НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біології клітини

Стасик Олег Володимирович

УДК 577.214:582.282.23:576.311.34

ІДЕНТИФІКАЦІЯ ГЕНУ GCR1, ЩО КОНТРОЛЮЄ КАТАБОЛІТНУ РЕПРЕСІЮ У МЕТИЛОТРОФНИХ ДРІЖДЖІВ

HANSENULA POLYMORPHA

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2004

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті біології клітини НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України,

Сибірний Андрій Андрійович,

Інститут біології клітини НАН України, директор, завідувач відділу молекулярної генетики і біотехнології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України,

Підгорський Валентин Степанович,

Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, директор, завідувач відділу фізіології промислових мікроорганізмів;

доктор біологічних наук,

Луцик Максим Дмитрович,

Інститут біології клітини НАН України,

пров. наук. співр. відділу регуляції проліферації клітин.

Провідна установа: Інститут фізіології рослин та генетики НАН України, м. Київ

Захист відбудеться "11" червня 2004 року о 1400 на засіданні спеціалізованої вченої ради К35.246.01 при Інституті біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Iнституту бiології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат розісланий "7" травня 2004 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Д. В. Федорович

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження молекулярних механізмів, що лежать в основі регуляції метаболізму та гомеостазу органел еукаріотичної клітини, є актуальною проблемою сучасної клітинної біології. Основним регуляторним механізмом, що забезпечує адаптацію метаболізму до змін навколишнього середовища у мікроорганізмів, є диференційна регуляція транскрипції генів. Важливими факторами, що викликають таку регуляцію, є різноманітні стресові умови, а також наявність у середовищі того чи іншого джерела азоту та вуглецю. Так, наприклад, присутність в середовищі глюкози, яка є “фаворитним” ростовим субстратом для більшості мікроорганізмів, викликає репресію транскрипції декількох груп генів за механізмом, відомим під назвою “катаболітна репресія” (Magasanik, 1969). Хоча на сьогодні досягнуто значного прогресу у встановленні молекулярного механізму явища катаболітної репресії у мікроорганізмів, декілька його ключових етапів залишаються нез’ясованими. В першу чергу це стосується еукаріотичних мікроорганізмів, зокрема дріждів, важливих для біотехнології та медицини.

Механізми катаболітної репресії досліджувались майже виключно на моделі пекарських дріжджів Saccharomyces cerevisiae. В той же час, молекулярно-генетичні дослідження інших, так званих неконвенційних видів дріжджів, також розпочали інтенсивно розвиватися, що зумовлено зростанням промислового значення цих організмів. Важливе прикладне та фундаментальне значення має дослідження механізмів катаболітної репресії на моделі метилотрофних дріжджів, здатних засвоювати токсичний метанол як єдине джерело вуглецю та енергії. Унікальною особливістю метилотрофних дріжджів є регуляція гомеостазу пероксисом вуглецевими субстратами: здатність до масивної проліферації цих органел у середовищі з метанолом та репресії їх біогенезу та швидкої деградації при додаванні глюкози чи етанолу. Таким чином, механізми катаболітної регуляції можуть досліджуватись на моделі метилотрофних дріжджів як на рівні окремих генів та білків, так і на рівні клітинних органел.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є частиною фундаментальних досліджень відділу молекулярної генетики та біотехнології Інституту біології клітини НАНУ за темами “Дослідження катаболітної репресії, індукції синтезу ферментів та їх інактивації як механізмів регуляції метаболізму метилотрофних дріжджів” (№ держ. реєстрації: 01940008021, Шифр теми 2.28.2.6., 1994-1997 рр.) та ”Молекулярні механізми регуляції гомеостазу пероксисом, біосинтезу флавінів і гетерологічних білків та захисту від стресу у неконвенційних дріжджів. (№ держреєстрації 0102V000613, Шифр теми 2.2.9.13, 2002-2005 рр.). Автор дисертаційної роботи є одним із виконавців вищеназваних досліджень.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було генетичне, біохімічне та ультраструктурне дослідження мутантів дріжджів H. polymorpha з пошкодженою катаболітною репресією та встановлення молекулярно-генетичної природи індукованих мутацій. Відповідно до мети, поставлені такі завдання:

1. Провести генетичний аналіз мутантів, нечутливих до глюкозної катаболітної репресії.

2. Дослідити у мутантів регуляцію пероксисомної алкогольоксидази (АО) та інших репресибельних ферментів глюкозою та іншими вуглецевими субстратами.

3. Встановити, чи пов’язане пошкодження глюкозної репресії у мутантів з пошкодженням метаболізму глюкози, або її транспорту у клітину.

4. Дослідити регуляцію процесу біогенезу пероксисом у мутантів різними вуглецевими субстратами.

5. Встановити, чи пошкоджують відповідні мутації індукований глюкозою процес катаболітної інактивації та деградації пероксидом.

6. Шляхом клонування встановити молекулярну природу одного з генів, що контролює глюкозну репресію у H. polymorpha.

7. Ідентифікувати природу мутації, що пошкоджує функцію гену, та сконструювати штам з делецією відповідного гену. Порівняти фенотип УФ-індукованого та делеційного мутантів.

