Національна академія наук України

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного

ВАЩЕНКО ЛЮДМИЛА МИКОЛАЇВНА

УДК 579.841.11:577.114

АНТИМУТАГЕННА І ПРОТИПУХЛИННА АКТИВНІСТЬ Pseudomonas syringae pv. atrofaciens i Pseudomonas syringae pv. coronafaciens

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2004

Дисертацією є рукопис

Дисертаційна робота виконана у відділі фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Гвоздяк Ростислав Ілліч,

Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д. К. Заболотного НАН України,

завідувач відділу фітопатогенних бактерій

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

член-кор. НАН України

Мацелюх Богдан Павлович,

Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д. К. Заболотного НАН України,

завідувач відділу генетики мікроорганізмів

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Сарнацька Вереса Василівна,

Інститут фізіології рослин та генетики

НАН України, провідний науковий співробітник

відділу фізіології росту і розвитку рослин

Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України

Захист відбудеться “21“ квітня 2004 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К.Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано “18” березня 2004 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Бактеріальні захворювання рослин завдають значної шкоди сільському господарству. Саме цим обумовлюється актуальність вивчення бактерій, які здатні уражувати рослини. Але не менш важливо дослідити екологічне значення фітопатогенних бактерій, які є постійними супутниками рослин і знаходяться не лише на уражених, але й на здорових рослинах (епіфітна та ендофітна фази). Разом із рослинами фітопатогенні бактерії або продукти їхньої життєдіяльності можуть потрапляти в організм людини і негативно впливати на неї. Відомо, що патогенні для людини бактерії мають мутагенний вплив на макроорганізм-хазяїна, спричиняючи збільшення кількості точкових мутацій, аберацій та зміни кількості хромосом у клітинах (Ильинских и др., 1984). Сапрофітні бактерії також можуть виявляти мутагенні властивості (Линдер и др., 2000). З іншого боку, бактеріям, які є постійними супутниками людини (молочнокислі, пропіоновокислі, біфідобактерії), притаманні антимутагенні властивості (Воробьева, Абилев, 2002). Що стосується фітопатогенних бактерій, то їхню здатність впливати на геном інших організмів і досі не з’ясовано.

Зернові культури займають важливе місце в щоденному раціоні людей. Зважаючи на широке розповсюдження фітопатогенних бактерій, які уражують зернові культури, та можливість надходження їх і продуктів їхньої життєдіяльності до організму людей, вивчення геномоделювальних властивостей збудників бактеріозів зернових є актуальним.

Не менш важливим є вивчення впливу фітопатогенних бактерій на процеси пухлиноутворення. Особливо це стосується ліпополісахаридів (ЛПС) фітопатогенних бактерій, яким властивий широкий спектр біологічної активності. Відомо, що ЛПС грамнегативних бактерій можуть використовуватися в імунотерапії онкологічних хворих. Однак стосовно фітопатогенних бактерій дані літератури суперечливі і свідчать як про позитивний, так і негативний вплив ЛПС на пухлиноутворення (Варбанец и др., 1995, Zdorovenko et al., 1997). Отже, вивчення дії фітопатогенних бактерій Pseudomonas syringae van Hall 1902 та їхніх ЛПС на пухлиноутворення є перспективним напрямом досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в межах НДР відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за темами: "Дослідження взаємовідносин між фітопатогенними, ендофітними та епіфітними бактеріями з метою виявлення їх ролі в стійкості рослин до хвороб" (номер державної реєстрації 0197U012033), "Дослідження фітопатогенних бактерій фітоценозу та їх генопротекторних, мутагенних та протипухлинних властивостей" (номер державної реєстрації 0101U009312).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення мутагенної та антимутагенної активності і впливу на пухлиноутворення двох патоварів P. syringae та їхніх ліпополісахаридів.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

§ вивчити біологічні властивості штамів P. syringae;

§ одержати та вивчити хімічний склад ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030;

§ дослідити вплив на частоту спонтанних та індукованих мутації у Salmonella typhimurium культуральної рідини та ліпополісахаридів P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030;

§ вивчити антимутагенну активність спиртового екстракту та соку із пшениці, інфікованої P. syringae pv. atrofaciens 8281;

§ підібрати штами Agrobacterium tumefaciens, які зумовлюють інтенсивне пухлиноутворення на експлантатах картоплі;

§ вивчити вплив культуральної рідини, клітин та ліпополісахаридів P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 на пухлиноутворення, спричинене A. tumefaciens на експлантатах картоплі.

Об’єкти дослідження: фітопатогенні бактерії P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 та їхні ліпополісахариди.

Предметом дослідження були мутагенна, антимутагенна та протипухлинна активність фітопатогенних бактерій P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 та їхніх ліпополісахаридів.

Матеріали та методи дослідження. Для вивчення властивостей досліджуваних штамів використано загальноприйняті мікробіологічні, біохімічні та серологічні методи. Ліпополісахариди екстрагували 0,85% розчином хлориду натрію, хімічний склад одержаних препаратів визначали за допомогою відомих біохімічних методів. Антимутагенні властивості вивчали із використанням бактеріальної тест-системи з ауксотрофними за гістидином штамами S. typhimurium, протипухлинні властивості – на моделі пухлиноутворення, спричиненого A. tumefaciens на експлантатах картоплі.

