НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Волкова Наталія Олександрівна

УДК: 615.361.441.014.41:57.085.1/2

КРІОКОНСЕРВОВАНІ ОРГАННІ КУЛЬТУРИ ЩИТОВИДНОЇ ЗАЛОЗИ

ПРИ АЛО- ТА КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦІЇ

03.00.19 – кріобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, Бондаренко Тетяна Петрівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України, завідувач відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем, м. Харків.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Жегунов Геннадій Федорович, Харківська державна зооветеринарна академія МАП України, завідувач кафедри хімії і біохімії, м. Харків.

доктор медичних наук Лучицький Євген Васильович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, завідувач відділу клінічної андрології, м. Київ.

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького, відділ експериментальних клітинних систем, м. Київ.

Захист відбудеться “6” липня 2004р. о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23)

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23)

Автореферат розісланий “4” червня 2004р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор,

член-кор. НАН України Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

На сьогодні накопичена досить велика кількість експериментальних робіт, присвячених питанням ало- та ксенотрансплантації ендокринних органів у вигляді зрізів, а також органних та клітинних культур щитовидної залози [Македонская В.А., 1986; Чуйко В.А., 1992; Kitamura Y., 1994]. Однак у більшості робіт дослідниками використовується нативний матеріал, доступність якого обмежена [Алиев М.А., 2000; Турчин И.С., 1996.]. Існуючі технології по кріоконсервуванню ендокринного матеріалу дозволяють на теперішній час зберігати біологічний матеріал без суттєвого зниження кількості життєздатних клітин [Белоус А.М., 1986; Грищенко В.І., 2000; Сандомирский Б.П., 2000;], що безумовно є основою для впровадження альтернативного методу корекції гормональної недостатності шляхом трансплантації саме кріоконсервованих органних культур.

Актуальність теми. В останній час серед загальновідомих методів корекції тиреоїдної недостатності поряд з традиційними медикаментозними засобами все більше поширення знаходять методи ало- та ксенотрансплантації органних культур щитовидних залоз. Результатами клінічних досліджень доведена висока ефективність трансплантації нативних ендокринних тканин новонароджених поросят [Комісаренко І.В., 1990; Турчін І.С., 2000]. Однак даний спосіб лікування обмежений неможливістю створення запасів ендокринного матеріалу. Розроблені ІПКіК НАН України технології низькотемпературного консервування дозволяють створити необмежений запас ендокринного матеріалу.

Дотепер залишається відкритим питання про вплив низькотемпературного консервування на функціональні характеристики ендокринного матеріалу та його подальше функціонування в організмі реципієнта. Також існує досить мало відомостей про вплив трансплантації на загальний метаболізм організму реципієнта. Одним із головних напрямків сучасної трансплантології є розробка нових підходів для збільшення строку функціонування трансплантаційного матеріалу. Відомо, що одним із способів зниження імунологічних властивостей трансплантаційного матеріалу є його попереднє культивування [Hullett D.A. et. al., 1990, Martin L. et. al., 1998; Moreland A.F. et. al, 1987]. Існують дані про те, що кріоконсервовані трансплантати мають більш довгий строк функціонування [Цуцаева А.А. и др., 2000; Чуйко В.А. и др., 1989; Tanaka-Matsuura L.M. et. al., 1984]. Однак досить мало відомостей про функціонування в організмі реципієнта кріоконсервованих ало- та ксенокультур щитовидних залоз та їх вплив на процеси загального метаболізму в організмі.

Збільшення кількості людей, страждаючих тиреоїдною недостатністю [Валдина Е.А., 2001; Кандор В.И., 2002; Цариковская Н.Г. и др., 1999], яка супроводжується не тільки зниженням гормонального фону, але і змінами загального метаболізму всього організму, робить очевидним актуальність робіт, спрямованих на пошук альтернативних засобів лікування гіпотиреозів, серед яких використання трансплантації кріоконсервованих органних культур щитовидних залоз є досить перспективним. У зв’язку з вищесказаним, дослідження в порівняльному аспекті нативних і кріоконсервованих органних культур щитовидних залоз in vitro та in vivo (трансплантація тваринам з експериментальним гіпотиреозом) є досить важливим.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках науково-дослідної теми Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України №3 “Дослідження механізмів функціонування кріоконсервованих органних культур ендокринних тканин” (шифр – 2.2.6.03, № 0101U003478)

Мета і задачі дослідження. Метою роботи був порівняльний аналіз морфо-функціональних характеристик кріоконсервованих та нативних органних культур із щитовидної залози новонароджених поросят та статевозрілих кроликів, за умов їхнього дослідження in vitro i in vivo (ало- і ксенотрансплантація субтотально тиреоїдектомованим (СТ) кроликам).

Для вирішення даної мети передбачалось вирішити ряд задач:

1.

2.

3.

Об’єкт дослідження. – Вплив процесів кріоконсервування на морфо-функціональні характеристики органних культур щитовидної залози новонароджених поросят та статевозрілих кроликів in vitro і за умов їх ало- і ксенотрансплантації.

Предмет дослідження. – Кріоконсервовані і нативні органні культури щитовидної залози новонароджених поросят і статевозрілих кроликів in vitro i in vivo (ало- і ксенографти).

