НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Тимченко Наталія Миколаївна

УДК 612.014.46.111.11:57.043

ВПЛИВ ТЕМПЕРАТУРИ ТА СКЛАДУ СЕРЕДОВИЩА НА ФЕТАЛЬНИЙ ГЕМОГЛОБІН І ГЕМОГЛОБІН ДОНОРСЬКОЇ КРОВІ

03. 00. 19 – кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини

Національної академії наук України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Моісеєв Віктор Олексійович,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної

академії наук України, головний науковий співробітник

відділу кріобіофізики.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Жегунов Геннадій Федорович,

Харківська державна зооветеринарна академія Міністерства

аграрної політики України, завідувач кафедри хімії і біохімії;

кандидат біологічних наук, доцент Гаташ Сергій Васильович,

Харківський національний університет МОН України,

доцент кафедри біологічної і медичної фізики.

Провідна установа: Харківський державний медичний університет Міністерства охорони

здоровя України, кафедра біохімії, м. Харків.

Захист відбудеться 22.06. 2004 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІПКіК НАН України за

адресою: 61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий 21.05. 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

Член-кореспондент НАН України Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Результати кріобіологічних досліджень мають величезне значення для практичного застосування в різних галузях народного господарства. Дані експериментів в області кріобіології дозволили визначити, зокрема, роль білків в кріопошкодженні біологічних систем різного рівня організації. Тепер ще залишаються актуальними питання консервації клітин кордової крові - еритроцитів. Основним білком еритроцитів є гемоглобін. Широке застосування методів низькотемпературного зберігання біологічних об’єктів потребує більш глибокого вивчення механізмів впливу факторів низькотемпературного консервування на молекулярному рівні.

Будова молекули гемоглобіну змінюється у процесі онтогенеза, але, незалежно від типу і періоду синтезу, більшість молекул гемоглобіну мають по два однакових поліпептидних ланцюга. Ембріональні гемоглобіни присутні на протязі перших двох місяців гестації. В останній ембріональний період життя після двох місяців гестації відбувається переважно синтез -ланцюгів, внаслідок чого переважає фетальний гемоглобін (гемоглобін F) (Карлсон Б., 1983). Структурно-функціональні особливості фетального гемоглобіну не так широко вивчені, як гемоглобіну А. Особливістю фетального гемоглобіну є те, що він в порівнянні з гемоглобіном А в фізіологічних умовах володіє підвищеною спорідненістю до кисню. Успішні результати застосування фетальних еритроцитів і розчинів фетального гемоглобіну завдяки вираженому антигипоксичному ефекту в експериментальних дослідженнях (Антоненко В.Т., 1979, 1980) обумовили необхідність тривалого зберігання гемоглобінів кордової крові.

Раніше досліджувалось пошкодження білків при заморожуванні (Білоус А.М., Луговий В.І., Лемешко В.В., 1976) і в теперішній час ця тема залишається актульною (Koseki T., 1990; Anchordoquy T.J., Carpenter J.F., 1996; Cao E., Foster P.R., 2003). Також були досліджені механізми кріопошкоджень білків, які мають четвертичну структуру. Визначено, що в результаті заморожування-відтавання відбувається дисоціація молекул білків і подальша рекомбінація. Гіперконцентрація електролітів, яка виникає у розчині при виморожуванні води, є основною причиною структурної перебудови молекули. При заморожуванні діє пошкоджуючий білки фактор – дегидратація поліпептидних ланцюгів, порушується конформаційний стан білка, зростає ступінь міжмолекулярних контактів, при цьому створюються умови для швидкого окислення SH-груп і створення S-S зв’язків, внаслідок чого втрачаються специфічні властивості білка. При застосуванні кріопротекторів можна запобігти процесу утрати властивостей біомакромолекул при охолодженні. Разом з тим не вивчені механізми пошкодження фетального гемоглобіну при заморожуванні-відтаванні. Саме тому дослідження структурно-функціональних властивостей фетального гемоглобіну при впливі пошкоджуючих факторів в процесі заморожування–відтавання, при взаємодії його з кріопротекторами, являються на даний час актуальними. Значимість невирішених проблем обумовила вибір теми, її актуальність й цільову спрямованість дисертаційного дослідження.

Зв‘язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі кріобіофізики в рамках планових тем НДР ІПКіК НАН України: № 69 “Дослідження впливу температури на структурний стан мембрани і цитозолю, а також на проникненість для електролітів і неелектролітів еритроцитів людини на різних стадіях розвитку і при деяких патологіях”, шифр – 2.2.6.69, № держреєстрації 0201U005152; № 99 “Дослідження впливу низьких температур і складу середовища на деякі елементи фетоплацентарного комплексу людини (клітини і плазма кордової крові, тканини плаценти та їх екстракти)”, шифр – 2.2.6.99, № держреєстраії 0100U003482.

Мета і задачі дослідження. Мета дослідження - визначити, як впливає заморожування–відтавання і склад середовища на конформаційний і функціональний стан гемоглобінів А і F людини.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

1.

2.

3.

4.

Об‘єкт дослідження. Конформаційний і функціональний стан гемоглобінів А і F людини.

Предмет дослідження. Структурно-функціональні зміни гемоглобінів A і F, викликані заморожуванням–відтаванням та впливом на них складу середовища (сольових розчинів і кріопротекторів).

