НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

САКАЛО Валентина Дмитрівна

УДК 581.1.134.19 : 577.152.2.4 : 631.811.98 : 633.63

МЕТАБОЛІЗМ САХАРОЗИ І ЙОГО РЕГУЛЯЦІЯ В РОСЛИНАХ З РІЗНИМ складом ЗАПАСНИХ ВУГЛЕВОДІВ

03.00.12 – фізіологія рослин

Автореферат дисертації на здобуття наукового

ступеня доктора біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України

Науковий консультант: | доктор біологічних наук,

академік НАН України, професор

Гродзинський Дмитро Михайлович

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України,

завідувач відділу біофізики та радіобіології

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, професор

Гуляєв Борис Іванович,

Інститут фізіології рослин і генетики

НАН України,

провідний науковий співробітник

відділу фізіології та екології фотосинтезу

доктор біологічних наук, професор

Булах Анатолій Андрійович,

Міжнародний Соломонів університет,

завідувач кафедри біології

доктор біологічних наук, професор

Кур’ята Володимир Григорович,

Вінницький державний педагогічний університет ім. М.Коцюбинського,

завідувач кафедри біології

Провідна установа: | Дніпропетровський національний університет

Захист відбудеться “16 ” грудня 2004 р. о 10.00 год.

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26. 212. 01 при Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м. Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (03022, м. Київ-22, вул. Васильківська, 31/17).

Автореферат розіслано “09” листопада 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради |

Є.Ю. Мордерер

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біосинтез і метаболізм сахарози, їх регуляція в онтогенезі є актуальними питаннями в сучасній фізіології рослин у зв’язку з важливою роллю цього дисахариду в життєдіяльності рослин та великим практичним значенням. Сахароза є носієм активованих гексоз, які з легкістю включаються в метаболізм без додаткових енергетичних витрат Курсанов, 1988, джерелом моносахаридів і сахаронуклеотидів, енергетичним ресурсом для біосинтетичних процесів Lalonde, 1999. Як високорозчинний дисахарид, сахароза є важливим компонентом у регуляції осмотичного тиску, вона здатна транспортуватись через біологічні мембрани такі, як плазмолема і тонопласт Giaquinta, 1980, що робить її багатофункціональною сполукою в рослинному організмі Koch, 1996. Найважливіша функція сахарози полягає в тому, що вона є основною транспортною формою вуглеводів більшості рослин, тобто зв’язуючим ланцюгом між органами, що синтезують і запасають асиміляти. Інтенсивність надходження сахарози із листків у запасаючі органи, її подальший метаболізм значною мірою визначають продуктивність рослин.

Важливою роллю сахарози диктується необхідність вивчення особливостей функціонування ферментних систем, які відповідають за її синтез і включення в коло метаболічних перетворень. Синтез сахарози в листках, який здійснюється ферментом сахарозофосфатсинтазою (СФС) значною мірою визначає подальший функціональний стан рослини. Тому особливо актуальними є питання, пов’язані з вивченням можливостей регуляції активності ферменту Jang et al., 1997, Perata et al., 1997, Pego et al., 2000. Включення сахарози в метаболізм запасаючих органів здійснюється сахарозосинтазою (СС), головна функція якої полягає в розщепленні сахарози з утворенням нуклеотиддифосфатцукрів (НДФЦ) субстратів для біосинтезу крохмалю, інших поліглюкозидів, що складають речовини клітинних стінок і забезпечують таким чином ростові процеси. Враховуючи той факт, що синтез НДФЦ здійснює і фермент пірофосфорилаза, актуальним є визначення ролі цих двох ферментних систем у регуляції крохмаленакопичення. З цією метою нами були вибрані рослини, що запасають крохмаль – картопля (Solanum tuberosum L.), кукурудза (Zea mays L.) та сахарозу цукровий буряк (Beta vulgaris L.), які є найважливішими сільськогосподарськими культурами в Україні.

Особливості функціонування сахарозосинтази, її ролі в регуляції вуглеводного метаболізму можна краще зрозуміти, вивчаючи активність очищенного ферменту і його молекулярних форм.

Вивчення можливостей регуляції активності ферментів, пов’язаних з синтезом і метаболізмом сахарози, може мати суттєве значення в розумінні шляхів інтенсифікації цукронакопичення у цукрового буряка, який є основним джерелом цукру в Україні. При вирощуванні цукрових буряків з ряду причин екологічного та економічного характеру ми не досягаємо того рівня цукристості, який генетично детермінований для даного сорту.

З метаболізмом цукрів пов’язані також глибокі біохімічні і структурні зміни, які відбуваються при природному старінні листків. Даних про гормональний контроль синтезу і метаболізму цукрів у зв’язку із старінням недостатньо Wingler et al., 1998, Harn et al., 1993. Регуляція вуглеводного метаболізму при старінні листків може бути визначальною в підвищенні біосинтетичного потенціалу цукрових буряків.