Методи дослідження. У роботі використовувався метод органного культивування ОКЩЗ, метод 2-х етапного кріоконсервування ОКЩЗ, радіоімунологічний метод визначення гормонів, колориметричний метод визначення білку, спектрофотометричний метод визначення РНК і ДНК, методи світлової мікроскопії, гістологічний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів. Представлено порівняльний аналіз морфо-функціонального стану кріоконсервованих і нативних ОКЩЗ донорів різного віку і віддаленої філогенетичної спорідненості (новонароджені поросята і статевозрілі кролики) in vitro, а також після їх ало- і ксенотрансплантації СТ тваринам, при цьому функціональна характеристика трансплантата оцінювалась на основі його здатності коригувати гормональну недостатність. Уперше представлений гістологічний аналіз трансплантатів у віддалені строки після трансплантації. Встановлено, що кріоконсервований і рекультивований матеріал має більш довгий строк функціонування в організмі реципієнта, ніж нативні трансплантати.

Практичне значення отриманих результатів. Органна культура щитовидної залози новонароджених поросят і статевозрілих кроликів зберігає після кріоконсервування свої морфо-функціональні властивості, притаманні нативній культурі. До 120-тої доби після ксенотрансплантації кріоконсервованої культури трансплантат зберігає гормонально активні клітини, які забезпечують регенерацію культі щитовидної залози у експериментальних тварин. Отримані дані свідчать про придатність використання кріоконсервованого матеріалу у якості трансплантата для корекції тиреоїдної недостатності.

Особистий внесок здобувача. Винесені на захист положення і результати отримані дисертантом особисто. Роботи, що мають відношення до теми дисертації, опубліковані у співавторстві з науковим керівником теми д.б.н. Бондаренко Т.П. та іншими співробітниками відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем, відображають результати по спільному плануванню і проведенню експериментів, обговоренню і підготовці матеріалів до друку.

Автор самостійно провів аналіз отриманих результатів і зробив висновки у роботі.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дослідження представлені на конференції молодих вчених ІПКіК разом з кафедрою UNESCO (Харків 2001, 2002, 2003р.), на Всеукраїнській науковій конференції “Успехи и перспективы развития криобиологии и криомедицины” (Харків, 2001р.), на науково-практичній конференції, присвяченій 150-річчю з дня народження академіка В.Я. Данилевського “Патогенетичні аспекти фармакотерапії ендокринних захворювань” (Харків, 2002, 2003р.), на конференції “Актуальні проблеми фундаментальної та прикладної біохімії-2002” (Київ, 2002р.), на ІІІ міжнародній медичній конференції студентів і молодих вчених (Дніпропетровськ, 2002р.), “Ліки та медицина” Тернопіль, 2003, “Проблеми клітинної та тканинної трансплантології” Івано-Франківськ, 2003, “Cryobiomol-2003” Коимбра, 2003р.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 6 статей у фахових виданнях, 8 тез доповідей.

Структура дисертації. Матеріали викладені на 163 сторінках, у тому числі на 25 сторінках цитована література. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду

літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень та їх обговорення, заключення, висновків, списку використаних джерел, що нараховує 250, з яких 136 - вітчизняних і 114 – іноземних. Роботу проілюстровано 11 рисунками, 16 таблицями, 30 мікрофотографіями.

ОСНОВНИЙ ЗМІCТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Об’єктом дослідження були органні культури, отримані із щитовидних залоз новонароджених поросят та статевозрілих кроликів. Новонароджених поросят під легким ефірним наркозом забивали гільйотинуванням. Щитовидні залози кроликів отримували при проведенні операції тиреоїдектомії. Екстирпація щитовидних залоз здійснювалась в умовах стерильного боксу з дотримуванням суворих правил асептики і антисептики. З тканин щитовидної залози отримували органну культуру [Тронько Н.Д., 1990], вирощувану в живильному середовищі на основі середовища 199 з 10% інактивованою телячою ембріональною сироваткою, антибіотиками: пеніцилін – 100 од/мл і канаміцин - 75 мкг/мл. Заміну живильного середовища проводили щодобово. Термін культивування становив 5 діб. В культуральному середовищі і гомогенатах ОКЩЗ, а також в плазмі крові тварин проводили визначення вмісту тиреоїдних гормонів радіоімунологічним методом за допомогою тест-набору РІА Т3,Т4-СТ. Кількість гормонів розраховували на кількість білку, що визначався за методом Бредфорда. Заморожування ОКЩЗ здійснювали в присутності 7% диметилсульфоксиду (ДМСО) за 2-х етапною програмою зі швидкістю охолодження 1С/хв до -80С з подальшим зануренням в рідкий азот за методом [Луговий С.В., 2003]. Матеріал зберігали у низькотемпературному банку. Після відігрівання на водяній лазні при 37С ОКЩЗ відмивали від ДМСО середовищем 199.

