НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ,

ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є.КАВЕЦЬКОГО

СЄВКО ОЛЕКСАНДРА ЛЕОНІДІВНА

УДК 616–[006.441:092.4]:576.314:612.12

АНАЛІЗ ВЛАСТИВОСТЕЙ ДЕНДРИТНИХ КЛІТИН КІСТКОВО-МОЗКОВОГО ПОХОДЖЕННЯ ПРИ РОЗВИТКУ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ЛІМФОМИ

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ-2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук

Смирнова Ірина Адріанівна,

завідувач відділу механизмів лейкозогенезу

Інституту експериментальної патології, онкології і

радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Кудрявець Юрий Йосипович,

завідувач відділу експериментальних клітинних систем

Інституту експериментальної патології, онкології і

радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України;

кандидат біологічних наук

Храновська Наталія Миколаївна,

старший науковий співробітник лабораторії клінічної

імунології Інституту онкології АМН України

Провідна установа – Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України, кафедра онкології, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться "28" квітня 2004 р. о 13 годині 30 хвилин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України (03022, м.Київ, вул.Васильківська, 45)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий "26" березня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради

доктор медичних наук Н.В.Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розробка засобів підсилення імунних реакцій організму проти пухлинних клітин є одним із важливих аспектів онкології. Сучасним і перспективним підходом для вирішення цієї задачі є використання дендритних клітин (ДК) в якості потужного антигенпрезентуючого агенту для ініціації та посилення імунної відповіді на пухлинні або пухлиноасоційовані антигени. ДК можуть бути надзвичайно ефективними ад’ювантами при створенні протипухлинних вакцин [Пащенков М.В. с соавт., 2001; Потебня Г.П. с соавт., 2002; Ярилин А.А., 2001; Graner M.W. et al, 2003; Hart D.N.J., 1997].

З іншого боку відомо, що пухлини суттєво впливають на розвиток та функціональну активність ДК. Дані літератури свідчать про те, що в залежності від природи пухлини та характеру пухлинного росту ефекти можуть істотно відрізнятись: від підвищення до суттєвого інгібування функціональної активності ДК, від відсутності помітного впливу до суттєвого пригнічення диференціації ДК, навіть в пухлинах одного генезу [Aalamian M. et al, 2001; Bonfanti A. et al, 2000; Hart D.N.J., 1997].

Вивченню біології ДК та їхньої ролі в формуванні протипухлинного імунітету, присвячено багато досліджень. Проте незважаючи на широкомасштабні розробки у вивченні властивостей ДК, їх взаємодія з пухлиною все ще залишається не до кінця вивченою.

Таким чином, дослідження різних аспектів участі ДК в розвитку і перебігу онкологічних захворювань, зокрема злоякісних лімфом, на наш погляд, відповідає запитам сучасної біології та медицини. Це обґрунтовує необхідність комплексного дослідження дозрівання та функціональних властивостей ДК як виділених in vivo, так і культивованих з кістково-мозкових (КМ) клітин-попередників в залежності від характеру пухлинного росту, що може допомогти виявленню сприятливих умов для створення клітинних протипухлинних вакцин. Відомості про чисельність та властивості ДК в уражених органах та тканинах при пухлинному рості можуть використовуватись як прогностичні критерії перебігу захворювання.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження за темою дисертації проводились у рамках планово-бюджетних наукових робіт Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, зокрема теми "Молекулярно-генетичні механізми модифікації властивостей лейкозних та інших злоякісних клітин" (шифр теми 2.2.5.214). Роботу було проведено за підтримкою гранту ICRETT №413 від Міжнародного товариства з боротьби з раком (UICC, Швейцарія) на проведення наукового проекту за темою: "Дендритні клітини та протипухлинний імунітет при злоякісних лімфомах" в Пітсбурзькому інституті раку, лабораторія імунопатології, Пітсбург, Пенсільванія, США. Номер контракту NO2-CO-91012.

Мета роботи. Дослідження диференціювання та функціональних особливостей ДК в залежності від локалізації Т-клітинної лімфоми EL-4 при різних способах імплантації лімфомних клітин.

Задачі дослідження:

1.

2.

3.

Об’єкт дослідження – ДК мишей лінії C57BL/6 з трансплантованою лімфомою штаму EL-4.

Предмет дослідження – особливості диференціювання КМДК in vitro, фенотипові та функціональні особливості КМДК та СДК при розвитку лімфоми EL-4 in vivo.

Методи дослідження.1) цитофлуориметричний (FACScan аналіз) – для визначення імунологічного фенотипу ДК (IAb, CD86, CD80, CD40, CD11c, CD11b); 2) культура змішаних лейкоцитів (з Т-лімфоцитами мишей лінії BALB/c) – для визначення функціональної активності ДК; 3) імуногістохімічний – для виявлення ДК в різних органах тварин (з використанням CD11c та NLDC-145); 4) цитоморфологічний (мазки-відбитки забарвлені за Папенгеймом) – для дослідження гістологічної структури лімфоми та органів, які можуть бути інфільтровані лімфомними клітинами; 5) статистичний аналіз з використанням t-критерію Стьюдента та програми WinMDI 2.8.

