ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Академія медичних наук України
Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова
ВАЛЬЧУК СЕРГІЙ ІВАНОВИЧ
УДК 578.651.63:576.8.095.38
"ВПЛИВ сполук ЙОДУ НА БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ
МІКРООРГАНІЗМІВ, ПРОДУКУЮЧИХ ВОДЕНЬ ПЕРОКСИД"
03.00.07 - мікробіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Харків - 2004
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Дніпропетровської державної медичної академії МОЗ України.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, заслужений працівник народної освіти України Кременчуцький Геннадій Миколайович, Дніпропетровська державна медична академія МОЗ Україні, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, старший науковий співробітник Бабич Євген Михайлович, Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України, завідувач лабораторії специфічної профілактики краплинних інфекцій;
доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри імунології, алергології та ендокринології
Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних захворювань
ім. Л.В.Громашевського АМН України
Захист відбудеться "19" лютого 2004 року о 12 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 64.618.01 при Інституті мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України за адресою: 61057: м. Харків, вул. Пушкінська, 14.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України за адресою: м. Харків, вул. Пушкінська, 14.
Автореферат розісланий " 3 січня " 2004 р.
Вчений секретар
спеціалізованої Вченої ради
к.мед.н., пров.н.с. Бруснік С.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Макроорганізм сумісно з його мікробіоценозами (бактеріями, вірусами, бактеріофагами, тощо) являє собою саморегулюючу біоасоціативну систему (Г.М. Кременчуцький та співавт., 2003). Мікроорганізми беруть участь майже у всіх біохімічних та фізіологічних процесах, що протікають на слизових оболонках і шкірному покрові (С.І.Климнюк, 2002). Достатньо вивчена також роль мікробів в регуляції і підтримці імунного статусу та фізіологічної рівноваги (гомеостазу) організму людини (А.А. Журило, 1999). Дещо гірше вивчено інформаційний статус мікроорганізмів (А.В.Алескин, 1999).
Біопрепарати з мікроорганізмів (пробіотики) сьогодні вже достатньо широко застосовуються в медичній практиці (В.В. Смирнов, В.С. Подгорський, Н.К. Коваленко, 2003). Однак, терапевтичний і профілактичний ефект пробіотиків опосереджується вельми складною системою ензимів, біологічно активних речовин, мікро- і макроелементів, рецепторних взаємодій з елементами імунної системи (А.Н. Бондаренко, 1996). Вплив мікро- і макроелементів на біологічні властивості пробіотиків (антагонізм, біохімічні, антигенні властивості, здатність щодо синтезу біологічно активних речовин, трансформації молекул макроорганізму) вивчено недостатньо.
Одним з найважливіших мікроелементів, що відіграють суттєву роль у біохімічних процесах макро- і мікроорганізмів, є йод і його сполуки (R.K. Мurray et al., 1999). Препарати йоду володіють дезинфікуючими властивостями із широким спектром антимікробної дії. Спиртові розчини йоду, окрім бактерицидної дії, проявляють також виражений спороцидний ефект, однак вони мають ряд недоліків, дещо знецінюючі їх практичне застосування. Основним з них є подразнююча дія на шкіру і слизові оболонки, здатність викликати опіки і алергійні реакції. Крім того, йод має обмежену розчинність у воді, він летючий і вельми токсичний.
В останні роки усе більш широке застосування знаходять так звані йодоформ - комплексні сполуки йоду з розчинними у воді полімерами. Йодофори, зберігаючи високі антисептичні властивості йоду, позбавлені більшості перерахованих вище недоліків. Вони володіють також миючими властивостями, що значно прискорює процес знезаражування. Однією з позитивних властивостей йодофорів є збереження ними високої бактерицидної активності в присутності органічних речовин - білку, крові, гною.
Бактерицидна дія йоду у вигляді вказаного комплексу значно пролонгується в порівнянні з неорганічними його сполуками. Бактерицидну дію елементного йоду з однією позитивною валентністю пояснюють гальмуванням ензимних процесів або прямим галоїдуванням протеїнів мікробної клітини (Г.К. Палій та ін., 1997). Відомі дві основні системи, що перетворюють галогени (аніони) J і СІ у біологічно активні гіпогалоїди з різними біологічними властивостями. Перша - органний рівень - щитовидна залоза, в якій у процесі окислювання НАДН2 утворюється водень пероксид, який використовується КІ-пероксидазою для окислювання КJ і утворення ді-, трийодтироніну і тироксину (R.К. Мurrау еt аl., 1999). Друга - клітинний рівень - фагоцити, що використовують реакцію окислювання НАДРН2 для одержання водню пероксиду та синтезу за допомогою хлорпероксидази бактерицидного гіпохлориду (А.Ф.Панченко, А.М. Герасимов, В.Д. Антоненков, 1981).
