7. O.V. Stasyk, O.M. Moroz, M.M. Maidan, O.G. Stasyk, A.R. Kulachkovsky, M.V. Gonchar, J.M. Cregg, A.A. Sibirny. Mutants of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha deficient in glucose repression as hosts for production of alcohol oxidase and heterologous proteins // Abstracts of X International Symposium on Yeasts. – Arnhem, The Netherlands. – 2000. – P.159.

8. O.V. Stasyk, A.R. Kulachkovsky, O.G. Stasyk, M. Veenhuis, J.M. Cregg, A.A. Sibirny. Hexose transporter/sensor homologue is involved in catabolite repression of peroxisome biogenesis in Hansenula polymorpha // Abstracts of XXI Specialized Symposium on Yeasts. – Lviv, Ukraine. – 2001. – P.21.

9. O.V. Stasyk, O.M. Moroz, M.M. Maidan, O.G. Stasyk, A.R. Kulachkovsky, M.V. Gonchar, J.M. Cregg, A.A. Sibirny. Mutants of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha as hosts for production of alcohol oxidase and heterologous proteins // Abstracts of Bio-Forum II. – Lodz, Poland. – 2001. – P.96.

10. O.V. Stasyk, A.R. Kulachkovsky, J.M. Cregg, A.A. Sibirny. Glucose repression in Hansenula polymorpha is controlled by the hexose transporter homologue // Abstracts of Conference for students, PhD students and young scientists on Molecular Biology and Genetics. – Kyiv, Ukraine. –2001. – P.21.

11. O.V. Stasyk. Glucose repression in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha is controlled by hexose transporter homologue // Abstracts of International Summer School “From Genome to Life” (Structural, Functional and Evolutionary approaches). – Cargese, France. – 2002. – P.53.

12. O.V. Stasyk, O.G. Stasyk, J. Komduur, M. Veenhuis, J.M. Cregg, A.A. Sibirny. Signalling for glucose repression in methylotrophic yeast Hansenula polymorpha involves hexose transporter/sensor homologue // Abstracts of First Ukrainian Congress for Cell Biology. – Lviv, Ukraine. –2004. – P.15.

АНОТАЦІЯ

Cтасик О.В. Ідентифікація гену GCR1, що контролює катаболітну репресію у метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 – клітинна біологія, цитологія, гістологія. – Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2004.

У дисертації подано результати генетичного, біохімічного та ультраструктурного дослідження мутантів з пошкодженою катаболітною репресією метилотрофних дріжджів H. рolymorpha.

Ідентифіковано ген GCR1, точкова мутація і амінокислотна заміна в якому (S85-F), або делеція якого призводять до плейотропного фенотипу. Мутації у гені GCR1 пошкоджують катаболітну репресію біогенезу пероксисом та синтезу ферментів метилотрофного та неметилотрофного метаболізму глюкозою, а також викликають пошкодження транспорту глюкози у клітину. Встановлено, що такі вуглецеві субстрати як етанол та сахароза мають GCR1-незалежний механізм репресії у H. рolymorpha. Ген GCR1 не бере безпосередньої участі у іншому індукованому глюкозою механізмі катаболітної інактивації та автофагійної деградації пероксисом.

Білковий продукт GCR1 гену (Gcr1p) є гомологом сенсорів та транспортерів глюкози з інших дріжджів та грибів. Gcr1p є єдиним відомим гомологом транспортерів гексоз, що бере участь у механізмі катаболітної репресії у дріжджів.

Ключові слова: метилотрофні дріжджі, глюкозна репресія, катаболітна регуляція, транспорт глюкози, сенсори глюкози, пероксисоми, клонування гену.

АННОТАЦИЯ

Cтасык О.В. Идентифицирование гена GCR1, контролирующего катаболитную репрессию у метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 – клеточная биология, цитология, гистология. – Институт биологии клетки НАН Украины, Львов, 2004.

В диссертации представлены результаты генетического, биохимического и ультраструктурного исследования мутантов з поврежденной катаболитной репрессией метилотрофных дрожжей H. рolymorpha.