Наукова новизна одержаних результатів.

· Вперше для фітопатогенних бактерій встановлено, що за культивування на картопляному бульйоні P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 не утворюють метаболітів із мутагенною активністю.

· Виявлено, що ліпополісахаридам P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 притаманні антимутагенні властивості. Вони здатні зменшувати частоту спонтанних і індукованих біхроматом калію мутацій у тест-штамів S. typhimurium. Антимутагенна активність ліпополісахаридів є найвищою за одночасного внесення їх та біхромату калію до суспензії клітин тест-штамів і може бути зумовлена зв’язуванням мутагену.

· Показано, що інфікування пшениці у фазі сходів P. syringae pv. atrofaciens 8281 не впливає на антимутагенну активність соку з листків цієї рослини.

· Встановлено здатність культуральної рідини та зруйнованих ультразвуком клітин P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 зменшувати пухлиноутворення, спричинене A. tumefaciens на експлантатах картоплі.

· Показано, що ліпополісахариди P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 запобігають утворенню пухлин, зумовлених A. tumefaciens на експлантатах картоплі, та зменшують інтенсивність їхнього розвитку.

Практичне значення одержаних результатів. Результати роботи можуть бути використані при здійсненні скринінгу речовин мікробного походження з антимутагенними і протипухлинними властивостями, розробленні методів боротьби з хворобами рослин, спричиненими A. tumefaciens, у сільському господарстві, а також в лекційному курсі для студентів вищих навчальних закладів.

Особистий внесок здобувача. Основна частина експериментального матеріалу, викладеного в дисертації, одержана автором особисто. Автором проведено визначення хімічного складу препаратів ЛПС, вивчення геномоделювальної активності культуральної рідини, ЛПС, спиртових екстрактів і соку із листків пшениці, а також впливу культуральної рідини, клітин та ЛПС досліджуваних патоварів P. syringae на пухлиноутворення, спричинене A. tumefaciens. Аналіз результатів, їхнє узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків, підготовку до друку наукових статей проведено особисто за консультації наукового керівника дисертаційної роботи д.б.н., проф. Р.І. Гвоздяка.

Вивчення культуральних, біохімічних та патогенних властивостей P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 та одержання їхніх ліпополісахаридів здійснювали спільно з к.б.н. Л.А. Пасічник, яка є співавтором публікацій дисертанта.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені на: Міжнародній науково-практичній школі для молодих учених і спеціалістів “Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу” (Ужгород, 2001); конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників Інституту мікробіології і вірусології НАН України (Київ, 2001, 2003); Міжнародній конференції “Мікробіологія і біотехнологія XXI століття” (Мінськ, Бєларусь, 2002); 6-й Міжнародній конференції по патоварах Pseudomonas syringae і близьких патогенах (Маратеа, Італія, 2002); VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); 7-й Пущинській школі-конференції молодих учених “Біологія наука XXI століття” (Пущино, Росія, 2003); І Конгресі європейських мікробіологів (Любляна, Словенія, 2003); конференції молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології і генетики, присвяченій золотому ювілею подвійної спіралі ДНК та 30-річчю заснування Інституту молекулярної біології і генетики (Київ, 2003); Міжнародній науково-теоретичній конференції молодих учених “Молодь і досягнення науки у вирішенні проблем сучасності” (Чернівці, 2003).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковано в 4 статтях у фахових наукових журналах та 6 матеріалах і тезах конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 166 сторінках машинописного тексту. Вона складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, 5 розділів експериментальної частини, обговорення результатів, висновків, списку використаних джерел літератури, який містить 193 посилання, в т.ч. 106 іноземних авторів. Дисертаційна робота містить 29 таблиць і 26 рисунків.

Основний зміст роботи

Розділ 1. Огляд літератури

В огляді літератури, який складається з 6 підрозділів, висвітлено біологічні властивості збудників захворювань зернових культур, описано явище полібіотрофії фітопатогенних бактерій, наведено дані щодо хімічного складу і будови ліпополісахаридів Pseudomonas syringae та їхньої біологічної активності, розглянуто сучасний стан проблеми мутагенезу і пошуку речовин з антимутагенною активністю, наведено класифікацію антимутагенів та уявлення щодо механізму їхньої дії, охарактеризовано антимутагенні властивості мікроорганізмів, викладена інформація щодо явища пухлиноутворення, спричиненого Agrobacterium tumefaciens, та можливості використання його в якості моделі під час пошуку речовин із протипухлинною активністю.

Розділ 2. Матеріали і методи досліджень

Об’єктом дослідження були два штами фітопатогенних бактерій, які належать до двох патоварів: штам 8281 Pseudomonas syringae pv. atrofaciens (McCulloch 1920) Young, Dye & Wilkie 1978, ізольований з ураженого жита сорту Харківське 60, і штам 9030 Pseudomonas syringae pv. coronafaciens (Elliott 1920) Young, Dye & Wilkie 1978, ізольований з ураженого вівса сорту Грач.