Методи дослідження. Методами ультрафіолетової диференціальної спектрофотометрії, гель-хроматографії, сольвентно-пертурбаційної диференціальної спектрофотометрії, температурно-пертурбаційної диференціальної спектрофотометрії в діапазоні температур +10+380С досліджувався конформаційний стан гемоглобіну A і фетального гемоглобіну. Ультрафіолетовою диференціальною спектрофотометрією вивчався характер впливу заморожування-відтавання і складу розчинника, методом гель-хроматографії досліджувався вплив складу розчинника, сольвентно-пертурбаційною диференціальною спектрофотометрією вивчався вплив заморожування–відтавання і кріопротекторів на конформаційний стан гемоглобіну А і фетального гемоглобіну. Температурно-пертурбаційною диференціальною спектрофотометрією в діапазоні температур +10+380С досліджувався конформаційний стан гемоглобіну A і фетального гемоглобіну до і після заморожування–відтавання. Диференціальною скануючою калориметрією визначали температури денатурації білків. Спектрофотометрією вивчали зв’язування гемоглобінами А і F органічного барвника бромтимолового синього. Спектрофотометрично кількісно визначали наявність окси-, дезокси- і метформ гемоглобінів А і F.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що вперше експериментально встановлено, що після заморожування–відтавання спостерігається збільшення вмісту метгемоглобінів у розчинах гемоглобінів A і F. Показано, що для молекули фетального гемоглобіну розпад на дімери відбувається при менших концентраціях натрію хлориду і калію хлориду, ніж для гемоглобіну А. Визначено, що фетальний гемоглобін функціонально менш стійкий, ніж гемоглобін А, до дії розчинів натрію хлориду і калію хлориду концентраціями 0,5-3,5М і подальшого заморожування–відтавання в присутності цих концентрацій солей. Вперше встановлено, що 1,2-пропандіол змінює конформацію фетального гемоглобіну після заморожування-відтавання, тоді як у випадку гемоглобіну А такого впливу не виявлено. Показано, що фетальний гемоглобін менше агрегує в присутності поліетиленгліколя-1500 в порівнянні з гемоглобіном А. Визначені числові значення параметрів зв’язування фетальним гемоглобіном органічного барвника бромтимолового синього, які вказують на те, що у фетального гемоглобіну в порівнянні з гемоглобіном А менше доступних гідрофобних областей на поверхні молекули.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані в роботі дані будуть використані при вивченні механізму дії заморожування–відтавання на конформаційний і функціональний стан гемоглобіну F. Вони також можуть враховуватися при розробці методів збереження розчинів гемоглобінів кордової крові, скоректованих з врахуванням особливостей фетального гемоглобіну в тому, що його стійкість до дії пошкоджуючих факторів при заморожуванні-відтаванні менше, ніж у гемоглобіну А.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно проаналізував дані літератури за темою дослідження. Автором разом з науковим керівником були визначені мета та завдання роботи, сформульовані остаточні висновки. Автором особисто одержані результати експериментальних досліджень та проведено їх статистичну обробку, зроблено попередні висновки. В статтях, опублікованих спільно з Розановою К.Д. та іншими співавторами, були використані результати, самостійно отримані здобувачем. У роботі, опублікованій сумісно з Онищенко О.В., автор готував зразки для експериментів, обробляв та аналізував одержані результати.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертаційної роботи доповідались і обговорювались на конференції молодих вчених ІПКіК НАН України (м. Харків, 2001); Всеукраїнській науковій конференції “Успіхи і перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини” (м. Харків, 2001); V з’їзді білоруського суспільного об’єднання фотобіологів і біофізиків „Молекулярні, мембранні і клітинні основи функціонування біосистем (м. Мінськ, 2002); 14-й зустрічі European Association for Red Cell Research (м. Роскофф, Франція, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті в провідних фахових наукових журналах і 4 тез доповідей на міжнародних і національних наукових конференціях.

Обсяг і структура дисертації. Матеріали викладені на 114 сторінках друкованого тексту і містять: введення, огляд літератури (1 розділ), матеріали, методи і методика досліджень (2 розділ), результати досліджень і їх обговорення (3-6 розділ), заключення, висновки. Матеріали дисертації проілюстровані 30 рисунками й 7 таблицями. Список літератури складається з 136 джерел і викладений на 15 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Дослідження проводились в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. Використовували оксигемоглобін А людини (НbА), виділений з свіжої донорської крові і очищений методом гель-хроматографії; фетальний гемоглобін (HbF), виділений з кордової крові за допомогою денатурації гемоглобіну А і осадження його сульфатом амонію, і очищення методом гель-хроматографії. Метгемоглобіни А і F одержували шляхом окислення оксигемоглобінів А і F надміром 1М ферецианіду калію і очищення одержаних розчинів на хроматографічній колонці.

Ліпосоми формували з фосфатидилхоліну (ФХ) і кардіоліпіну (КЛ) у ваговому співвідношенні ФХ:КЛ=4:1, грубу дисперсію опрацьовували 10 хв ультразвуком за допомогою ультразвукового диспергатора на частоті 22кГц. Заморожування розчинів гемоглобінів А і F проводили у фізіологічному розчині з середньою швидкістю 200С/хв до температури рідкого азоту. Відтавання здійснювали на водяній бані при +200С. Вміст оксиформ HbA і HbF в гемолізатах перед виділенням гемоглобінів складав 902%. Розчини бромтимолового синього (БТС) готували на 0,05М Na–фосфатному буфері, рН 7,2. Час контакту HbA і HbF з БТС складав 20 хв. Спектри поглинання розчинів HbA і HbF, БТС, зразків HbA+БТС, HbF+БТС записували на спектрофотометрі “РYЕ UNICAM 8000” (Великобританія). Концентрації HbA і HbF в зразках визначені спектрофотометрично і склали 0,81,410-5М і 1,21,510-5М, відповідно; концентрації БТС – 530*10-6М.