Об’єктом дослідження даної роботи є явище та молекулярні механізми катаболітної репресії у метилотрофних дріжджів. Предметом дослідження цієї роботи є мутантні штами дріжджів H. polymorpha з пошкодженою глюкозною катаболітною репресією.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше ідентифіковано ген метилотрофних дріжджів (GCR1), що бере участь в механізмі глюкозної катаболітної репресії. Встановлено, що відповідний ген кодує білок, гомологічний до транспортерів глюкози та інших гексоз. Поряд з цим, послідовність продукту гену GCR1 (Gcr1р) має ряд унікальних особливостей, що відрізняють його від інших відомих транспортерів гексоз у дріжджів. Встановлено функціональну роль консервативного залишку серину-85 у послідовності Gcr1р, заміна якого призводить до модифікації функції Gcr1р, та сконструйовано штам з делецією відповідного гену.

Отримані біохімічні дані свідчать, що білок Gcr1 є імовірним сенсором глюкози, що бере участь в перших етапах передачі сигналу глюкозної репресії. У інших видів дріжджів транспортери глюкози не беруть безпосередньої участі в сигнальному механізмі репресії, - досі мало дослідженому процесі. Подальше дослідження молекулярного механізму функціонування Gcr1р становить значний інтерес для розуміння закономірностей передачі сигналу від молекули-ефектора до наступних компонентів сигнального каскаду репресії у дріжджів.

Вперше описано мутанти H. polymorpha здатні до надсинтезу пероксисомної АО та конститутивного біогенезу пероксисом у середовищі з глюкозою та показано, що дисахариди мальтоза та сахароза мають незалежний від глюкозного сигнальний механізм репресії у H. polymorpha.

Вперше описано феномен “оберненої диауксії” та інгібування метанолом утилізації глюкози у gcr1 мутантів.

Вперше розроблено систему для флуоресцентного мічення пероксисом у H. polymorpha з використанням зеленого флуоресцентного білка.

Практичне значення одержаних результатів. Практичний інтерес становить використання отриманих штамів H. polymorpha з пошкодженою глюкозною репресією для продукції гетерологічних білків під промотором гену АО у середовищі з глюкозою, - більш зручним ніж токсичний метанол субстратом за умов масштабної ферментації.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом спільно з науковим керівником розроблено програму проведення досліджень, відібрано методи вирішення поставлених завдань та самостійно, або в деяких випадках спільно з іншими працівниками, виконано викладені в роботі експерименти. Встановлення нуклеотидної послідовності клонованого гену GCR1 та його мутантної форми проводилось дисертантом на базі лабораторії проф. Джеймса Крегга (Орегонський Інститут вищих студій, США), якому автор висловлює щиру подяку за сприяння у проведенні цих досліджень. Дослідження автофагійної деградації пероксисом з використанням методів флуоресцентної мікроскопії проводилось у співпраці з лабораторією проф. Мартена Венхауза (Біологічний центр університету м. Гронінген, Нідерланди). Автор також висловлює подяку к.б.н. Кулачковському О.Р. (біологічний факультет Львівського національного університету) за сприяння у проведенні електронномікроскопічних досліджень. Деякі експерименти по фізіологічному дослідженню мутантів проведено у співпраці з інж. Стасик О.Г. Результати вищевказаних досліджень опубліковано у спільних публікаціях. У процесі виконання дисертаційної роботи автором особисто проаналізовано наукову літературу за темою дослідження. Аналіз та обговорення планів та результатів досліджень, а також підготовку публікацій за темою дослідження проведено разом із науковим керівником.

Апробація роботи. Матеріали дисертації були представлені у вигляді тез та стендових доповідей на наступних наукових конференціях: Міжнародній спеціалізованій конференції по дріжджах Hansenula polymorpha HPWN-1 (Дюссельдорф, Німеччина, 2000), ХХІ Міжнародній спеціалізованій конференції по дріжджах ISSY-21 (Львів, 2001); зокрема у вигляді усних доповідей дисертанта на Конференції по транспорту та енергетиці дріжджів, SMYTE-12 (Карпач, Польща, 1993), ХІХ Міжнародній конференції по генетиці та молекулярній біології дріжджів (Ріміні, Італія, 1999), X Міжнародному Симпозіумі по дріжджах ISY-2000 (Арнхем, Нідерланди, 2000), Науково-практичній конференції Біофорум-2 (Лодзь, Польща, 2001), Конференції молодих науковців Інституту молекулярної біології НАНУ (Київ, 2001), Міжнародній літній школі “Від геномів до життя: структурні, функціональні та еволюційні підходи” (Каргезе, Франція, 2002) та Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті та тези 8 доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини (матеріалів і методів досліджень, результатів та їх обговорення), підсумків, висновків і списку літератури, що охоплює 167 найменувань. Роботу викладено на 128 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 31 рисункoм та 7 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи. У роботі використовували штами дріжджів: H. polymorpha генетичної лінії NCYC 495: AS8 (leu10), AS38 (met6), leu1-1, ade11, що були люб’язно надані доктором Пітером Садбері (Шеффілдський університет, Великобританія); сконструйовані автором штами met6 leu1-1, ade11 leu1-1; мутанти з пошкодженою глюкозною репресією: gcr1-1, gcr1-2, gcr1-3, отримані шляхом УФ-мутагенезу; мутант з делецією гену GCR1 (Dgcr1), штами з флуоресцентно міченими пероксисомами, що експресують модифікований зелений флуоресцентний білок.