Культуральні, фізіологічні та серологічні властивості цих бактерій вивчали загальноприйнятими методами (Бельтюкова и др., 1968; Klement et al., 1990). Для дослідження геномоделювальної і протипухлинної активності використовували культуральну рідину, яку одержували культивуванням бактерій на картопляному бульйоні при 28?С на качалках (240 об/хв). В зруйнованих ультразвуком клітинах P. syringae, після видалення залишків клітинних стінок, досліджували протипухлинну активність.

ЛПС екстрагували 0,85% -м водним розчином NaCl (Здоровенко и др., 1982) та очищали діалізом і ультрацентрифугуванням. Вміст білка визначали методом O. Lowry et al. (1951), вуглеводів – за реакцією з фенолом та сірчаною кислотою, 2-кето-3-дезоксиоктонової кислоти – за реакцією з тіобарбітуровою кислотою (Захарова, Косенко, 1982), нуклеїнових кислот спектрофотометричним методом А. С. Спирина (1958), жирних кислот – методом газорідинної хроматографії метилових ефірів жирних кислот (Brian, Gardner, 1967; Жеребило, Вишталюк, 1987).

Взаємодію між штамами P. syringae та тест-штамами A. tumefaciens і S. typhimurium вивчали методом відстроченого антагонізму (Егоров, 1965). Для з’ясування впливу ЛПС P. syringae на тест-культури A. tumefaciens і S. typhimurium їх вносили до поживних середовищ, на яких культивували бактерії.

Протипухлинну активність тестували за допомогою експлантатів бульб картоплі. Для індукції пухлиноутворення використовували суспензію клітин A. tumefaciens титром 109 кл/мл. На поверхню кожного експлантату наносили по 0,1 мл досліджуваного розчину та суспензії клітин A. tumefaciens (Гвоздяк та ін., 1998). Для вивчення впливу досліджуваних речовин на процеси прикріплення A. tumefaciens до рослинних клітин експлантати картоплі обробляли в різні строки до та після інокуляції їх суспензією клітин A. tumefaciens. Через три тижні інкубації експлантатів при температурі 20є? підраховували кількість та інтенсивність розвитку на них пухлин. Якщо на експлантаті утворилося до 10 горбиків пухлин розвиток пухлин вважали слабким, від 10 до 30 середнім, 30 і більше сильним (Гвоздяк та ін., 1998).

Для визначення антимутагенної активності використовували тест-систему з ауксотрофними за гістидином штамами Salmonella typhimurium таких генотипів: S. typhimurium ТА100 his G46, ?uvr B, rfa, рКМ101; S. typhimurium ТА98 his D3052, ?uvr B, rfa, рКМ101 (McCann et al., 1975).

Для вивчення впливу на спонтанний мутагенез 0,1 мл досліджуваної речовини (культуральної рідини, розчину ЛПС, спиртового екстракту або соку із листків пшениці) вносили до розплавленого напіврідкого агару одночасно із 0,1 мл суспензії клітин тест-штаму. Для вивчення впливу на індукований мутагенез до напіврідкого агару разом з суспензією тест-штаму та досліджуваною речовиною вносили 0,1 мл розчину мутагену – біхромату калію (концентрація 2 мг/мл). Напіврідкий агар виливали на шар мінімального агару без гістидину. Через 48 год культивування при температурі 37?С здійснювали облік кількості колоній His+ ревертантів. Антимутагенну дію стосовно спонтанного мутагенезу виражали у відсотках зменшення кількості ревертантів порівняно зі спонтанним фоном мутацій тест-штаму S. typhimurium. У разі вивчення впливу на індукований мутагенез у відсотках зменшенням кількості ревертантів, індукованих біхроматом калію за присутності досліджуваної речовини, порівняно з кількістю ревертантів, індукованих лише біхроматом калію. Статистичну оцінку даних проводили за t-критерієм Стьюдента (р < 0,05).

Штучне зараження пшениці у фазі сходів проводили в теплиці інокуляцією листків уколом крізь краплину бактеріальної суспензії. Після розвитку видимих ознак ураження, збирали листки рослин з ознаками ураження (дослід) і здорових рослин (контроль). Для одержання спиртового екстракту до подрібнених листків додавали 40%-й розчин етилового спирту у співвідношенні 1:10. Екстракцію проводили на киплячій водяній бані протягом 5 хв. Для одержання стерильного соку подрібнені листки розтирали до повного руйнування тканин, сік віджимали центрифугуванням (30 хв, 2000 об/хв) і фільтрували крізь азбестові фільтри.

Розділ 3. Біологічні властивості Pseudomonas syringae pv. atrofaciens i Pseudomonas syringae pv. coronafaciens

Основними збудниками бактеріальних захворювань жита в Україні є P. syringae pv. atrofaciens, вівса – P. syringae pv. coronafaciens. Штами цих патоварів було обрано об’єктами нашого дослідження. Оскільки ці штами тривалий час зберігали в лабораторних умовах, ми вважали необхідним вивчити їхні основні фізіолого-біохімічні властивості порівняно з типовим штамом P. syringae pv. syringae 8511 (NCPPB 281, ATCC 19310, УКМ B-1027).