Сольвентно-пертурбаційна диференціальна спектрофотометрія в ультрафіолетовій області застосовувалась для дослідження конформаційного стану молекул гемоглобіну А і фетального гемоглобіну при взаємодії цих білків з розчинами кріопротекторів.

Температурно-пертурбаційною диференціальною спектрофотометрією в ультрафіолетовій області оцінювали конформацію білків при дослідженні впливу температури в інтервалі +10+38С на фетальний гемоглобін і гемоглобін А до і після заморожування-відтавання.

Метод гель-хроматографії застосовувався для оцінки агрегатного стану білків в розчинах солей концентраціями 0,5-3,5М. Для характеристики конформаційного стану білка використовували перші похідні спектрів поглинання гемоглобінів А і F в ультрафіолетовій області. Спектрофотометрично кількісно визначали вміст окси-, дезокси- і метформ гемоглобінів А і F.

Диференціальною скануючою калориметрією визначали температуру денатурації білків за величиною температури у максимумі термограм, що реєструються. Кінетичні залежності процесів зв’язування окси- і метгемоглобінів А і F з ліпосомами одержували, реєструючи зміну оптичної щільності білок-ліпідних сумішів у максимумі смуги Соре. Результати експериментів оброблені статистично з врахуванням коефіцієнтів Стьюдента для n5 при довірливій імовірності Р=0,95.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив заморожування–відтавання на розчини гемоглобіну A і фетального гемоглобіну. Вивчення вмісту різних форм гемоглобіну у розчинах білків показали, що після заморожування–відтавання спостерігається збільшення вмісту метгемоглобіну. Одержані результати свідчать про те, що в процесі заморожування–відтавання утворюються умови, які сприяють окисленню заліза в білках. Оскільки в розчині присутній тільки NaCl, можливо, такі умови утворюються при концентруванні солі в процесі вимерзання води. Проведені дослідження в розчинах NaCl концентраціями 0,5-3,5М підтверджують наші припущення.

Заморожування–відтавання розчинів гемоглобіну А і фетального гемоглобіну приводить до конформаційних змін в молекулах цих білків. Після заморожування-відтавання білків відбувається зміщення максимуму спектра поглинання розчинів гемоглобіну А і фетального гемоглобіну в короткохвильову область. Це свідчить про збільшення доступності розчиннику поглинаючих хромофорів, в даному випадку, тирозинових амінокислотних залишків, так як зміни в формі першої похідної спектрів поглинання (ІПСП) відбуваються в області 277 нм, яка відповідає поглинанню тирозинових амінокислотних залишків, що розташовуються в полярних областях. Таким чином, заморожування-відтавання розчинів гемоглобіну А і фетального гемоглобіну приводить до конформаційних змін, які торкаються переважно полярних областей білкових глобул.

Досліджено вплив температури в діапазоні +100С+380С на гемоглобін А і фетальний гемоглобін до і після заморожування-відтавання. При цьому використовували методи температурно-пертурбаційної спектрофотометрії і аналізу ІПСП. Залежність інтенсивності в максимумі температурно-пертурбаційних диференціальних спектрів при 286 нм (температура порівняння +100С), пронормованої на інтенсивність спектра поглинання при +100С, від температури для розчинів гемоглобіну А і фетального гемоглобіну має S-образний вид. На цій залежності для гемоглобіну А існують злами: перший в області температур +250С+270С і другий в області температур +330С+350С. Для фетального гемоглобіну подібні злами спостерігаються при менших температурах: перший в області температур +200С+230С, другий в області температур +270С+300С. Ця S-образна залежність, можливо, звязана з наявністю конформаційних змін в молекулі гемоглобіну А в області температур +250С+350С, а фетального гемоглобіну – в області температур +200С+300С. Для розчинів гемоглобіну А при +100С і +180С структури ІПСП схожі між собою, а при +100С і +360С – відрізняються. Також для розчинів фетального гемоглобіну при +100С і +180С структури ІПСП схожі між собою, а при +100С і +360С - відрізяються. Це свідчить про те, що молекули гемоглобінів А і F мають різний конформаційний стан при +100С і +360С. При дослідженні впливу температур в області +100С+380С на конформаційний стан гемоглобінів А і F виявлено, що після заморожування-відтавання розчинів цих білків відбувається згладжування зламів на залежностях інтенсивності в максимумі температурно-пертурбаційних диференціальних спектрів при 286 нм (температура порівняння +100С), пронормованої на інтенсивність спектра поглинання при +100С, від температури. Це свідчить про те, що згладжуються, стають менше помітними за результатами експерименту температурозалежні конформаційні зміни в білкових молекулах.

Методом диференціальної скануючої калориметрії була визначена температура плавлення фетального гемоглобіну +620С. Це не суперечить літературним даним про те, що HbF менш температуростійкий у порівнянні з HbA.

Методом диференціальної скануючої калориметрії досліджено вплив заморожування-відтавання на температуру денатурації гемоглобіну і за максимумами термограм визначено, що температура денатурації HbF в фізіологічному розчині зменшилась.