Дріжджові штами вирощували при 37oС на багатому середовищі (YPD, 1 % дріжджовий екстракт, 1,5 % пептон, 2 % глюкоза, або на стандартному мінімальному середовищі (YNB, 0,67 % Yeast Nitrogen Base ("Difco", США), 0.5% сульфат амонію, 1 % глюкоза). Інші джерела вуглецю додавались в концентрації 1%, якщо не вказано інакше. Амінокислоти додавались до середовища в концентрації 50 мг/л. Агаризовані середовища містили 2 % агару.

Для виконання завдання дослідження використовували методи класичної та молекулярної генетики, біохімічні методи, а також методи електронної та флуоресцентної мікроскопії. Використані методи класичної та молекулярної генетики дріжджів H. polymorpha описані в Gellissen et al., 2001. Секвенування ДНК проводили на базі Відділення молекулярної біології Регіонального центру дослідження приматів (Бівертон, США), як описано в Stasyk et al., 2004.

Методи культивування бактерій E. сoli, ампліфікації та виділення плазмідної ДНК, а також використані молекулярно-генетичні методи описані в Sambrook et al.,1989, із використанням модифікацій у деяких випадках, згідно з інструкціями виробників ферментів та аналітичних наборів.

Визначення активностей ферментів метаболізму метанолу та гліколізу, та внутрішньоклітинних інтермедіатів гліколізу проводили як описано в Стасык и др., 1997. Дослідження транспорту глюкози клітинами дріжджів проводили згідно з методики Gamo et al., 1994. Методи електронної та флуоресцентної мікроскопії описані в Johnson et al., 1999.

Результати досліджень та їх обговорення.

Виділення та генетичний аналіз мутантів H. polymorpha, нечутливих до глюкозної катаболітної репресії.

УФ-індуковані мутанти з пошкодженою катаболітною репресією були виділені за здатністю рости на середовищі з метанолом, що містило антиметаболіт глюкози 2-дезоксиглюкозу. Штам дикого типу не здатен утилізувати метанол за таких умов, оскільки синтез ферментів метилотрофного метаболізму підлягає репресії 2-дезоксиглюкозою. Серед виділених резистентних штамів близько 50% виявляли активність АО при вирощуванні на середовищі з глюкозою. Таким чином, експресія гену АО у виділених мутантів є конститутивною і не вимагає індукції метанолом.

15 мутантів було схрещено зі штамом дикого типу з комплементарним маркером ауксотрофності. Усі отримані прототрофні диплоїди виявляли дикий фенотип – відсутність АО в клітинах, вирощених на середовищі з глюкозою. Таким чином, усі проаналізовані мутації виявились рецесивними.

Комплементаційний аналіз був проведений для чотирьох фертильних мутантів (усі leu10). Три з них було схрещено зі штамом дикого типу AS38 (met6), і серед спорового потомства відповідних диплоїдів відібрано сегреганти з мутантним фенотипом, що містили met6 маркер. Ці штами було схрещено з чотирма вихідними мутантами leu10 в усіх можливих комбінаціях. Всі отримані диплоїдні штами характеризувались конститутивним синтезом АО в середовищі з глюкозою. Отже, відповідні мутації є алельними та пошкоджують один ген, позначений як GCR1 (Glucose Catabolite Repression), (відповідні мутанти - gcr1).

Біохімічний та фізіологічний аналіз мутантів gcr1.

Аналіз активності репресибельних пероксисомних та цитозольних ферментів у gcr1 мутантів. Можна було припустити, що у мутантів, крім АО, буде порушеною катаболітна репресія також інших ферментів, оскільки використаний метод селекції мутантів (метилотрофний ріст в присутності 2-дезоксиглюкози) передбачає функціонування всього метаболічного шляху утилізації метанолу, в тому числі декількох ферментів, що підлягають репресії глюкозою (Sibirny et al., 1988).

Для трьох проаналізованих алельних gcr1 мутантів конститутивний синтез в середовищі з глюкозою без метанолу був встановлений, крім АО, для іншого пероксисомного фермента - каталази, і частково конститутивний синтез для цитозольних ферментів - формальдегіддегідрогенази і дигідроксиацетонкінази. Репресія інших цитозольних ферментів утилізації метанолу – форміатдегідрогенази і фруктозо-1,6-бісфосфатази – була пошкоджена в середовищі з глюкозою лише в присутності метанолу. Таким чином, існують деякі відмінності в характері пошкодження механізмів катаболітної репресії пероксисомних і цитозольних ферментів утилізації метанолу, причому для перших характерний повністю конститутивний синтез в середовищі з глюкозою. Крім вищевказаних ферментів утилізації метанолу, у мутантів була також пошкоджена глюкозна катаболітна репресія синтезу a-глюкозидази – ферменту утилізації мальтози, що підлягає глюкозній репресії у багатьох інших видів дрожджів. Таким чином, ген GCR1 бере участь в катаболітній репресії синтезу не лише ферментів метаболізму метанолу.

Виявилось, що мутанти gcr1 виявляли незвичайні властивості - рівень активності АО в клітинах мутантів, вирощених до середини експоненційної фази росту на середовищі з глюкозою, був у них навіть вищим, ніж в середовищі з метанолом. Такий фенотип у мутантів метилотрофних дріжджів з пошкодженою катаболітною репресією не був раніше описаний.