P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 є грамнегативними оксидазонегативними рухливими паличками. На лакмусовій сироватці обидва штами утворюють луг, не утворюють індол та сірководень, не редукують нітрати. Досліджувані штами відрізняються за здатністю розріджувати желатину. На картопляному агарі P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 утворюють круглі сірі напівпрозорі блискучі колонії із хвилястим краєм. Подібно до типового штаму P. syringae pv. syringae 8511 досліджувані штами використовують як єдине джерело вуглецевого живлення глюкозу, арабінозу, галактозу, ксилозу, фруктозу, інозитол, манітол, сахарозу, манозу, сорбітол, гліцерол і не утилізують лактозу, саліцин, мальтозу, рамнозу, целобіозу, інулін, дульцитол. На відміну від типового штаму, вони не використовують рафінозу. P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 належать до серогрупи I відомої схеми серогрупування бактерій P. syringae (Пастушенко, Симонович, 1979). Обидва штами виявляють патогенні властивості та індукують реакцію надчутливості на листках тютюну. У складі клітинних ліпідів P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 було виявлено характерні для бактерій виду P. syringae насичені, ненасичені та оксизаміщені жирні кислоти.

Таким чином, за фізіологічними, біохімічними, серологічними і патогенними властивостями досліджувані штами P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 не відрізнялися від типового штаму P. syringae pv. syringae 8511, що свідчить про умовний їхній поділ на патовари.

Розділ 4. Ліпополісахариди патоварів Pseudomonas syringae

Вихід ЛПС досліджуваних бактерій за екстракції 0,85%-м розчином хлориду натрію становить 5,4% від сухої маси бактерій для P. syringae pv. atrofaciens 8281 і 6,0% – для P. syringae pv. coronafaciens 9030 (табл. 1). ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 містить 32,6% вуглеводів, ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 – 42,0%. В ЛПС обох штамів міститься значна кількість білка: 22,0 і 17,4% відповідно (табл. 1). В одержаних препаратах білок не відокремлюється від ЛПС за осадження з 3%-го розчину ультрацентрифугуванням. Це свідчить про те, що білок і ЛПС утворюють комплекс.

Таблиця 1

Хімічний склад ліпополісахаридів патоварів P. syringae

Патовар, штам | Вихід ЛПС, % від сухої маси бактерій | % від сухої маси ЛПС

Вуглеводи | Білок | Нуклеїнові кислоти | КДО

P. syringae pv. atrofaciens 8281 | 5,4 | 32,6 | 22,0 | 8,7 | 0,56

P. syringae pv. coronafaciens 9030 | 6,0 | 42,0 | 17,4 | 5,4 | 0,87

Примітка. КДО – 2-кето-3-дезоксиоктонова кислота

ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 містять нуклеїнові кислоти і КДО (табл. 1).

В жирнокислотному складі досліджуваних ЛПС виявлено насичені (додеканова, тетрадеканова, пентадеканова, гексадеканова, октадеканова), ненасичені (гексадеценова, октадеценова) та оксизаміщені (3-оксидеканова, 2-оксидодеканова, 3-оксидодеканова) жирні кислоти. Наявність 3-оксидеканової, 2-оксидодеканової і 3-оксидодеканової кислот є характерною ознакою для патоварів P. syringae (Stead, 1992).

Раніше E.L. Zdorovenko et al. (2001) встановлено структуру О-специфічних полісахаридів (О-ПС) ЛПС цих патоварів P. syringae. В О-ПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 основними повторюваними одиницями є лінійні трисахарид і тетрасахарид -L-рамнози. В мінорній кількості виявлено також розгалужений пентасахарид з основним ланцюгом, який утворено -L-рамнозою і бічним моносахаридом 3-ацетамідо-3,6-дидезокси-D-галактозою (D-фукозою). В О-ПС ланцюзі P. syringae pv. atrofaciens 8281 повторювані одиниці є розгалуженими тетра- та двома пентасахаридами, які відрізняються за розташуванням бічної D-фукози.

Розділ 5. Мутагенна і антимутагенна активність екзометаболітів та ліпополісахаридів патоварів Pseudomonas syringae

Здатність фітопатогенних бактерій утворювати речовини з мутагенною активністю практично і досі залишається поза увагою дослідників, хоча вони можуть потрапляти в продукти харчування і впливати на здоров’я людей.

P. syringae pv. coronafaciens 9030 і P. syringae pv. atrofaciens 8281 не мають антагоністичного, а їхні ЛПС – токсичного або стимулювального впливу на тест-штами S. typhimurium, що є передумовою вивчення їхньої геномоделювальної активності.

Фільтрат культуральної рідини P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 не виявляє мутагенної активності в експериментах з обома тест-штамами S. typhimurium (рис. 1, 2).

Примітки: КБ – картопляний бульйон, СФМ – спонтанний фон мутацій, ФКР – фільтрат культуральної рідини.

ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 в концентраціях від 0,1 до 1000,0 мгк/чашка не виявляють мутагенної активності стосовно S. typhimurium. Водночас у концентрації 1000,0 мкг/чашку ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 вірогідно зменшує частоту спонтанних мутацій тест-штаму S. typhimurium ТА100 на 16%, а тест-штаму S. typhimurium ТА98 – на 31%. Після термічного оброблення (2 год, 100?С) антимутагенна активність ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 майже не змінюється порівняно з нативним ЛПС цього штаму. ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 у концентраціях 1000,0 та 100,0 мкг/чашку вірогідно знижує спонтанний фон мутацій тест-штаму S. typhimurium ТА100 на 23 та 19% відповідно. ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 не зменшує спонтанний фон мутацій тест-штаму S. typhimurium ТА98.

ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 зменшує показники мутагенезу, індукованого біхроматом калію, у обох тест-штамів S. typhimurium. Як і стосовно спонтанного мутагенезу, ЛПС виявився активнішим в експериментах із S.typhimurium ТА98 (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 на індукований мутагенез у S. typhimurium

ЛПС, мкг/чашка | Біхромат калію, мкг/чашка | S. typhimurium ТА98 | S. typhimurium ТА100

Кількість ревертантів на чашку | Інгібування мутагенезу, % | Кількість ревертантів на чашку | Інгібування мутагенезу, %

1000,0 | 200 | 35,0 0,2 | 78 | 295,3 5,7 | 49

100,0 | 200 | 41,7 0,2 | 74 | 363,3 6,5 | 37

10,0 | 200 | 53,3 0,3 | 67 | 339,3 31,2 | 41

1,0 | 200 | 55,7 0,1 | 65 | 333,3 34,6 | 42

0,1 | 200 | 68,7 0,1 | 57 | 493,3 13,1 | 14

0 | 200 | 161,7 0,3 | 0 | 576,3 3,6 | 0

Спонтанний фон мутацій | 33,3 0,04 | 93,0 2,9

ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 також зменшує кількість індукованих біхроматом калію His+ ревертантів у обох тест-штамів S. typhimurium (табл. 3).

В експериментах із тест-штамом S. typhimurium ТА98 спостерігається незначне зниження антимутагенної активності досліджуваних ЛПС зі зменшенням їхньої концентрації, тоді як у дослідах із S. typhimurium ТА100 антимутагенна активність ЛПС істотно залежить від їхньої концентрації, але ця залежність не є лінійною.

Отже, нами вперше встановлено наявність антимутагенних властивостей у ліпополісахаридів фітопатогенних бактерій на прикладі ЛПС P. syringae. Досліджувані ліпополісахариди здатні зменшувати показники як спонтанного, так і індукованого мутагенезу у S. typhimurium.

Для з’ясування можливого механізму антимутагенної дії нами було проведено експерименти за схемою, наведеною на рисунку 3.

Таблиця 3

Вплив ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 на індукований мутагенез у S. typhimurium

ЛПС, мкг/чашка | Біхромат калію, мкг/чашка | S. typhimurium ТА98 | S. typhimurium ТА100

Кількість ревертантів на чашку | Інгібування мутагенезу, % | Кількість ревертантів на чашку | Інгібування мутагенезу, %

1000,0 | 200 | 87,7 0,1 | 46 | 410,7 80,5 | 51

100,0 | 200 | 88,3 0,5 | 45 | 532,0 73,4 | 37

10,0 | 200 | 90,7 0,1 | 44 | 605,0 12,8 | 28

1,0 | 200 | 91,5 0,1 | 43 | 683,3 14,2 | 19

0,1 | 200 | 95,6 0,1 | 41 | 738,6 10,0 | 12

0 | 200 | 161,7 0,3 | 0 | 840,0 13,9 | 0

Спонтанний фон мутацій | 33,3 0,4 | 58,7 0,9

Результати вивчення антимутагенної активності ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 залежно від послідовності оброблення клітин тест-штаму S. typhimurium мутагеном і ЛПС наведено в таблиці 4.

У разі інкубації клітин S. typhimurium ТА100 з біхроматом калію впродовж 30хв кількість реверсій становить 260,0 40,8 (табл. 4, варіант 2.1). Після внесення ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 до клітин цього тест-штаму, попередньо оброблених протягом 30 хв біхроматом калію, кількість His+ ревертантів становить 150,0 5,6 на чашку (табл. 4, варіант 2.2). За оброблення клітин S. typhimurium ТА100 одночасно мутагеном і ЛПС утворюється ще менша кількість ревертантів – 130,0 29,9 (табл. 4, варіант 4.1). Отже, ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 захищає клітини S. typhimurium ТА100 від мутагенної дії біхромату калію за одночасного внесення мутагену і ЛПС до клітин тест-штаму і значно слабше за внесення ЛПС після дії мутагену. Попереднє оброблення клітин S. typhimurium ТА100 цим ЛПС не збільшує їхню стійкість до дії мутагену (табл. 4, варіанти 3.2 і 1.2).

Можна припустити, що механізм антимутагенної дії ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 стосовно S. typhimurium ТА100 пов’язаний з перешкоджанням проникненню мутагенів у клітини, а також, ймовірно, із впливом на репараційні системи клітин, що дозволяє усувати попередньо утворені пошкодження ДНК.