Таким чином, заморожування-відтавання розчину гемоглобіну F приводить до невеликого зниження термостійкості і згладжування температурозалежних конформаційних змін. Крім того, в процесі заморожування гемоглобіну А і фетального гемоглобіну утворюються умови, які сприяють окисленню заліза в гемоглобіні, котрі, можливо, викликані концентрованим сольовим розчином. Тому для подальшого розкриття цих механізмів нами було вивчено питання зясування характеру впливу сольових розчинів на білки, що вивчаються.

Вплив розчинів солей концентраціями 0,5-3,5М і заморожування–відтавання на стан гемоглобінів А і F. Наведені результати експериментального дослідження впливу розчинів натрію хлориду і калію хлориду концентраціями 0,5-3,5М, заморожування–відтавання на конформаційний і функціональний стан гемоглобінів А і F за допомогою методів ультрафіолетової диференціальної спектрофотометрії, гель-хроматографії та кількісного визначення окси-, дезокси- і метформ гемоглобінів.

За допомогою методу ультрафіолетової спектрофотометрії одержані ІПСП, які характеризують конформаційний стан гемоглобінів А і F в фізіологічному розчині і з різними концентраціями натрію хлориду. На ІПСП гемоглобіну F максимум в області 277 нм (відповідний поглинанню тирозинових залишків білків) є більш виражений в порівнянні з гемоглобіном А. Це підтверджує відомий факт про більший вміст тирозину в фетальному гемоглобіні в порівнянні з гемоглобіном А. Форми ІПСП HbA і HbF, починаючи з 0,5М натрію хлориду, практично не змінюються до певних концентрацій натрію хлориду, після яких в області 277 нм приймають інший вигляд, теж в свою чергу незмінний при подальшому збільшенні концентрації солі. Концентрації натрію хлориду, після яких відбуваються зміни в формі ІПСП в області 277 нм для гемоглобіну А – 22,5М, для гемоглобіну F – 1,52М натрію хлориду.

Методом ультрафіолетової диференціальної спектрофотометрії одержані залежності Е/Е від концентрації натрію хлориду в розчині для гемоглобіну А і фетального гемоглобіну (рис. 1). Злам на цих залежностях пов’язаний з розпадом тетрамерів гемоглобінів А і F на димери. Як видно з рис. 1, дисоціація фетального гемоглобіну відбувається при більш низьких концентраціях натрію хлориду.

Рис. 1. Залежність інтенсивності в максимумі диференціальних спектрів при 277 нм гемоглобіну А і фетального гемоглобіну в присутності розчинів NaCl концентраціями 0,5-3,5М (порівняння з поглинанням відповідного білка в фізіологічному розчині), пронормованої на інтенсивність спектра поглинання відповідного білка в фізіологічному розчині, від концентрації NaCl.

Одержано розподіл гемоглобінів А і F за молекулярними масами в розчинах з різною концентрацією натрію хлориду методом гель-хроматографії. Встановлено, що положення максимумів на кривих фракціонування розчинів як гемоглобіну А, так і гемоглобіну F в 1,5М натрію хлориду відповідає одній і тій же фракції з молекулярною масою 64 кД. При фракціонуванні розчинів гемоглобіну А і F в 1,9М натрію хлориду положення максимумів для гемоглобіну А не змінюється, в той час як для гемоглобіну F зсувається й відповідає фракції з молекулярною масою 36 кД (рис.2).

Рис. 2. Криві фракціонування розчинів гемоглобіну А і фетального гемоглобіну в присутності 1,5M и 1,9M натрію хлориду. (Е577 - інтенсивність спектра поглинання при 577 нм розчинів гемоглобінів).

Таким чином, можемо зробити висновки, що фетальний гемоглобін є менш стійкий до дії розчинів натрію хлориду і калію хлориду концентраціями 0,5-3,5М, оскільки для нього відбуваються зміни конформації, а також з‘являються фракції зі значно меншою молекулярною масою – при менших концентраціях солі. Можливо, це пов’язано з відомим фактом меншого вмісту двох реактивних SH-груп в фетальному гемоглобіні (в порівнянні з гемоглобіном А), які підтримують четвертичну структуру цих білків.

Після заморожування-відтавання білків в розчинах солей (гемоглобіну А в 1,5М NaCl, фетального гемоглобіну в 1М NaCl), менших за концентрацією, ніж ті, що викликають дисоціацію білкової молекули на димери до заморожування-відтавання, спостерігається зміщення “ноля” ІПСП (максимуму спектра поглинання) в короткохвильову область. Це свідчить про збільшення доступності розчиннику поглинаючих хромофорів. Для фетального гемоглобіну збільшення доступності розчиннику поглинаючих хромофорів після заморожування-відтавання відбувається

при менших концентраціях солі, ніж для гемоглобіну А.

Кількісне визначення окси-, дезокси- і метформ гемоглобінів після заморожування–відтавання гемоглобінів А і F з різними концентраціями натрію хлориду показало, що після заморожування–відтавання гемоглобінів А і F в розчинах солі, які не викликають дисоціацію цих білків, збільшується вміст дезоксигемоглобінів і зменшується вміст оксигемоглобінів, а в розчинах, які приводять до дисоціації гемоглобінів А і F, підвищується вміст метгемоглобіну за рахунок зменшення кількості оксигемоглобіну. Для гемоглобіну F збільшення вмісту метформи починається при менших концентраціях натрію хлориду. Можемо зробити висновок, що фетальний гемоглобін є менш стійкий до дії розчинів натрію хлориду і калію хлориду концентраціями 0,5-3,5М і подальшого заморожування-відтавання в присутності цих концентрацій солі.