Наукова новизна. Результати роботи мають перш за все теоретичне значення, оскільки розкривають нові аспекти взаємодії ДК та пухлини, вплив локалізації пухлини на дозрівання та функціональні властивості ДК. Вперше на моделі лімфоми EL-4 показано, що в залежності від характеру росту пухлини, зумовленого різними шляхами введення пухлинних клітин, СДК і КМДК мають різний імунофенотип та функціональну активність. Показано, що КМДК, які контактували з пухлинними антигенами, введені тваринам з лімфомою EL-4, відновлюють дозрівання КМДК реципієнтів та пригнічують у них розвиток лімфоми. Встановлено, що така стимуляція імунної відповіді, зумовлена активованими КМДК, залежить від способу введення останніх і більш виражена при внутрішньовенному введенні.

Практичне значення. Розкриття механізмів пригнічення диференціації та функціональної активності ДК при пухлинному рості буде сприяти розробці терапевтичної стратегії, спрямованої на відновлення протипухлинної імунної відповіді. Аналіз складу поверхневих антигенів на ДК та їх функціональної активності можна розглядати як один із критеріїв оцінки ступеня злоякісності пухлинного процесу. Визначення кількості ДК в пухлині та їх функціональної здатності може мати прогностичне значення.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто зібрана та проаналізована література за темою дисертації, вироблений план досліджень і виконана експериментальна частина роботи, зокрема самостійно проводились всі маніпуляції на тваринах, виділення та культивування ДК, приготування препаратів для цитоморфологічного, імуногістохімічного та цитохімічного досліджень. Автор самостійно проводила цитофлуориметричний та імуногістологічний аналізи, постановку реакції в культурі змішаних лейкоцитів та цитоморфологічний аналіз ДК. Автор приймала участь в аналізі результатів цитохімічних досліджень. Самостійно проведена статистична обробка одержаних даних та теоретичне узагальнення результатів досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були висвітлені в доповідях на: спільному засіданні відділень молекулярної біології, біохімії, експериментальної та клінічної фізіології і загальної біології НАН України та Вченої ради біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, 2001), VI Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих учених (Тернопіль, 2002), V конференції молодих онкологів України “Сучасні аспекти експериментальної та клінічної онкології” (Київ, 2002), школі-семінарі “Актуальные вопросы проточной цитометрии” (Київ, 2003), Vi конференції молодих онкологів України “Сучасні аспекти експериментальної та клінічної онкології” (Київ, 2003).

Публікації. Основні результати досліджень по темі дисертації викладено в 4 статтях в провідних фахових журналах та 3 тезах на вітчизняних конференціях і конгресі.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 108 сторінках друкованого тексту, складається із вступу, огляду літератури, п’яти розділів власних досліджень, обговоренні результатів власних досліджень, висновків і списку літератури. Список літератури містить 23 вітчизняних та 146 зарубіжних джерел. Робота ілюстрована 2 схемами, 9 таблицями, 8 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. В роботі проаналізовано 1356 препаратів, одержаних від 120 мишей-самців лінії C57BL/6 та 10 мишей-самців лінії BALB/c. Тварини віком 6-8 тижнів були одержані з розплідника Taxonic (Germantown, NY, США) та з віварію ІЕПОР НАНУ. На протязі двох тижнів тварини проходили акліматизацію і перебували при 12 годинному світловому циклі та температурі 20-220C. Харчування та воду одержували ad libitum. Роботи проводили у відповідності з міжнародно прийнятими правилами проведення робіт з експериментальними тваринами.

Культура клітин. В роботі використовували культуру Т-клітинної лімфоми EL-4, яка була одержана з банку клітинних культур Пітсбурзького університету, а також перещеплюваний на мишах штам EL-4, одержаний з банку клітинних культур ІЕПОР. Клітини культивувались в середовищі RPMI 1640 з 10% інактивованої сироватки ембріонів корів, з додаванням гентаміцину, пірувату натрію і L-глутаміну (Gibco BRL, США) (далі RPMI 1640), при 370C в атмосфері 5% CO2 або перещеплювались на мишах лінії C57BL/6. Досліджувана культура клітин не інфікована мікоплазмою.

Перещеплювання клітин лімфоми EL-4. Для підтримання асцитного штаму мишам лінії C57BL/6 вводили внутрішньочеревинно по 1Ч106 клітин на мишу. До початку дослідів розморожені лімфомні клітини відмивали в середовищі RPMI 1640 та проводили через 3 – 4 пасажі. Для визначення впливу характеру пухлинного росту на систему ДК мишам лінії C57BL/6 вводили по 105 клітин лімфоми EL-4 в 0,2 мл фосфатного буферу підшкірно (п/ш) в ділянці правого підребер’я, внутрішньочеревинно (в/ч) та внутрішньовенно (в/в) в латеральну хвостову вену. Пухлинний ріст контролювали за присутністю клітин лімфоми в кістковому мозку, селезінці та лімфатичних вузлах, вимірювали розміри пухлин при п/ш введенні тваринам пухлинних клітин та оцінювали наявність асциту при в/ч введенні тваринам пухлинних клітин.