Идентифицирован ген GCR1, точечная мутация и аминокислотная замена в котором (S85-F), или делеция которого обуславливают плейотропный фенотип. Мутации в гене GCR1 повреждают катаболитную репрессию биогенеза пероксисом и синтеза ферментов метилотрофного и неметилотрофного метаболизма глюкозой, а также вызывают повреждение транспорта глюкозы в клетку. Установлено, что такие углеродные субстраты как этанол и сахароза имеют GCR1-независимый механизм репрессии в H. рolymorpha. Ген GCR1 не принимает непосредственного участия в другом индуцированном глюкозой механизме катаболитной инактивации и автофагической деградации пероксисом.

Белковый продукт GCR1 гена (Gcr1p) является гомологом транспортеров и сенсоров глюкозы из других дрожжей и грибов. Gcr1p является единственным известным гомологом транспортеров гексоз, принимающим участие в механизме катаболитной репрессии у дрожжей.

Ключевые слова: метилотрофные дрожжи, глюкозная репрессия, катаболитная регуляция, транспорт глюкозы, сенсоры глюкозы, пероксисомы, клонирование гена.

SUMMARY

Stasyk O.V. Identification of the GCR1 gene that controls catabolite repression in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha – Manuscript.

Dissertation for the degree of Candidate of Biological Sciences, speciality 03.00.11 – cell biology, cytology and hystology. – Institute of Сell Biology, National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv, 2004.

The thesis describes results of genetic, biochemical and structural analysis of the mutants of methylotrophic yeast H. polymorpha deficient in catabolite repression.

Peroxisome biogenesis and synthesis of peroxisomal enzymes in H. polymorpha are under the strict control of glucose repression. The first known for H. polymorpha gene involved in glucose catabolite repression (GCR1) has been isolated by functional complementation. GCR1 deficiency leads to the pleyotropic phenotype and complex alterations in cell’s physiology. They include impairment of glucose repression of several repressible cytosolic and peroxisomal enzymes and constitutive peroxisome biogenesis in glucose-grown mutant cells. gcr1 mutants are also characterized by retarded growth in glucose medium, normal specific activities of enzymes of primary glucose metabolism but decreased intracellular levels of glycolytic intermediates, as well as affected glucose transport relative to the wild-type strain. The GCR1 gene is primarily involved in high-affinity glucose transport, as growth of gcr1 mutants at glucose concentrations of less than 5 mM and its transport into the cells are severely impaired.

In addition, gcr1 mutants exhibited phenomenon of methanol inhibition of glucose utilization and reverse order of carbon substrate utilization from methanol/glucose mixture cultures. The process of glucose-triggered autophagic degradation of peroxisomes is not blocked by mutations in the GCR1 gene.

In addition to glucose, mannose and trehalose fail to repress the peroxisomal enzyme, alcohol oxidase, and heterologous green fluorescent protein expressed under control of alcohol oxidase gene’s promoter in gcr1 mutant cells. It was also demonstrated that such carbon sources as ethanol, sucrose or maltose have GCR1-independent repression mechanism(s) in H. polymorpha, as these substrates continue to exert repression effect on AO synthesis and peroxisome biogenesis in gcr1 mutants.

Protein encoded by the GCR1 gene is homologous to glucose transporters and sensors from other yeasts and fungi. This is the only hexose transporter homologue known so far to participate in the repression mechanism in yeasts.

Glucose transport and repression defects in a UV-induced gcr1-2 mutant were found to result from a missense point mutation that causes substitution of a serine residue (S85) with a phenylalanine in the second predicted transmembrane segment of the Gcr1 protein. This single amino asid substitution leads to all observed mutant phenotypes. Glucose repression defect in a point gcr1-2 mutant was more pronounced relative to the constructed mutant deleted for the GCR1 gene. A deletion mutant was also deficient in fructose-triggered repression of alcohol oxidase synthesis and peroxisome biogenesis. Such difference between a point and deletion gcr1 mutants implies modified function of the protein in the UV-induced mutant.

The defect in AO repression did not correlate with a concentration-dependent glucose transport capacity, as AO levels were higher in cells fed with higher concentrations of glucose. This observation and other results of this study suggest that Gcr1p participates in early stages of signal transduction mechanism in glucose repression, acting as a putative glucose sensor.

Key words: methylotrophic yeasts, glucose repression, catabolite regulation, glucose transport, glucose sensing, peroxisomes, gene cloning.

Підписано до друку 06.05.2004 р.

Формат 60х90/16. Папір офсетний. Ум. друк. арк. 1,0

Наклад 100 прим. Зам. № 27

м. Львів, вул. Драгоманова 14/16, к. 3

ПП “Арк-Сервіс”, тел. 72-60-34