Визначення активності ключових ферментів утилізації глюкози у gcr1 мутантів. Швидкість росту мутантних штамів в середовищі з глюкозою є зниженою порівнянo зi штамом дикого типу. Час подвоєння біомаси в експоненційній фазі росту для штаму дикого типу становить 3 год, тоді як для gcr1 мутантів - 8-10 год. Було висловлене припущення, що мутації, які пошкоджують катаболітну репресію у мутантів, можуть бути пов’язані з одним із ферментів, що беруть участь в метаболізмі глюкози, і, як наслідок, призводити до сповільнення утилізації глюкози з середовища. Однак нами не було виявлено суттєвих відмінностей у питомих активностях ферментів метаболізму глюкози: гексокінази, фосфоглюкоізомерази, фосфофруктокінази (ферменти гліколізу) і глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (фермент пентозофосфатного циклу) у мутантів, вирощених в середовищі з глюкозою порівняно зі штамом дикого типу (Табл. 1).

Активності ферментів метаболізму глюкози у клітинах штаму дикого типу (WT) та gcr1-2 мутанта, вирощених до середини експоненційної фази росту у мінеральному середовищі з 1% глюкозою.

Таким чином, зниження швидкості росту мутантів у середовищі з глюкозою не є зумовлене пошкодженням однієї з проаналізованих ферментативних активностей.

Аналіз внутрішньоклітинного вмісту інтермедіатів гліколізу. Хоча активності ключових ферментів утилізації глюкози у мутантів не є зміненими, внутрішньоклітинні пули інтермедіатів гліколізу - глюкозо-6-фосфату, фруктозо-6-фосфату, фруктозо-1,6-бісфосфату та дигідроксиацетонфосфату у мутантів є зниженими при рості на глюкозі порівняно зі штамом дикого типу (Табл. 2).

Концентрації інтермедіатів гліколізу у клітинах штаму дикого типу (WT) та gcr1-2 мутанта, вирощених до середини експоненціальної фази росту у мінеральному середовищі з 1% глюкозою.

Цікаво відзначити, що зниження пулу фруктозо-1,6-бісфосфату у gcr1 мутантів є більш значним, порівняно з монофосфатами. Оскільки у gcr1 мутантів є зниженим пул глюкозо-6-фосфату, але не гексокіназна активність, можна припустити, що причиною зниження швидкості росту мутантів в середовищі з глюкозою є пошкодженя її транспорту в клітину.

Аналіз кінетики росту та впливу різних вуглецевих ростових субстратів на синтез АО. Субстрати, що утилізуються H. polymorphа, можна поділити на групи за ознакою здатності викликати репресію АО. Так, активність цього ферменту була нижчою рівня детекції у клітинах штаму дикого типу, вирощених на глюкозі, фруктозі, манозі, сахарозі, мальтозі, трегалозі, етанолі, ацетаті та дигідроксиацетоні як єдиних джерелах вуглецю. Активність АО була присутня в клітинах, вирощених у середовищі з метанолом, а також у середовищах з гліцеролом та ксилозою.

Виявилось, що для gcr1-2 та інших алельних мутантів є характерним пошкодження репресії АО в присутності деяких цукрів: глюкози, манози, трегалози, а також підвищений, порівняно зі штамом дикого типу, синтез ферменту у середовищі з ксилозою (Рис. 1). Поряд з цим, мутанти не відрізнялись від штаму дикого типу за репресією АО такими субстратами як етанол, ацетат, дигідроксиацетон, фруктоза, мальтоза і сахароза. Важливим було спостереження, що у всіх випадках пошкодження репресії корелює із сповільненням росту на відповідному вуглецевому субстраті (Рис. 1), а також зниженням пулів інтермедіатів гліколізу.

Слід зазначити, що такі вуглецеві субстрати, як гексози та дисахариди, мають спільні реакції катаболізму, зокрема гліколітичний шлях, але відрізняються за здатністю до репресії синтезу АО у gcr1-2 мутанта, а також за швидкістю росту, яку вони забезпечують. Таким чином, різниця в ефекті різних цукрів на ріст та синтез АО у gcr1-2 може бути зумовлена диференційованою участю продукту гена GCR1 у їх транспорті та передачі сигналу репресії.

Дослідження кінетики транспорту та поглинання глюкози з середовища у gcr1-2 мутанта. Встановлено, що швидкість поглинання глюкози з середовища (визначена за зміною її зовнішньоклітинної концентрації) клітинами gcr1-2 мутанта є зниженою, порівняно зі штамом дикого типу. Різниця є більш вираженою при низьких концентраціях глюкози в середовищі, наприклад при 5 мM концентрації глюкози становить 3.5 рази, і зменшується при підвищених концентраціях глюкози, наприклад при 55 мM становить 1.3 рази (Рис. 2). Початкова швидкість транспорту міченої по вуглецю 14C-глюкози клітинами мутанта також є залежною від її зовнішньоклітинної концентрації, причому дефект транспорту також є більш вираженим при низьких концентраціях глюкози (Рис. 2).

Аналогічний характер залежності пошкодження транспорту та поглинання глюкози з середовища від її зовнішньоклітинної концентрації вказує на те, що саме дефект транспорту є причиною сповільненого росту мутанта у середовищі з глюкозою. При зовнішньоклітинних концентраціях глюкози нижче 5 мМ gcr1 мутанти практично нездатні до росту. Очевидно, мутації у відповідному гені специфічно блокують високоафінний компонент транспортної системи глюкози H. polymorpha.