Частку деконсервованого матеріалу приміщували в середовище 199 на водяну лазню при 37С та інкубували 1 годину (кріоконсервований матеріал). Другу частку деконсервованого матеріалу використовували для рекультивування: піддавали повторному культивуванню на протязі 48 годин в умовах стерильного боксу при 37С з щодобовою зміною живильного середовища. Після закінчення строку рекультивування зразки 3-4 рази відмивали від середовища культивування середовищем 199. Усі зразки аналізували на вміст тиреоїдних гормонів та піддавали гістологічним дослідженням. В клітинах культури проводився контроль вмісту рівня нуклеїнових кислот, отриманих методом фракціонування [Орехович В.Н., 1977], на спектрофотометрі Unicam SP 8000. Контролем були відповідні нативні ОКЩЗ.

На кожному етапі експерименту проводився контроль кількості живих клітин, для чого органну культуру піддавали трипсинізації. Після цього проводився підрахунок життєздатних клітин шляхом їх забарвлення трипановим синім по методу [De Miguel M.P., 1996], у нашій модифікації [Бондаренко Т.П., Волкова Н.А., 2001]. Метод дає можливість визначення кількості нежиттєздатних клітин, що накопичили барвник, шляхом вимірювання інтенсивності забарвленості їх лізату. Вимірювання оптичної щільності поводили на ФЕК (КФК-2-УХЛ-42) при довжині хвилі 595 нм. Контролем була загальна кількість клітин, зруйнованих 0,32% оцтовою кислотою. Паралельно визначалась кількість життєздатних клітин шляхом підрахунку в гемоцитометрі [Адамс Р., 1983].

Субтотальну тиреоїдектомію (СТ) кроликам вагою 2,5-3 кг проводили за методикою [Корлэтяну А.Н., 1987] під комбінованим наркозом (тіопентал Na із розрахунку 1 мл розчину з концентрацією 4,5 мг/мл на 100 г ваги тварини та ефірна маска). Тваринам після оперування в якості пиття давали 0,2% розчин СаCl2, щоб вилучити можливість порушення мінерального обміну [Demeester-Mirkine N. et. al., 1992]. На 21-у добу після СТ тварини були розділені на групи (по 7-8 тварин в групі) котрим здійснювали ало- і ксенотрансплантацію (АлТц і КсТц) нативних, кріоконсервованих та рекультивованих культур, в залежності від мети експерименту. Доза трансплантованого матеріалу складала 0,3 г на 100г ваги тіла тварини [Тронько Н.Д., 1990].

Тварин забивали на 30-ту та 120-ту добу після трансплантації з використанням ефірного наркозу. На аналіз забирали внутрішні органи та плазму крові, в якій вимірювали рівень гормонів. Трансплантат і культю брали на гістологічний аналіз. Усі внутрішні органи аналізували на масу відносно ваги тіла тварин, також проводився аналіз вмісту нуклеїнових кислот (НК) в печінці, нирках, селезінці та тимусі при перерахуванні на вагу тканини. Підрахунок кількості лейкоцитів та лейкоцитарної формули робили за методикою [Назаренко Г.И., 2000].

Матеріал для гістологічних досліджень фіксували 10% нейтральним формаліном і піддавали стандартній методиці заливання в парафін [Лилли Р., 1969; Шрейбер В., 1987], зрізи забарвлювали гематоксиліном і еозином. Аналіз проводили під світловим мікроскопом зі збільшенням 10х16 та 10х40. У роботі було використано мікрофотонасадки МФНЕ-144.2.

Статистичну обробку результатів здійснювали за методом Стьюдента-Фішера за допомогою пакета програм Ms Excel i SigmaPlot.

Результати досліджень та їхнє обговорення

Питання про вплив низькотемпературного консервування на ОКЩЗ, отриманих від донорів різного віку та віддаленої філогенетичної спорідненості вивчено недостатньо. Кріоконсервування за 2-х етапною програмою ОКЩЗ новонароджених поросят (ОКЩЗНП) з використанням у якості кріопротектору 7% ДМСО дозволяє отримати після відігріву функціонально-активний біологічний матеріал [Луговий С.В., 2003]. В нашій роботі були досліджені морфо-функціональні властивості ОКЩЗ, котрі отримували від новонароджених поросят та статевозрілих кроликів (ОКЩЗК) in vitro та в умовах їхнього трансплантування СТ тваринам.