На відміну від штаму S. typhimurium ТА100, у дослідах із S. typhimurium ТА98 внесення ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 до попередньо оброблених біхроматом калію клітин тест-штаму не приводить до зменшення кількості ревертантів (табл. 4, варіант 2.2). Однак за одночасного внесення ЛПС і біхромату калію до клітин тест-штаму ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 виявляє антимутагенну активність. Попереднє оброблення ЛПС цього штаму клітин S. typhimurium ТА98 вірогідно не підвищує їхньої стійкості до дії мутагену.

Рис. 3. Схема досліду

Примітка. МС – мінімальне середовище.

Таблиця 4

Антимутагенна активність ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 за різних умов інкубації тест-штамів S. typhimurium із біхроматом калію

Варіант досліду (рис. 3) | Порядок оброблення клітин тест-штаму | Кількість колоній ревертантів

S. typhimurium ТА98 | S. typhimurium ТА100

1.1 | Спонтанний фон мутацій | 31,3 8,1 | 100,0 10,8

1.2 | Клітини + біхромат калію | 960,0 59,8 | 1700,0 299,4

2.1 | Клітини, попередньо оброблені біхроматом калію (30 хв) | 53,3 8,6 | 260,0 40,8

2.2 | Клітини, попередньо оброблені біхроматом калію (30 хв) + ЛПС | 66,3 18,1 | 150,0 5,6

3.1 | Клітини, попередньо оброблені ЛПС (30 хв) | 24,7 1,6 | 88,6 5,8

3.2 | Клітини, попередньо оброблені ЛПС (30 хв) + біхромат калію | 866,0 65,3 | 1300,0 299,4

4.1 | Клітини, попередньо оброблені біхроматом калію та ЛПС (30 хв) | 47,0 9,3 | 130,0 29,9

Результати вивчення антимутагенної активності ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 на моделі S. typhimurium ТА98 залежно від послідовності оброблення мутагеном та ЛПС наведено в таблиці 5.

Таблиця 5

Антимутагенна активність ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 за різних умов інкубації тест-штаму S. typhimurium ТА98 з біхроматом калію

Варіант досліду (рис. 3) | Порядок оброблення клітин тест-штаму | Кількість колоній ревертантів

S. typhimurium ТА98

1.1 | Спонтанний фон мутацій | 30,7 4,7

1.2 | Клітини + біхромат калію | 700,0 11,3

2.1 | Клітини, попередньо оброблені біхроматом калію (30 хв) | 91,6 4,0

2.2 | Клітини, попередньо оброблені біхроматом калію (30 хв) + ЛПС | 77,5 1,2

3.1 | Клітини, попередньо оброблені ЛПС (30 хв) | 30,7 0,7

3.2 | Клітини, попередньо оброблені ЛПС (30 хв) + біхромат калію | 750,0 5,7

4.1 | Клітини, попередньо оброблені біхроматом калію та ЛПС (30 хв) | 34,7 12,6

Якщо до попередньо оброблених біхроматом калію клітин S. typhimurium ТА98 додавати ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030, то кількість His+ ревертантів знижується до 77,5 1,2 (табл. 5, варіант 2.2). Але інтенсивніше ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030, як і ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281, зменшує мутагенну дію біхромату калію за одночасного внесення їх до суспензії клітин S. typhimurium ТА98. Кількість ревертантів за таких умов експерименту становить 34,7 12,57 (табл. 5, варіант 4.1). Отже, за одночасного оброблення клітин тест-штаму S. typhimurium ТА98 біхроматом калію і ЛПС P.syringae pv. coronafaciens 9030 останній майже повністю усуває мутагенну дію біхромату.

Таким чином, ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 притаманні антимутагенні властивості. Вони зменшують як спонтанний, так і індукований біхроматом калію мутагенез у тест-штамів S. typhimurium.

Розділ 6. Антимутагенна активність пшениці, ураженої Pseudomonas syringae

Значна частина мутагенів належить до сполук, які нині не можуть бути виведені зі сфери життєдіяльності людини. Тому використання антимутагенів для захисту геному людей від шкідливого впливу мутагенів є одним з найперспективніших шляхів вирішення цієї проблеми. При здійсненні пошуку речовин з антимутагенними (генопротекторними) властивостями увагу дослідників досить часто привертають рослини. Антимутагенні властивості виявлені у соків, водних, ацетонових та спиртових екстрактів багатьох сільськогосподарських та лікарських рослин (Бариляк, Исаева, 1994). Проте зазвичай поза увагою залишається питання щодо впливу збудників захворювань на антимутагенну активність рослин.

Вивчення антимутагенних властивостей уражених бактеріями рослин нами проведено на пшениці. Відомо, що комплексу речовин, які містяться в екстракті із її проростків, притаманні антимутагенні властивості (Задорожная и др., 1997).

За нашими даними, спиртові екстракти із уражених P. syringae pv. atrofaciens 8281 листків пшениці у фазі сходів та неуражених листків не виявляють геномоделювальної активності.