Одержання КМДК та СДК. Клітини КМ мишей лінії C57BL/6 одержували промиванням епіфізів гомілкових кісток з дотриманням правил асептики. З клітинної суміші видаляли еритроцити, В- і Т- лімфоцити. Після відмивання клітини в кількості 1Ч106 клітин на лунку культивували в шестилункових планшетах в середовищі RPMI 1640 з додаванням рекомбинантного мишачого грануло-моноцитарного колонієстимулюючого фактору (ГМ-КСФ) та рекомбинантного мишачого інтерлейкіну (ІЛ)-4 при 370C в атмосфері 5% CO2. На 4-ту добу цитокіни додавали повторно з порцією свіжого поживного середовища.

Селезінки мишей ліній C57BL/6 та BALB/c в стерильних умовах подрібнювали в середовищі RPMI 1640 та фільтрували крізь клітинний фільтр для одержання однорідної клітинної суспензії. Еритроцити, В- та Т-лімфоцити видаляли, а суспензію клітин використовували як джерело антигенпрезентуючих клітин (АПК).

Морфологічні дослідження. Культивовані КМДК на 6-й день росту досліджували за допомогою інвертованого мікроскопу (збільшення ґ 400) на наявність угрупувань (кластерів) ДК.

Препарати з культивованих КМДК для морфологічного дослідження одержували на цитоцентрифузі Cytospin-2 Shandon. Забарвлення проводили з використанням набору стандартних барвників ЛейкоСтат (Fisher Scientific, США). Мазки-відбитки з селезінки, лімфатичних вузлів, печінки, кісткового мозку та пухлин забарвлювали за методом Папенгейма.

визначення функціональної активності ДК. Оцінку здатності КМДК та АПК селезінки до індукції проліферації Т-клітин проводили за методом змішаної культури алогенних лейкоцитів (ЗКЛ), в основі якого полягає реакція бласттрансформації Т лімфоцитів [Клиниченко В.В. с соавт., 1995, Hart D.N.J., 1997]. Селезінки мишей лінії BALB/с подрібнювали в середовищі RPMI 1640 та фільтрували крізь клітинний фільтр для одержання однорідної клітинної суспензії. З клітинної суспензії видаляли еритроцити та виділяли Т-клітини на колонці з нейлоновою ватою. Алогенні Т-клітини в концентрації 3Ч105 клітин на лунку в середовищі RPMI 1640 вносили в 96-лункові планшети і додавали суспензію КМДК по 10 – 105 на лунку або суспензію АПК селезінки по 103 – 105 на лунку. Інкубацію проводили у зволоженій атмосфері при 5% CO2 і 370C на протязі 72 год після чого на 16 год вносили [3H] тимідин в дозі 1 мкКu на лунку. Всі розведення повторювались тричі.

Цитофлуориметричне дослідження. Визначення поверхневих антигенів проводили за рекомендацією фірми-виробника. ДК визначали з використанням наступної панелі мічених моноклональних антитіл (МКАТ): анти-IAb (антиген ГКГ ІІ класу) (FITC), CD86 (FITC), CD80 (FITC), CD40 (FITC), CD11b (FITC и PE) та CD11c (PE). Зразки фіксували в 2% розчині формаліну.

АПК з селезінки відмивали в фосфатному буфері, підраховували і суспендували у кількості 3Ч105 клітин на пробірку в FACScan буфері. Маркування ДК проводили з використанням наступної панелі МКАТ: анти-IAb (FITC), CD8 (FITC), CD11c (РЕ). Аналіз проводили на приладі FACScan (Becton Dickinson, США). Результати аналізували з використанням програми WinMDI 2.8.

Імуногістохімічне дослідження. З селезінки, печінки, легенів та пухлинної тканини мишей готували кріотомні зрізи товщиною 4 мкм. Використовували авідин/біотинову систему візуалізації. ДК визначали з використанням антитіл до CD11c та NLDC-145 (Non-Lymphoid Dendritic Cells). Всі препарати були дофарбовані гематоксилином. Число позитивних клітин визначали напівкількісно: 0 – відсутність позитивного забарвлення, + слабке, але визначаєме забарвлення поодиноких клітин, ++ позитивне забарвлення, ++++ різко позитивне і +++ - інтенсивність між ++ та ++++.

Приготування пухлинного лізату. Клітини лімфоми EL-4 в кількості 107 клітин на мл фосфатного буферу (ФБ) розливали по 1 мл в кріогенні пробірки і проводили 5 циклів заморожування в рідкому азоті та відтавання при 370C. Після повного розморожування лізат центрифугували при 2000 об/хв 15 хв і для роботи відбирали надосадову рідину.