У попередніх дослідженнях показано, що представники нормальної мікрофлори організму людини - аерококи, - що живуть на слизових оболонках порожнини рота, тонкого і товстого кишківнику, продукують водень пероксид у результаті окислювання молочної кислоти (Г.M. Кременчуцький, П.Я. Аренков, 1989), піровиноградної кислоти (С.А. Черняєв, 2002) і б-гліцерофосфату (С.А. Риженко, 2000). Аерококи використовують продукуємий водень пероксид для пригнічення росту інших мікроорганізмів і глутатіонпероксидазу - для захисту від ендогенного водню пероксиду.
Аерококи як мікроаерофіли позбавлені гемвмістних каталази і пероксидази (J.В.Еvans , 1953). Антиоксидантний захист клітин здійснюється функціонуванням глутатіонпероксидази, супероксиддисмутази, а також за допомогою хімічної реакції між піровиноградною кислотою і воднем пероксидом. Зроблено припущення, що окрім глутатіонпероксидазної активності мікроаерофіли можуть проявляти й інші види пероксидазної дії, наприклад, за рахунок ферментів типу І- пероксидази. Таким чином, мікроорганізми роду Аегососсиз володіють самими різними антагоністичними властивостями щодо інших членів мікробіоценозів, та механізми вказаної дії далеко ще не розкриті. Вказане диктує необхідність виконання нашого дослідження.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна робота є фрагментом планової науково-дослідної роботи кафедри мікробіології, вірусології та імунології Дніпропетровської державної медичної академії "Біотехнологія отримання асоційованого препарату із Aerococcus viridans і Вacillus subtilis, які входять до складу А-бактерину і Субаліну, та дослідження його біологічних властивостей "in vitro" і "іn vivo" (номер державної реєстрації – 0100V 003058)", Інституту мікробіології і імунології ім.І.І.Мечнікова "Вивчення чутливості до дії сучасних антибіотиків та інші біологічні властивості госпітальних штамів-збудників гнійно-запальних інфекцій" (шифр ЦФ.4.28.99, № державної реєстрації 0199М003170), Дисертант є співвиконавцем фрагментів цієї наукової роботи.
Мета дослідження: визначити вплив йоду і його сполук на антагоністичну властивість та біохімічну активність мікроорганізмів, продукуючих водень пероксид.
Задачі дослідження:
1. Вилучити і охарактеризувати охаректеризувати продуценти водню пероксиду різного походження, означити їх місце в таксономії мікроорганізмів;
2. Означити субстрати, при окисленні яких продукується водень пероксид, і дослідити кореляцію цього процесу з антагоністичною активністю продуцента;
3. Дослідити вплив сполук йоду на біологічні властивості продуцентів водню пероксиду;
4. Встановити вплив біологічно активних речовин у комплексі з сполуками йоду на рівень антагоністичної активності і окислення молочної кислоти аерококами та їх ферментними комплексами;
5. Дати комплексну порівняльну оцінку ефективності застосування аерококів сумісно з сполуками йоду та біологічно активними речовинами при експериментальній стафілококовій інфекції;
6. Визначити можливість йодування органічних речовин за допомогою бактерій, продукуючих водень пероксид;
7. Вивчити антигіпоксичну дію лізату аерококів на моделі гіпоксії мишей.
Об'єкт дослідження. Мікроорганізми, які продукують водень пероксид.
Предмет дослідження. Сполуки йоду й їхній вплив на біологічні властивості продуцентів водню пероксиду. Біологічно активні речовини й їхній вплив на антагоністичні властивості представників нормальної мікрофлори. Терапевтична дія препарату з аерококів у комплексі з препаратами йоду та хімічно чистого водню пероксиду на моделі експериментальної стафілококової інфекції білих мишей.
Методи дослідження. Мікробіологічні (виділення продуцентів водню пероксиду з організму людини і тварин, їх морфологічна, біохімічна і фізіологічна ідентифікація). Біохімічні (визначення ферментативної активності продуцентів водню пероксиду, вилучення ферментних комплексів бактерій і визначення їх оксидазної активності).
Наукова новизна одержаних результатів.
Доведена наявність у доброякісних та злоякісних пухлинах продуцентів водню пероксиду. Вперше встановлено стимулюючий вплив KJ, доданого до живильного середовища, на антагоністичну активність аерококів, продукуючих водень пероксид. За аналогією з приведеними вище механізмами використання аніонів на тканинному і клітинному рівнях макроорганізму висловлено припущення, що аерококи також володіють KJ-пероксидазною активністю і використовують продукуємий водень пероксид для окислення KJ до гіпойодиду, що призводить до значного посилення протимікробної дії (в порівнянні з пероксидом водню).
Означено субстрати окислення продуцентів водню пероксиду, до яких відносяться: молочна кислота, б-гліцерофосфат, піруват, гліцин, глутатіон, валін, цистін, пролін.
Показана антигіпоксична дія лізату аерококів на моделі гіпоксії білих мишей. Виявлено стимулюючу дію сполук йоду на профілактичний та лікувальний ефект препарату з аерококів. Встановлена можливість йодування органічних речовин за допомогою продуцентів водню пероксиду, володіючих KJ-пероксидазною активністю.
