НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна

Спиридонов Владислав Геннадійович

УДК 577.217

РНК-ЗВ’ЯЗУВАЛЬНА АКТИВНІСТЬ БІЛКА ОБОЛОНКИ ВІРУСУ МОЗАЇКИ ЛЮЦЕРНИ В ТРИГІБРИДНІЙ СИСТЕМІ SACCHAROMYCES CEREVISIAE

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Національному аграрному університеті Кабінету Міністрів України.

Науковий керівник - кандидат біологічних наук, доцент

Мельничук Максим Дмитрович,

завідувач кафедри фізіології рослин, вірусології та

біотехнології Національного аграрного університету.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Матишевська Ольга Павлівна,

професор кафедри біохімії Київського національного

університету імені Тараса Шевченка;

доктор біологічних наук, професор

Радавський Юрій Леонідович,

завідувач відділу структури та функції білків та

пептидів Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії

НАН України.

Провідна установа - Інститут молекулярної біології та генетики

НАН України, відділ структури та функції

нуклеїнових кислот.

Захист відбудеться “21” червня 2004 р. О 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: м. Київ, вул. Леонтовича, 9.

Автореферат розісланий “17” травня 2004 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук _________________ Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

РНК-білкові взаємодії відіграють важливу роль у біологічних процесах клітини. Молекула РНК структурно різноманітніша, ніж ДНК, та виконує значну кількість функцій. В клітині РНК функціонує в комплексі з білковими факторами. Відомо, що білки, які зв’язуються з РНК, стабілізують та захищають її, транспортують РНК у різні компартменти клітини. Слід відзначити важливу роль білків, які зв’язуються з РНК, у регуляції активності генів, тому що саме вони беруть участь в альтернативному сплайсінгу мРНК, виборі сайтів поліаденілювання, корекції РНК і пошуку сайтів ініціації та термінації трансляції [Lewin, 1997].

Деякі РНК-вмісні віруси, такі як ВІЛ і пікорнавіруси, використовують специфічні РНК-білкові взаємодії для регуляції інфекційності та реплікації вірусної РНК. Тому знання про ці специфічні взаємодії використовують для розробки ліків нового покоління [Karn, 1995].

Біохімічні методи, які використовують для виявлення та аналізу РНК-білкових взаємодій, такі як футпринт аналіз, нативний електрофорез РНК-білкових комплексів (EMSA) тощо, дозволяють вивчати ці взаємодії в умовах in vitro. Ці методи відносно складні, мають лімітовані можливості, які обумовлюються штучним середовищем виконання, крім того більшість з них потребують використання радіоактивних сполук [Sambrook, 2000].

Більш ефективно РНК-білкові взаємодії можна вивчати в умовах in vivo, за допомогою тригібридної системи Saccharomyces cerevisiae, яка дозволяє не тільки аналізувати РНК-зв’язувальні властивості деяких білків, але також відкриває можливість ідентифікувати нові, що при скринінгу експресуючих кДНК бібліотек взаємодіють зі специфічною РНК-принадою [Bernstein, 2002].

До РНК-вмісних вірусів належить більшість рослинних вірусів. Знання, набуті при вивченні біохімії фітовірусів, використовують для розробки стратегій захисту сільськогосподарських видів рослин від вірусних хвороб [Бойко, 1990]. При цьому надзвичайно актуальним є питання створення трансгенних рослин, стійких до більшості контагіозних фітовірусів [Мельничук, 2000]. Серед таких рослин найпоширеніші, так звані, СР-трансгенні рослини (від англ. Coat protein – білок оболонки). Такі СР-рослини експресують білок оболонки специфічного вірусу, при цьому спостерігається зниження симптомів вірусного захворювання. На сьогодні немає чіткої відповіді на питання, яким чином ці трансгенні рослини набувають ознак резистентності [Sturtevant, 1993].

Взаємодія білку оболонки вірусу мозаїки люцерни (БО ВМЛ) з власною геномною РНК ініціює активацію геному, що спричинює розвиток симптомів захворювання у чутливих рослин. Показано, що суміш вірусних РНК 1-3 ВМЛ при інокуляції чутливої рослини була неінфекційна, доки декілька молекул БО не додавали до інокулюму [Bol, 1971]. На підставі отриманих даних було висунуто гіпотезу, що білок оболонки ВМЛ крім структурної функції – формування вірусного капсиду, має регуляторний ефект через вплив на транскрипцію та трансляцію вірусних РНК [Jaspars, 1999].

Мета і завдання дослідження. Метою наших досліджень було продемонструвати взаємодію білка оболонки вірусу мозаїки люцерни (БО ВМЛ) з РНК4 в умовах in vivo, за допомогою тригібридної системи Saccharomyces cerevisiae, виявити частину БО, яка зв’язується з РНК4, та необхідну для цієї взаємодії полярність ланцюга РНК.

Для досягнення поставленої мети до завдань роботи входило:

· Одержати рекомбінантний білок оболонки ВМЛ (РБО ВМЛ), використовуючи бактеріальну систему експресії Escherichia coli.

