи, між інтеркальованими поверхнями спостерігалось накопичення таніна. Зміни плазмолеми вільної поверхні КМЦ і Т-тубул практично не відрізнялись. Просвіти помірно розширених Т-тубул заповнював розпушений глікокалікс, в їх гирлах часто скупчувався реагуючий із феризолем аморфно-фібрилярний субстрат.

Мітохондрії, що набували помірно виражені явища структурно-метаболічного поліморфізму, розташовувались у вигляді ланцюжків вздовж міофібрил, утворювали досить масивні компактні скупчення навколо ядра, поміж міофібрилами, під сарколемою. Незважаючи на деякий поліморфізм, в більшості КМЦ домінували органели з відносно добре збереженою будовою і лише в поодиноких випадках зустрічались мітохондрії з явищами значної деструкції внутрішньої мембрани та мієліноподібної трансформації. Кардіопротекторний вплив обзидану зі стабілізацією ультраструктури мітохондрій покращував енергетичне забезпечення функції КМЦ про що свідчіть вірогідне збільшення КЕЕМ на 14% від нелакованих тварин (табл.5). Тести з НГА підтверджують покращення функціонального стану мітохондрій і як депо Са2+, сумарна Са2+-кумулююча здатність яких підвищується на 14% відносно спостережень з моделюванням хронічної ІХС без корегую чого впливу.

Мембрана СПС не завжди зберігала чіткість контурів, але її вогнищева фрагментація і лізис зустрічались рідше, а нерівномірна дилятація канальців і вакуолізація цистерн були меншими, ніж у тварин, котрі не отримували обзидан. Це призводило до вірогідного зменшення об’ємної щільності органели відносно нелікованих тварин (табл.5). Тести з НГА виявляли збільшення функціональної гетерогенності різних сегментів канальцевого відділу органели порівняно з контролем, яка однак не досягала такого рівня як при “хронічної ІХС”, а загальна Са2+-звязуюча ємність органели становила 88, а не 73% - як у нелікованих тварин.

Перебудова контрактильного апарату КМЦ відрізнялась меншою поширеністю і поліморфізмом, ніж у тварин, яких не лікували. Частина міофібрил підпадала помрній гіпертрофії або атрофії але, деструктивні зміни мали досить обмежений характер.

Внутрішньоклітинні пошкодження в переважній більшості КМЦ ефективно компенсувались посиленням пластичних процесів. Про це свідчили накопичення моно- і полірибосом в саркоплазмі, гіпертрофія ядерець з переважанням у них гранулярного компоненту, домінування еухроматину над гетерохроматином в ядрах з ускладненим рельєфом нуклеолеми, зниження вмісту вторинних форм лізосом, а загалом - оптимізація об’ємних та кількісних співвідношень органел (табл. 5).

Таким чином, активне медикаментозне попередження надлишку некомпартменталізованого кальцію в КМЦ справляє чітко виражений сприятливий вплив на морфофункціональний стан вентрикулярних КМЦ з певними особливостями в його реалізації, що до використаних препаратів

При застосуванні фіноптину - кардіопротекторний ефект, насамперед, досягався збільшенням Са2+-зв’язуючої здатності глікокалікса за рахунок блокади від’ємних реакційно-здатних груп, мембраностабілізуючим впливом на плазмолему вільної поверхні та Т-системи КМЦ. Це суттєво нівелює комплекс негативних наслідків, пов’язаних з надлишком вільних катіонів у вентрикулярних робочих клітинах міокарда, який відмічався при хронічній ІХС, сприяючи нормалізації енергетичного обміну і пластичного забезпечення функції КМЦ, обмежуючи альтерацію їхніх органел і запобігаючи прогресуючій перебудові ультраструктури клітин скоротливого міокарда.

Ангіопротекторний вплив обзидану на скоротливий міокард пов’язаний зі зниженням чутливості міокарда до стимулюючого впливу агоністів ?-адренорецепторів, як загального, так і місцевого походження внаслідок їх селективного блокування (Ю.Н. Беленков,1997, Л.Т. Малая,1996, М.Д. Машковский, 1997). Разом з попередженням перевантаження саркоплазми КМЦ позаклітинними іонами Са2+ це, як свідчать наші данні, стабілізує весь комплекс цитомембран КМЦ: плазмолемму, СПС, мітохондрій та інших органел, включаючи лізозоми. Обмеження гіперфункції КМЦ, яка стимулюється надлишком Са2+, забезпечує більш сприятливіші умови для протікання в мітохондріях процесів тканинного дихання і окислювального фосфорилювання. Блокування ?-адренорецепторів препаратом знижує рівень цАМФ, який стимулює гліколіз, про що свідчать порушення