Практичне значення одержаних результатів.
На підставі аналізу результатів експериментів зроблено висновок, що аерококи, введені підшкірно у вогнище поразки, розмножуючись там, проявляють профілактичний та лікувальний ефект за рахунок своїх продуктів метаболізму, у тому числі і пероксиду водню. Антагоністичну активність аерококів підсилюють треонін, глутамінова та аспарагінова кислоти, валін, глутатіон відновлений і цистеїн. Висловлено припущення і доведено, що амінокислоти відіграють значну регуляторну роль в окислювальному метаболізмі аерококів.
Визначено, що сполуки йоду підвищують лікувальний ефект і захисну дію препарату з аерококів. Дані про йодування органічних речовин за допомогою продуцентів водню пероксиду відкривають новий шлях боротьби з йоддефіцитними захворюваннями.
Особистий внесок здобувача. Автор самостійно здійснив пошук літературних джерел та аналіз літературних даних. Вилучення продуцентів перекису водню з організмів людини та тварин, їх ідентифікацію і мікробіологічну характеристику повністю виконано автором. Дисертант особисто дослідив вплив сполук йоду на антагоністичну та біохімічні властивості продуцентів пероксиду водню. Статистична обробка дослідів, висновки та практичні рекомендації зроблені особисто автором.
Апробація результатів дисертації. Результати виконаних досліджень оприлюднені в доповідях на симпозіумі "Синтез, експериментальне вивчення та клінічне застосування четвертинних амонієвих сполук", Чернівці, 1995; на Міжнародній конференції "Стратегія і тактика використання антисептиків в медицині", Вінниця, 2000; на науковій конференції "Розвиток санітарної мікробіології в Україні", Чернівці, 2002; на міжнародній конференції "Новые информационные технологии в медицине и экологии", Ялта-Гурзуф, 2003; на міжнародній науковій конференції " Актуальные вопросы борьбы с инфекционными болезнями", м. Харків, 2003; підсумкових конференціях Дніпропетровської обласної СЕС, Дніпропетровськ, 2000 - 2003.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 наукових праць, з них 3-у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, два розділи у монографії, 2 роботи у матеріалах і збірниках конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 127 сторінках і складається із вступу, огляду літератури, розділу "Матеріали і методи досліджень", 3 розділів власних досліджень, аналізу та обговорення результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних літературних джерел (всього 214 найменувань). Робота ілюстрована 36 таблицями та 19 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У першому розділі роботи подано огляд літератури, в якому наведено дані щодо вмісту перекисводнюутворюючих бактерій в організмі людини, їх біологічних властивостей, впливу макро- і мікроелементів на мікроорганізми. Висвітлено недоліки вивчення взаємодії сполук йоду та біологічно активних речовин з мікроорганізмами - продуцентами перекису водню, обґрунтовано доцільність цього дослідження.
Матеріал і методи дослідження. Вилучено, ідентифіковано і охарактеризовано 102 штами аерококів і стрептококів різного походження, штами з вираженою антагоністичною активністю, яка вивчалася методом відстроченого посіву тест-культур через 24 години вирощування антагоністів (С.А.Риженко, 2001). Охарактеризовано також штам Vibrio NAG р-6078, позбавлений каталазної і пероксидазної активності, чутливий до H2O2 і тест культури, що мають каталазну і пероксидазну активність. Окислювання КJ визначалося на індикаторному середовищі по кольоровій реакції окисленого J2 з розчинним крохмалем. Зони окислювання KJ зіставлялися з зонами пригнічення росту Vibrio NAG р-6078, S.flexneri, S.aureus, P. aeruginosa, С.albicans, К. pneumonіае, Е.соlі, S. typhimurium. Продукти окислювання визначали згідно методики В.Е. Каган та ін. (1986).
Для визначення ступеню антагоністичної дії аерококів на стафілококи в дослідах in vivo використано модель місцевої стафілококової інфекції білих мишей (Еlек S.D., 1956).
Вилучення і часткове очищення ферментного комплексу аерококів проводили шляхом висалювання сульфатом амонію білків з лізатів клітин, розчиненням осаду в 0,01 М фосфатному буфері (рН 7,4) і діалізом розчину через целофанову мембрану проти 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,4), як описано Р. Скоупсом (1985). НАД - незалежна лактатдегідрогеназна активність аерококів визначалась згідно з Н.W.Dоеllе (1971). Глутатіонредуктазна активність досліджена за методом, описаним Ю.І. Губським із співавт. (1983). Супероксиддисмутазна активність аерококів визначалась за методикою Є.В.Макаренка (1988).
Результати дослідження та їх аналіз. Результати власних досліджень наведено в 3-ому - 5-ому розділах.