Вплив гліцерину, 1,2-пропандіолу і поліетиленгліколю-1500 на стан гемоглобінів А і F при заморожуванні–відтаванні. За допомогою методу сольвентно-пертурбаційної спектрофотометрії досліджено вплив гліцерину, 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), поліетиленгліколю-1500 (ПЕГ-1500) на конформаційний стан HbA і HbF при заморожуванні–відтаванні.

Залежність інтенсивності в максимумі сольвентно-пертурбаційних диференціальних спектрів при 286 нм розчинів HbA і HbF з гліцерином (порівняння з поглинанням відповідного білка в фізіологічному розчині), пронормованої на інтенсивність спектра поглинання відповідного білка в фізіологічному розчині, від концентрації гліцерину має лінійний характер. Структура (положення “ноля” й негативних максимумів) ІПСП цих розчинів не змінюється. Це означає, що за допомогою методу сольветно-пертурбаційної диференціальної спектрофотометрії не фіксуються зміни конформації білків при збільшенні концентрації гліцерину до 40%. Після заморожування–відтавання конформаційний стан HbA і HbF також не змінюється.

Залежність Е/Е від концентрації 1,2-ПД для розчинів HbA і HbF з 1,2-ПД має лінійний характер (рис. 3, 4). Це означає, що за допомогою методу сольветно-пертурбаційної

диференціальної спектрофотометрії не фіксуються зміни конформації білків при збільшенні концентрації 1,2-ПД до 40%. Після заморожування-відтавання розчинів HbA з 1,2-ПД конформаційний стан білка залишився незмінним (рис.3). Для розчинів HbF з 1,2-ПД заморожування–відтавання привело до зменшення кута нахилу цієї залежності, що, можливо, свідчить про меншу доступність розчиннику хромофорів HbF в середовищі з 1,2-ПД після заморожування–відтавання (рис.4).

В присутності в розчинах гемоглобіну ПЕГ-1500 спостерігається агрегація білків, що

утруднює структурні дослідження. Порівняльне вивчення впливу ПЕГ-1500 на конформаційний стан HbA і HbF показало, що в присутності ПЕГ-1500 гемоглобін А більше агрегує, ніж гемоглобін F, це видно з даних по світлорозсіюванню (табл.).

Також була досліджена температура денатурації фетального гемоглобіну в розчинах, що містять 1,2-ПД та гліцерин до й після заморожування–відтавання за допомогою адіабатичного скануючого мікрокалориметра ДАСМ-4. Для цього знімали термограми розчинів фетального гемоглобіну на фізіологічному розчині (0,15М NaCl) з добавками гліцерину або 1,2-ПД в кількості до 30 мас%. З одержаних термограм знаходили температуру денатурації HbF. Після

заморожування–відтавання й подальшого досліджування методом диференціальної скануючої

Рис. 3. Залежність інтенсивності в максимумі сольвентно-пертурбаційного диференціального спектра при 286 нм розчинів HbA з 1,2-ПД (порівняння з поглинанням HbA в фізіологічному розчині), пронормованої на інтенсивність спектра поглинання HbA в фізіологічному розчині, від концентрації 1,2-ПД: 1 – до, 2 – після заморожування-відтавання.

калориметрії одержані дані про те, що температура плавлення фетального гемоглобіну в фізіологічному розчині зменшується. При додаванні до розчину 1,2-ПД на термограмах реєструється зниження температури денатурації, в той час як при додаванні гліцерину суттєвих відмін в температурах денатурації HbF не реєструється.

Таким чином, гліцерин не змінює конформацію HbA і HbF до і після заморожування-відтавання. 1,2-ПД також не змінює конформацію HbA і HbF до заморожування-відтавання, а

після заморожування-відтавання конформаційний стан фетального гемоглобіну змінюється, в той час як гемоглобіну А залишається незмінним.

Взаємодія фетального гемоглобіну з органічним барвником бромтимоловим синім і з ліпосомами. Одним з методів вивчення розподілу по білковій макромолекулі полярних і неполярних груп є взаємодія органічних фарбників з білками. Перед тим, як досліджувати взаємодію HbA і HbF з ліпосомами, ми вивчали доступні фарбнику гідрофобні області HbF, так як відомо, що білки взаємодіють з ліпосомами, як і з БТС, зокрема, за допомогою гідрофобних зв’язків. Проведено дослідження зв’язування фетальним гемоглобіном органічного барвника

бромтимолового синього. Використовували розчини HbA і HbF в 0,05М Na–фосфатному буфері,

Рис. 4. Залежність інтенсивності в максимумі сольвентно-пертурбаційного диференціального спектра при 286 нм розчинів HbF з 1,2-ПД (порівняння з поглинанням HbF в фізіологічному розчині), пронормованої на інтенсивність спектра поглинання HbF в фізіологічному розчині, від концентрації 1,2-ПД: 1 – до, 2 – після заморожування-відтавання.

Таблиця

Світлорозсіювання розчинів HbA и HbF в присутності ПЕГ-1500

Білок | Концентрація ПЕГ-1500, % | 0 | 10 | 40

HbA | 0,0720,008 | 0,0820,008 | 0,1880,009

HbF | 0,0710,009 | 0,0750,009 | 0,0870,007

рН 7,2.