Гістологічний аналіз нативних ОКЩЗ (5-та доба культивування) показав, що культивування призводить до однонаправлених змін в гістоструктурі паренхіми щитовидних залоз як кроликів, так і новонароджених поросят. Кріоконсервування по програмі [Луговий С.В., 2003] в цілому забезпечує морфологічне збереження тканини щитовидної залози, однак, справляє різнонаправлений вплив на гістоструктуру по всій площі фрагмента ОКЩЗНП та призводить до переважного ушкодження центральної частини фрагментів ОКЩЗК. Ця виборність, імовірно, обумовлена змінами в центральній зоні, що має місце при 5-ти добовому культивуванні. Рекультивування є необхідним етапом підготовки деконсервованого матеріалу перед наступним використанням, оскільки, з одного боку, сприяє розвитку репаративних процесів в клітинах, що виявляється у відновленні тканини щитовидної залози в центральних зонах ОКЩЗК. З іншого боку, рекультивування також сприяє відновленню об’ємних характеристик фолікулів кріоконсервованих ОКЩЗНП, що є необхідною умовою для підтримування гомеостазу [Белоус А.М. и др. 1982] та здійснення гормонопоезу [Herrmann M.E. et. al., 1995; Kitamura Y. et. al., 1994]. Морфологічні дослідження нативних та кріоконсервованих ОКЩЗ дозволили зробити висновок, що кріоконсервування з використанням 7% ДМСО дозволяє отримати біологічний матеріал з гістоструктурою, що схожа зі структурою нативної тканини. Ця підстава була основою для проведення досліджень по вивченню функціональних властивостей кріоконсервованих та нативних ОКЩЗ. На першому етапі була проаналізована кількість життєздатних клітин з використанням суправітального барвника - трипанового синього. Отримані результати свідчать про те, що кріоконсервування по-різному впливає на життєздатність клітин вивчених об’єктів. У випадку ОКЩЗНП після деконсервування зберігається 72,4±4,6% клітин, а у випадку ОКЩЗК – 64,5±3,8% клітин. Рекультивування призводить до незначного зростання кількості життєздатних клітин приблизно на 6% та 8% відповідно для ОКЩЗНП та для ОКЩЗК. Ці дані, насамперед, обумовлені розвитком репаративних процесів у клітинах, відновленням у них енергетичного балансу. Різниця у кількості життєздатних клітин, отриманих від новонароджених та дорослих донорів, пов’язана зі властивостями тканин, оскільки тканини новонароджених містять більшу кількість молодих клітин, котрі більш стійкі до дії екстремальних факторів та мають високий рівень метаболізму після кріоконсервування. Важливим показником функціонального стану культур є здібність до гормоностворювання та секреції. На рис.1 подані дані по рівню синтезу та секреції Т3 та Т4 клітинами ОКЩЗК та ОКЩЗНП.

З наведених результатів можна бачити, що секреція і внутрішньоклітинний вміст тиреоїдних гормонів у нативних зразках вірогідно не відрізняється. Кріоконсервування призводить до зменшення вмісту гормонів у клітинах ОКЩЗК, однак, наступне рекультивування сприяє збільшенню цих значень. Інша картина функціональної активності виявлена для ОКЩЗНП. Кріоконсервування призводило до зростання внутрішньоклітинного рівня Т3, при цьому рівень Т4 вірогідно не відрізнявся від контролю. Це може бути обумовлено дегідратацією клітин, що призводить до інтенсифікації процесів дейодування [Di Fulvio M. et. al., 2000; Sato K. et. al., 1988 ]. Наступне рекультивування призводить до нормалізації цих показників. Слід зауважити, що ці процеси протікають одночасно зі збільшенням секретуючої активності ОКЩЗНП, найбільш виявленої за рівнем Т4. Білоксинтезуюча здібність ендокринних клітин є одним із важливих показників повноцінності метаболічних процесів. Кількісний аналіз вмісту білку в гомогенатах клітин нативних та кріоконсервованих зразків виявив суттєве зниження в кріоконсервованих зразках ОКЩЗК, при відсутності істотних змін даного показника в клітинах неонатальних донорів. Відомо, що екстремальні фактори кріоконсервування справляють різний по силі дії та місцю прикладення вплив на генетичний апарат клітин [Грищенко В.И., 1989]. У зв’язку з цим положенням нами були проведені дослідження впливу факторів кріоконсервування на вміст нуклеїнових кислот в ОКЩЗ. На рис.2 подано індекс РНК/ДНК, що відображує рівень біосинтетичних процесів у клітинах.

З поданих даних можна бачити, що кріоконсервування ОКЩЗНП супроводжується зростанням індексу РНК/ДНК, що відповідає даним про зростання рівню білку. Зростання цього показника, можливо, пов’язане з процесами конденсації – деконденсації хроматину за умов дії низьких температур. Наступне рекультивування призводить до пропорційного зростання досліджуваного показника відносно контролю, що також є свідоцтвом розвитку репаративних процесів. Проведена оцінка морфо-функціонального стану органних культур дозволяє зробити висновок про те, що кріоконсервований матеріал може бути використаний при ало- та ксенотрансплантації з метою виявлення можливості корекції гормонального статусу у експериментальних тварин.

Одним з шляхів моделювання тиреоїдної недостатності на лабораторних тваринах є хірургічна екстирпація щитовидної залози. Літературні дані вказують, що при моделюванні тиреоїдної недостатності досить важливим є об’єм видаленої залози [Шкуматов Л.М., 2001]. У зв’язку з цим в роботі було проведено дослідження по моделюванню гіпотиреоїдного стану у самців кроликів. Динаміку розвитку тиреоїдної недостатності було виявлено експериментальним шляхом на підставі вимірювання рівню тиреоїдних гормонів у плазмі експериментальних тварин. З даних, що подано на рис. 3, можна бачити, що тиреоїдектомія призводить до закономірної зміни концентрації Т4 та Т3 в крові експериментальних тварин. Вже на 7-му добу після операції спостерігається вірогідне зниження концентрації Т4 на 46% (p<0,05) відносно контрольної групи тварин. Незначне збільшення Т4, що спостерігалось на 14-ту добу після тиреоїдектомії, було короткочасним. Подальші спостереження свідчать про поступове зниження Т4 в плазмі крові СТ кроликів починаючи з 21-шої доби спостереження. При цьому має місце зниження рівню Т3 з 7-ї по 21-шу добу після операції на 32-38% (р<0,05). Дана тенденція зниження рівню Т3 на протязі перших трьох тижнів, можливо, пов’язана з інгібуванням процесів дейодування Т4 в органах –мішенях [Верещагина Г.В. и др., 1991]. Проведені дослідження дозволили нам зробити висновок про те, що виражені ознаки гіпотиреозу спостерігаються на 21-30-ту добу після операції. Цей висновок підтверджується даними про зміну клітинного складу крові СТ кроликів. У експериментальних тварин відмічено вірогідне зменшення кількості лейкоцитів, вмісту нейтрофілів. У СТ тварин змінювався також вміст нуклеїнових кислот в лімфоїдних органах (тимус та селезінка).