Сік із уражених P. syringae pv. atrofaciens 8281 листків пшениці і сік із неуражених листків не мають геномоделювальної активності в дослідах з тест-штамом S. typhimurium ТА98. В експериментах з тест-штамом S. typhimurium ТА100 сік із листків пшениці у фазі сходів виявив антимутагенну активність. При цьому соку із листків з ознаками ураження P. syringae pv. atrofaciens притаманна така сама активність, як і соку із здорових листків. Сік із уражених листків зменшує кількість спонтанних ревертантів на 21%, а сік із не інокульованих листків пшениці – на 22%. Сік із листків, інокульованих P. syringae pv. atrofaciens 8281, пригнічує мутагенну дію біхромату калію стосовно S. typhimurium ТА100 на 39%, а сік із здорових листків – на 38%. Тобто, антимутагенна активність соку із листків здорових і уражених бактеріями рослин є однаковою.

Таким чином, нами встановлено, що соку із листків пшениці у фазі сходів притаманна антимутагенна активність стосовно тест-штаму S. typhimurium ТА100. При цьому за ураження пшениці P. syringae pv. atrofaciens 8281 антимутагенна активність її соку не змінюється.

Розділ 7. Протипухлинна активність патоварів Pseudomonas syringae і їхніх ліпополісахаридів

Відомо, що речовини, яким притаманні антимутагенні властивості, можуть виявляти також протипухлинну активність. Тому ми дослідили протипухлинну активність P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 та їхніх ЛПС, для яких нами встановлено антимутагенну активність.

Для вивчення протипухлинних властивостей серед колекційних штамів було відібрано штами A. tumefaciens 9052 і A. tumefaciens 9054, які з високою інтенсивністю спричинювали утворення пухлин на експлантатах картоплі.

P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P.syringae pv. coronafaciens 9030 не мають антагоністичного, а їхні ЛПС не виявляють токсичного впливу на тест-штами A. tumefaciens, що є необхідною умовою вивчення протипухлинної активності.

Картопляний бульйон, на якому культивували P. syringae, не впливає на пухлиноутворення, зумовлене A. tumefaciens 9052 (табл. 6).

Таблиця 6

Вплив фільтрату культуральної рідини P. syringae pv. atrofaciens 8281 на пухлиноутворення, зумовлене A. tumefaciens 9052 на експлантатах картоплі1

Досліджувана речовина | Послідовність оброблення | Кількість експлантатів без пухлин, % до загальної кількості | Кількість пухлин на один експлантат | Зменшення кількості пухлин, %3

Позитивний контроль2 | 0 | 12,34 2,83 | 0

Картопляний бульйон | за 15–20 хв до інокуляції A.tumefaciens | 0 | 14,65 2,06 | 0

через 15–20 хв після інокуляції A.tumefaciens | 0 | 13,00 2,38 | 0

Фільтрат культуральної рідини | за 15–20 хв до інокуляції A.tumefaciens | 17 | 4,16 1,23 | 66

через 15–20 хв після інокуляції A.tumefaciens | 11 | 6,38 1,59 | 48

через 24 год після інокуляції A.tumefaciens | 0 | 12,55 2,78 | 0

Фільтрат культуральної рідини після термічного оброблення | за 15–20 хв до інокуляції A.tumefaciens | 0 | 14,96 2,62 | 0

через 15–20 хв після інокуляції A.tumefaciens | 0 | 12,54 3,18 | 0

через 24 год після інокуляції A.tumefaciens | 0 | 12,80 3,02 | 0

Примітки: Тут і в табл.7, 8, 9, 10: 1 – на експлантатах, які не інокулювали A. tumefaciens, пухлини не утворюються, 2 – необроблені експлантати інокулювали культурою A. tumefaciens, 3 – відсоток зменшення кількості пухлин обчислювали за наявності статистично вірогідної різниці між дослідними варіантами та позитивним контролем.

Фільтрат культуральної рідини (ФКР) P. syringae pv. atrofaciens 8281 виявив здатність інгібувати утворення пухлин за оброблення експлантатів до або через 15 – 20 хв після інокуляції A. tumefaciens 9052. Оброблення експлантатів ФКР P. syringae pv. atrofaciens 8281 через 24 год після інокуляції A. tumefaciens не впливає на пухлиноутворення. Після термічного оброблення (2 год, 100?С) ФКР P. syringae pv. atrofaciens 8281 втрачає протипухлинну активність (табл. 6).

Аналогічні результати одержано для ФКР P. syringae pv. coronafaciens 9030. ФКР цього штаму виявляє здатність запобігати пухлиноутворенню та зменшувати його інтенсивність, при цьому вища протипухлинна активність спостерігається у разі попереднього оброблення експлантатів порівняно з таким через 15 – 20 хв після інокуляції A. tumefaciens.

За збільшення тривалості культивування протипухлинна активність культуральної рідини P. syringae pv. coronafaciens 9030 підвищується. Після термічного оброблення ФКР P. syringae pv. coronafaciens 9030 майже повністю втрачає протипухлинну активність.

Таким чином, ФКР P. syringae pv. atrofaciens 8281 та P. syringae pv. coronafaciens 9030 можуть запобігати пухлиноутворенню, спричиненому A. tumefaciens на експлантатах картоплі. Протипухлинна дія ФКР досліджуваних штамів пов’язана з термолабільними речовинами, які накопичуються в середовищі в процесі їх культивування.