Зв’язування БТС гемоглобіном приводить до зменшення інтенсивності спектра поглинання при 615 нм. Визначали параметри зв’язування фарбника оксигемоглобінами А і F (число місць зв’язування органічного фарбника БТС білком та константу дисоціації комплексу білок-фарбник). Концентрація вільного БТС в розчині є більшою при зв’язуванні БТС гемоглобіном F, ніж гемоглобіном А. Число місць сорбції БТС гемоглобіном F виявилось менше, ніж гемоглобіном А. Константа дисоціації комплексу білок-фарбник менше для фетального гемоглобіну в порівнянні з гемоглобіном А. Це указує на більш міцне зв’язування фарбника фетальним гемоглобіном, ніж гемоглобіном А.

З літератури відомо, що в -ланцюзі фетального гемоглобіну міститься менше гідрофобних амінокислотних залишків, ніж в -ланцюзі гемоглобіну А. Але залишалось невідомим, в якому білку на поверхні менше доступних фарбнику гідрофобних центрів. Через те, що зв’язування аніонного барвника з білком при рНрІ здійснюється шляхом гідрофобних взаємодій, менше сорбування БТС на поверхні молекули HвF в порівнянні з HвA при рН 7,2 говорить про те, що доступних гідрофобних центрів на поверхні молекули фетального гемоглобіну менше, ніж на поверхні гемоглобіну А.

Відомо, що гемоглобін взаємодіє з еритроцитарними й штучними мембранами. Достатньо докладно вивчено взаємодії гемоглобіну А з модельними ліпосомальними мембранами. Раніше були зроблені спроби практичного застосування ліпосом зі зв’язаним гемоглобіном А. У відношенні фетального гемоглобіну подібні роботи практично відсутні. З наших експериментів по зв’язуванню гемоглобінами А і F бромтимолового синього стало відомо, що кількість доступних фарбнику гідрофобних областей на поверхні цих білків різна. Представляло інтерес визначити, чи є різниця між гемоглобінами А і F у зв’язуванні з ліпосомами, так як відомо, що взаємодія білків з ними здійснюється також і за допомогою гідрофобних зв’язків.

Нами була досліджена кінетика взаємодії оксиHbA і оксиHbF з модельними ліпосомальними мембранами, сформованими з фосфатидилхоліну і кардіоліпіну за визначенням змін інтенсивності поглинання гемоглобіну у смузі Cope (414 нм).

Характер залежності зміни інтенсивності спектра поглинання у смузі Соре від часу для оксигемоглобіну А відповідає даним літератури. Для оксигемоглобіну F не виявлено значних відмін від оксигемоглобіну А. Вважається, що взаємодія гемоглобіну з ліпідами включає адсорбцію гемоглобіну на поверхні ліпідних везикул, вбудування фрагмента білкової молекули в біслой, зміну конформації білка. Є дані про те, що комплексоутворення зумовлене електростатичною взаємодією гемоглобіну з полярними головками КЛ та ФХ, а також зв’язане з проникненням (вбудуванням) білків у внутрішню область ліпідного біслою і з гідрофобною взаємодією гемоглобіну з ліпідами. Крім того, відомо, що при взаємодії окси- і метгемоглобіну з ліпідами в модельних і природних мембранах ці форми гемоглобіну приймають участь в ініціації процесу перекисного окислення ліпідів. Індукція перекисного окислення ліпідів у модельних системах супроводжується перетворенням оксигемоглобіну в метформу.

Як нами виявлено, кількість доступних гідрофобних областей на поверхні гемоглобіну А і фетального гемоглобіну різна. Не спостерігається відміна між гемоглобінами А і F в кінетиці зв’язування з ліпосомами, яке здійснюється також і за допомогою гідрофобних взаємодій.

Заморожування-відтавання оксигемоглобінів А і F практично не вплинуло на взаємодію цих білків з ліпосомами.

Показано, що оксиHbA з меншою швидкістю вбудовується в ліпосомальні мембрани в порівнянні з метHbA. Тому нами була вивчена кінетика взаємодії метHbA і метHbF з модельними ліпосомами, сформованими з фосфатидилхоліну і кардіоліпіну за зменшенням інтенсивності поглинання гемоглобіну у смузі Cope (405 нм).

Характер залежності зміни інтенсивності спектра поглинання метHbA у смузі Соре від часу відповідає літературним даним, для метHbF не виявлено значних відмінностей від метHbA.

Можна зробити висновок, що оксиформи фетального гемоглобіну й гемоглобіну А практично однаково взаємодіють з ліпосомами ФХ:КЛ, а також нема відмінностей у процесі утворення комплексу з ліпосомальними мембранами метформ гемоглобінів А і F. Заморожування–відтавання оксигемоглобіну А і оксигемоглобіну F практично не впливає на кінетику процесу взаємодії з ліпосомами, що вивчаються.

ВИСНОВКИ

1. Успішні результати застосування фетальних еритроцитів і розчинів фетального гемоглобіну в експериментальних дослідженнях обумовили необхідність тривалого зберігання еритроцитів і гемоглобінів кордової крові. Практично не вивчений вплив факторів низькотемпературного консервування на гемоглобін F. У зв’язку з цим в роботі було визначено, як впливає заморожування-відтавання і склад середовища на конформаційний і функціональний стан гемоглобінів А і F людини.

2. Заморожування-відтавання гемоглобінів А і F приводить до зміни конформації цих білків, що показано методом ультрафіолетової спектрофотометрії, і до зміни функціонального стану гемоглобінів А і F - підвищення вмісту метгемоглобіну.

3. Методами ультрафіолетової диференціальної спектрофотометрії і гель-хроматографії показано, що фетальний гемоглобін є менш стійким до дії розчинів натрію хлориду і калію хлориду концентраціями 0,5-3,5М – дисоціація цього білка починається при менших концентраціях солі у порівнянні з гемоглобіном А.