Оскільки СС включає сахарозу в метаболізм не тільки у вегетуючих рослинах, але і у коренеплодах що зберігаються, актуальною є регуляція активності ферменту з метою зниження втрат цукру. Регуляція фізіологічно активними речовинами (ФАР) ферментів, що відповідають за біосинтез сахарози і включення її в ланцюг біохімічних перетворень як у вегетуючих рослинах, так і при зберіганні урожаю, може бути вирішальною для розробки теоретичних основ підвищення продуктивності сільськогосподарських рослин. Всі ці моменти визначили мету і задачі даної роботи.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у рамках науково-дослідних робіт відділу біохімії рослин, потім генетичної інженерії Інституту фізіології рослин і генетики НАН України. Бюджетні теми: “Генетична і метаболічна регуляція диференціації клітин запасаючих тканин і органів рослин” (номер держреєстрації 76033016, 19751980), “Вивчення структури ДНК і особливості функціонування геному в онтогенезі запасаючих органів рослин” (номер держреєстрації 81015959, 19811985), “Вивчити регуляцію експресії структурних генів в онтогенезі рослин і розробити спосіб мікроклонального розмноження хмелю” (номер держреєстрації 01.86.0006641, 19861990), “Мінливість популяції мРНК в органогенезі рослин” (номер держреєстрації 01.9.10010064, 19911995), “Посттранскрипційні зміни РНК в процесі морфогенезу цукрового буряка і соняшника” (номер держреєстрації 0199U 000777, 19962000). Здобувач була керівником розділів даних тем. Частково робота виконувалась у рамках проектів ДКНТ: Державної науково-технічної програми 3.13 “Створення нових енергозберігаючих технологій для переробки і збереження сільськогосподарської продукції” напрямок 3.0 “Виробництво, переробка і збереження сільськогосподарської продукції” – “Вивчення порушення метаболізму коренеплодів цукрових буряків і розробка технології їх зберігання в несприятливих умовах” (19941996). Робота частково фінансувалась Міннауки України – “Вивчення впливу обробки посівів цукрових буряків регуляторами росту на активність ферментів метаболізму сахарози і продуктивність” – договір № 2.55 3р/15 Ф від 2.10.1997 р., АТ “Високий урожай” – договори 19981999р., “Біостим” – договір 2000 р. Здобувач була керівником даних проектів.

Мета і задачі дослідженнь. Основна мета роботи – встановити закономірності функціонування ключових ферментів вуглеводного метаболізму в онтогенезі рослин, що накопичують крохмаль або запасають сахарозу, і можливості їх регуляції фізіологічно активними речовинами в цукрових буряках для підвищення продуктивності і зниження втрат урожаю при зберіганні.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі головні задачі:

-

-

-

-

-

-

-

Об’єкт дослідження – вуглеводний метаболізм у рослинах, що накопичують в якості запасного продукту крохмаль або сахарозу.

Предмет дослідження – ферменти вуглеводного метаболізму – сахарозофосфатсинтаза, сахарозосинтаза, пірофосфорилаза, крохмальсинтаза, інвертаза, гексокіназа, фруктокіназа, глюкозо-6-фосфатізомераза, глюкозо-6-фосфатдегідрогенеза, їх активність і регуляція.

Методи дослідження – метод мічених атомів, хроматографія на папері, гель-фільтрація, іонообмінна хроматографія, електрофорез у ПААГ і денситометрія білків, біохімічні методи визначення білків, цукрів, фосфору, спектрофотометричне визначення НАДФ-Н+, подвійна імунодифузія, диференційне центрифугування.

Наукова новизна одержаних результатів. Експериментально обгрунтована роль СС у регуляції АДФГ-крохмальсинтази в бульбах картоплі і насінні кукурудзи. Отримано нові дані, які розширили уявлення про участь ферментних систем СС і пірофосфорилази в біосинтезі крохмалю.

Установлено наявність молекулярних форм сахарозосинтази, показано зміну їх вмісту і активності в онтогенезі кормових і цукрових буряків, вивчено кінетику реакцій, які каталізують ці молекулярні форми.

Отримані антитіла на очищену СС із коренеплодів буряків сорту Білоцерківська однонасіннева (БЦО-34), показано, що біохімічна гетерогенність молекулярних форм сахарозосинтази не супроводжується імунохімічними відмінностями, що СС різних сортів, гібридів і видів диких буряків відрізняється інтенсивністю і направленістю реакції, але не має імунохімічних відмінностей, тобто селекція на цукристість не пов’язана із структурними змінами ферментного білка. СС крохмальзапасаючих рослин має лише часткову гомологію з ферментом коренеплодів цукрових буряків.

Показана регуляція активності СФС цукрових буряків екзогенними гормонами (БАП, ІОК, ГК3, 2,4 Д).

Наведено фізіолого-біохімічне обгрунтування підвищення продуктивності цукрових буряків при обробці РРР – емістимом С та бетастимуліном через їх вплив на ферментні системи і оптимізовані терміни обробки. Показано, що залежно від сорту та термінів обробки посівів, емістим С дає збільшення урожаю на 1124,6%, збору цукру на 1026 %, бетастимулін – на 3,335,7 % та 10,733 % відповідно [Деклараційні патенти: № 39662, 2001; № 39663, 2001]. Допосівна обробка насіння емістимом С та бетастимуліном дає підвищення збору цукру на 1314 % [Деклараційний патент № 34684, 2001].

Установлено особливості регуляції СС цукрових буряків. Показано, що СС, на відміну від СФС, екзогенними гормонами (БАП, ІОК, ГК3, 2,4 Д) і РРР (емістимом С та бетастимуліном), не активується. Експериментально обгрунтовано, що процес цукронакопичення забезпечується регуляторною взаємодією цих двох ферментів, при якій СС активується сахарозою, що інтенсивно синтезується в листках.

Установлено зниження активності СФС при старінні листків цукрових буряків і показано можливість її регуляції екзогенними гормонами та РРР.

Показано, що основні втрати сахарози при зберіганні коренеплодів цукрових буряків у несприятливих умовах відбуваються за рахунок активації СС і установлена можливість інгібування ферменту ФАР: 0,2 % оксалін та 0,1 % триман знижують втрати сахарози в 1,52 рази.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані в роботі результати можуть бути використані як у фундаментальних дослідженнях, так і в практиці сільськогосподарського виробництва.

Дослідження ролі СС у біосинтезі НДФЦ в бульбах картоплі та насінні кукурудзи, метаболітного та білкового складу строми амілопластів роблять внесок у вирішення питань механізму і регуляції біосинтезу крохмалю. Функціонування очищеної СС коренеплодів цукрових буряків і її молекулярних форм, кінетика реакцій дають розуміння фізіологічної ролі ферменту в процесах цукронакопичення in vivo, що може бути використано при розробці молекулярних біотехнологій.