Ці дані узгоджуються з даними літератури про те, що рівень тиреоїдних гормонів змінює інтенсивність біосинтетичних процесів на рівні експресії генів Антоняк Г.Л. и др., 2000. Базуючись на отриманих результатах, ми вважали, що 21-ша доба після СТ є оптимальним строком для корекції тиреоїдної недостатності шляхом трансплантації кріоконсервованої ОКЩЗ.

Про функціональну активність трансплантатів судили по вмісту тиреоїдних гормонів в плазмі крові експериментальних тварин у різні строки після трансплантації. Відомо, що зміна концентрації тироксину є важливим показником функціональної активності щитовидної залози [Верещагина Г.В. и др., 1984].

Аналіз зміни тироксину при різних варіантах здійснення трансплантації подано на рис.4. У порівнянні з групою СТ тварин у всіх груп тварин, котрим була здійснена трансплантація ОКЩЗ, відзначалась позитивна динаміка компенсації тиреоїдної недостатності по рівню Т4. Характер підвищення рівню тироксину залежав від виду трансплантату. Слід відзначити, що у випадку алотрансплантації функціонування нативної та кріоконсервованої ОКЩЗК призводить до однакової динаміки зміни Т4 в організмі тварин. При цьому функціонування рекультивованої ОКЩЗК в організмі тварин призводить до більш вираженого коригуючого ефекту. У випадку ксенотрансплантації перші признаки компенсації тиреоїдної недостатності констатуються вже на 14-ту добу після трансплантації усіх видів ксеноматеріалу. Згідно з існуючими даними [Sachs D.H., 1990], 14 діб після трансплантації є достатнім строком для розвитку цитотоксичних реакцій проти ксенотрансплантату. Однак, рівень Т4 мав тенденцію до зменшення починаючи з 30-ї доби, але не досягав рівня, відповідного групі тварин, яким не здійснювали трансплантацію. Можна припустити, що різке збільшення концентрації Т4 обумовлено викидом гормонів з клітин, що лізуються, а подальше зниження концентрації тироксину обумовлено зменшенням кількості активних гормонпродукуючих клітин у наслідок відторгнення трансплантату [Sykes M., 1996]. Найбільш цікаві дані отримані за умов використання сумісної трансплантації культур щитовидної та надниркових залоз. Починаючи з 60-тої по 120-ту добу ми спостерігали зростання у плазмі крові рівня досліджуваного гормону. Відомо, що глюкокортикоїдні гормони, що продукуються наднирниками, стимулюють гормонопоез тиреоїдних гормонів, з іншого боку глюкокортикоїди забезпечують захист від імунологічної реакції організму на чужорідні клітини [Dhabhar F.S.,1993]. Скоріше за все, присутність ОКНЗНП сприяє пролонгуванню строку життя трансплантату. Трансплантація нативних та кріоконсервованих ОКЩЗНП призводить до компенсації тиреоїдної недостатності, але дані про зміну концентрації Т4 мають різну інтенсивність та швидкість розвитку у часі, що пояснюється, певне, різним функціональним станом культур перед трансплантацією. Також не можна не зазначити, що динаміка зміни Т4 в плазмі крові експериментальних тварин може відображати і втрату функціональної активності трансплантату у процесі відторгнення.

Відомо, що трийодтиронін є найбільш активною формою тиреоїдних гормонів [Shintani N., 2002]. Тому ми вважали доцільним дослідити картину зміни Т3. Отримані результати подані на рис. 5. У всіх груп тварин з трансплантацією ми спостерігали компенсацію по рівню Т3 на протязі всього експерименту. Зміни концентрації Т3 в плазмі крові кроликів з нативними та кріоконсервованими трансплантатами ОКЩЗК мають однаковий характер розвитку у часі. Максимальне збільшення в концентрації Т3 спостерігалося в плазмі крові групи тварин з кріоконсервованим трансплантатом ОКЩЗК. На протязі всього експерименту рівень Т3 не досягав відповідних показників у групи СТ кроликів. Слід зауважити, що у тварин з ксенотрансплантацією нативної, кріоконсервованої, рекультивованої та сумісної трансплантації ОКЩЗНП спостерігається однакова компенсаторна динаміка зміни концентрації Т3 на протязі всього експерименту. Однак, профілі кривих, що описують динаміку вмісту Т3 в плазмі крові груп тварин з нативним та рекультивованим, а також кріоконсервованим та сумісною трансплантацією збігаються як кількісно так і якісно. Підвищений вміст тиреоїдних гормонів у тварин з трансплантацією можливо був пов’язаний зі стимулюванням культі. Щоб з’ясувати це питання, ми провели гістологічний аналіз місць резекції щитовидної залози у експериментальних тварин.