Активніше порівняно з позаклітинними метаболітами на пухлиноутворення впливають зруйновані ультразвуком клітини обох патоварів P. syringae. При цьому протипухлинна активність зруйнованих клітин P. syringae pv. atrofaciens 8281 не залежить від періоду оброблення експлантатів (табл. 7).

Розведення зруйнованих клітин призводить до зменшення їхньої протипухлинної активності.

Таблиця 7

Вплив зруйнованих ультразвуком клітин P. syringae pv. atrofaciens 8281 на спричинене A. tumefaciens 9054 пухлиноутворення на експлантатах картоплі1

Послідовність оброблення експлантатів | Кількість експлантатів без пухлин, % до загальної кількості | Кількість пухлин на один експлантат | Зменшення кількості пухлин, %3

Позитивний контроль2 | 8 | 10,00 2,93 | 0

за 15–20 хв до інокуляції A. tumefaciens | 67 | 1,28 0,17 | 13

через 15–20 хв після інокуляції A. tumefaciens | 64 | 1,33 0,18 | 13

У разі оброблення експлантатів зруйнованими клітинами P. syringae pv. coronafaciens 9030 до інокуляції культурою A. tumefaciens 9052 пригнічення пухлиноутворення було інтенсивнішим порівняно з обробленням експлантатів після інокуляції A. tumefaciens (табл. 8).

Таблиця 8

Вплив зруйнованих ультразвуком клітин P. syringae pv. coronafaciens 9030 на спричинене A. tumefaciens 9052 пухлиноутворення на експлантатах картоплі1

Послідовність оброблення експлантатів | Кількість експлантатів без пухлин, % до загальної кількості | Кількість пухлин на один експлантат | Зменшення кількості пухлин, %3

Позитивний контроль2 | 0 | 26,70 3,46 | 0

за 15–20 хв до інокуляції A. tumefaciens | 100 | 0 | 100

через 15–20 хв після інокуляції A. tumefaciens | 21 | 9,20 2,56 | 66

Оброблення експлантатів розчином ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 в концентрації 10,0 мг/мл приводить до зменшення кількості пухлин на 87 %, при цьому на 31% експлантатів пухлини не утворюються взагалі. ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 в концентрації 1,0 мг/мл зменшує кількість пухлин на 67%, а в концентрації 0,1 мг/мл – на 37%. Після оброблення експлантатів розчином ЛПС в концентрації 1,0 мг/мл на 6% експлантатів пухлини не утворюються. Використання для оброблення розчину ЛПС в концентрації 0,1 мг/мл менш ефективне – на всіх експлантатах утворилися пухлини, але кількість їх менша порівняно з позитивним контролем. Таким чином, в концентраціях від 0,1 мг/мл до 10,0 мг/мл ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 виявляє здатність частково запобігати пухлиноутворенню на експлантатах картоплі і зменшувати інтенсивність розвитку пухлин.

Досліджуваний ЛПС активніше впливає на пухлиноутворення, спричинене A. tumefaciens 9054. Після оброблення експлантатів ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 в концентрації 10,0 мг/мл на 57% експлантатів не відбувається утворення пухлин. На тих експлантатах, де пухлини утворюються, кількість їх зменшується на 90% порівняно з позитивним контролем. Протипухлинна активність ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 знижується зі зменшенням його концентрації.

ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 також інгібує індуковане A. tumefaciens пухлиноутворення. Оброблення експлантатів розчином ЛПС в концентрації 10,0 мг/мл зменшує кількість пухлин, спричинених A. tumefaciens 9052, на 84% порівняно з позитивним контролем, а на 17% експлантатів пухлини взагалі не утворюються. Кількість пухлин, зумовлених A. tumefaciens 9054, таке оброблення зменшує на 74%, при цьому на 43% експлантатів пухлини не виникають.

Отже, ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 запобігають індукції пухлиноутворення та/або зменшують інтенсивність розвитку пухлин на експлантатах картоплі. Протипухлинна дія залежить від концентрації застосованого для оброблення експлантатів розчину ЛПС та від штаму A. tumefaciens, використаного для індукції пухлиноутворення.

Протипухлинна активність ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 після його термічного оброблення (2 год, 100?С) зменшується.

Для дослідження можливого впливу ЛПС на процеси прикріплення клітин A. tumefaciens до клітин експлантатів картоплі проводили оброблення останніх розчинами ЛПС в різний термін – до або після інокуляції культурою A. tumefaciens.

Оброблення експлантатів ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 за 20 хв до інокуляції A. tumefaciens та через 20 хв після неї інгібує пухлиноутворення майже однаково (табл. 9).

Таблиця 9

Залежність впливу ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 на пухлиноутворення, спричинене A. tumefaciens 9052, від послідовності оброблення експлантатів1

Концентрація розчину ЛПС, мг/мл | Послідовність оброблення експлантатів | Кількість експлантатів без пухлин, % до загальної кількості | Кількість пухлин на один експлантат | Зменшення кількості пухлин, %3

Позитивний контроль2 | 0 | 20,36 2,85 | 0

1,0 | за 20 хв до інокуляції A.tumefaciens | 23 | 13,40 2,15 | 34

0,1 | 6 | 17,20 2,38 |