Продуценти водню пероксиду вилучено з молозива породіль, узятого в них до і після пологів. Масовому обстеженню піддалися 291 матір шляхом однократного посіву незбираного молока на звичайний простий живильний агар. Для виявлення продуцентів водню пероксиду чашки Петрі з колоніями аерококів запилювали в герметичній камері тест-мікробом - V. NAG p-6078. Усього вилучено 88 штамів продуцентів. Продуценти водню пероксиду виділено також з доброякісних пухлин 32 хворих і злоякісних новоутворень 26 пацієнтів. В подальшому в роботі використано 14 штамів продуцентів водню пероксиду, вилучених з пухлин.
З усіх виділених штамів продуцентів водню пероксиду 97 відносилися до роду Аerococcus і 5 до роду Enterococcus.
На рисунку1 представлена зона інгібіції росту тест-культури V. NAG p-6078 колонією продуцента водню пероксиду, рисунку 2 ілюструє колонії аерококів на живильному середовищі, що містить KJ і розчинний крохмаль при окислюванні молочної кислоти.
Рис. 1. Зона інгібіції росту Рис. 2. Індикаторне фарбування при
тест-культури V. NAG p-6078 рості продуцентів на середовищі, що
колонією продуцентів Н2 О2 містить KJ і розчинний крохмаль
У таблиці 1 проведено зіставлення зон пригнічення росту V. NAG p-6078 з діаметрами зон індикаторного фарбування, що виникають при продукції різними штамами бактерій Н2О2.
Статистично в усіх варіантах експерименту визначено повний збіг зон пригнічення росту V. NAG p-6078 з діаметрами зон індикаторного фарбування, що виникають при продукції різними штамами мікробів Н2О2.
Таблиця 1
Результати зіставлення зон пригнічення росту Vіbrio NAG р-6078
з діаметрами зон індикаторного фарбування
№
з.п. |
Куль-тури |
Антагоністична та оксидазна активність аерококів в
індикаторному середовищі ІС
Діаметр (мм) зони
пригнічення росту
Vіbrio NAG р-6078М±м |
Діаметр (мм) зони
індикаторного фарбування
М±м
1 | 2 | 3 | 4
1 |
167 |
25,3±1,2 |
25,6±0,8
2 |
201 |
31,5±1,2 |
29,0±1,2
3 |
79 |
15,3±1,2 |
13,0±0,8
4 |
87 |
28,6±2,5 |
29,6±2,6
5 |
89 |
22,0±2,9 |
19,3±2,6
6 |
90 |
30,6±2,6 |
27,0±2,6
7 |
93 |
19,6±1,2 |
18,6±1,2
8 |
77 |
17,8±0,8 |
17,0±0,8
9 |
80 |
24,0±2,2 |
21,6±0,8
10 |
81 |
30,3±2,1 |
28,6±2,4
11 |
118 |
29,0±1,6 |
28,6±1,8
12 |
94 |
28,3±2,8 |
28,0±2,8
13 |
95 |
16,6±2,2 |
16,2±2,4
14 |
127 |
27,3±0,9 |
26,6±0,5
15 |
128 |
32,6±1,2 |
31,3±3,3
16 |
123 |
25,0±0,8 |
24,6±1,2
17 |
124 |
17,3±1,2 |
17,0±0,8
18 |
125 |
21,0±1,6 |
20,3±1,2
Р |
> 0,05
Вивчено вплив різних концентрацій основного субстрату окислювання аерококами молочної кислоти. Раніше встановлено, що аерококи однаково добре окислюють D- и L-ізомери молочної кислоти (Кременчуцький Г.М., Аренков П.Я., 1989). Показником окислювання молочної кислоти служили зони індикаторного фарбування в середовищі, що містить KJ і крохмаль, під впливом продукуємої Н2О2.
Дані таблиці 2 підтверджують пряму дозову залежність ступеня продукції аерококами водню пероксиду від вмісту лактату в живильному середовищі.
Таблиця 2
Діаметр пофарбованих зон, ініціюємих різними штамами продуцентів водню пероксиду в залежності від концентрації лактата, що вводиться у середовище |
Діаметри зон індикаторного фарбування (М±м, мм)
№ |
Культури |
в залежності від концентрації лактату (мМ)
з.п. |
аерококів
90 |
9 |
0,9
1 |
2 |
3 |
4 |
5
1 |
167 |
58,5±2,5 |
35,1±1,7 |
11,2±0,7
Р |
- |
<0,01 |
<0,01
2 |
124
167 (окс, вар) |
78,3±3,5 |
47,8±2,5 |
18,8±1,5
Р |
- |
<0,01 |
<0,01
3 |
87 |
61,4±1,5 |
39,5±2,1 |
15,6±1,8
Р |
- |
<0,01 |
<0,01
4 |
89 |
87,5±2,4 |
51,6±3,5 |
21,4±2,4
Р |
- |
<0,01 |
<0,01
5 |
90 |
85,6±1,7 |
47,4±1,9 |
20,0±1,8
Р |
- |
<0,01 |
<0,01
6 |
201 |
62,5±2,8 |
40,1±1,7 |
17,5±2,5
Р |
- |
<0,01 |
<0,01
7 |
79 |
27,2±1,1 |
14,3±0,5 |
0
Р |
- |
<0,01 |
<0,01
8 |
93 |
59,8±1,7 |
37,2±8,3 |
13,2±1,7
Р |
- |
<0,01 |
<0,01
9 |
77 |
58,1±2,1 |
35,5±1,5 |
10,2±1,1
Р |
- |
<0,01 |
<0,01
10 |
80 |
58,5±2,5 |
35,Ш,7 |
11,2±0,7
Р |
- |
<0,01 |
<0,01
11 |
81 | 78,3±3,5 |
47,8±2,5 |
18,8±1,5
Р |
- |
<0,01 |
<0,01
Наступним етапом дослідження стало вивчення впливу різних концентрацій калію йодиду на антагоністичну активність продуцентів водню пероксиду роду Aerococcus viridans щодо різних тест-культур.