Приготування препарату з дендритних клітин для введення тваринам. КМДК на шостий день культивування збирали, відмивали в середовищі RPMI без додавання сироватки ембріонів корів. Доводили клітини до концентрації 106/мл і додавали пухлинний лізат з розрахунку 107 клітин EL-4 на 106 КМДК. На протязі 3 год при температурі 370C проводили інкубацію, після чого відмивали в ФБ. На 7-му, 10-ту та 14-ту добу від початку експерименту тваринам вводили КМДК, які контактували з пухлинними антигенами, в кількості 5Ч105 у відповідному об’ємі за наступною схемою:

· При п/ш трансплантації клітин EL-4 тваринам першої підгрупи (група Іа) вводили внутрішньопухлинно оброблені КМДК, другої (група Іб) – ту ж саму кількість необроблених лізатом ДК в 150 мкл ФБ і третьої (позитивний контроль, група Ів) – 150 мкл ФБ.

· При в/в трансплантації тваринам першої підгрупи (група ІІа) вводили в/в оброблені лізатом ДК, другої (група ІІб) – ту ж саму кількість необроблених лізатом ДК в 250 мкл ФБ і третьої (позитивний контроль, група ІІв) – 250 мкл ФБ.

Статистичний аналіз. Статистичну вірогідність визначали за t-критерієм Стьюдента. Вірогідними вважали значення при рівнях p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ.

Співробітниками лабораторії імунопатології Пітсбурзького інституту раку під керівництвом професора М.Р. Щуріна було показано, що введення тваринам з трансплантованою лімфомою EL-4 FLT-3 ліганду, синергісту таких гематопоетичних факторів, як ІЛ-3, ІЛ-6, ІЛ-7, ІЛ-11, ІЛ-12 та ГМ-КСФ, призводить до підвищення кількості ДК в пухлинній тканині та селезінці [Esche C. et al, 1998]. Але питання впливу розвитку лімфоми на диференціацію та функціональну активність ДК не досліджувалось і розробка цієї проблеми була покладена на нас.

При п/ш введенні клітин лімфоми EL-4 відмічали локальний ріст пухлини; при в/ч – частково обмежений ріст; при в/в – дисемінований ріст лімфоми. Нами було показано, що при п/ш трансплантації лімфомні клітини дисемінують переважно в шкіру та п/ш лімфатичні вузли. На 24-28-ту добу після п/ш трансплантації тварини гинуть без розвитку віддалених метастазів, локалізація пухлини обмежена місцем ін’єкції, пухлина інкапсульована. При в/ч введенні розвивається асцит і ріст лімфоми обмежений черевною порожниною та мезентеріальними лімфатичними вузлами. При в/в імплантації пухлинних клітин відбувається генералізація процесу. На 24-ту добу розвитку лімфоми тканина досліджуваних лімфатичних вузлів представлена здебільшого лімфомними клітинами. В селезінці нараховується до 10-20% лімфомних клітин.

При проведенні імуногістохімічних досліджень нами було відмічено, що на 7-му добу від початку експерименту кількість CD11c+ клітин підвищувалася в селезінці при п/ш та в/в введенні лімфомних клітин, в легенях – при в/ч та в/в введенні, в печінці – при в/в трансплантації. На 14-ту добу, незалежно від способу введення клітин EL-4, цей показник в селезінці та лімфатичних вузлах був нижчий за контрольний, в печінці та легенях вертався до вихідного рівня. При п/ш введенні лімфомних клітин на 7-му добу в пухлинній тканині з’являлися CD11c+NLDC-145– ДК, а на 14-й день ДК в пухлині не визначалися.

Кількість NLDC-145+ клітин в селезінці на 7-му добу не змінювалась, на 14-ту добу – знижувалась при п/ш введенні лімфомних клітин та підвищувалась при в/ч та в/в трансплантації. Кількість NLDC-145 позитивних клітин та щільність експресії NLDC-145 в лімфовузлах була значно меншою, ніж у інтактних тварин. В печінці, легенях та пухлині NLDC-145+ клітини не були виявлені в жодному разі.

Виявлене нами на 7-му добу деяке підвищення кількості CD11c+ клітин може вказувати на тимчасову активацію ДК мієлоїдного походження на ранніх етапах росту лімфоми. У всіх випадках кількість CD11c+, але не NLDC-145+, клітин знижується на 14-ту добу по відношенню до такої на 7-му добу, що свідчить про пригнічення активації ДК, виявлене нами на 7-му добу. Відмічене нами деяке збільшення кількості NLDC-145+ клітин в селезінці мишей при в/в та в/ч введенні лімфомних клітин на 14-му добу може бути пов’язане із збільшенням кількості макрофагів, які, за даними літератури, також експресують NLDC-145 [Hart D.N.J., 1997].

Функціональну активність АПК оцінювали за їхньою здатністю викликати проліферацію Т-лімфоцитів в алогеннній ЗКЛ. Нами було виявлено значне підвищення проліферативної активності Т-клітин при внесенні 105 АПК на лунку у випадку п/ш та в/о введення лімфомних клітин по відношенню до такої в контролі. В ЗКЛ з АПК тварин, яким клітини лімфоми перещеплювали в/в, показники реакції не відрізнялись від контрольних значень (показники для АПК інтактних тварин), але були вірогідно менші за такі при п/ш (локальний ріст лімфоми) та в/ч (частково обмежений ріст) введеннях пухлинних клітин (Рис. 1).