Активність ферментів синтезу і метаболізму сахарози – сахарозофосфатсинтази та сахарозосинтази різних сортів, гібридів і видів диких буряків може бути використана як додатковий показник у селекційній роботі.

Установлена можливість гормональної регуляції СФС цукрових буряків розкриває нову грань у функціонуванні цього ферменту і може бути додатковим критерієм при оцінці його фізіологічної ролі. Регуляція метаболічних процесів у старіючих листках робить внесок у фундаментальну проблему ролі вуглеводного обміну у запрограмованій загибелі клітин і має прикладне значення, пов’язане з регуляцією дозрівання.

Активація РРР ферменту синтезу сахарози – СФС, а через нього СС, безпосередньо пов’язана з продуктивністю цукрових буряків. Рекомендовані оптимальні терміни обробки листків буряків емістимом С і бетастимуліном для підвищення продуктивності культури. Регуляцію ФАР сахарозосинтази в коренеплодах, що зберігаються, доцільно використовувати в цукровиробництві для зниження втрат цукру. Дані, що викладені в дисертації, запропоновано використовувати в курсах лекцій з фізіології та біохімії рослин у ВУЗах.

Особистий внесок здобувача. Нові теоретичні і експериментальні ідеї, викладені в дисертації, належать здобувачу. Експериментальний матеріал, одержаний на бульбах картоплі, насінні кукурудзи, цукрових буряках, у тому числі розробка методик, теоретичні розрахунки при проведенні експериментів, інтерпретація та узагальнення даних проведені здобувачем особисто. Експериментальний матеріал з отримання антитіл виконаний у відділі імунології Інституту ендокринології і обміну речовин МОЗ України.

Особисто здобувачем проведено огляд та аналіз джерел наукової літератури за темою дисертації, статистичну обробку отриманих результатів.

Апробація роботи. Основні наукові результати за матеріалами дисертації були представлені на: VII з’їзді Українського ботанічного товариства (Донецьк, 1982), на III Всесоюзній конференції “Транспорт ассимилятов в растениях и проблема сахаронакопления” (Фрунзе, 1983), VIII з’їзді Українського ботанічного товариства (Івано-Франківськ, 1987), V Українському біохімічному з’їзді (Івано-Франківськ, 1987), II з’їзді Всесоюзного товариства фізіологів рослин (Москва, 1992), VI Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1992), II з’їзді Українського товариства фізіологів рослин (Київ, 1993), X Конгресі Європейського товариства фізіологів рослин (Італія, 1996), семінарі “Стан та перспективи вивчення і впровадження біостимуляторів росту рослин” (Вінниця, 1997), XI Конгресі Європейської федерації фізіологів рослин (Варна, 1998), V Міжнародній конференції “Регуляторы роста и развития растений” (Москва, 1999), IV з’їзді фізіологів рослин РАН (Москва, 1999), Міжнародній конференції “Фотосинтез і продуктивність” (Київ, 2002), III з’їзді Українського товариства фізіологів рослин (Тернопіль, 2002), V з’їзді фізіологів рослин РАН (Пенза, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 48 наукових праць, із них 28 статей у провідних фахових виданнях, 1 монографія (у співавторстві), 3 деклараційних патенти на винахід (Україна).

Об’єм та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 339 сторінках і складається із вступу, 7-ми розділів, заключення, висновків, списку використаної літератури, який включає 412 джерел, 51 таблицю, 47 рисунків.

об’єкти і методи досліджень

Дослідження ферментів вуглеводного метаболізму – крохмальсинтази, СС, пірофосфорилази проводили на бульбах картоплі (Solanum tuberosum L.) сортів Приєкульський ранній, Рання Роза, Гарнет Чилі та насінні кукурудзи (Zea mays L.) сорту ВІР-27 і його цукристого мутанта – ВІР-27 su. Для очистки СС використовували коренеплоди сорту БЦО-34. Активність СФС та СС вивчали в сортах і гібридах буряків (Beta vulgaris L.), які відрізнялись рівнем цукронакопичення, в мангольдах, видах Beta trigyna W. et K. та Beta mаritima L. Інвертазу, гексокіназу, фруктокіназу, глюкозо-6-фосфатізомеразу, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу, їх регуляцію при зберіганні коренеплодів вивчали в буряках сорту Білоцерківська однонасіннева-45 (БЦО-45). У роботі використовували коренеплоди в різні періоди онтогенезу і при зберіганні, а також листки, судинно-провідні пучки.

Посадковий матеріал картоплі отримували із науково-дослідного Інституту картоплярства УААН (Немішаєве), кукурудзи – із відділу експериментального мутагенезу Інституту молекулярної біології і генетики НАН України. Насіння буряків мангольдів, Beta trigyna W. et K., Beta mаritima L., гібриду Р ЧС-83 отримували із Інституту рослинництва ім. М.І. Вавилова (Росія), решту – із Інституту цукрових буряків УААН. Насіння, оброблене ФАР, а також препарати для обприскування посівів і обробки коренеплодів при зберіганні отримували із відділу регуляції росту і розвитку Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.