· Імунізувати кролів РБО ВМЛ, одержати та очистити специфічні поліклональні антитіла.

· Одержати генетичні конструкції, які кодують гібридні форми БО ВМЛ та гібридну РНК 4 ВМЛ позитивної та негативної полярності.

· Трансформувати дріжджові клітини одержаними генетичними конструкціями та оцінити ступінь взаємодії БО ВМЛ з РНК4 в дріжджовій тригібридній системі.

Об’єкт дослідження: білок оболонки ВМЛ, бактеріальні та дріжджові клітини.

Предмет дослідження: взаємодія БО з РНК4 в умовах in vivo.

Методи дослідження. Ген БО ВМЛ клонували у плазмідні вектори за допомогою методів генетичної інженерії з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Трансформацію бактеріальних клітин плазмідною ДНК проводили методами електропорації та теплового шоку. Трансформацію дріжджових клітин плазмідною ДНК здійснювали літій-ацетатним методом. Чистоту РБО ВМЛ аналізували за допомогою електрофорезу у ПААГ-ДСН. Специфічність одержаних антитіл проти РБО ВМЛ перевіряли методом ІФА та Вестерн-блот аналізом. Результат взаємодії БО ВМЛ з РНК4 в умовах in vivo визначали за активністю -галактозидази у колориметричних реакціях на нітроцелюлозних фільтрах та у розчині.

Наукова новизна одержаних результатів. За допомогою тригібридної системи Saccharomyces cerevisiae вперше показана взаємодія БО ВМЛ з РНК4 в умовах in vivo. Отримано нові дані, які свідчать що БО ВМЛ з високою спорідненістю зв’язується з плюс-ланцюгом та не зв’язується з мінус-ланцюгом РНК4. Показано, що з РНК4 зв’язується NH2-кінцева частина БО ВМЛ. Виявлено негативний вплив мутації Q159R в послідовності БО ВМЛ на формування гомодимерів БО в двогібридній системі.

Практичне значення отриманих результатів. Результати дослідження взаємодії БО ВМЛ з РНК4 в умовах in vivo за допомогою дріжджової тригібридної системи розширюють уявлення стосовно природи цих взаємодій.

Поліклональні кролячі антитіла проти РБО ВМЛ можуть бути використані при розробці діагностичної системи на основі ІФА по виявленню білка оболонки ВМЛ в рослинах, уражених нативним вірусом, та трансгенних СР-рослинах, стійких до ВМЛ.

Розроблена тригібридна система може бути покладена в основу детальнішого вивчення взаємодій між БО ВМЛ та РНК4 за допомогою мутаційного аналізу активних центрів молекули БО та молекули РНК4, що беруть участь у цих взаємодіях.

Особистий внесок здобувача. Здійснення інформаційного пошуку та оцінка літературних даних, створення генетичних конструкцій, одержання та очистка РБО ВМЛ, трансформація бактеріальних та дріжджових клітин, аналіз та теоретичне обґрунтування результатів досліджень виконані дисертантом особисто. Планування та розробка методичних підходів виконання комплексу лабораторних досліджень проведені разом з науковим керівником к.б.н., доц. Мельничуком М.Д.

Імунізація кролів РБО ВМЛ проводилась у віварії Інституту вірусології та мікробіології НАН України разом із науковим керівником к.б.н. Мельничуком М.Д. та ст. наук. співробітником лабораторії фітовірусології та біотехнології НАУ Смирновою С.О.

Створення генетичних конструкцій для дво- та тригібридних систем проводили на базі лабораторії дріжджових моделей хвороб людини університету ім. Луї Пастера, м. Страсбург, Франція, під керівництвом Dr. B. Winsor.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках науково-дослідних тем лабораторії вірусології та біотехнології НАУ на 1998 – 2002 рр. “Вивчення механізмів взаємодії фітовірусів із клітинами та розробка методів діагностики вірозів і отримання безвірусних рослин” (р/№0198U004073), та у рамках FEBS collaborative experimental scholarships for Central and Eastern Europe, Summer 2002.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації опубліковані та доповідались на: 1st “Ukrainian–Bulgarian Workshop on Plant Biotechnology”, September 2001, Lessidren (Bulgaria); International symposium “Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources”, May 2002, Yalta (Ukraine); на конференціях та науково-практичних семінарах НАУ; в міністерстві аграрної політики України; на виставках “Сучасна освіта в Україні – 2001, та 2002”; на ІІІ Всесвітній конференції GCHERA, вересень 22-24, 2003 м. Київ.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 робіт, з них 3 статті у провідних фахових виданнях та 3 тези доповідей.

Структура та об’єм роботи. Дисертаційна робота викладена на 121 сторінках машинописного тексту, складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної частини, висновків та списку використаної літератури (налічує 121 найменування). Робота містить 49 рисунків та 9 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Перший розділ дисертації складається з 4 підрозділів, у яких узагальнені літературні дані стосовно природи формування вірусних капсидів. Детально розглянуті молекулярні та біохімічні особливості вірусу мозаїки люцерни, розібрані стратегії захисту рослин за допомогою сучасних біотехнологій. Розглянуті принципи та методичні підходи використання генетично-селекційних систем для вивчення взаємодії макромолекул в умовах in vivo.