Гістологічне дослідження місць резекції щитовидної залози (видалення 2/3 залози) при різноманітних варіантах трансплантації показало, що в культі розвиваються відновлювальні процеси, котрі виявляються в проліферації та гіперплазії залозистих структур, при яких структура органа суттєво змінюється.

Переважним компонентом стають мікрофолікули, що вистлані високим кубічним епітелієм. Гістологічний аналіз трансплантатів (30-та доба) виявив розвиток запальних реакцій на місці трансплантації кріоконсервованих ОКЩЗНП, при цьому рекультивовані ОКЩЗНП викликали менш виражені запальні реакції та сприяли активній васкулярізації та проліферації пухкої з’єднувальної тканини.

На 120-ту добу з моменту АлТц виявлялась лише 1/10 первинно трансплантованого матеріалу. Фрагменти містили групи епітеліальних тироцитоподібних клітин, з котрих були сформовані мікрофолікули, які розташовувались у пухкій з’єднувальній тканині холки кролика. На гістологічних препаратах фрагментів області холки кролика на 120-ту добу з моменту КсТц була виявлена наявність як залозистих структур, характерних для щитовидної залози, так і клітин ОКНЗНП. Фолікули трансплантату знаходились у активному функціональному стані. Морфо-функціональний стан трансплантатів залежав від способу їх підготовки до трансплантації. Так, трансплантат нативної ОКЩЗНП на віддалених посттрансплантаційних строках зазнавав деструктивно-некротичних змін. Трансплантати кріоконсервованої ОКЩЗНП містили невелику кількість клітин, але їх гістоструктура свідчила про функціональну активність. Рекультивовані трансплантати ОКЩЗНП не тільки зберігали гістоструктуру щитовидної залозиновонародженого поросяти, але й мали виражену морфо-функціональну активність, специфічну для тканини щитовидної залози.

Відомо, що тиреоїдні гормони у плазмі крові зв’язуються з білками, що здійснюють транспортну функцію. Альбумін відноситься до білків переносників тиреоїдних гормонів. У зв’язку з цим ми вважали доцільним проаналізувати динаміку зміни концентрації альбуміну у плазмі крові. Слід зазначити, що рівень альбуміну у тварин з ало- та ксенотрансплантацією кріоконсервованої ОКЩЗ знаходився у межах контрольних значень на протязі всього експерименту. За умов сумісної трансплантації перевищував контрольні значення на 56%. Отримані дані дають змогу стверджувати, що трансплантація кріоконсервованих ОКЩЗНП та ОКЩЗК буде призводити до нормалізації показників крові. Дійсно, наприклад, рівень лейкоцитів у тварин з трансплантатами знаходився в межах контрольних значень, тобто був вищим, ніж у СТ групи.

Однією з особливостей дії тиреоїдних гормонів є їх здатність впливати на стан лімфоїдних органів та печінки, що є головним органом мішенню [Розен В.Б., 1984; Hadden J. W., 1992]. В зв’язку з цим ми вважали доцільним проаналізувати як відносні маси цих органів, так і рівень в них НК. Отримані дані подані в табл. 1. Наведені дані свідчать, що маса тіла у всіх тварин з трансплантатами мала тенденцію до нормалізації. При цьому були відзначені вірогідні зміни у відносних масах печінки, селезінки та тимусу. У групи СТ тварин на даному строку після тиреоїдектомії на тлі зниження маси тіла спостерігається зменшення відносної маси та індексу РНК/ДНК в усіх досліджуваних внутрішніх органах, за винятком селезінки, що є свідоцтвом розвитку гіпотиреозу [Исмаилов С.И., 1989]. У груп тварин з АлТц рекультивованої культури спостерігалось вірогідне збільшення індексу РНК/ДНК в печінці у 2,8 рази відносно контрольної групи тварин. Слід зазначити, що найбільш суттєвих змін зазнають лімфоїдні органи. АлТц нативного та рекультивованого матеріалу не призводить до вірогідних змін РНК/ДНК в селезінці та тимусі, при цьому у тварин з кріоконсервованим трансплантатом спостерігається збільшення РНК/ДНК в селезінці та зменшення в тимусі. У тварин з КсТц кріоконсервованої, рекультивованої культури та при сумісній трансплантації спостерігалось зменшення вмісту НК у тимусі майже у 3,5 рази. Наведені дані узгоджуються з динамікою концентрації тиреоїдних гормонів (рис.4, 5), а саме збільшенням рівня Т3 на 120-ту добу.