На 7-му добу росту лімфоми при в/в перещеплюванні було виявлене значне зниження кількості СДК, які експресують IAb. Кількість IAb+ СДК тварин з п/ш та в/ч введенням лімфомних клітин наближувалась до контрольного значення (СДК інтактних тварин) (Табл. 1).

Таблиця 1

Вплив характеру росту лімфоми на дозрівання СДК (цитофлуориметричне дослідження)

Групи тварин | Відсоток позитивних клітин

IAb | CD86 | CD11c

Контроль | 13.68 ±? 1.07 | 0.18 ± 0.06 | 4.72 ± 1.09

Дослід

(Характер

росту лімфоми) | 1 | 15.43 ± 2.03 | 0.21 ± 0.04 | 4.74 ± 0.74

2 | 6.65 ± 0.80???*** | 0.16 ± 0.03 | 4.92 ± 0.73

3 | 17.54 ± 2.62 | 0.27 ± 0.06 | 4.54 ± 0.41

Примітка: 1 – локальний ріст лімфоми; 2 – дисемінований ріст лімфоми; 3 – частково обмежений ріст лімфоми; контроль – АПК інтактних тварин. ***P < 0.001 - по відношенню до контролю.

Відомо, що ДК мієлоїдного походження експресують на своїй поверхні молекули головного комплексу гістосумісності (ГКГ), зокрема ІІ класу, представником яких є IAb; на противагу ДК щільність молекул ГКГ ІІ класу на мишачих макрофагах (МФ) низька. Завдяки високій експресії молекул ГКГ ІІ класу ДК є ефективними стимуляторами первинної Т-лімфоцитарної відповіді як в ало-ЗКЛ, так і в Аг-специфічних системах [Tourkova I.L. et al., 2002]. Найнижча функціональна активність АПК при в/в трансплантації EL-4, яку ми спостерігали, вочевидь пов’язана із зниженням кількості IAb+ СДК (вдвічі нижча за кількість IAb+ СДК інтактних тварин).

При всіх шляхах трансплантації EL-4 кількість CD86+CD11c+ клітин була близька до такої у інтактних тварин (Табл. 1). CD86, що експресується на зрілих ДК, є костимуляторною молекулою, яка бере участь в ДК-Т-клітинній взаємодії. CD11c відповідає за адгезивну взаємодію ДК з Т-лімфоцитами.

Нами було показано, що кількість та функціональна активність СДК залежать від характеру росту клітин лімфоми EL-4, зумовленому різними шляхами трансплантації пухлинних клітин. При в/ч та п/ш введенні лімфомних клітин, які забезпечують відповідно частково обмежений та локальний характер росту лімфоми, функціональна активність АПК селезінки вірогідно вища за таку при в/в трансплантації (генералізований ріст) та в контролі, тоді як показники функціональної активності АПК у випадку в/в трансплантації близькі до контрольних. При в/в введенні лімфомних клітин знижується кількість IAb+ АПК, виділених з селезінки. Нами вперше була простежена наявність CD11c+ ДК в різних органах в динаміці росту пухлини. Те, що на 7-му добу після трансплантації клітин лімфоми EL-4 в різних органах виявляються ДК, свідчить про їх тимчасову активацію. Проте на 14-ту добу активація ДК пригнічується у всіх піддослідних тварин, що виражається в різкому зниженні кількості CD11c+, але не NLDC-145+ клітин у всіх досліджуваних органах.

Оскільки, як було доведено, дозрівання та функціональна активність СДК і кількість ДК в пухлині, селезінці, печінці та легенях тварин залежать від характеру росту лімфоми, цілком слушно було проаналізувати, чи існує така ж залежність для культивованих КМДК (ДК з кістково-мозкових клітин-попередників). Нами були досліджені морфологічні особливості КМДК в культурі при різному характері пухлинного росту. Мишам лінії C57BL/6 трансплантували клітини лімфоми EL-4 п/ш та в/в. Контролем були інтактні миші. Кістковий мозок виділяли на 14-ту добу після введення лімфомних клітин. ДК культивували з кістково-мозкових попередників і на 6-ту добу культуру досліджували за допомогою інвертованого мікроскопу на наявність угрупувань (кластерів) ДК та готували препарати для цитоморфологічного аналізу.