На підставі аналізу вітчизняних та зарубіжних літературних джерел обґрунтовано актуальність проведення досліджень за темою дисертаційної роботи.

Матеріали та методи досліджень. Об’єктом дослідження обрано бактеріальні та дріжджові клітини, трансформовані генетичними конструкціями, що кодують ген БО ВМЛ.

Клонували ген БО ВМЛ у плазмідні вектори за допомогою класичних методів генетичної інженерії [Sambrook, 2000], з використанням ПЛР [Mullis, 1985]. Олігонуклеотидні праймери для ПЛР синтезовані компанією MWG-Biotech AG (Німеччина). ПЛР здійснювали на ампліфікаторі “GeneAmp 2400” (Applied Biosystems).

Трансформацію бактеріальних клітин плазмідною ДНК проводили за допомогою електропорації, використовуючи електропоратор “Gene pulser” (Bio-Rad) Трансформацію дріжджових клітин плазмідною ДНК проводили літій-ацетатним методом [Hill, 1991].

Нуклеотидні послідовності, які клонували у плазмідні вектори, визначали за допомогою автоматичного секвінатору ABI 3100 (Applied Biosystems), аналізували з використанням Internet-серверів NCBI, EMBO та порівнювали з базами даних DDBJ/EMBL/GenBank.

Для продукції РБО ВМЛ використовували бактеріальну систему індукції експресії рекомбінантних білків [Moffatt and Studier, 1986]. Чистоту РБО ВМЛ встановлювали за допомогою електрофорезу у ПААГ-ДСН [Laemmli, 1970].

Імунізували кролів РБО ВМЛ за стандартною схемою з власними модифікаціями [Мельничук, 2002]. Специфічність отриманих антитіл проти РБО ВМЛ перевіряли у непрямому варіанті ІФА та Вестерн-блот аналізом за загальноприйнятими методиками [Harlow and Lane, 1988].

Формування димерів БО ВМЛ в умовах in vivo аналізували в дріжджовій двогібридній системі “Matchmaker”, фірми (Clontech). Результат взаємодії БО ВМЛ з РНК4 в тригібридній системі [SenGupta, 1996] фіксували за активністю -галактозидази у колориметричному тесті на нітроцелюлозних фільтрах, згідно методу [Breeden and Nasmyth, 1985]. Ензиматичну активність -галактозидази також вимірювали у розчині та виражали в одиницях активності – Miller units за методом [Kandels-Lewis and Seraphin, 1993].

Генетичні конструкції pBCP та pADCP люб’язно надані Dr. J. Bol (Нідерланди), конструкцію pBICP надано Dr. O. Kudela та L. Mazurova (Словаччина), конструкцію pHST403 надано Dr. L. Gehrke (Сполучені Штати Америки).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Бактеріальна експресія та очистка РБО ВМЛ.

З метою одержання поліклональних антитіл, специфічних проти білка оболонки ВМЛ, нами було застосовано бактеріальну систему експресії рекомбінантного аналога білка оболонки (РБО ВМЛ), оскільки ми не мали можливості виділити та очистити в достатній кількості для імунізації кролів препарат природного ізоляту ВМЛ.

Отриманий за допомогою ПЛР продукт ампліфікації, який представляв змінену відкриту рамку зчитування гену БО ВМЛ, клонували у вектор рЕТ-24а (Novagen). Для перевірки здатності генетичної конструкції до експресії цільового білка відібрані позитивні клони методом трансформації переводили у штам E.coli BL21(DE3)RIL (Stratagene).

Аналіз продукту суперекспресії БО ВМЛ проводили електрофорезом бактеріального лізату до та після індукції з ІПТГ (ізопропіл-?-D тіогалактопіранозід) у 15% ПААГ-ДСН. Результати аналізу (рис.1) вказують на наявність продукту суперекспресії РБО ВМЛ з молекулярною масою близько 30 kD.

Генетичну конструкцію, здатну до бактеріальної експресії РБО ВМЛ ми назвали рЕТСР. Комп’ютерний аналіз амінокислотної послідовності РБО ВМЛ виявив дві амінокислотні заміни (G119S, Q159R) та показав, що рекомбінантний білок був коротший за свій природний аналог на три амінокислотні залишки.

РБО ВМЛ виділили з бактеріального лізату як тільця включення, оскільки виявилося, що рекомбінантний білок знаходився в нерозчинній фракції бактеріальних білків. Чистота препарату (рис.2) була достатня для проведення імунізації кролів та отримання специфічних поліклональних антитіл до РБО ВМЛ.

Отримання поліклональних антитіл до РБО ВМЛ.

Два кролі віком 12 тижнів та середньою масою 2 кг імунізували РБО ВМЛ за стандартною схемою. Титр антитіл в сироватці імунізованих тварин визначали у непрямому варіанті ІФА через 6 тижнів після першої імунізації. Результати аналізу показали високий титр антитіл до РБО ВМЛ, який становив 1/6400 (ОГ450–1,75) у порівнянні з негативним контролем до імунізації (ОГ450–0,45) (рис.3).