Вивчення впливу РРР на метаболізм і продуктивність цукрових буряків проводили в умовах вегетаційних та польових дослідів. Вегетаційні досліди закладали в 15-кілограмових посудинах Вагнера із внесенням поживної суміші ВНІЦ, розробленої в ІЦБ УААН (10–15-кратна повторність). Рослини обробляли розчинами емістиму С та бетастимуліну в концентрації 0,015 мл на 300 мл води, контроль – вода. Польові досліди проводили на полях Київської області с. Пінчуки –виробничий посів 1996 р., дослідного господарства ІЦБ УААН “Салівонківське” – 1997 р., господарства “Лосятинське” – 1998 р.; на полях Полтавської області господарство “Зелена Рутка” – 1999–2000 р.р. Дослідні ділянки площею 25 м2 закладали в 5-кратній повторності. Обробляли розчинами емістиму С та бетастимуліну в концентрації 0,075 мл на 1,5 л води.

Допосівна обробка насіння емістимом С, бетастимуліном та етамоном – 20 мл/т, препаратами похідних тетрагідротіофендіоксидів, що є аналогами природного біотину – 0,002 %-ми розчинами.

Вивчення гормональної регуляції ферментів метаболізму сахарози проводили в умовах вегетаційних дослідів. Обробку проводили у фазу 6–8 листків та в період інтенсивного цукронакопичення розчинами гормонів у таких концентраціях: БАП – 4 10-5 М, ІОК – 10-6, їх суміш (1:1); ГК3 – 100 мл/л, кінетин – 4 10-5 М, 2,4 Д – 10-5 М, контроль – вода. Всі гормони фірми “Serva”, Німеччина.

У дослідах in vitro з активації СФС і СС вміст в інкубаційній суміші кінетину, БАП, ІОК, 2,4 Д – 0,2 мкмоля, ГК3 – 1 мкмоль, емістиму С і бетастимуліну – 0,5–1,0 мкл. Для вивчення метаболізму сахарози при зберіганні коренеплоди отримували із Яготинського цукрового заводу і витримували їх при 20–23С протягом 2–10 діб, зважуючи для визначення втрати води (5–20 %).

Визначення активності ферментів. Гранулозв’язану крохмальсинтазу виділяли із бульб картоплі та насіння кукурудзи за модифікованим нами методом Мурати Murata T. et al., 1964. До складу інкубаційної суміші включали по 1 мкКюрі основного субстрату крохмальсинтази – АДФГ-14С (питома активність 263 мкКюрі/моль) або УДФГ-3Н (питома активність 8,3 мкКюрі/моль) (Amersham, Англія). Активність ферменту визначали за інтенсивністю включення глюкози із АДФГ-14С або УДФГ-3Н в крохмаль. Інтенсивність включення визначали на сцинтиляційному рахівникові (SL-40 фірми Інтертекнік з ефективністю рахунку для 14С – 98 %, для 3Н – 50 %.

Виділення амілопластів. Амілопласти із бульб картоплі у фазах бутонізації, цвітіння та дозрівання рослин виділяли двома методами: у водному та безводному середовищах. Безводна процедура виділення амілопластів проводилась за частково модифікованою нами методикою Liu, Shannon, 1981. Метаболіти амілопластів визначали: сахарозу Roe, 1954, фруктозу Somogyi, 1952, крохмаль Писаренко, 1971, фосфор Fiske, Subbarou, 1925. Білки виділяли за методом Dure, Chlan, 1981, визначали за Lowry et al., 1951, електрофорез проводили за Laemmly, 1970. Інтенсивність включення 14С-глюкози із 14С-сахарози в крохмаль визначали в інкубаційній суміші, яка містила препарати крохмальсинтази та сахарозосинтази, а із 14С-глюкозо-1-фосфату – крохмальсинтази та пірофосфорилази і необхідні для їх функціонування субстрати.

Сахарозосинтазу і пірофосфорилазу із бульб картоплі та насіння кукурудзи виділяли за частково модифікованою нами методикою Sowokinos, 1976. У середовище для виділення ферментів у цих культурах додавали натрійметабісульфіт для інгібування дифенолоксидазної активності. У середовище для виділення сахарозосинтази із цукрових буряків для інгібування поліфенолоксидаз вносили глутатіон або ДТТ, а також MgCI2. Активність СС визначали в реакції синтезу за кількістю утвореної сахарози Roe, 1954, в реакції розщеплення сахарози та інвертазу – за звільненою фруктозою Somogyi, 1952. Активність пірофосфорилази визначали за кількістю утвореної із 14С-глюкозо-1-фосфату АДФГ-14С (УДФГ-14С) після їх розділення на хроматографічному папері марки Filtrak 12, ідентифікації в ультрахеміскопі та елюції 0,1 N HCI.

Очистка сахарозосинтази коренеплодів цукрових буряків складалась із висолювання сульфатом амонію (30–50 %), гель-фільтрації на Сефадексі G-200. Оптичну густину білкових фракцій визначали при 280 нм на Specоrd M-40 (“Carl Zeiss”, Німеччина), їх сахарозосинтазну активність за синтезом сахарози. Фракції з максимальною активністю об’єднували, концентрували поліетиленгліколем (ПЕГ) (2,0 х 104 Д), очищали на іонообміннику ДЕАЕ-сефарозі CL-6B (“Pharmacia”, Швеція). Елюювали лінійним градієнтом концентрації NaCI (0–0,5 М) в 0,05 М тріс- HCI буфері, рН 7,5 з 1мМ ЕДТА і ДТТ, та 10 мМ MgCI2. Вимірювали оптичну густину фракцій та їх сахарозосинтазну активність. Концентровану ПЕГ фракцію піддавали електрофорезу в ПААГ для встановлення її чистоти Davis,1964. Молекулярну масу нативних білків визначали електрофорезом їх та стандартних білків у градієнтному гелі (пластини 2–16 та 4–30 % концентрації ПААГ) (“Pharmacia”, Швеція). Дослідні білки та стандарти забарвлювали 0,14 % розчином кумасі бриліантового голубого R-250, денситометрували при 585 нм СФ DU-8B (“Beckman”, США) і визначали електрофоретичну рухливість та молекулярну масу окремих білків.