Встановлено, що починаючи з концентрації 400 мкг/мл KJ, доданий у живильне середовище, різко підвищує антагоністичну активність Aerococcus viridans, в тому числі і штамів, продукуючих пероксид водню. За аналогією з механізмами використання аніонів на тканинному і клітинному рівнях макроорганізму висловлено припущення, що аерококи також володіють KJ-пероксидазною активністю та окислюють KJ до гіпойодиду. Вказане призводить до різкого посилення їх бактерицидної дії (в порівнянні з пероксидом водню).
Отримані дані свідчать, що гліцерофосфат, як попередник дигідрооксиацетону, метилгліоксалю і молочної кислоти, достовірно активує процес окислювання калію йодиду й суттєво підвищує антагоністичну активність аерококів. Оптимальна концентрація гліцерофосфату в живильному середовищі знаходиться в межах 200-400 мкг/мл. Заслуговують на увагу результати отримані при додаванні в живильне середовище тіаміну. Починаючи з концентрацій тіаміну 100 мкг/мл у деяких випадках спостерігалося пригнічення окислювання калію йодиду й антагоністичної активності. Рибофлавін стимулював вказані властивості аерококів у концентрації 10 мкг/мл; при підвищенні його дози ефект був зворотнім. Додавання в живильне середовище тіаміну і рибофлавіну сумісно в концентраціях 10 мкг/мл не привело до достовірних змін ступеня окислювання калію йодиду та підвищення антагоністичної активності аерококів. Додатково перевірено вплив калію броміду на антагоністичну активність аерококів та достовірних її змін при цьому також не виявлено.
У процесі підбору амінокислотного складу селективно-індикаторного середовища визначеного біохімічного складу для аерококів відмічено, що зміна концентрацій деяких амінокислот, наприклад, глутамінової кислоти, або введення до складу середовища інших амінокислот, необхідних для росту аерококів, призводило або до посилення індикаторної реакції середовища на оксидазну активність, або ж до зменшення. По цьому вивчено вплив різних амінокислот на оксидазну активність ферментного комплексу, виділеного з штаму № 167 аерококів. Діаметр кольорової зони, що утворюється при окислюванні молочної кислоти, порівнювали з рівнем поглинання кисню (табл. 3).
Таблиця 3
Вплив амінокислот на окислювання калію йодиду ферментним
комплексом аерококів
№
з.п. |
Амінокислоти |
Діаметр кольрової зони в індикаторному гелі (мм) |
МкМ О2 за 1 хв на 1 мг білку ферментного комплексу
1 |
2 |
3 |
4
1 |
Контроль |
9,3±0,36 |
227,6±19,7
р |
- |
-
2 |
Тирозин |
14,3±0,36 |
209,7±15,6
р |
<0,05 |
>0,05
3 |
Триптофан |
0 |
95,3±7,3
Р |
- |
<0,05
4 |
Гліцин |
14,0±0,38 |
209,8±12,1
Р |
<0,05 |
>0,05
5 |
Лейцин |
8,3±0,36 |
206,0±12,8
Р |
>0,05 |
>0,05
6 |
Лізин |
12,3±0,36 |
450,3±12,6
Р |
<0,05 |
<0,01
7 |
Серин |
8,6±0,36 |
220,6±8,4
Р |
>0,05 |
>0,05
8 |
Треонін |
13,6±0,36 |
523,7±13,8
Р |
0,05 |
<0,01
9 |
Орнітин |
8,3±0,36 |
193,3±3,5
Р |
>0,05 |
>0,05
10 |
Глутамін |
0 |
1 12,2±3,8
Р |
- |
<0,05
11 |
Глутамінова |
8,6±0,5 |
456,5±34,2
кисл.
Р |
>0,05 |
<0,01
12 |
Аспарагін |
0 |
98,7±4,5
Р |
- |
<0,01
13 |
Аспарагінова |
8,6±0,67 |
192,0±2,7
кисл.