Специфічність антитіл визначали Вестерн-блот аналізом, для цього РБО ВМЛ після електрофорезу у 10% ПААГ-ДСН переносили на PVDF мембрану (Amersham-Pharmacia). Мембрану фарбували амідо-чорним барвником для візуалізації РБО та маркерів молекулярної маси (рис.4 А), після чого проводили Вестерн-блот аналіз з використанням афінно-очищених антитіл. Мембрану проявляли на рентгенівську плівку Kodak методом підсиленої хемілюмінесценції, за допомогою “ECL kit” (Pierce). Результати аналізу показали наявність трьох дискретних специфічних сигналів у положеннях близько 30, 60 та 120 kD (рис.4 В).

На підставі одержаних даних нами висловлено припущення, що РБО ВМЛ здатний до стабільної димеризації, утворюючи вірусоподібні частки в умовах in vitro. Явище збирання рекомбінантного білка оболонки ВМЛ у Т=1 вірусоподібні частки в умовах in vitro було показано раніше [Yusibov, 1996], але формування часток проходило за певних умов, заданих експериментатором.

Формування димерів БО ВМЛ в двогібридній системі.

З метою визначення впливу точкових мутацій G119S та Q159R в послідовності БО ВМЛ на формування димерів в умовах in vivo ми обрали двогібридну систему

S. cerevisiae. Як позитивний контроль формування димерів БО ми використовували генетичні конструкції pBCP та pADCP, які кодують гібридний БО ВМЛ дикого типу (штам Leiden425), приєднаний відповідно до ДНК-зв’язувального та активуючого транскрипцію доменів дріжджового транскрипційного фактору Gal4p [Tenllado and Bol, 2000].

Нами було клоновано послідовність БО ВМЛ з мутаціями (G119S та Q159R) у вектор pGBT9 (Clontech) з утворенням генетичної конструкції pGBCP, яка кодує гібридний БО ВМЛ в єдиній рамці зчитування з ДНК-зв’язувальним доменом Gal4p (ДЗД-БО ВМЛ). Паралельно ми клонували послідовність БО ВМЛ з мутаціями у вектор pAСТІІ (Clontech) з утворенням генетичної конструкції pAСТCP, яка кодує гібридний БО ВМЛ в єдиній рамці зчитування з активуючим транскрипцію доменом Gal4p (ТАД-БО ВМЛ) (рис.5).

Здатність генетичних конструкцій pGBCP та рАСТСР до дріжджової експресії гібридних форм БО ВМЛ перевіряли Вестерн-блот аналізом із використанням очищених антитіл проти РБО ВМЛ. Вестерн-блот аналіз показав достатньо високі рівні експресії гібридних білків, молекулярна маса яких дорівнювалася 42kD – для ДЗД-БО та 47kD – для ТАД-БО.

Для аналізу формування димерів мутантного БО ВМЛ в умовах in vivo ми трансформували штам S. cerevisiae Y190 двома конструкціями pGBCP та рАСТСР водночас. Подвійні трансформанти відбирали на синтетичному селективному середовищі без триптофану та лейцину. Паралельно ми трансформували штам Y190 плазмідами pBCP/pADCP як позитивний контроль формування димерів БО ВМЛ та плазмідами pGBT9/pACTII, як негативний контроль. Також ми проаналізували реципрокні комбінації плазмід pBCP/pACTCP та pGBCP/pADCP.

Одержані подвійні трансформанти розсівали на нітроцелюлозний фільтр для якісного колориметричного тесту на активність гену-репортеру LacZ, що кодує ?-галактозидазу. Результати тесту показали, що дріжджові колонії, трансформовані парою плазмід pGBCP/рАСТСР після інкубації фільтру на субстратному середовищі з X-Gal (5-бромо-4-хлоро-3-індоліл-?-D тіогалактопіранозід) не змінювали свого забарвлення, в той час як позитивні контрольні клони pBCP/pADCP набували блідо-синього кольору. Таким чином, активність ферменту ?-галактозидази відновилась внаслідок формування димерів БО ВМЛ дикого типу (штам Leiden 425), але формування димерів мутантного БО ВМЛ в двогібридній системі не спостерігалось.

Цікавим виявився той факт, що дріжджові колонії, трансформовані комбінаціями плазмід pBCP/pACTCP та pGBCP/pADCP, були здатні до активації ?-галактозидази та набували синього забарвлення. Це свідчило про утворення гетеродимерів БО ВМЛ, які з одного боку формувалися субодиницею з мутацією та з іншого субодиницею дикого типу.

Ми виміряли ферментативну активність ?-галактозидази в дріжджових лізатах трансформованих клонів за допомогою субстрату ONPG (орто-нітрофеніл ?-D галактопіранозід), результати аналізу перевели в одиниці активності ?-галактозидази– Miller units (таблиця 1).