4. Методом сольвентно-пертурбаційної диференціальної спектрофотометрії встановлено, що гліцерин і 1,2-ПД в області концентрацій 1040% не впливають на конформацію фетального гемоглобіну до заморожування-відтавання. В присутності 10% и 40% розчинів ПЕГ-1500 відбувається агрегація макромолекул, причому фетальний гемоглобін агрегує в меншій мірі, ніж гемоглобін А.

5. Визначено, що заморожування-відтавання в присутності 1040% розчинів гліцерину дозволяє зберегти конформацію гемоглобіну А і фетального гемоглобіну незмінною. Розчини 1,2-ПД концентрацією 1040% дозволяють зберегти незмінною конформацію гемоглобіну А при заморожуванні-відтаванні, в той час як гемоглобін F зазнає конформаційних змін.

6. Кінетика взаємодії фетального гемоглобіну з модельними ліпосомальними мембранами, сформованими з фосфатидилхоліну і кардіоліпіну, не відрізняється від кінетики взаємодії гемоглобіну А з мембранами. Заморожування-відтавання не впливає на неї.

7. Одержані в роботі результати можуть враховуватися при розробці методів збереження розчинів гемоглобінів кордової крові, скоректованих з врахуванням особливостей фетального гемоглобіну в меншій стійкості, в порівнянні з гемоглобіном А, до дії пошкоджуючих факторів при заморожуванні-відтаванні.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Тимченко Н.Н., Розанова Е.Д., Моисеев В.А., Хромушкин К.Н. Изучение влияния концентрированных растворов натрия хлорида на состояние фетального гемоглобина и гемоглобина А // Біофізичний вісник. –2001.-№2 (9).-С.64-66. (Дисертантом виконані експерименти з порівняльного вивчення впливу розчинів хлориду натрію на гемоглобіни А і F, проведена статистична обробка даних та проаналізовані отримані результати; Розановою К.Д. виконано аналіз перших похідних спектрів поглинання розчинів гемоглобіну; Моісеєвим В.О. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів; Хромушкіним К.М. одержано біологічний матеріал для дослідження, виконано теоретичний аналіз одержаних результатів).

2. Тимченко Н.Н., Розанова Е.Д., Кучеренко Ю.В. Спектральные свойства фетального гемоглобина после замораживания-оттаивания в растворах глицерина и 1,2-пропандиола // Проблемы криобиологии.-2001.-№4.-С.73-74. (Дисертантом виконані експерименти з вивчення конформації гемоглобінів А і F після заморожування-відтавання в розчинах гліцерину і 1,2-ПД, статистично оброблені та проаналізовані отримані результати; Розановою К.Д. виконано аналіз диференціальних спектрів поглинання розчинів гемоглобіну з кріопротекторами; Кучеренко Ю.В. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів).

3. Тимченко Н.Н., Розанова Е.Д., Кучеренко Ю.В., Леонов Б.Н. Аутоокисление гемоглобинов А и F после замораживания-оттаивания // Проблемы криобиологии.-2002.-№4.–С.68-71.(Дисертантом виконані експерименти з вивчення впливу заморожування-відтавання на структурно-функціональний стан гемоглобінів А і F, проведена статистична обробка даних і проаналізовані отримані результати; Розановою К.Д. виконано аналіз перших похідних спектрів поглинання розчинів гемоглобіну; Кучеренко Ю.В. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів; Леоновим Б.М. виконані розрахунки вмісту різних форм гемоглобіну в розчинах).

4. Тимченко Н.Н. Влияние заморажиания-оттаивания на конформацию фетального гемоглобина и взаимодействие его с липосомами // Проблемы криобиологии. – 2003. - № 2. – С. 104-108.

5. Тимченко Н.Н., Розанова Е.Д., Моисеев В.А., Хромушкин К.Н. Сравнительное изучение влияния замораживания-оттаивания на гемоглобины А и F // Проблемы криобиологии. Тезисы докладов Всеукраинской научной конференции “Успехи и перспективы развития криобиологии и криомедицины”.–2001.-№3.-С.20. (Дисертантом виконане порівняльне вивчення впливу заморожування-відтавання в розчинах, що містять різні концентрації хлориду натрію, на гемоглобіни А і F; статистично оброблені та проаналізовані отримані результати; Розановою К.Д. виконані розрахунки вмісту різних форм гемоглобіну в розчинах; Моісеєвим В.О. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів; Хромушкіним К.М. одержано біологічний матеріал для досліджень, виконано теоретичний аналіз одержаних результатів).

6. Онищенко Е.В., Тимченко Н.Н. Влияние низких температур, глицерина и 1,2-пропандиола на термоденатурацию фетального гемоглобина// Проблемы криобиологии. Тезисы докладов конференции молодых ученых ИПКиК НАН Украины.-2002.-№1.-С. 113-114. (Дисертантом приготовлені зразки для експериментів та оброблені і проаналізовані отримані результати; Оніщенко О.В. виконані експерименти з дослідження впливу низьких температур, гліцерину і 1,2-пропандіолу на термоденатурацію фетального гемоглобіну).

7. Морозова Т.Ф., Дюбко Т.С., Тимченко Н.Н. Температурная лабильность белковой части и гема гемоглобина человека после охлаждения до температуры -196?С // Материалы V съезда белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков “Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем”.-Минск, Беларусь.-2002.-С.Т-82. (Дисертантом був виділений і очищений гемоглобін для дослідження, проведені спектральні вимірювання, статистична обробка спектральних даних, теоретичний аналіз одержаних результатів; Морозовою Т.Ф. виконане теоретичне узагальнення експериментального матеріалу; Дюбко Т.С. виконано розрахунок вмісту різних форм гемоглобіну в розчині і аналіз перших похідних спектрів поглинання гемоглобіну).