Р |
>0,05 |
>0,05
14 |
Р - феніл - б - |
8,6±0,67 |
190,6±4,01
аланін
Р |
>0,05 |
>0,05
15 |
Ізолейцин |
11,6±0,36 |
210,15±6,3
Р |
<0,05 |
>0,05
16 |
Р - аланін |
0 |
98,6±4,1
Р |
- |
<0,01
17 |
Норвалін |
8 |
132,6±2,7
Р |
>0,05 |
<0,01
18 |
Норлейцин |
8,6±0,36 |
194,7±9,95
Р |
>0,05 |
>0,05
19 |
Метіонін |
0 |
391,9±38,02
Р |
- |
<0,01
20 |
Валін |
13,0±0,58 |
239,9±15,1
Р |
<0,05 |
>0,05
21 |
б - аланін |
21,3±1,36 |
589,5±30,3
Р |
<0,01 |
<0,01
22 |
Гістидін |
0 |
355,1±17,1
Р |
- |
<0,01
23 |
Пролін |
22,6±0,86 |
421,9±11,7
Р |
<0,01 |
0,01
24 |
Глутатіон |
0 |
0
віднов.
Р |
- |
-
25 |
Глутатіон |
21,3±0,36 |
21,3±0,36
окисл.
Р |
<0,01 |
<0,01
26 |
Аргинин |
8,6±0,5 |
8,6±0,5
Р |
>0,05 |
>0,05
27 |
Цистеін |
11,3±0,67 |
11,3±0,67
Р |
>0,05 |
>0,05
28 |
Цистін |
14,6±0,89 |
14,6±0,89
Р |
<0,05 |
<0,05
Дані таблиці 3 свідчать, що тирозин, гліцин, лізин, треонін, ізолейцин, валін, аланін, пролін, глутатіон окислений та цистін вірогідно підсилюють індикаторну реакцію гелю на лактатоксидазну активність ферментного комплексу тест-штаму аерококу. Достовірне посилення споживання кисню при окислюванні молочної кислоти дають лізин, треонін, глутамінова кислота, метіонін, аланін, гістидін, пролін, глутатіон відновлений і окислений, цистеїн і цистін.
Антагоністичну активність аерококів підсилюють: треонін, глутамінова та аспарагінова кислоти, валін, глутатіон відновлений і цистеїн. З отриманих даних можна припустити, що амінокислоти відіграють суттєву регуляторну роль в окислювальному метаболізмі бактерій роду Aerococcus.
Визначено антигіпоксичну дію бактеріального лізату в дослідах "in vivo" на моделі гіпоксії замкненого простору. Експерименти проведені на білих безпородних мишах масою 18-22 гр. Тварин розміщували в колбах об'ємом 150 мл, які герметично зачиняли. Ступінь антигіпоксичної дії лізату аерококів визначали згідно показника збільшення тривалості життя в групі тварин, яким за 5 хвилин до вміщення в колбу вводили бактеріальний лізат у дозах 1/10 та 1/20 ЛД50 (табл. 4).
Таблиця 4
Вплив бактеріального лізату аерококів на тривалість життя мишей в умовах
замкнутого простору
Група тварин |
Тривалість життя (сек) |
% щодо контролю
контроль
1/10 ЛД50
1/20 ЛД50 |
925 ± 88,7
1302 ± 119,5
953 ± 72,3 |
+ 40*
+ 3
Примітка: *Р<0,05
Як видно з даних, приведених у таблиці 4, в умовах гіперкапничної гіпоксії тривалість життя мишей, яким до початку експерименту вводили бактеріальний лізат у дозі 1/10 ЛД50, вірогідно довше, ніж у тварин контрольної групи.
Наступним етапом роботи стало вивчення профілактичної та лікувальної здатності аерококів, що виживають і розмножуються під шкірою тварин, при експериментальній стафілококовій інфекції.
Білим мишам підшкірно вводили інфікуючу дозу стафілокока, і в різний
термін - культури аерококів (2 млрд. клітин на одне введення). Проводили спостереження за часом прояву місцевих симптомів хвороби й інтенсивністю їхнього подальшого розвитку. Аерококи, введені під шкіру до інфікування стафілококами за 5 годин і через 3 години після введення останніх, проявляють достатньо виражену антагоністичну активність і попереджують розвиток інфільтрату. Аналогічні результати отримані при введенні аерококів у вогнище зараження в різні строки (до 5 годин) після зараження. Аерококи, введені у вогнище зараження через 24 і 48 годин, значно скорочували терміни прояву хвороби в порівнянні з контрольною групою мишей, яким антагоністи не вводилися. Починаючи з 3 - 4 дня місцевий процес у них помітно загасав, у той час як у контрольних тварин інфільтрат ще був чітко вираженим навіть на 8 добу спостереження.