Таблиця 1

Формування димерів БО ВМЛ в двогібридній системі

Гібридні молекули БО ВМЛ | Активність ?-галактозидази,

Miller units | Колориметричний тест на фільтрах з X-Gal

ДЗД-БО(R159) – ТАД-БО(R159) | 0,2

ДЗД-БО(Q159) – ТАД-БО(R159) | 18,8 | +++

ДЗД-БО(R159) – ТАД-БО(Q159) | 15,6 | +++

ДЗД-БО(Q159) – ТАД-БО(Q159) | 5,6 | +

ДЗД-Gal4p – ТАД-Gal4p | 0,2

Як видно з наведених даних, формування гетеродимерів БО ВМЛ (15,6–18,8U) сприятливіше, ніж гомодимерів БО дикого типу (5,5U). Формування гомодимерів БО з мутаціями G119S та Q159R в двогібридній системі не спостерігалось (0,2U). Одержані дані узгоджуються з колориметричним тестом на нітроцелюлозних фільтрах з X-Gal.

РНК-зв’язувальна активність БО ВМЛ в тригібридній системі.

Для конструювання тригібридної системи та аналізу РНК-зв’язувальної активності білку оболонки ВМЛ в умовах in vivo ми використовували штам дріжджів S. cerevisiae L40-coat [SenGupta, 1996]. Цей штам містить у своєму геномі інтегровану копію гену, що кодує перший гібридний білок – бактеріальний білок LexA, приєднаний до білку оболонки бактеріофага MS2 (LexA-БО MS2). Тригібридна система базується на тому ж принципі, що і двогібридна, але ускладнюється тим, що гібридна молекула РНК функціонує як молекулярний місток між двома гібридними протеїнами (рис.6).

Специфічна взаємодія між РНК-Х та білком-Y призводить до активації транскрипції гену-репортеру LacZ. Експресію ?-галактозидази, що кодується геном LacZ, можна виявити за фенотипом клітин чи за допомогою біохімічного аналізу.

Для визначення полярності ланцюга РНК4, який приймає участь у взаємодії з білком оболонки ВМЛ, ми субклонували ген БО з 3?-термінальною послідовністю (3?-UTR) з плазміди pHST403 в SmaI сайт транскрипційного вектора pIIIA/MS2-1 в сенс- та антисенс положенні. Одержані генетичні конструкції, які кодують плюс- або мінус- ланцюги РНК4, ми назвали pIIIACP(+) та pIIIACP(–), відповідно (рис.7). Генетичну конструкцію pACTCP використовували для експресії другого гібридного білку, ТАД-БО ВМЛ.

Дріжджовий штам S. cerevisiae L40coat трансформували двома комбінаціями плазмід рІІІАСР(+)/pACTCP та рІІІАСР(–)/pACTCP. Подвійні трансформанти відбирали на синтетичному селективному середовищі без урацилу та лейцину. Паралельно ми трансформували штам L40coat наступними комбінаціями плазмід рІІІАСР(+)/рАСТІІ, pIIIA/MS2-1/pACTCP та pIIIA/MS2-1/рАСТІІ з метою контролю неспецифічної активації експресії гену-репортеру LacZ.

Одержані подвійні трансформанти розсівали на нітроцелюлозний фільтр для якісного колориметричного тесту на активність гену-репортеру LacZ. Результати тесту показали, що дріжджові колонії, трансформовані парою плазмід рІІІАСР(+)/pACTCP після інкубації фільтру на субстратному середовищі з X-Gal, набували яскраво-блакитного забарвлення, тоді як колонії, трансформовані рІІІАСР(–) /pACTCP та комбінаціями контрольних плазмід, не змінювали свого забарвлення. Одержані результати свідчать про те, що БО ВМЛ зв’язується з плюс-ланцюгом РНК4 ВМЛ та не зв’язується з мінус-ланцюгом.

Ми виміряли активність ?-галактозидази в лізатах трансформованих клонів L40coat, результати аналізу перевели в одиниці активності ?-галактозидази (табл.2).

Одержані дані узгоджуються з колориметричним тестом на нітроцелюлозному фільтрі та підтверджують той факт, що БО ВМЛ зв’язується з плюс-ланцюгом РНК4 (269,1U) та не зв’язується з мінус-ланцюгом РНК4 (0,9U).

Таблиця 2

Визначення полярності ланцюга РНК4 ВМЛ в тригібридній системі

Гібридні молекули РНК4 та білку оболонки ВМЛ | Активність в-галактозидази, Miller units | Колориметричний тест на фільтрах з X-Gal

MS2-РНК4(+) – ТАД-БО | 269,1 | + + +

MS2-РНК4(–) – ТАД-БО | 0,9–

MS2-РНК4(+) – ТАД-Gal4p | 0,6–

MS2 – ТАД-БО | 2,6–

MS2 – ТАД-Gal4p | 1,2–

З метою локалізації РНК-зв’язувального домену в послідовності БО ВМЛ ми одержали генетичні конструкції, які кодують окремо N-кінцеву та С-кінцеві частини БО ВМЛ у сполученні з ТАД-Gal4p. Для цього NcoI–BamHI та BamHI–XhoI рестрикційні фрагменти гену БО з генетичної конструкції рАСТСР субклонували у відповідні сайти вектора рАСТІІ в єдиній рамці зчитування з ТАД-Gal4p.