На 6-ту добу культивування КМДК утворювали в культурі кластери, які є показником проліферативної активності клітин. Нами було відмічено, що кількість клітин в кластерах різнилась в залежності від способу трансплантації лімфомних клітин, який зумовлював різний характер пухлинного росту. Так, кластери ДК в контролі (інтактні тварини) і при п/ш введенні лімфоми (локалізований ріст) складались з 40-50 клітин з численними протрузіями цитоплазми, а при в/в (дисемінований ріст лімфоми) – тільки з 10-15 клітин. Ці зміни спостерігалися в усіх досліджуваних випадках, з чого можна зробити висновок, що вказане явище визначається саме характером пухлинного росту. Встановлено, що при фарбуванні за Папенгеймом ці клітини були розміром 15-20 мкм та мали багато витинів цитоплазматичної мембрани, сіро-фіолетову цитоплазму, овальне або бобоподібне ядро. В ядрі зрідка відмічалися ядерця. Морфологія ДК при дисемінованому характері росту лімфоми (в/в введення) не відрізнялася від такої в контролі та при локальному характері росту пухлини (п/ш введення лімфомних клітин). Морфологія КМДК цілком відповідає опису, поданому в літературі [Hart D.N.J., 1997, Steinman R.M., 1997]. В культурі також були присутні в невеликій кількості мононуклеарні клітини розміром 10-12 мкм, з сіро-фіолетовою цитоплазмою та округлим ядром, які могли бути недозрілими ДК.

Таким чином, нами було показано, що утворення кластерів КМДК в культурі залежало від характеру росту клітин злоякісної лімфоми EL-4 in vivo. Зокрема, при дисемінованому характері росту лімфоми ДК утворювали в культурі кластери значно менших розмірів, що свідчило про порушення проліферативної активності клітин-попередників ДК.

Для вивчення диференціювання та функціональної активності КМДК при розвитку лімфоми мишам лінії C57BL/6 вводили клітини лімфоми EL-4 п/ш, в/ч та в/в. Контролем були інтактні миші цієї ж лінії. На 14-й день після введення клітин лімфоми EL-4 тварин забивали та виділяли кістковий мозок (КМ). ДК культивували з КМ попередників. На 7-8-му добу культивування ДК визначали функціональну активність КМДК в ЗКЛ з Т-лімфоцитами, ізольованими з селезінок мишей лінії BALB/c. Для пояснення результатів аналізу функціональної активності КМДК, необхідно було проаналізувати їх антигенний профіль за допомогою цитофлуориметричного дослідження. Для цього клітини маркували міченими флуорохромами МКАТ (IAb, CD86, CD80, CD40, CD11c та CD11b).

Активація проліферації Т-клітин КМДК, ізольованими після п/ш імплантації лімфомних клітин, не відрізнялась від такої в контролі при всіх проаналізованих співвідношеннях цих клітин. При в/ч введенні клітин лімфоми EL-4 спостерігалося підвищення, у порівнянні з контролем, проліферативної активності Т-клітин, стимульованої ДК, при концентрації 104 клітин на лунку. При більш високих та більш низьких концентраціях Т-клітин рівень включення [3Н]-тимідину не відрізнявся від контрольних значень. При в/в трансплантації спостерігалося зниження включення [3Н]-тимідину при концентраціях 103 та 104 ДК на лунку. При концентраціях 101 – 102 та 105 ДК на лунку показники реакції не відрізнялись від таких в контролі (Рис. 2).

Суттєві відмінності у кількості зрілих КМДК по відношенню до КМДК інтактних тварин були помічені в усіх групах при різному характері росту лімфоми (Рис. 3). При в/в введенні лімфомних клітин кількість клітин, які експресують CD11c, CD11b, CD40, CD80 та CD86 була майже вдвічі нижча за таку в контролі. При п/ш трансплантації спостерігалося підвищення кількості CD86+, CD40+ та IAb+ клітин та зменшення кількості CD11b+ клітин. При в/ч введенні клітин лімфоми спостерігалося підвищення кількості CD40+, CD11c+ та IAb+ ДК по відношенню до такої в контролі. При цьому вірогідної різниці в кількості CD40+ та IAb+ при п/ш та в/ч введенні клітин EL-4 не було (Рис. 3).

При з’ясуванні зв'язку поверхневих молекул ДК з їх функціональною активністю необхідно зупинитись на наступних фактах. CD11c (p150/95) – маркер ДК мієлоїдного походження є b2 гетеродимером з родини інтегринів і зазвичай експресується на поверхні ДК з високою щільністю. Навпаки, CD11b експресується на ДК набагато слабше і його вважають маркером МФ. CD11c відповідає за адгезивну взаємодію ДК з Т-лімфоцитами, його експресія підвищується під впливом різноманітних запальних агентів. CD86 та CD80 (В7-1 та В7-2) є костимулюючими молекулами, які приймають участь в ДК – Т-клітинній взаємодії (на Т-лімфоцитах їм відповідає CD28). Різними дослідниками було показано, що при лімфомах людини та тварин, зокрема EL-4 лімфомі, слабка експресія молекул CD86 та CD80 призводить до Т-клітинної анергії за ІЛ-4 залежним механізмом [Cardoso A.A. et al., 1996, Dorfman D.M. et al., 1997]. CD40 є 33 kDa мембранним протеїном ІІ типу, членом родини фактору некрозу пухлин (ФНП). Він відіграє важливу роль в процесі диференціації ДК: продукція Т-клітинами CD40 – ліганда (CD40L) на протязі декількох годин після активації призводить до розвитку ДК з КМ клітин-попередників за рахунок блокування диференціації гранулоцитів та до стимуляції кінцевого дозрівання ДК [Steinman R.M. et al., 1997, Shurin M.R. et al., 2002].