При вивченні активності молекулярних форм СС після електрофорезу із пластини гелю вирізали вузьку смужку, забарвлювали її протягом 45 хв 0,14 % розчином кумасі бриліантового голубого R-250 і використовували як маркер для виявлення спектрів нативних білків, які екстрагували з геля тріс-HCI буфером, рН 7,5, концентрували ПЕГ; визначали білок. У деяких дослідах гель безпосередньо інкубували із субстратами. Для визначення молекулярної маси субодиниці СС, очищений білок дисоціювали в буфері, що містив 1 % Na-ДДС і 1 % -меркаптоетанол. Електрофорез проводили в гелі 12 % концентрації Laemmly, 1970. Для отримання антитіл використовували електрофоретично чистий фермент після елюції з гелю, із імунохімічних методів застосовували інгібування активності СС антитілами та подвійну імунодифузію за Охтерлоні 1979. Всі основні реактиви, використані в цій роботі, фірми “Serva” (Німеччина).

Виділення та визначення активності сахарозофосфатсинтази проводили за модифікованими нами відповідно до культури методами Lafta, Lorenzen, 1995, Huber, 1983. Буфер для екстракції: 50 мМ Мопс-NaOH, рН 7,5 з добавками 15 мМ MgCl2, 6 мМ ДТТ, 1 мМ ЕДТА, 0,1 % (w/v) тритону Х-100. Після цетрифугування при 20 000g 15 хв, супернатант знесолювали на Сефадексі G-25, центрифугували при 5 000g 5 хв і зразу ж використовували для визначення активності. Інкубаційна суміш формувалась при насиченому рівні субстратів. Активність визначали за кількістю утвореної сахарози [Roe, 1954] на 1 мг білка чи 1 г тканини в год.

Гексокіназу, фруктокіназу, глюкозо-6-фосфатізомеразу і глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу коренеплодів цукрових буряків виділяли за методикою Курсанов з співавт., 1989. Визначення активності проводили на СФ Specоrd M-40 (“Carl Zeiss”, Німеччина), при 340 нм за швидкістю утворення НАДФН, коефіцієнт молярної екстинції якого 6,2 х 103. В роботі використовували глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу фірми “Ferak” (Німеччина), інші реактиви фірми “Serva” (Німеччина). Визначення хлорофілу проводили за методом [Hiscox J.D., Izraelstam L.F.,1979], цукрів, цукристості Починок, 1976, Єрмаков і інш., 1972, площі листків Ничипорович і інш., 1961.

Статистичну обробку результатів проводили за Молостовим 1966, результатів польових дослідів за Доспеховим 1985.

Результати досліджень

Участь ферментів синтезу нуклеотиддифосфатцукрів в утворенні крохмалю в бульбах картоплі і ендоспермі насіння кукурудзи

У крохмальзапасаючих рослинах існують тісні метаболічні відносини між сахарозою і полісахаридом, тому що сахароза є джерелом АДФГ – субстрату для біосинтезу крохмалю. Від активності ферментних систем, які включають сахарозу в метаболізм, значною мірою залежить процес крохмаленакопичення в сільськогосподарських культурах. На період початку наших досліджень питання участі двох ферментів, які постачають НДФЦ для крохмальсинтази – сахарозосинтази і пірофосфорилази, залишалось суперечливим, і панувала точка зору, що АДФГ синтезується, в основному, АДФГ-пірофосфорилазою Gustafson, Gandler, 1972, Turner, 1969, Sowokinos, 1976. Вивчення регулюючої ролі ферментів, які беруть участь у біосинтезі крохмалю, було проведено на рослинах, що відрізнялись рівнем крохмаленакопичення (сорти картоплі) та спрямованістю на біосинтез крохмалю або сахарози (генотипи кукурудзи). У звязку з тим, що ферменти СС і пірофосфорилаза переважно синтезують УДФГ, а в біосинтезі крохмалю бере участь, в основному, АДФГ, важливим було вивчення їх функціонування з різними нуклеотидди- і трифосфатами. Порівняльне вивчення активності сахарозосинтази з двома субстратами – УДФ і АДФ в онтогенезі бульб картоплі показало, що фермент здатний утворювати АДФГ, інтенсивність цього процесу корелює з крохмалеутворенням (рис. 1) Сакало, Горовая, 1979. Вивчення кінетики реакції, яка каталізується СС з АДФ, показало, що криві субстратного насичення є сигмоподібними, що характерно для регуляторних ферментів. |

Рис. 1. Активність сахарозосинтази в онтогенезі бульб картоплі (розщеплення сахарози):

1 сахароза + УДФ (2,5 мкмоль);

2 сахароза + АДФ (5 мкмоль).

Разом з тим, у бульбах картоплі присутня і АДФГ- (УДФГ-) пірофосфорилаза, максимальна активність якої теж корелює з процесом крохмалеутворення (рис. 2) Сакало, Горовая, 1979. Але невисока активність пірофосфорилази свідчить про те, що один цей фермент не може забезпечити того рівня біосинтезу крохмалю, який ми спостерігаємо в бульбах картоплі (табл. 1) Сакало, Горовая, 1979. |

Рис. 2. Активність АДФГ- і УДФГ-пірофосфорилаз в онтогенезі бульб картоплі:

1 УДФГ-пірофосфорилаза;

2 АДФГ-пірофосфорилаза.

Для інтенсивного крохмаленакопичення необхідна участь двох систем, що синтезують АДФГ – пірофосфорилази і СС. Це положення було підтверджено нами на сортах картоплі, які відрізнялись рівнем накопичення крохмалю. З цією метою брали генетично чистий матеріал бульб картоплі напівкультурного сорту Гарнет Чилі (6–7 % крохмалю) і отриманого із нього шляхом самозапилення культурного сорту Рання роза (15–16 % крохмалю).