Аналіз впливу різних концентрацій зовнішньоклітинної глюкози та на ріст та синтез АО. Встановлено, що ступінь пошкодження репресії АО у gcr1-2 мутантa в середовищах з різними концентраціями глюкози не корелює з пошкодженням її транспорту при відповідних концентраціях. Так, при концентрації глюкози 55 мМ активність АО є найвищою (2.5 U/мг білка),

проти 2.0 U/мг при 5 мМ концентрації глюкози. В той же час існує кореляція між пошкодженням транспорту та сповільненням росту. Ці дані вказують на додаткову регуляторну функцію продукту гену GCR1 в механізмі репресії, не пов’язану безпосередньо з ефективністю транспортної системи гексоз.

Дослідження кінетики росту та утилізації вуглецевих субстратів при вирощуванні мутантів на сумішах вуглецевих субстратів. Згідно з класичною парадигмою катаболітної репресії (Magasanik, 1969) штам дикого типу H. polymorpha утилізує глюкозу в першу чергу при вирощуванні на суміші глюкози та метанолу. При цьому ферменти метаболізму метанолу підлягають глюкозній репресії. Виявилось, що для gcr1-2 мутанта є характерним зворотній порядок утилізації вуглецевих субстратів: глюкоза засвоюється лише після вичерпання метанолу з середовища (Рис. 3). Цей феномен, молекулярний механізм якого не встановлений, був названий нами “оберненою диауксією”, оскільки почергове засвоєння ростових субстратів мутантами відображається у диауксичному характері кривої росту.

Клонування та молекулярно-генетичний аналіз гену GCR1.

Клонування гену GCR1 методом функціональної комплементації та встановлення його нуклеотидної послідоності. З метою встановлення молекулярної природи gcr1 мутацій, ген GCR1 було виділено з бібліотеки (банку) генів H. polymorpha методом функціональної комплементації. Як реципієнтний штам використовували сконструйований gcr1-2 leu1-1 мутант. Ауксотрофний дефект по лейцину, зумовлений мутацією leu1-1, комплементується гетерологічним геном LEU2 S. cerevisiae, що міститься у плазмідах банку генів. Для позитивної селекції трансформантів з комплементацією gcr1-2 мутації був використаний дефект росту реципієнтного штаму на середовищі з низькими конценраціями глюкози (фенотип l-Glc-). Були отримані прототрофні колонії, здатні рости на мінімальному середовищі з 5 мМ глюкозою (фенотип Leu+ l-Glc+), які одночасно виявили відновлену репресію синтезу АО глюкозою (Aog-). З клітин, що походили від індивідуальних колоній, виділялась загальна ДНК, якою трансформували клітини E. coli штаму DH5a. З ампіцилін-резистентних колоній бактерій були виділені чотири індивідуальні плазміди, які були здатні функціонально комплементувати штам gcr1-2 leu1-1 при ретрансформації.

Рестрикційний аналіз чотирьох комплементуючих плазмід виявив ідентичні за розміром фрагменти PstI-PstI (2 т.п.н.) та SalI-SalI (1,2 т.п.н.), що локалізуються у ділянках геномної ДНК на всіх чотирьох плазмідах. Виявилось, що ці рестрикційні фрагменти знаходяться у фрагменті довжиною 3,3 т.п.н., присутньому у складі плазміди з найкоротшою вставкою, позначеній pOS22. Для цієї ділянки геномної ДНК була встановлена нуклеотидна послідовність. Комп’ютерний аналіз нуклеотидної послідовності цього фрагменту виявив єдину відкриту рамку зчитування (ORF) довжиною 1623 пар нуклеотидів, здатну кодувати білок довжиною 541 амінолислотних залишки – комплементуючий ген GCR1.

Аналіз амінокислотної послідовності білкового продукту гену GCR1 та її порівняння з комп’ютерними базами даних. Порівняння амінокислотної послідовності білкового продукту гену

GCR1 (Gcr1p) з комп’ютерними базами даних виявило значний ступінь гомології між Gcr1p та групою білків з різних організмів, що належать до великої родини транспортерів гексоз (Boles et al., 1996). У послідовності Gcr1p були ідентифіковані дванадцять імовірних трансмембранних доменів, що є характерними для усіх відомих транспортерів гексоз (Рис. 4).

Найвищу ступінь гомології до Gcr1p виявляють білки грибів з невстановленою функцією: з Aspergillus fumigatus, позначений ApHxt1p (69% ідентичності, 77% подібності), Amanita muscaria AmMst1p (47% ідентичності, 64% подібності), та Uromyces fabae UfHxt1p, 46% ідентичності, 63% подібності). Gcr1p є також на 44% ідентичним та 62% подібним до внутрішньої послідовності (не включаючи N-, та С-кінцевих регіонів) білка S. cerevisiae Snf3p, високоафінного сенсора глюкози (Ozcan et al., 1998). Інші білки з високим ступенем гомології включають: S. cerevisiae Rgt2p (42% ідентичності, 60% подібності), K. lactis Rag4p (41% ідентичності, 60% подібності) та Neurospora crassa Rco3p (40% ідентичності, 58% подібності). Gcr1p виявляє менш ніж 37% ідентичності до інших відомих білків родини транспортерів гексоз.

Еволюційне дерево, побудоване на основі ступеня гомології, свідчить, що Gcr1p є унікальним білком у дріжджів, оскільки є більш спорідненим до білків багатоклітинних грибів, і за цією ознакою не має аналогів серед відомих дріжджових транспортерів гексоз (Рис. 5).