8. Morozova T.F., Rozanova E.D., Dyubko T.S., Timchenko N.N. Low temperature influence on donor blood hemoglobin // 14th Meeting of the European Association for Red Cell Research. – Roskoff, France. – 2003. – P. 8. (Дисертантом був виділений і очищений гемоглобін для дослідження, проведені спектральні вимірювання, статистична обробка спектральних даних, теоретичний аналіз одержаних результатів; Морозовою Т.Ф. виконано теоретичний аналіз одержаних результатів; Розановою К.Д, виконані розрахунки вмісту різних форм гемоглобіну в розчині; Дюбко Т.С. виконано аналіз перших похідних спектрів поглинання розчинів гемоглобіну).

АНОТАЦІЇ

Тимченко Н.М. Вплив температури та складу середовища на фетальний гемоглобін і гемоглобін донорської крові. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія. Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2004.

Дисертація присвячена дослідженню впливу температури, розчинів солей, кріопротекторів на гемоглобін А і фетальний гемоглобін, а також вивченню взаємодії цих білків з модельними ліпосомальними мембранами. Методом спектрофотометрії було показано, що заморожування-відтавання приводить до збільшення вмісту метформ гемоглобінів. Розчини солей приводять до розпаду гемоглобіну F на димери при менших концентраціях солей, ніж для гемоглобіну А. При низькомпературному впливі на гемоглобіни А і F 1,2-пропандіол змінює конформацію фетального гемоглобіну і не впливає на гемоглобін А. Виявлено, що заморожування-відтавання оксигемоглобінів А і F не впливає на кінетику взаємодії з ліпосомальними мембранами, сформованими з кардіоліпіну та фосфатидилхоліну.

Ключові слова: гемоглобіни А і F, конформаційний стан, диференціальна УФ-спектрофотометрія, кріопротектори, ліпосоми, заморожування-відтавання.

Тимченко Н.Н. Влияние температуры и состава среды на фетальный гемоглобин и гемоглобин донорской крови. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 – криобиология. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2004.

Диссертация посвящена исследованию влияния температуры, растворов солей, криопротекторов на гемоглобин А и фетальный гемоглобин, а также изучению взаимодействия этих белков с модельными липосомальными мембранами. Методом спектрофотометрии было показано, что замораживание-оттаивание приводит к конформационным изменениям в молекулах гемоглобинов А и F и к увеличению содержания метформ гемоглобинов. Растворы солей приводят к распаду гемоглобина F на димеры при меньших концентрациях солей, чем для гемоглобина А. При изучении влияния криопротекторов на состояние гемоглобина А и фетального гемоглобина методом спектрофотометрии обнаружено, что глицерин не изменяет конформацию фетального гемоглобина ни до, ни после замораживания-оттаивания. 1,2-пропандиол до замораживания-оттаивания не изменяет конформацию гемоглобина А и фетального гемоглобина; после замораживания-оттаивания в случае гемоглобина А конформационное состояние остается прежним, а для фетального гемоглобина среда с этим криопротектором оказывает действие таким образом, что хромофоры молекулы становятся меньше доступны растворителю по сравнению с доступностью растворителю до замораживания-оттаивания. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии обнаружено, что после замораживания-оттаивания температура плавления фетального гемоглобина в присутствии глицерина изменяется, а при наличии в растворе 1,2-пропандиола происходит уменьшение температур плавления. Определено, что замораживание-оттаивание оксигемоглобинов А и F не влияет на кинетику взаимодействия с липосомальными мембранами, сформированными из кардиолипина и фосфатидилхолина.

Ключевые слова: гемоглобины А и F, конформационное состояние, дифференциальная УФ-спектрофотометрия, криопротекторы, липосомы, замораживание-оттаивание.

Timchenko N.N. Effect of temperature and medium composition on fetal haemoglobin and donor blood hemoglobin. - Manuscript.

Thesis for competing the scientific degree of Candidate of Biological Sciences, speciality 03.00.19 - Cryobiology. - Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv, 2004.

Thesis is devoted to the investigation of the effect of temperature, saline solutions and cryoprotectants on hemoglobin A and fetal hemoglobin, as well as to the study of these proteins interaction with model liposomal membranes. Using the spectrophotometry method it was shown, that the freeze-thawing resulted in an increase of the hemoglobin metform content. The solutions of salts result in fetal hemoglobin disintegration in dimmers under lower concentrations of salts, than for hemoglobin A. Under low-temperature influence on hemoglobin A and fetal hemoglobin 1,2-propandiol changes the conformation of fetal hemoglobin and does not affect hemoglobin A. It was determined, that the freez-thawing of oxyhemoglobins A and F do not affect the kinetic of interaction with liposomal membranes, formed from cardiolipin and phosphatidylcholine.

Key words: hemoglobins A and F, conformational state, differential UV-spectrophotometry, cryoprotectants, liposomes, freeze-thawing.

Відповідальний за випуск Г.О. Бабійчук

Підписано до друку 6.05.2004. Формат 60х90/16.

Тираж 100 прим. Ум. друк. арк. 0,9.

Надруковано в ТОВ „Спайк”, м. Харків, вул. Сумська, 11

Тел.: 14-29-61