Таблиця 1

Питома активність АДФГ-14С- і УДФГ-3Н-крохмальсинтази в онтогенезі бульб картоплі (сорт Приєкульський ранній)

Строки відбору зразків | Варіант | Інтенсивність включения міченої глюкози

(на 1 мг білка за 1,5 год)

Імп/хв х 106 | Пікомолі

22.06

13.07

27.07

13.07

27.07

17.08 | АДФГ-14С

УДФГ-3Н | 1,84 0,092

4,32 0,238

5,10 0,335

0,006 0,001

0,007 0,0007

0,003 0,0004 | 3182

7475

11882

0,27

0,31

0,15

Включення 14С-глюкози із 14С-глюкозо-1-фосфату в крохмаль, що здійснювалось сумісною дією АДФГ – пірофосфорилази і крохмальсинтази, у низькокрохмалистого сорту Гарнет Чилі йде в 15–20 разів слабіше порівняно з Ранньою розою (табл. 2) Лобов, Сакало, Подгаецкий, 1984.

Таблиця 2

Інтенсивність включення 14С-глюкози із 14С-глюкозо-1-фосфату і 14С-сахарози в крохмаль бульб картоплі (імп/хв х 104 на 1 г свіжої тканини 1,5 год)

Сорт | Варіант досліду |

Бутонізація | Цвітіння | Дозрівання

Гарнет Чилі

Рання роза | 14С-глюкозо-1-фосфат+АТФ | 0

84,06,0 | 4,00,2

85,010,0 | 12,01,5

180,020,0

Гарнет Чилі

Рання роза | 14С-сахароза+ АДФ | 0

81,00,1 | 0,20,01

1,00,1 | 0,90,04

1,60,2

Включення 14С-глюкози із 14С-сахарози в крохмаль, що здійснювалось сумісною дією СС і крохмальсинтази, у сорту Гарнет Чилі в 1,5–5 разів нижче ніж у Ранньої рози. Пірофосфорилаза і СС проявляють найбільш високу активність у бульбах високо-крохмалистого сорту Рання роза і у фазу бутонізації з однаковою інтенсивністю здатні включати глюкозу в крохмаль.

Координація ферментних систем при біосинтезі крохмалю показана і для насіння кукурудзи сорту ВІР-27 та його цукристого мутанта ВІР-27 su, в якому блокується перехід простих цукрів у крохмаль, у результаті чого їх вміст у 10–15 разів більший, ніж у вихідній формі. Активність АДФГ-крохмальсинтази в обох генотипах кукурудзи вища ніж з УДФГ в якості субстрату (рис. 3) Сакало, Лобов, 1983, але у ВІР-27 su вона низька і підвищується тільки на 50-й день після запилення. |

Рис. 3. Активність крохмальсинтази насіння кукурудзи:

1 – АДФГ-;

2 – УДФГ-крохмальсинтаза ВІР-27;

3 – АДФГ-;

4 – УДФГ-крохмальсинтаза ВІР-27 su.

Для забезпечення синтезу крохмалю через АДФГ-крохмальсинтазу необхідно постійне надходження АДФГ. У насінні кукурудзи присутні як СС, так і пірофосфорилаза, що здатні її утворювати, але інтенсивність синтезу АДФГ пірофосфорилазою у генотипів практично не відрізнялась (табл. 3) Сакало, Лобов, 1983. Крім того, в них не було чіткої кореляції між рівнем активності пірофосфорилази і синтезом крохмалю. Тому у генотипів кукурудзи синтез крохмалю значною мірою залежав від інтенсивності синтезу АДФГ сахарозосинтазою, активність якої в ВІР-27 su в 2 раза нижча і корелює з рівнем АДФГ-крохмальсинтази.

У ВІР-27 su зниження утворення АДФГ сахарозосинтазою пов’язано з підвищенням у 10–15 разів активності ферменту в напрямку синтезу сахарози. Отримані дані свідчать про те, що регуляцію крохмального синтезу здійснює не тільки АДФГ-пірофосфорилаза, але і СС, оскільки зміна в направленості активності ферменту, викликана мутацією, призводить до зниження активності крохмальсинтази.

Таким чином, фізіологічна роль СС у бульбах картоплі та насінні кукурудзи – каталізувати розщеплення сахарози і, утворюючи АДФГ, регулювати активність крохмальсинтази. Високий рівень крохмаленакопичення може забезпечити тільки координоване функціонування двох ферментних систем – пірофосфорилази і сахарозосинтази.

Таблиця 3

Питомі активності АДФГ- і УДФГ-пірофосфорилаз (НДФГ, мкмоль / мг білка год) і сахарозосинтази (фруктоза, мкмоль / мг білка год) у насінні кукурудзи |