Дріжджові гомологи Gcr1p,- ScSnf3p, ScRgt2p, KlRag4p, які формують окрему філогенетичну підгрупу (Рис. 5), є інтегральними білками плазматичної мембрани, що мають функцію сенсорів глюкози, але не функціональних транспортерів. Встановлено, що білки ScSnf3p, ScRgt2p беруть участь у сигнальному механізмі індукції транскрипції глюкозою, але не в механізмі репресії (Ozcan et al., 1996). Накладення послідовностей Gcr1p та його гомологів-сенсорів (включно з NcRco3p) виявило, що ТМ сегменти є найбільш консервативними структурами цих білків (Рис. 6).

Gcr1p та його найближчі гомологи-сенсори містять також декілька консервативних амінокислотних залишків, що не зустрічаються у відповідній позиції в послідовностях інших транспортерів гексоз. У послідовності Gcr1p відсутній видовжений C-кінцевий фрагмент, характерний для білків-сенсорів (Рис. 6). Однак, порівняльний аналіз С-кінцевої ділянки Gcr1p та відповідних ділянок його трьох гомологів, ScSnf3p, ScRgt2p та KlRag4p, виявив коротку послідовність амінокислотних залишків з обмеженою гомологією до так званого домену “глюкозного сенсора” (Рис. 6В). Консенсусною послідовністю для Gcr1p та згаданих гомологів є M/L-G-L/I-X4-K/R-G, з двома консервативними залишками гліцину (Gcr1p G520 та G527). Подібна послідовність не була ідентифікована у C-кінцевій ділянці жодного іншого транспортера гексоз з баз даних. Слід відзначити, що С-кінцеві ділянки ScSnf3p, ScRgt2p, NcRco3p та KlRag4p є гено-специфічними і виявляють гомологію лише в регіоні домену “глюкозного сенсора”.

Аналіз нуклеотидної послідовності промоторної ділянки гену GCR1. У промоторній ділянці гену GCR1була ідентифікована коротка рамка зчитування, так звана uORF, розміром 93 п.н. у позиції –146 п.н. у 5’-напрямку від ATG кодону старту трансляції гену GCR1, яка може відігравати регуляторну роль в його експресії. Чотири імовірних сайти (центри) зв’язування для Mig1-подібного білка-репресора транскрипції були ідентифіковані в промоторній ділянці в позиціях –24, –89, –105 та –335 п.н. вище кодону ATG. Консенсус-послідовність для цих імовірних центрів, (A/G)(A/G)AAAN1(C/G)TGGGG, узгоджується з послідовністю, встановленою для репресора ScMig1p (Klein et al., 1998). Можна припустити, що, подібно до ScSNF3 (Сelenza et al., 1988), експресія самого GCR1 гену може регулюватись глюкозою.

Ідентифікація мутації у гені GCR1, виділеному зі штаму gcr1-2

Молекулярна природа мутації у штаму gcr1-2 була встановлена шляхом виділення мутованого гену за допомогою ПЛР та визначення його нуклеотидної послідовності. Спочатку, для приблизної локалізації сайту мутації у алеля gcr1-2 декілька фрагментів плазміди pOS22, що містили різні ділянки GCR1 ORF, аналізувались на здатність функціонально комплементувати мутант gcr1-2. Очевидно, що комплементувати gcr1 мутацію можуть лише фрагменти, що містять певну частину GCR1 ORF, включно із сайтом мутації. Встановлена мінімальна ділянка GCR1 ORF, необхідна для комплементації gcr1-2 мутанта, містить 400 п.н. з 5’-кінця відповідного гену.

Для безпосереднього встановлення мутації загальна геномна ДНК штамів gcr1-2 leu1-1 та вихідного мутанта gcr1-2 leu10 була використана у ПЛР як матриця. Для виключення потенційної можливості появи помилок, внесених при ПЛР-ампліфікації, два незалежно отриманих ПЛР-фрагменти були секвеновані в обох напрямках. Після накладання послідовностей ДНК гену GCR1 дикого типу (з банку генів та вихідного штаму leu10) з послідовностями мутованих генів (gcr1-2 leu1-1 та gcr1-2 leu10) була ідентифікована точкова мутація, а саме транзиція С – Т у позиції 254 нуклеотидної послідовності GCR1 ORF (Рис. 7). Таким чином, ідентифікація мутації додатково підтверджує, що з банку генів було клоновано власне ген, пошкоджений у вихідного мутанта, а не ген, здатний до супресії його фенотипу.

Ідентифікована точкова мутація призводить до заміни амінокислотного залишку серину (S85) на залишок фенілаланіну у послідовності мутованого білка, як показано на Рис. 6 та Рис. 7. Слід зазначити, що амінокислотний залишок у цій позиції є консервативним у різних

транспортерів гексоз з баз даних. У більшості білків це є серин, у деяких транспортерів в цій позиції знаходяться аланін або гліцин. Таким чином, відповідний амінокислотний залишок є важливим для функціонування Gcr1р, і його заміна на ароматичний залишок фенілаланіну викликає мутантний фенотип.