NcoI–BamHI фрагмент гену БО ВМЛ розміром 257 пнз кодує з 1 по 85 амінокислотні залишки БО. BamHI–XhoI фрагмент гену БО ВМЛ розміром 400 пнз кодує з 86 по 221 амінокислотні залишки БО. Одержані генетичні конструкції ми назвали pADN85CP для N-кінцевої та pAD?NCP для С-кінцевої форми БО (рис.8).

Наступним нашим кроком було показати здатність одержаних генетичних конструкцій pADN85CP та pAD?NCP до експресії дилеційних форм гібридного БО в дріжджових клітинах. Ми трансформували специфічний штам-реципієнт S. cerevisiae L40coat одержаними генетичними конструкціями. Вестерн-блот аналіз з використанням очищених антитіл проти РБО ВМЛ показав, що молекулярні маси гібридних форм БО ВМЛ складали: 46 kD для повнорозмірного, 27 kD для N-кінцевої форми, 34 kD для С-кінцевої форми ТАД-БО та наближалися до теоретично розрахованих даних (рис.9).

Нами було трансформовано дріжджовий штам S. cerevisiae L40coat наступними комбінаціями плазмід: рІІІАСР(+)/pADN85CP та рІІІАСР(+)/pAD?NCP. Паралельно ми трансформували штам L40coat контрольними комбінаціями рІІІАСР(+)/рАСТІІ, pIIIA/MS2-1/pADN85CP та pIIIA/MS2-1/рАСТІІ, з метою контролю неспецифічної активації експресії гену-репортеру LacZ.

Подвійні трансформанти розсівали на нітроцелюлозний фільтр для якісного колориметричного тесту активності гену-репортеру LacZ. Результати тесту показали, що дріжджові колонії, трансформовані парою плазмід рІІІАСР(+)/pADN85CP після інкубації фільтру на субстратному середовищі з X-Gal, набували блідо-блакитного забарвлення, при чому колонії, трансформовані рІІІАСР(+)/pAD?NCP не змінювали свого забарвлення. Одержані результати свідчать про те, що N-кінцева частина БО ВМЛ (1-85 аз) містить РНК-зв’язувальний домен, здатний до активації експресії ?-галактозидази в тригібридній системі. Ми виміряли активність ферменту в лізатах трансформованих клонів L40coat, результати аналізу перевели в одиниці активності ?-галактозидази, Miller units (табл.3).

Одержані дані повністю узгоджуються з колориметричним тестом на нітроцелюлозному фільтрі та підтверджують той факт, що саме N-кінцева частина БО ВМЛ (1-85 аз) містить РНК-зв’язувальний домен, який приймає участь у взаємодії з гібридною РНК4 в умовах in vivo (50,8U). C-кінцева частина БО ВМЛ (86-221 аз) безпосередньої участі у взаємодії з РНК4 не приймає (1,6U). Однак активність гена-репортера LacZ, у випадку взаємодії з РНК4 тільки N-термінальної частини білка оболонки ВМЛ, у п’ять разів нижча, ніж при взаємодії з повнорозмірним білком. Останнє може свідчити про те, що третинна структура повнорозмірного БО ВМЛ сприятливіша для цієї взаємодії.

Таблиця 3

Визначення РНК-зв’язувального домену БО ВМЛ в тригібридній системі

Гібридна молекула РНК4 (+) та усічені форми білку оболонки ВМЛ | Активність ?-галактозидази, Miller units | Колориметричний тест на фільтрах з X-Gal

MS2-РНК4(+) – ТАД-БО(1-85аз) | 50,8 | + +

MS2-РНК4(+) – ТАД-БО(86-221аз) | 1,6–

MS2-РНК4(+) – ТАД-Gal4p | 0,6–

MS2 – ТАД-БО(1-85аз) | 2,6–

MS2 – ТАД-Gal4p | 1,2–

Таким чином, ми вперше показали РНК-зв’язувальну активність білку оболонки ВМЛ в умовах in vivo, за допомогою дріжджової тригібридної системи. Отримані дані свідчать, що БО ВМЛ з високою спорідненістю зв’язується з плюс-ланцюгом та не зв’язується з мінус-ланцюгом РНК4. Також ми локалізували РНК-зв’язувальний домен, який розташовано на NH2-кінцевій частині БО ВМЛ. Наші дані узгоджуються з попередніми даними, одержаними з використанням фізико-хімічних та біохімічних методів в умовах in vitro, та розширюють уявлення стосовно природи цих взаємодій.

ВИСНОВКИ

1. В бактеріальній системі експресії E. coli одержано рекомбінантний білок оболонки вірусу мозаїки люцерни (ВМЛ). Комп’ютерний аналіз амінокислотної послідовності показав, що цей білок має дві амінокислотні заміни (G119S, та Q159R) і коротший за свій природний аналог на три амінокислотні залишки.