На нашу думку, підвищення проліферативної активності Т-лімфоцитів в ЗКЛ при в/ч введенні лімфомних клітин зумовлене підвищенням кількості CD11c+ клітин. Пригнічення функціональної активності КМДК при в/в імплантації може бути пов’язане із зниженням кількості зрілих КМДК, тобто позитивних за IAb, CD80, CD86, CD40 та CD11с клітин.

Розбіжності в функціональній активності КМДК та експресії маркерів на поверхні їхньої цитоплазматичної мембрани при в/ч, п/ш та в/в трансплантації лімфомних клітин пов’язані з тим, що вогнища росту лімфоми в випадках в/ч та п/ш імплантації на ранніх стадіях росту локалізовані в місці введення лімфомних клітин і вони не контактують безпосередньо з ДК або їх попередниками. При в/в введенні відбувається генералізація пухлинного росту, що зумовлює безпосередній контакт ДК з клітинами лімфоми в кровотворних органах та в органах імунного захисту.

Таким чином, нами було показано, що диференціювання та функціональна активність ДК, культивованих з КМ клітин-попередників, залежать від характеру пухлинного росту, який зумовлюється різним способом введення лімфомних клітин. А саме, при дисемінованому рості лімфоми (в/в введення лімфомних клітин) спостерігалось суттєве пригнічення кількості зрілих КМДК по відношенню до такої у інтактних тварин, та більш низька функціональна активність КМДК в порівнянні з функціональною активністю КМДК тварин з в/ч та п/ш трансплантацією лімфомних клітин. При локальному характері росту пухлин (п/ш трансплантація) відмічено підвищення кількості CD86+, CD40+ та IAb+ клітин та зменшення експресії CD11b по відношенню до контрольних значень на КМДК інтактних тварин. Функціональна активність цих клітин за результатами ЗКЛ суттєво не відрізнялася від контрольної. У тварин з частково обмеженим ростом лімфоми (в/ч трансплантація клітин EL-4) була підвищена активність КМДК в ЗКЛ та кількість CD40+, CD11c+ та IAb+ КМДК по відношенню до такої у інтактних тварин.

Для визначення впливу сингенних КМДК, оброблених лізатом з клітин лімфоми, на дозрівання ДК реципієнтів та на розвиток лімфоми, яку їм перещеплювали, тваринам трансплантували клітини лімфоми EL-4 п/ш та в/в. На 7-му, 10-ту та 14-ту добу від початку експерименту тваринам вводили оброблені пухлинним лізатом КМДК так, як було вказано вище. У тварин з п/ш трансплантацією кожні 2 доби, починаючи з 7-ї доби від трансплантації лімфомних клітин до моменту загибелі тварин, вимірювали розмір пухлин. На 24-ту добу від початку експерименту у тварин досліджували мазки-відбитки з селезінки, лімфатичних вузлів, печінки, кісткового мозку, пухлинної тканини, та виділяли кістковий мозок. ДК культивували з КМ клітин-попередників та на 7-му добу культивування відбирали для цитофлуориметричного дослідження.

На 24-ту добу від початку експерименту відмічали значне зменшення серед кількості IAb+ та CD11b+ клітин в усіх досліджуваних випадках по відношенню до негативного контролю, зменшення кількості CD86+ клітин тварин з груп Ів та ІІв, CD80+ та CD11c+ ДК тварин з груп Іа, Ів та ІІв в порівнянні з кількістю КМДК інтактних тварин (Рис.4). При цьому кількість IAb+ клітин у тварин, яким вводили оброблені лізатом КМДК (групи Іа та ІІа), була вірогідно вища, ніж така у тварин з груп позитивного контролю (групи Ів та ІІв відповідно). Кількість CD86+ клітин у тварин з груп Іа та ІІа була близька до контрольного рівня. Кількість CD80+ КМДК мишей, які отримували в/в сингенні КМДК, що контактували з лімфомними антигенами, також наближувалась до рівня в контролі, а кількість CD11c+ в цій групі навіть мала тенденцію до зростання. Кількість CD40+ клітин у тварин з груп Ів та ІІв наближувалась до контрольних значень, а у тварин з груп Іа та ІІа мала тенденцію до зростання (Рис. 4).

Рис.4 Дозрівання КМДК тварин-реціпієнтів в залежності від характеру росту пухлини та від введення сингенних КМДК, які контактували з пухлинним лізатом.

* P < 0.05, ** P < 0.01, ***P < 0.001;

Контроль – КМДК інтактних тварин;

Іа – локальний ріст лімфоми EL-4, оброблені лізатом КМДК вводили внутрішньопухлинно; Ів – локальний ріст лімфоми EL-4, вводили лише ФБ; ІІа – дисемінований ріст лімфоми EL-4, оброблені лізатом КМДК вводили внутрішньовенно; ІІв – дисемінований ріст лімфоми EL-4, вводили лише ФБ.