Конструювання делеційного мутанта по гену GCR1 та аналіз його фенотипу

З метою отримання додаткового підтвердження, що клонована з банку генів ORF є власне геном GCR1, був сконструйований мутантний штам з делецією у цьому гені (gcr1) методом “генної заміни” (gene replacement) та досліджені його властивості. Для цього була сконструйована плазміда pOS29, в якій 1479 п.н. кодуючої ділянки GCR1 (а. з. 1 – 493) були замінені фрагментом з геном LEU2 S. cerevisiae (Рис. 8). Ця плазміда була оброблена рестриктазами HindIII та XbaI, що вищеплюють фрагмент довжиною 3.9 т.п.н., який містить ScLEU2, фланкований 5'- та 3'-послідовностями гену GCR1 (алель gcr1D::SLEU2). Цей фрагмент був трансформований у штам дикого типу leu1-1 met6 методом електропорації. Leu+ трансформанти відбирались на агаризованому мінеральному середовищі з сахарозою без лейцину та аналізувались на Gcr- фенотип. Частина (приблизно 30%) трансформантів були нездатні рости на середовищі з низькою 5 мМ концентрацією глюкози та виявляли активність АО на середовищі з 55 мМ глюкозою, тобто характеризувались фенотипом Gcr-, аналогічним до мутанта gcr1-2. Для підтвердження делеції гену GCR1 геномна ДНК, виділена з декількох трансформантів з фенотипом Gcr-, використовувалась у аналітичній ПЛР з двома парами праймерів, як показано на Рис. 8Б. ПЛР аналіз з такими парами праймерів підтвердив коректну хромосомну інтеграцію делеційної касети. Один із проаналізованих трансформантів з генотипом gcr1::SLEU2 leu1-1 met6 був використаний для подальших досліджень (позначений як gcr1).

gcr1 met6 штам був схрещений з точковим мутантом gcr1-2 leu1-1 і прототрофні клітини диплоїдного штаму виявляли фенотип Gcr-. Додатково, приблизно 1000 колоній спорового потомства цього диплоїда, вирощені на середовищі з сахарозою, переносились методом реплік на середовище з 5 мМ глюкозою. Жодна з них не була здатною рости за таких умов. Разом, фенотип Gcr- диплоїдного штаму та його спорового потомства є чітким доказом того, що gcr1-2 (Gcr1S85F) та gcr1 є мутантними алелями одного і того ж гену.

Для мутанта gcr1 є характерними також інші фенотипічні ознаки, встановлені для мутанта gcr1-2. Так, наприклад, gcr1 нездатний рости на середовищі з низькими концентраціями глюкози (Рис. 9).

Час подвоєння біомаси мутанта gcr1 у середовищі з глюкозою є збільшеним, однак цей фенотип є більш вираженим, ніж у точкового мутанта (Рис. 10).

Поряд з цим, максимальна пікова активність АО в середовищі з глюкозою в мутанта gcr1 є дещо нижчою, порівняно з gcr1-2. Делеційний штам також відрізнявся від точкового мутанта за ефектом фруктози на ріст та синтез АО (див. нижче). Таким чином, фенотип точкового та делеційного gcr1 мутантів не є ідентичним. Слід відзначити, що подібний феномен був встановлений для деяких УФ-індукованих мутантів по генах сенсорів глюкози ScSNF3 та NcRCO3, фенотип яких також був відмінний від відповідних делеційних штамів. Можна припустити, що відмінні фенотипи точкових мутантів, в тому числі Gcr1S85F, є зумовлені модифікацією функції відповідних білків, тоді як фенотипи делеційних штамів є результатом відсутності їх функції.

Структурне дослідження клітин gcr1 мутантів

Електронно-мікроскопічний аналіз пероксисом та імуноцитохімічна локалізація АО у клітинах мутантів gcr1. Клітини gcr1-2 та gcr1 мутантів з експоненційої фази росту в середовищі з глюкозою містять мікротільця - пероксисоми, що відсутні у вирощених в аналогічних умовах клітинах штаму дикого типу, але характерні для клітин при метилотрофному рості. Імуноцитохімічний аналіз свідчить, що АО, яка конститутивно синтезується у мутантів на середовищі з глюкозою, локалізується за таких умов у пероксисомах (Рис. 11).

Слід відзначити, що феномен конститутивної присутності пероксисом в клітинах мутантів з блоком катаболітної репресії, вирощених в середовищі з глюкозою, встановлений вперше. Таким чином, мутації в GCR1 гені пошкоджують не лише катаболітну репресію синтезу ферментів матриксу пероксисом, але й цілого ряду інших білків-пероксинів, необхідних для біогенезу цих органел.

Дослідження процесу автофагійної деградації пероксисом у gcr1 мутантів. З метою встановлення ролі GCR1 гену у процесі вакуолярної деградації пероксисом, або “пексофагії” (Klionsky, 2001) був проведений електронно-мікроскопічний аналіз клітин gcr1 мутантів, перенесених з метанольного середовища у середовище з глюкозою. На відміну від штаму дикого типу, у gcr1 мутантів кількість пероксисом на зрізах клітин залишалась практично постійною навіть через 6 годин після перенесення у глюкозне середовище. Слід враховувати, що процес пексофагії у мутантів може маскуватись за таких умов утворенням нових пероксисом внаслідок пошкодження репресії їх біогенезу глюкозою. Однак, деякі індивідуальні пероксисоми у клітинах мутантів були оточені додатковими шарами мембран, що є типовою ознакою перших етапів їх деградації (Leao and Kiel, 2003) (Рис. 11Д). Отже, щонайменше деякі етапи пексофагії у мутантів відбуваються і мутації у гені GCR1 не призводять до повного блоку деградації пероксисом. Дійсно, при перенесенні індукованих метанолом клітин мутанта з флуоресцентно-міченими пероксисомами у середовище з глюкозою флуоресцентний сигнал локалізувався як у перокисомах, так і у вакуолях. Очевидно, Gcr1p не бере безпосередньої участі у сигнальному механізмі глюкозної інактивації/деградації пероксисом.