Дні після запилення

Генотипи | Варіант досліду | 24 | 36 | 50

АДФГ- і УДФГ-пірофосфорилази

ВІР-27

ВІР-27 su | УТФ

АТФ

УТФ

АТФ | 12,5 1,35

1,65 0,05

16,5 1,5

1,75 0,05 | 6,05 0,05

1,35 0,05

8,17 0,38

1,6 0,1 | 8,95 0,55

3,1 0,01

7,6 0,4

2,0 0,01

Сахарозосинтаза

ВІР-27

ВІР-27 su |

УДФ

АДФ

УДФ

АДФ | 36,6 0,8

13,35 0,25

29,0 0,01

6,7 0,04 | 13,95 0,15

7,65 0,15

7,0 0,7

3,35 0,25 | 5,4 0,3

4,3 0,4

9,1 0,5

3,9 0,3

Суттєвим доказом функціонування ферментів, що синтезують НДФЦ, може бути склад строми амілопластів – пластид, де відбувається біосинтез крохмалю. Строма амілопластів розвинута слабо, має дрібнозернисту будову, але має важливу роль у синтезі крохмалю і формуванні крохмального зерна [Badenhuizen, 1969]. В стромі амілопластів, виділених у безводному середовищі, виявлені сахароза, фруктоза, органічний і неорганічний фосфор Сакало, Чибисова, Лобов, 1984, баланс яких змінюється при зберіганні бульб картоплі за різних температурних режимів Сакало, 1986. Наявність ряду метаболітів передбачає можливість синтезу в амілопластах не тільки крохмалю, але і його субстрату – АДФГ. Тим більше, що в останній час показана здатність фосфорильованих цукрів, глюкози, мальтози проникати через мембрани амілопластів [Weber et al., 2000]. Крім того, виявлені нами білки строми амілопластів Лобов, Сакало, 1985, здатність включати в крохмаль мічену глюкозу із 14С-сахарози чи 14С-глюкозо-1-фосфату є побічним доказом того, що синтез АДФГ в амілопластах можливий.

САХАРОЗОСИНТАЗА І ПРОЦЕСИ ЦУКРОНАКОПИЧЕННЯ В ЦУКРОВИХ БУРЯКАХ

Сахарозосинтаза як ключовий фермент вуглеводного метаболізму, має визначальну роль у процесах цукронакопичення в цукрових буряках, регулюючи ріст коренеплодів і відкладання сахарози. Вивчення закономірностей і механізмів функціонування СС, кінетики реакції, яка дає розуміння її ролі in vivo, було проведено нами на очищеному ферменті. Використовуючи методи висолювання сульфатом амонію, гель-фільтрацію, іонообмінну хроматографію, електрофорез, ми отримали СС 90–95 % чистоти при виході білка 4,6 %. Електрофорез у градієнтному гелі очищеного білка і дальше визначення його активності показали, що сахарозосинтаза складається із трьох форм: основної з молекулярною масою 400 кД, та двох мінорних – 550 кД і 750 кД (рис. 4) Сакало, Лобов, 1988. |

Рис. 4. Денситограма при 585 нм і електрофоретичний спектр очищеної СС коренеплодів цукрового буряка:

1–3 – молекулярні форми СС.

При ДДС-гель електрофорезі очищеної фракції виявлено білковий спектр з молекулярною масою 95 кД, тобто СС є олігомером з різним числом ідентичних за молекулярною масою субодиниць (рис. 5) Сакало, Лобов, 1988.

Молекулярні форми відрізнялись за деякими біохімічними і кінетичними параметрами. Так, високомолекулярна форма 750 кД мала широкий діапазон активності при рН 6,8–8,5, в той час як дві інші – 550 і 400 кД – мали оптимум рН 7,5. Mg+2 інгібував високомолекулярну форму і підвищував активність тетрамеру, не впливаючи на активність молекулярної форми 550 кД. Уже ці факти свідчили про можливу регуляторну роль молекулярних форм ферменту в коренеплодах, яка була далі підтверджена нами при вивченні їх функціонування в сортах буряків з різним рівнем цукронакопичення – урожайно-цукристого БЦО-34 і кормового Київський. Вміст молекулярних форм щодо сумарного препарату, отриманого при денситометрії електрофореграм, змінювався в онтогенезі і відрізнявся у двох сортів. Так, у кормового сорту Київський на початку вегетації високомолекулярні форми відсутні, в період інтенсивного цукронакопичення вони виявлялись і їх відносна частка становила 35 %, що значно більше, ніж у цукристого БЦО-34. |

Рис. 5. Денситограма при 585 нм і електрофоретичний спектр СС, після обробки Na-ДДС.

Відповідно змінювався і відносний вміст тетрамеру: у БЦО-34 – збільшувався, у кормового – зменшувався (табл. 4) Сакало, Лобов, 1992.

Таблиця 4

Вміст молекулярних форм сахарозосинтази двох сортів буряка щодо їх сумарного препарату, %

Строк відбору | Молекулярна

форма, кД | Сорт

БЦО-34 | Київський

21.06 | 750

550

400 | 11,0

15,6

73,4 | 0

0

100

25.07 | 750

550

400 | 5,9

9,6

84,5 | 14,6

17,6

68,4

23.08 | 750

550

400 | 4,8

8,7

86,5 | 18,0

15,7

66,2

Молекулярні форми сортів з різним рівнем цукронакопичення відрізнялись і за питомою активністю (табл. 5) Сакало, Лобов, 1992. В кінці вегетації високомолекулярні форми в реакції розщеплення сахарози не активні. В реакції синтезу питома активність тетрамеру значно вища у БЦО-34, а в реакції розщеплення – у кормового сорту. Вивчення кінетики молекулярних форм сахарозосинтази двох сортів буряка показало, що залежність швидкості реакції від концентрації субстратів – сахарози, фруктози, УДФ мала гіперболічний характер і підпорядковувалась рівнянню Міхаеліса-Ментен тільки для тетрамеру. Км свідчать, що реакція розщеплення сахарози більш сприятливо проходила у кормового сорту, оскільки максимальна швидкість (Vmax) досягалась при більш низькій концентрації сахарози і УДФ, а її синтез – при більш високій концентрації фруктози.

Таблиця 5

Питома активність молекулярних форм сахарозосинтази із коренеплодів буряка, мкмоль продукту / мг білка год.