2. Виділено та очищено рекомбінантний білок оболонки ВМЛ з бактеріального лізату у вигляді тілець включення. Чистота препарату білка оболонки була достатня для отримання поліклональних антитіл.

3. Одержано та очищено поліклональні кролячі антитіла проти рекомбінантного білка оболонки ВМЛ, які показали високий рівень специфічності і чутливості в ІФА та Вестерн-блот аналізі.

4. Виявлено здатність рекомбінантного білка оболонки ВМЛ до стабільної димеризації в умовах in vitro.

5. Показано негативний вплив мутації Q159R на формування гомодимерів білка оболонки ВМЛ в дріжджовій двогібридній системі.

6. За допомогою дріжджової тригібридної системи вперше показано, що білок оболонки ВМЛ з високою спорідненістю зв’язується з плюс-ланцюгом РНК4 в умовах in vivo.

7. Мутаційним аналізом встановлено, що N-термінальна частина білка оболонки ВМЛ (з 1 по 85 аз) містить РНК-зв’язувальний домен, здатний до активації експресії -галактозидази в тригібридній системі.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г. Аналіз гена капсидного білка вірусу мозаїки люцерни (CP AlMV), клонованого у вектор для трансформації рослин pBI121 // Мікробіологічний журнал. – 2001. – Т.63, №4. – С.62 – 68.

2. Melnychuk M.D., Spyrydonov V.G. Obtaining and purification recombinant coat protein of alfalfa mosaic virus expressed in Escherichia coli // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченко (Біологія). – 2001, Вип. 35. – С.58 – 62.

3. Спиридонов В.Г., Мельничук М.Д. РНК-связывающая активность белка оболочки вируса мозаики люцерны в трехгибридной системе Saccharomyces cerevisiae // Доп. НАН України. – 2003. – №7. – С.181 – 188.

4. Melnychuk M.D., Spyrydonov V.G. Obtaining and purification recombinant coat protein of alfalfa mosaic virus expressed in Escherichia coli // 1st Ukrainian–Bulgarian Workshop on Plant Biotechnology. – Lessidren (Bulgaria). – 2001. – P.17.

5. Melnychuk М.D., Smyrnova S.A., Spyrydonov V.G. Obtaining a rabbit polyclonal antiserum reactive against a recombinant coat protein of alfalfa mosaic virus expressed in E. coli // International symposium “Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources”. – Yalta (Ukraine). – 2002. – P.19.

6. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г. Біонебезпека трансгенних технологій з використанням 35S промотору // Наукова конференція “Генетично модифіковані рослини: перспективи та проблеми” (Інститут цукрових буряків УААН). – Київ. – 2003. – С.83-87.

АНОТАЦІЯ

Спиридонов В.Г. РНК-зв’язувальна активність білка оболонки вірусу мозаїки люцерни в тригібридній системі Saccharomyces cerevisiae. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2004.

Дисертаційна робота присвячена вивченню молекулярних особливостей взаємодії білка оболонки вірусу мозаїки люцерни (ВМЛ) з РНК4, яка кодує цей білок.

В бактеріальній системі експресії одержали рекомбінантний білок оболонки ВМЛ. Комп’ютерний аналіз амінокислотної послідовності виявив, що цей білок має дві амінокислотні заміни (G119S та Q159R) і коротший за свій природній аналог на три амінокислотні залишки.

Виділений та очищений рекомбінантний білок оболонки ВМЛ використовували для імунізації кролів та одержання поліклональних антитіл. Вестерн-блот аналізом, з використанням афінно-очищених поліклональних антитіл, виявили здатність рекомбінантного білка оболонки ВМЛ до стабільної димеризації в умовах in vitro.

Виявили негативний вплив мутації Q159R в послідовності білка оболонки ВМЛ на формування гомодимерів в дріжджовій двогібридній системі in vivo.

За допомогою тригібридної системи вперше показали, що білок оболонки ВМЛ з високою спорідненістю зв’язується з плюс-ланцюгом РНК4 в умовах in vivo.

Мутаційний аналіз функціональної частини білка оболонки ВМЛ виявив, що N-термінальна частина білка оболонки ВМЛ (з 1 по 85 аз) містить РНК-зв’язувальний домен, здатний до активації експресії -галактозидази в тригібридній системі.

С-термінальна частина білка оболонки ВМЛ (з 86 по 221 аз) безпосередньої участі не приймає у взаємодії з РНК, однак активність -галактозидази у випадку взаємодії тільки N-кінцевої частини нижче у п’ять разів на відміну від повнорозмірного білка, що може свідчити про те, що третинна структура повнорозмірного білка оболонки ВМЛ сприятливіша для цієї взаємодії.

Ключові слова: РНК-білкові взаємодії, тригібридна система, вірус мозаїки люцерни, білок оболонки.

АННОТАЦИЯ

Спиридонов В.Г. РНК-связывающая активность белка оболочки вируса мозаики люцерны в трехгибридной системе Saccharomyces cerevisiae. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2004.

Диссертация посвящена изучению молекулярных особенностей взаимодействия белка оболочки вируса мозаики люцерны (ВМЛ) с РНК4, которая кодирует этот белок.