Конструювання gcr1 штамів, що синтезують пероксисомну форму зеленого флуоресцентного білка (GFP-PTS1) під промотором гену АО та їх аналіз. З метою отримати підтвердження, що дефект репресії АО у gcr1 мутантів на різних вуглецевих субстратах відповідає зміненій транскрипційній регуляції промотора гену АО (PMOX) і супроводжується конститутивним утворенням пероксисом на відповідних субстратах, були сконструйовані штами, які ситезують пероксисомну форму зеленого флуоресцентного білка (GFP) під PMOX. Була сконструйована плазміда pOS18 – човниковий вектор для E. coli-H. polymorpha, що містить химерний ген EGFP-PTS1 під контролем PMOX. До послідовності EGFP з С–кінця була приєднана послідовність нуклеотидів дев’яти останніх амінокислот гену РЕХ8 метилотрофних дріжджів Pichia pastoris. С-кінцева ділянка РрPex8p містить триплет амінокислот AKL, так звану сигнальну послідовність пероксисомного транспорту першого типу (PTS1). Отримана плазміда є інтегративною і містить ген ScLEU2 як маркер селекції. Плазміда pOS18 була лінеаризована по унікальному сайту StuI в регіоні PMOX і трансформована у штам дикого типу leu1-1 та мутант gcr1-2 leu1-1 для інтеграції у геном за механізмом гомологічної рекомбінації. Були отримані мітотично-стабільні прототрофні трансформанти, позначені як wt (GFP-PTS1) (дикого типу) та мутантний gcr1-2 (GFP-PTS1). Також, шляхом генетичної рекомбінації був отриманий делеційний мутант з флуоресцентно-міченими пероксисомами,- gcr1 (GFP-PTS1).

Усі три сконструйованих штами були здатні експресувати GFP під контролем PMOX на середовищі з метанолом. За допомогою флуоресцентно-мікроскопічного аналізу in vivo виявлено, що вся клітинна флуоресценція локалізується у пероксисомах. У клітинах штаму дикого типу, вирощених на глюкозі, не спостерігалось жодного флуоресцентного сигналу. Поряд з тим, у клітинах мутанта gcr1-2, вирощених на усіх вуглецевих субстратах, репресія синтезу АО якими є у нього пошкодженою, були виявлені флуоресцентні пероксисоми (Рис. 12). Клітини штаму gcr1-2 (GFP-PTS1), вирощені на фруктозі, обох точкового і делеційного мутантів, вирощених у середовищах з сахарозою, мальтозою або етанолом, як і клітини штаму дикого типу, вирощені на усіх перелічених субстратах, не виявляли флуоресцентного сигналу. Виявилось, що мутант gcr1

(GFP-PTS1) також утворює флуоресцентні пероксисоми у середовищі з фруктозою (Рис. 12). Таким чином, ця гексоза має різний ефект на експресію PMOX у точкового та делеційного gcr1 мутантів.

Отже результати аналізу експресії GFP-PTS1 у мутантів gcr1 свідчать про пошкодження у них транскрипційної регуляції PMOX. Специфічний щодо вуглецевих субстратів фенотип мутантів gcr1 надає можливість їх використання як продуцентів гетерологічних білків під контролем PMOX. Така модифікована система експресії могла б об’єднати переваги регульованого ефективного PMOX з використанням дешевих субстратів-цукрів для росту та індукції штамів продуцентів (наприклад сахарози та глюкози відповідно), виключаючи використання токсичного метанолу у технологічному процесі.

ВИСНОВКИ

В результаті виконаної роботи ідентифіковано ген GCR1, що контролює глюкозну катаболітну репресію транскрипції генів у дріжджів H. polymorpha. Встановлено, що мутації у цьому гені, що кодує імовірний білок-сенсор глюкози, призводять до плейотропного фенотипу та глобальних змін у фізіології дріжджової клітини та регуляції гомеостазу органел пероксисом.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Стасык О.В., Кшеминская Г.П., Кулачковский А.Р., Сибирный А.А. Мутанты метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha с поврежденной катаболитной репрессией // Микробиология. –1997. – Т.66, №6 – С.755-760.

2. Стасик О.Г., Стасик О.В., Сибірний А.А. Регуляція вуглецевими субстратами промотора гену алкогольоксидази у мутантів дріжджів Hansenula polymorpha з пошкодженою катаболітною репресією // Біополімери і клітина. – 2002. – Т.18, №2 – С.155-161.

3. Стасик О.В., Сибірний А.А. Молекулярні механізми катаболітної репресії у дріжджів // Мікробіологічний журнал. – 2003. – Т.65, №3 – С.84-103.

4. O.V. Stasyk, O.G. Stasyk, J. Komduur, M. Veenhuis, J.M. Cregg, A.A. Sibirny. A hexose transporter homologue controls glucose repression in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // J. Biol. Chem. – 2004. – V.279, N 9. – P. 8116-8125.

5. O.V. Stasyk, A.V. Petryshyn, A.A. Sibirny. Impairment of glucose uptake as a possible cause of catabolite repression deficiency in mutants of methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Abstract of XII Small Meeting on Yeast Transport and Energetics (SMYTE-XII) – Karpach, Poland, 1994. – Folia microbiologica. – 1994. –V39 – P.545-546.

6. O.V. Stasyk, A.R. Kulachkovsky, J.M. Cregg,