Наступна серія експериментів проведена на 60 білих мишах, у яких аерококи, х/ч водень пероксид і аерококи з йодидом калію застосовано з лікувальною метою при бурхливому розвитку запалення. З цією метою трьом групам білих мишей (по 15 тварин у кожній) з уже чітко означеним гнійником вводили аерококи в дозі 1,9х109 клітин, водень пероксид (0,25 мл 0,01%), аерококи в дозі 1,9x109 клітин з йодидом калію (0,04%). Ще 15 мишей склали контроль. Спостереження за ступенем прояву місцевих симптомів запалення проводили щоденно, бактеріологічний контроль на наявність стафілококів виконували шляхом висіву гною на 10 % молочно-сольовий агар.
Одноразове введення хімічно чистого пероксиду водню у 2 з 15 тварин скоротило терміни видужання на 2 - 3 доби в порівнянні з контрольною групою мишей. У групі мишей, що одержували аерококи, 6 з 15 тварин видужали протягом перших 3-х діб від початку лікування; у групі мишей, що одержували аерококи з калієм йодидом, 10 з 15 тварин видужали протягом перших 3-х діб від початку лікування. Хімічно чистий пероксид водню, введений в організм одноразово, швидко нейтралізувався тканинними ферментами з каталазно-пероксидазною активністю і не встигав проявити згубну дію щодо масиву стафілококів, що містяться в рані. По цьому, патологічний процес пробігав довгостроково, без суттєвої різниці з контролем (неліковані тварини).
Найбільш вираженою лікувальною дією володів протективний комплекс аерококів з йодидом калію, що обумовлено як антагоністичною активністю аерококів щодо стафілококів, так і подовженою за часом протимікробною дією йодофору. На доповнення виконаних експериментів означена підвищена властивість аерококів, здатних продукувати водень пероксиду, сумісно зі сполуками йоду йодувати органічні речовини (тирозін та альбуміни різного походження), що вказує на ще одну сторону механізму протизапальної дії дослідженого комплексу і дозволяє технологам компонувати лікувальні форми пробіотиків більш цілеспрямованої направленості.
ВИСНОВКИ
1. У дисертації наведено нове розв'язування наукових питань, пов'язаних з виділенням продуцентів водень пероксиду з тканин доброякісних та злоякісних пухлин, впливом сполук йоду на біологічні властивості продуцентів, їх профілактичну і лікувальну активність, з органіфікацією йоду продуцентами водень пероксиду, а також з антигіпоксичною дією лізату аерококів.
2. З грудного молока і тканин доброякісних і злоякісних пухлин урологічних хворих виділено і вивчено культури бактерій, продукуючих водень пероксид, з яких 97 віднесені до роду Aerococcus і 5 культур до роду Enterococcus;
3. Виявлено нові субстрати окислювання в аерококів: гліцін, валін і глутатіон, які вірогідно підвищують антагоністичну дію аерококів на 20-30%;
4. Додаток йодиду калію в концентрації 400 мкг/мл до живильного середовища у 2-3 рази підвищує антагоністичну дію аерококів, що володіють калій йодид пероксидазною активністю;
5. Проміжні метаболіти біологічного синтезу водню пероксиду і привнесені в живильне середовище тіамін і рибофлавін в дозах 0,1 мкг/мл за участю KJ-пероксидази вірогідно стимулюють процес окислювання йодиду калію пероксидом водню, на окислювання молочної кислоти ферментним комплексом аерококків суттєво впливають амінокислоти: треонін, глютаміновая та аспарагіновая кислоти, валін, цистеїн і пептид - глутатіон відновлений;
6. Комплекс аерококів (1,9х109 КУО) з йодидом калію (0,04%) вірогідно попереджує розвиток місцевого патологічного процесу і володіє лікувальною дією при експериментальній стафілококовій інфекції;
7. Лізат аерококів, володіючих оксидазною активністю, у дозі 0,1 ЛД50 проявляє достатньо виражену антигіпоксичну дію;
8. Воденьпероксидпродукуючі аерококи сумісно з калієм йодидом здатні в межах 11,1% - 27,5 % викликати органіфікацію йоду, що дозволяє на їх основі розробляти лікарські форми пробіотиків принципово нового призначення.
СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ
ДИСЕРТАЦІЇ
1. Вальчук С.И. Влияние калия йодида на антагонистическую активность микроорганизмов, образующих водород пероксид //Вісник проблем біології і медицини. - 2003. - В.6. - С.5-8
2. Кременчуцкий Г.Н., Рыженко С.А., Вальчук С.И. Роль микроэкологии организма человека и принципы ее коррекции: Монография. -Днепропетровск: Пороги, 2003. - 230 с.
3. Кутовий О.Б., Риженко С.А., Молчанов Р.М., Вальчук С.І. Використання Aerococcus viridans для профілактики хірургічних та урологічних ускладнень, обумовлених мікробною транслокацією // Урологія. - 2003. -№1.-С.23-25.
4. Риженко С.А., Вальчук С.І., Шарун О.В. Дослідження лікувальної дії Aerococcus viridans на моделі стафілококової інфекції. // Медичні перспективи. - 2003.- Т.VІІІ, № 1. - С. 34-36.