Таким чином, подані дані свідчать на користь того, що трансплантати ОКЩЗ сприяють нормалізації тиреоїдної функції у СТ тварин, ступінь якої залежить від виду трансплантату (нативні, кріоконсервовані, рекультивовані, сумісна трансплантація). Кріоконсервовані трансплантати викликають менші зміни імунологічного статусу організму реципієнтів у порівнянні з нативними трансплантатами.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Бондаренко Т.П., Волкова Н.А., Самченко И.И., Божок Г.А., Алабедалькарим Н.М. Колориметрическое определение жизнеспособности органной культуры клеток семенников, надпочечников и щитовидной железы // Лабораторная диагностика. - 2001. - №4. - С.44-47. (Дисертантом відпрацьована методика колориметричного визначення життєздатності клітин органних культур щитовидних залоз).

2. Волкова Н.А., Божок Г.А., Алабедалькарим Н.М, Бондаренко Т.П. Влияние

трансплантации криоконсервированной органной культуры щитовидной железы на содержание нуклеиновых кислот в печени кроликов // Проблемы криобиологии. - 2002. - №1. - С.115-117. (Дисертантом виконані експерименти з визначення нуклеїнових кислот у печінках тварин з експериментальною трансплантацією, проаналізовані отримані дані).

3. Волкова Н.А., Бондаренко Т.П. Функционирование криоконсервированной органной культуры щитовидной железы при экспериментальной алотрансплантации // Проблеми медичної науки та освіти. - 2002. - №4. - С.38-47. (Дисертантом виконана трансплантація нативної та кріоконсервованої органної культури щитовидних залоз кроликів субтотально тиреоїдектамованим кроликам і оцінені зміни в організмі реципієнтів на підставі вимірювання рівня тиреоїдних гормонів на різних посттрансплантаційних строках).

4. Волкова Н.А., Божок Г.А., Алабедалькарим Н.М, Легач Е.И., Бондаренко Т.П. Влияние ксенотрансплантации криоконсервированной органной культуры щитовидной железы на физиологические параметры экспериментальных животных // Проблемы криобиологии.- 2003. - №1.- С.16-19. (Дисертантом проведені експерименти по вивченню вплива ксенотрансплантації нативної та кріоконсервованої органної культури щитовидної залози на гормональний стан реципієнтів та вагу внутрішніх органів).

5.Волкова Н.А., Алабедалькарим Н.М., Божок Г.А., Бондаренко Т.П. Влияние криоконсервирования на функциональные характеристики органных культур щитовидной железы кроликов и новорожденных поросят // Проблемы криобиологии. - 2003. - №2.- С.109-114. (Дисертантом проведені експерименти щодо дослідження впливу кріоконсервування на гістологічну структуру органних культур щитовидної залози кроликів та новонароджених поросят та здатності до секреції гормонів).

6. Бондаренко Т.П., Легач Е.І., Божок Г.А., Алабедалькарим Н.М., Волкова Н.О., Луговий С.В., Самченко І.І. Ксенотрансплантація кріоконсервованого ендокринного матеріалу як метод корекції гіпофункції залоз у експерименті // Трансплантологія. - 2003.-Т4., №1. - С.60-63. (Дисертантом виконані роботи з моделювання тиреоїдної недостності та оцінки ефективності ксенотрансплантації, за здатністю компенсувати тиреоїдну недостатність по рівню тиреоїдних гормонів).

7. Легач Е.И., Бондаренко Т.П., Луговой С.В., Волкова Н.А. Ксенотрансплантация криоконсервированной органной культуры надпочечных желез в лечении бронхиальной астмы // Збірник тез всеукраїнської конференції: „Актуальні проблеми відновлювальної хірургії”. - Запоріжжя. - 2001. - С.151-152.

8. Бондаренко Т.П., Волкова Н.А., Луговой С.В. Уровень тиреоидных гормонов в плазме крови кроликов при ксенотрансплантации криоконсервированной органной культуры щитовидной железы неонатальных поросят // Проблемы криобиологии. - 2001. - №3. - С.41-42.

9. Волкова Н.А., Бондаренко Т.П., Луговой С.В., Божок Г.А., Алабедалькарим Н.М. Изучение функционирования криоконсервированной органной культуры щитовидной железы при трансплантации // Збірник тез конференції: „Патогенетичні аспекти фармакотерапії ендокринний захворювань”.- Харків. - 2002. - С.25-26.

10. Volkova N.A. Transplantation effect of thyroid gland’s cryopreserved organ culture on rabbit’s thyroid status with experimental hypothyrosis // Збірник тез ІІІ міжнародної медичної конференції студентів та молодих вчених: „Медицина – здоров’я- ХХІ сторіччя”. - Дніпропетровськ. - 2002. - С.32.

11. Волкова Н.О. Вміст нуклеїнових кислот у нирках кроликів за ксенотрансплантації кріоконсервованої органної культури щитовидної залози // Укр. біохім. журнал. - 2002. - Т.74., №4. - С.142.

12. Волкова Н.А., Бондаренко Т.П. Влияние аллотрансплантации щитовидной железы на содержание нуклеиновых кислот в лимфоидных органах кроликов // Збірник тез конференції: „Патогенетичні аспекти фармакотерапії ендокринний захворювань”. -Харків. - 2003. - С.35-36.

13. Волкова Н.О., Легач Є.І., Бондаренко Т.П. Ксенотрансплантація кріоконсервованої органної культури щитовидної залози кроликам з експериментальним гіпотиреозом // Укр. медичні вісті. - 2003. - Т.5., №1(63). - С.126.