В бактериальной системе экспрессии получен рекомбинантный белок оболочки ВМЛ. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности показал, что полученный белок имеет две аминокислотных замены (G119S и Q159R), а также короче своего естественного аналога на три аминокислотных остатка.

Выделенный и очищенный рекомбинантный белок оболочки ВМЛ использовали для иммунизации кролей и получения поликлональных антител. Вестерн-блот анализом, с использованием афинно-очищенных поликлональных антител, обнаружили способность рекомбинантного белка оболочки ВМЛ к стабильной димеризации в условиях in vitro.

С помощью дрожжевой двухгибридной системы показали негативное влияние мутации Q159R на формирование гомодимеров белка оболочки ВМЛ in vivо.

С помощью трехгибридной системы впервые показали, что белок оболочки ВМЛ с высоким сродством связывается с плюс-цепью РНК4 в условиях in vivo.

Мутационный анализ функционального домена белка оболочки ВМЛ показал, что N-терминальная часть белка оболочки (с 1 по 85 ао) содержит РНК- связывающий домен, способный активировать экспрессию -галактозидазы в трехгибридной системе.

С-терминальная часть белка оболочки ВМЛ (с 86 по 221 ао) непосредственно с РНК не взаимодействует, однако активность -галактозидазы в случае взаимодействия только N-терминального домена ниже в пять раз по сравнению с полноразмерным белком оболочки, что может свидетельствовать о том, что третичная структура полноразмерного белка оболочки ВМЛ более оптимальна для этого взаимодействия.

Ключевые слова: РНК-белковые взаимодействия, трехгибридная система, вирус мозаики люцерны, белок оболочки.

ANNOTATION

Spyrydonov V.G. RNA-binding activity a coat protein of alfalfa mosaic virus in the three-hybrid system of Saccharomyces cerevisiae. – Manuscript.

Thesis for Ph. D. Degree (Biology) on specialty 03.00.04 – biochemistry. of NAS of Ukraine, Kyiv, 2004.

The thesis is devoted to studying the molecular features of interaction a coat protein of alfalfa mosaic virus with RNA4, which encodes this protein.

Alfalfa mosaic virus (AMV) is a worldwide-distributed plant virus with unique morphology and relative broad host range. The symptoms of infection are diverse (e.g., mosaic, mottling, necrotic and chlorotic local lesion, systemic necrosis etc.), and strongly depend on the virus strain, host variety, stage of growth and experimental conditions.

The genome of AMV consists of three ssRNAs separately encapsidated into bacilliform particles of different lengths. RNA 1 and RNA 2 encode the replicase proteins P1 and P2, bicistronic RNA 3 encodes the movement protein P3 and the coat protein (CP). CP is translated from subgenomic RNA 4.

The four RNAs (1-4) complexes with a small amount of CP are essential for the start of infection process. The early function of CP in initiation of infection was termed “genome activation”. The molecular mechanism of genome activation is unknown, despite the fact that the AMV has been the subject of biochemical and molecular-biological studies for many years.

We obtained the recombinant coat protein of AMV in the bacterial expression system. For this purpose we cloned ORF of the CP gene into plasmid pET-24a using PCR technique. The protein encoding this construction had some amino acidic replacements, (G119S and Q159R) and was on three amino acidic residuals shorter then the natural protein. A reason of absence 6xHis on the C-terminal, the recombinant protein was purified as inclusion bodies by set of washing.

Two rabbits were immunized first with 0,5mg of respective purified recombinant CP (rCP AMV) emulsified in Freund’s complete adjuvant. Inoculations were subcutaneous injection on shaven backs. In the subsequent injection we used Freund’s incomplete adjuvant and 0,5mg of purified recombinant CP. Three booster injections were given every 2 weeks following the primary injection. Two weeks after the last immunization, blood was collected from respective ear vessels.

ELISA test was performed for evaluation of specificity and sensitivity obtained antiserum. The results have shown that the titer of antibodies against rCP AMV composed 1/6400 (OD450 - 1,75).

Western blot assay has shown that rCP AMV, isolated from bacteria as inclusion bodies, occurs as stable dimers in solution.

Using a yeast two-hybrid system we have shown the negative influence of mutation Q159R on the homodimers formation in vivo.

For studying interaction of AMV CP with RNA4 we used a yeast three-hybrid system. We have shown that AMV CP is bound with high affinity to the plus-strand of RNA4 in vivo. The mutational analysis has shown, that the N-terminal part of AMV CP (aa 1 to 85) contains an RNA-binding domain. The C-terminal part of this protein (aa 86 to 221) does not participate in the direct interaction with RNA4. However, the activity of the reporter-gene LacZ, which codes -galactosidase in case of interaction of only the N-terminal part of AMV CP, is lower by five times in comparison with full-length hybrid protein, which probably testifies to that the tertiary structure of full-length AMV CP is more favorable for the interaction with RNA4.

Key words: RNA-protein interaction, three-hybrid system, alfalfa mosaic virus, coat protein.