5. Кременчуцкий Г.Н., Черняев С.А., Риженко С.А., Кременчуцкий С.Г., Вальчук С.И. Разработка селективно-индикаторных сред определенного биохимического состава для исследования физиологических свойств Aerococcus viridans // Тези доповідей наукової конференції "Розвиток санітарної мікробіології в Україні". - 2002. - Чернівці. - С. 61 - 66.
6. Кременчуцкий Г.Н., Кулишенко С.Г., Рыженко С.А., Вальчук С.И., Юргель Л.Г.. Бицкий В.В., Лахтионова Н.Г., Шарун О.В. Влияние живой культури Aerococcus viridans на факторы иммунологической реактивности организма человека "in vitro" // Материалы XI международной конференции "Новые информационные технологии в медицине". - 2003. - С. 370 - 374.
АНОТАЦІЯ
Вальчук С.І. Вплив сполук йоду на біологічні властивості мікроорганізмів, продукуючих водень пероксид. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07. - мікробіологія. - Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України, Харків, 2004.
Вперше встановлено стимулюючий вплив KJ, доданого в живильне середовище, на антагоністичну активність аерококів, продукуючих водень пероксид. За аналогією з приведеними вище механізмами використання аніонів на тканинному і клітинному рівні макроорганізму доведено, що аерококи володіють KJ-пероксидазною активністю і використовуючи продукуємий водень пероксид окислюють KJ до гіпойодиду, який проявляє значно більшу бактерицидну дію, ніж нативний водень пероксид. В умовах гіперкапничної гіпоксії введення білим мишам лізату аерококів на 40% збільшувало тривалість їх життя в порівнянні з контрольною групою.
При експериментальній стафілококовій інфекції комплекс аерококів з калієм йодидом викликав більш швидке загоєння ран в порівнянні з контролем. Визначено умови йодування органічних молекул за допомогою продуцентів водню пероксиду і неорганічних сполук йоду.
Ключові слова: аніони, антагонізм, аерокок, водень пероксид, гіпойодид, калій йодид, пероксидаза.
АННОТАЦИЯ
Вальчук С.И. Влияние соединений йода на биологические свойства микроорганизмов, продуцирующих водород пероксид . - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт микробиологии и иммунологии им. И.И.Мечникова АМН Украины, Харьков, 2004.
Установлено стимулирующее влияние KJ, добавленног в питательную среду, на антагонистическую активность аэрококков, продуцирующих водород пероксид. По аналогии с приведенными выше механизмами использования анионов на тканевом и клеточном уровнях макроорганизма показано, что аэрококки обладают KJ-пероксидазной активностью, используя продуцируемый ими пероксид водорода, окисляют KJ до гипойодида. Последний проявляет значительно более выраженную бактерицидную активность, чем нативный водород пероксид.
Глицерофосфат способствует окислению калий йодида и также повышает антагонистическую активность аэрококков. При добавлении в питательную среду тиамина, начиная уже с концентрации 100 мкг/мл, наблюдается угнетение процесса окисления йодида калия и снижение антагонистической активности аэрококков. Рибофлавин стимулирует продукцию водород пероксида аэрококками. В условиях гиперкапнической гипоксии введение белым мышам лизата аэрококков на 40 % увеличивает продолжительность жизни животных в сравнении с контролем.
При экспериментальной местной стафилококковой инфекции комплекс аэрококков с калий йодидом обладает выраженным профилактическим и лечебным действием. Способность аэрококков - продуцентов пероксида водорода - и неорганических соединений йода (йодофоров) йодировать в достаточно высокой степени (до 11,1% - 27,5%) органические субстраты позволяет создавать пробиотики направленного действия.
Ключевые слова: анионы, антагонизм, аэрококк, водорода пероксид, гипойодид, калий йодид, пероксидаза.
SUMMARY
Valchuk S.I. Influence of connections iodine on biological properties of microorganisms producing peroxide of hydrogen. - Manuscript.
Dissertation for obtaining the scientific degree of a Candidate of Medical Sciences in speciality - 03.00.07. - Microbiology. - Institute of microbiology and immunnology by I.I. Mechnicov AMS of Ukraine, Kharkov, 2004.
We for the first time establish the stimulating influence KJ, added in a nutrient medium on antagonistic activity of aerococci, producing hydrogen peroxide. By analogy to above mentioned mechanisms of use anions at a fabric and cellular level of macroorganisms, we state the assumption, that aerococci have KJ-peroxidase activity and using produced hydrogen peroxide for oxidize KJ up to hypoiodide which has considerably the big bactericidal action, than hydrogen peroxide. In conditions hypercapneutic hypoxy introduction to white mice lysate of aerococci on 40 % increased life expectancy in comparison with control group.
At an experimental staphylococcal infection the complex aerococci with potassium iodide caused faster healing wounds after comparison with the control.
Conditions iodination of organic molecules with the help of producers hydrogen peroxide and inorganic connections of iodine are determined.
Key words: anions, antagonism, aerococc, hydrogen peroxide, hypoyodid, potassium iodized, peroxidase.