14. Volkova N.A., Bondarenko T.P. Cryopreservation effect on thyroid gland organ culture biochemical indices // Criobiomol-2003: Coimbra, Portugal. - 2003. - P.76.

АНОТАЦІЇ

Волкова Н.O. Кріоконсервовані органні культури щитовидної залози при ало- та ксенотрансплантації. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія, Інститут проблем кріобіології та кріомедицини НАН України, Харків, 2004.

У роботі проведено морфо-функціональний аналіз кріоконсервованих і нативних органних культур щитовидних залоз кроликів та новонароджених поросят, за умов їхнього вивчення in vitro (рекультивування) та in vivo при трансплантації субтотально тиреоїдектомованим самцям кроликів. Зроблено висновок про коригуючий вплив трансплантатів на гормональний статус тиреоїдектомованих тварин. Поряд з використанням алогенного матеріалу стає можливим використання ксеногенного матеріалу, функціонування якого в організмі реципієнта пролонгується за умов використання сумісної трансплантації культур надниркових залоз.

Ключові слова: кріоконсервування, органна культура щитовидної залози, ало- та ксенотрансплантація, рівень тиреоїдних гормонів, вміст нуклеїнових кислот.

Волкова Н.А. Криоконсервированные органные культуры щитовидной железы при алло- и ксенотрансплантации.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19.- криобиология, Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2004.

В работе проведен морфо-функциональный анализ криоконсервированных и нативных органных культур щитовидных желез кроликов и новорожденных поросят in vitro (рекультивирование) и in vivo (трансплантация субтотально тиреоидэктомированным самцам кроликов). Было установлено, что криоконсервирование по 2-х этапной программе с использованием 7% ДМСО не приводит к существенным изменениям функциональных характеристик исследуемых культур. Наблюдаемые изменения в гистологической картине криоконсервированных культур связаны с уменьшением объема клеток и являются обратимыми, восстанавливаясь при рекультивировании. Следует отметить, что криоконсервированные органные культуры щитовидной железы новорожденных поросят, сохраняя морфоструктуру, характеризуются более высоким уровнем гормонопоэза, содержанием белка, нуклеиновых кислот по сравнению с органными культурами щитовидной железы кроликов. Полученные результаты, вероятнее всего, обусловлены тем, что ткани новорожденных доноров более устойчивы к влиянию низких температур и способны в большей мере к репаративным процессам после деконсервации. Проведенная оценка морфо-функционального состояния криоконсервированных образцов позволяет сделать заключение о том, что данный эндокринный материал может быть использован при алло- и ксенотрансплантации с целью выявления возможности коррекции гормонального статуса у животных с экспериментальным гипотиреозом.

Результаты проведенных исследований по адаптированию модели тиреоидной недостаточности свидетельствуют, что удаление 2/3 щитовидной железы у экспериментальных животных приводит к развитию тиреоидной недостаточности, сопровождающейся изменениями в клеточном составе крови, массе животных, массе внутренних органов, содержанием нуклеиновых кислот в печени и лимфоидных органах. Развитие тиреоидной недостаточности у экспериментальных животных наблюдается на протяжении всего срока эксперимента, однако, наиболее четкие проявления наблюдались к 21-30-тым суткам. Эти данные позволили сделать заключение о возможности использования данной модели для коррекции гормональной недостаточности путем транслантации криоконсервированной органной культуры щитовидной железы.

Сравнительный анализ аллогенного и ксеногенного трансплантата на основе изучения различных показателей у экспериментальных животных (уровень гормонов, состояние лимфоидных органов, печени, почек) позволило нам сделать вывод о том, что как аллогенные, так и ксеногенные трансплантаты оказывают коррегирующее действие на тиреоидный статус животных. Однако, компенсирующий эффект находится в зависимости от вида используемого трансплантата. Если нативный и криоконсервированный аллогенный трансплантат оказывали практически одинаковое коррегирующее влияние (по уровню Т3 и Т4), то использование рекультивированного материала приводило к более выраженному эффекту. Нативный ксеногенный материал оказывал соответствующий эффект на 14 –тые сутки (по уровню Т4), что, по всей видимости, связано с развитием иммунологических реакций в организме реципиента. При этом следует отметить, что использование нативного и криоконсервированного ксеногенного материала приводило к компенсации тиреоидной недостаточности (по уровню Т4), но имело разную интенсивность и скорость развития во времени. Полученные данные согласуются с результатами гистологических исследований зоны трансплантации и самих трансплантатов. Трансплантаты в виде криоконсервированных ксеногенных культур на 30-тые сутки после воздействия приводили к развитию иммунологических реакций на месте трансплантации. При этом на более длительных посттрансплантационных сроках (120-тые сутки) криоконсервированный материал не вызывал иммунологических реакций, хорошо приживался в организме реципиента, проявляя регенеративную и специфическую функциональную активность. Однако, следует отметить, что к данному сроку оставалась примерно 1/10 часть изначально трансплантируемого материала, что очевидно является следствием развития реакций отторжения на более ранних сроках, вызванных значительными видовыми различиями между тканями донора и реципиента. Исследования зоны резекции щитовидной железы, показали, что в культе животных с трансплантатами отмечается компенсаторная