Сорт | Молекулярна форма, кД | Синтез сахарози | Розщеплення

сахарози

БЦО-34 | 750

550

400

-“- | 24,82,4

30,53,5

120,010,2

Км фр. –. 5,0 мМ | 0

0

24,02,0

Км сах. –. 83,0 мМ

Км УДФ – 5,0 мМ

Київський | 750

550

400

-“- | 24,42,2

25,63,6

49,55,5

Км фр. – 9,0 мМ | 0

0

33,0

Км сах. –. 66,5 мМ

Км УДФ – 1,83 мМ

Високомолекулярні форми давали сигмоподібні криві залежності швидкості реакції від концентрації фруктози, що властиво алостеричним регуляторним ферментам. Отримані результати свідчать про те, що високомолекулярні форми, скоріш за все, виконують регуляторну роль у запасаючих тканинах, а основна молекулярна форма тетрамер – функцію цукронакопичення і росту. Молекулярні форми СС, незважаючи на їх біохімічну гетерогенність, імунохімічно ідентичні, що припускає їх структурну гомологію.

Відмінність кінетичних характеристик сахарозосинтази двох сортів буряків стимулювало до розширення досліджень особливостей функціонування ферменту в різних сортах, гібридах і видах диких буряків. Для сортів БЦО-34, Еккендорф, Янаш-1 виявлена закономірність між цукристістю, рівнем питомої активності і спрямованістю сахарозосинтазної реакції, а у мангольдів, з низьким вмістом сахарози, на початку вегетації відмічена висока сахарозосинтезуюча активність, яка знижувалась до кінця вегетації, вид дикої Beta trigyna W. et K. характеризувався низькою активністю з перевагою синтетичної спрямованості реакції. Ці результати свідчать про те, що питома активність СС, її спрямованість на синтез чи розщеплення сахарози змінюються протягом вегетації, та не завжди мають сортову специфіку Сакало, Лукашова, 1993.

У зв’язку з цим важливе значення має вивчення синтезу сахарози в листках сахарозофосфатсинтазою, як однієї із найважливіших складових процесу цукронакопичення. Вивчення активності СФС і СС, проведене на урожайно-цукристому сорті БЦО-45 і видах диких буряків Beta maritima L. та Beta trigyna W. et K., показало існування залежності між активністю ферментів і цукронакопиченням (табл. 6) Сакало, Киризий, Курчий, 1999.

Таблиця 6

Активність сахарозофосфатсинтази, сахарозосинтази і накопичення біомаси сорту і видів диких буряків

Показники | Сорт, види

БЦО-45 | Beta maritima L. | Beta trigyna W. et K.

Активність СФС (мкмоль сахарози/г тканини год) |

14,22,0 |

6,00,8 |

6,51,5

Маса гички, г | 50030 | 30025 | 15019

Активність СС (мкмоль фруктози/г тканини год) |

6,90,1 |

9,00,2 |

3,90,1

Маса коренеплоду, г | 37515 | 245,515 | 8010

Суха речовина, г | 21,80,2 | 24,10,1 | 22,90,3

Сахароза, % сирої речовини | 18,20,2 | 10,40,4 | 9,80,2

Нецукри*, % сирої речовини | 3,6 | 13,7 | 13,1

Сахароза/нецукри* | 5,0 | 0,8 | 0,7

Сахароза, % сухої речовини | 83,5 | 43,1 | 42,9

Нецукри*, % сухої речовини | 16,5 | 56,9 | 57,1

Вихід цукру із 1 коренеплоду, г | 68,2 | 25,5 | 7,8

*Нецукри – сума структурних полісахаридів, білків, азотистих та безазотистих речовин, інших сполук Павлинова, 1981

З середини вегетації, коли листки, в основному, вже здійснювали донорну функцію, активність СФС у диких видів була в 2 рази нижчою, ніж в БЦО-45, що при слабому розвитку листкового апарату не може забезпечити високого рівня сахарози. Сорт і види буряків відрізнялись активністю сахарозосинтази. У Beta trigyna W. et K. сахароза слабо включалась у метаболізм, що гальмувало ростові процеси і цукронакопичення, і як результат – низькі маса коренеплодів і вміст цукрів при високому рівні нецукрів. У Beta maritima L. висока активність СС і вихід цукру збільшувався за рахунок маси коренеплодів.

Проведений імунодифузійний аналіз показав відсутність імунохімічних відмінностей сахарозосинтази коренеплодів кормових, цукрових буряків, гібридів, мангольдів, диких видів (рис. 6) Сакало, Лукашова, 1992. |

Рис. 6. Імунодифузійний аналіз сахарозосинтази різних сортів, гібридів і видів диких буряків:

Б – БЦО-34; Я – Янаш-1;

К – Київський;

Эк – Эккендорф;

Г1 – гібрид Р ЧС-83;

Г2 – ЧС компонент;

Г3 – багатонасінний запилювач;

Мл – мангольд Лукулл;

Мр – мангольд Poirea vetegcorde; Мк – мангольд червоночерешковый;

B.tr. – Beta trigyna;

AТ – антисироватка проти сахарозосинтази коренеплодів цукрового буряка БЦО-34.

Це свідчить про те, що рівень активності, спрямованість реакції на синтез чи розщеплення сахарози не пов’язані із структурними змінами молекули ферменту і, що в процесі відбору на цукристість, сам фермент практично не змінювався, а відбувалась лише кількісна регуляція його активності. Методичний відбір на підвищення цукристості сприяв збільшенню питомої активності, а регулюючим фактором у синтезі та розщепленні сахарози може бути рівень синтезу сахарозосинтазного білка, або концентрація субстратів.

При порівнянні сахарозосинтази коренеплодів цукрових буряків з ферментом крохмаль- чи інулінзапасаючих рослин (бульби картоплі, насіння кукурудзи, топінамбур) між ними виявлена лише часткова імунологічна ідентичність, про що свідчить “шпора”, яка утворювалась при подвійній імунодифузії в агарі. В той же час дві молекулярні форми ферменту із бульб картоплі проявляли повну антигенну ідентичність між собою (рис. 7) Сакало, Лукашова, 1992. |

Рис. 7.