1 – аналіз вірогідності по відношенню до контролю; 2 – аналіз вірогідності групи ІІа по відношенню до групи Іа; 3 – аналіз вірогідності групи Іа по відношенню до групи Ів; 4 – аналіз вірогідності групи ІІа по відношенню до групи ІІв.

Тварини з локальним характером росту лімфоми при п/ш трансплантації лімфомних клітин гинули на 24 – 27 добу після початку експерименту незалежно від введення ДК оброблених або необроблених лізатом та ФБ, при чому динаміка росту пухлин не відрізнялась суттєво в усіх досліджуваних групах. І хоча кількість IAb+CD86+CD11b+ клітин в групі Іа була вірогідно вища за таку в групі Ів, проте в цілому ми спостерігали зменшення кількості зрілих КМДК у тварин груп Іа та Ів.

Безпосередній позитивний вплив введення сингенних КМДК, які контактували з пухлинним лізатом, спостерігався при в/в трансплантації. При цьому тварини, яким вводили ФБ та такі, що одержували необроблені сингенні КМДК, гинули майже одночасно на 24 – 26 добу від початку експерименту. Проте у тварин, яким вводили КМДК, що контактували з пухлинним лізатом, відмічена тенденція до більш тривалого виживання: від 29 – 37 діб до 1,5 місяців, що, на нашу думку, може бути пов’язане з відновленням дозрівання КМДК тварин цієї групи.

Так, кількість зрілих КМДК у тварин з пухлинами, яким вводили оброблені пухлинним лізатом сингенні КМДК в/в, суттєво відрізнялась від такої в тих випадках, коли мишам вводили ФБ або трансплантували внутрішньопухлинно КМДК, які контактували з пухлинними антигенами, (Рис.4). А саме: в групі ІІа спостерігалась вірогідно вища по відношенню до групи Іа експресія CD80 і CD11c та тенденція до підвищення експресії CD11b i CD40, а по відношенню до групи ІІв вірогідно вища експресія всіх досліджуваних маркерів (IAb, CD86, CD80, CD40, CD11b та CD11c).

Отже, нами було показано, що найефективніший вплив сингенних КМДК, які контактували з пухлинними антигенами, відмічався при в/в їх застосуванні, що можна пояснити явищем хоумінгу (homing) ДК. При попаданні в венозне русло ДК мігрують до легенів, печінки та селезінки. Саме в селезінці ДК, які одержали антигени (Аг) з пухлинного лізату, можуть спричинити Т-лімфоцитарну відповідь. При внутрішньопухлинному введенні КМДК, які контактували з пухлинними антигенами, частина трансплантованих клітин гине під впливом пухлинних факторів, і лише незначна кількість КМДК потрапляє в капілярний кровотік та викликає протипухлинну відповідь. Це пояснює вірогідно вищу експресію IAb, CD86, CD11b та CD11c на поверхні КМДК у тварин групи ІІа по відношенню до такої у тварин, яким вводили ФБ.

Таким чином, імунофенотип КМДК, виділених від тварин, яким вводили препарат з КМДК, що контактували з пухлинними антигенами, відрізняється від такого у тварин, яким вводили ФБ, за експресією ряду поверхневих антигенів. А саме, в групі Іа та ІІа експресія IAb, CD86 та CD11b нижча за таку на КМДК інтактних тварин, але вірогідно вища за експресію вказаних Аг на КМДК тварин з груп Ів та ІІв відповідно. Кількість клітин, які експресують CD80, в групі ІІа наближується до такої в негативному контролі, а клітин, які експресують CD40 та CD11c навіть вища за контрольні значення. В/в введення ДК, оброблених лімфомним лізатом, значно відрізняється від внутрішньопухлинного, що видно за результатами виживаності тварин (хоча дослідження виживаності тварин не входило до задач нашого дослідження) та змінами кількості зрілих КМДК, виділених з кісткового мозку таких тварин, по відношенню до КМДК тварин з групи Іа. А саме: кількість CD80 та CD11c позитивних клітин від тварин групи ІІа вірогідна вища за таку в групі Іа, а кількість клітин, які експресують CD11b та CD40, має тенденцію до зростання.

Таким чином, кількість та функціональна активність ДК, виділених з селезінки та генерованих з КМ клітин-попередників, залежить від характеру пухлинного росту. Дозрівання КМДК порушується під впливом лімфомних клітин. Кількість ДК в пухлинній тканини, селезінці, печінці та легенях тварин знижується в динаміці росту пухлини. Найбільш виражені порушення диференціювання, дозрівання та функціональної активності ДК виявлені при дисемінованому характері росту лімфоми EL-4, що зумовлено безпосереднім контактом пухлинних клітин з ДК та їх попередниками в кістковому мозку, лімфатичних вузлах та селезінці. При трансплантації сингенних КМДК, які контактували з лімфомними антигенами, спостерігалось відновлення дозрівання КМДК тварин-реципієнтів, найбільш виражене при в/в введенні сингенних КМДК.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і розкриті нові аспекти взаємодії ДК та пухлини: диференціації та функціональної активності ДК кістково-мозкового походження на моделі Т-клітинної лімфоми EL-4.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.