МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

ВОЙЦЕХОВСЬКИЙ ВАЛЕРІЙ ГРИГОРОВИЧ

УДК 576.5:579.852.1:579.24

АГРЕГАЦІЯ КЛІТИН В ОНТОГЕНЕЗІ

СПОРОУТВОРЮЮЧИХ МІКРООРГАНІЗМІВ

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному медичному університеті ім.О.О.Богомольця МОЗ України

Науковий консультант доктор медичних наук, професор,

академік НАН України, член-кореспондент АМН України,

заслужений діяч науки і техніки України

Широбоков Володимир Павлович,

Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця,

завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології

Офіційні опоненти

доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України

Коваленко Надія Костянтинівна, Інститут мікробіології і вірусології

ім.Д.К.Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник

відділу фізіології промислових мікроорганізмів

доктор медичних наук, професор

Кременчуцький Геннадій Миколайович, Дніпропетровська державна

медична академія, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології

доктор медичних наук, професор Клімнюк Сергій Іванович

Тернопільська державна медична академія ім. І.Я. Горбачевського,

завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології

Провідна установа

Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика,

кафедра мікробіології та епідеміології, МОЗ України, м. Київ

Захист відбудеться 26.04. 2004 року о 13-30 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.01 Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця за адресою : 03057, м.Київ-57,

пр. Перемоги, 34, санітарно-гігієнічний корпус, аудиторія № 2.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного

університету ім. О.О. Богомольця за адресою: 03057, м.Київ-57, вул. Зоологічна, 1.

Автореферат розісланий 25.03.2004 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Анісімов Є.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження глибинних механізмів міжклітинної взаємодії у еукаріот і прокаріот є однією з актуальних проблем сучасної медицини і біології. Міжклітинні зв’язки відіграють важливу роль на всіх рівнях організації живих систем, а їх дослідження має важливе значення в розв’язанні таких фундаментальних проблем біології, мікробіології, імунології та онкології, як розвиток клітин, їх диференціація, міжклітинна кооперація, злоякісна трансформація тощо.

Процеси міжклітинної взаємодії всебічно вивчаються серед еукаріотичних і прокаріотичних клітин. До теперішнього часу залишаються не розв’язаними проблеми міжклітинної взаємодії при різноманітній патології, мало вивчені питання взаємодії бактеріальних клітин з клітинами організму людини під час інфекційного процесу (Олескин А.В. и др., 1999; Воронов О.О. із співавт., 1999; Hartshorn K.L. et al., 2002; Sheikh J. et al., 2002; Mellata M. et al., 2003).

За останні роки став помітним суттєвий прогрес у підходах до вивчення процесів міжклітинної взаємодії та механізмів її регулювання. Одним із можливих підходів до розв’язання вказаних загальнобіологічних проблем є використання мікробіологічної моделі дослідження механізмів міжклітинної взаємодії, зокрема аеробних спороутворюючих бактерій (Дорошенко Е.В. и др., 2000; Lazazzera B.A. et al., 2001; Chary V.K., Piggot P.J., 2003; Eichenberger P. еt al., 2003). Представники роду Bacillus на певних стадіях свого розвитку різко відрізняються між собою за морфологічними ознаками, мають характерну клітинну диференціацію та унікальні властивості спорових форм.

Аеробні спороутворюючі бактерії відносять до умовно патогенних мікроорганізмів, які здатні викликати в організмі людини ряд патологічних процесів: харчові отруєння, септицемії, ендокардити, ревматоїдні артрити, менінгіти, енцефаліти, пневмонії, нефрити тощо. Їх дія на організм обумовлена такими факторами патогенності, як ентеротоксини (Fletcher P. et al., 1999; Granum G. et al., 1999), ендотоксини (Mahler H. et al., 1997), гемолізини (Okstad O. et al., 1999; Kuse M. et al., 2000), ферменти патогенності: фосфоліпаза С, беталактамаза, протеаза, коллагеназа тощо (Bach H. et al., 1999; Nund T. et al., 1999; Kurakahe M. et al., 2000; Hosaka T. et al., 1999). Поява факторів патогенності спороутворюючих бактерій тісно пов’язана з певними фазами їх росту та розвитку. Окремі представники роду Bacillus, зокрема B.megaterium H, мають перехресно-реагуючі антигени з тканинами злоякісних пухлин (Затула Д.Г., 1982). Невірулентні штами бацил широко використовують для одержання пробіотиків (Кременчуцкий Г.Н. и др., 2003). Тому дослідження процесів розвитку цих мікроорганізмів має важливе значення як для розв’язання питань, пов’язаних з різноманітною інфекційною патологією, так і для пошуку та отримання корисних біологічно активних речовин, в тому числі, протипухлинної дії.

Вивчення міжклітинної взаємодії у бактерій – це важлива проблема не тільки медичної мікробіології, але й загальнобіологічна. Мікробіологічний аспект її полягає в тому, що, не зважаючи на численні дослідження, ще й досі залишаються недостатньо вивчені фази розвитку періодичної культури мікроорганізмів, роль ауторегуляторних факторів у процесах розвитку, зміни хімічного складу бактеріальних клітин під час росту та розмноження, значення окремих елементів та біополімерів у процесах диференціації, в реалізації механізмів анабіозу. Важливими та нерозв’язаними залишаються питання, пов’язані із структурними та функціональними особливостями бактеріальних клітин на різних стадіях розвитку, механізмами регуляції розвитком та диференціацією, можливістю управління цими процесами у мікроорганізмів.

Однією з головних перешкод в дослідженні невирішених питань було те, що до недавнього часу не існувало сучасних технічних засобів, які дозволяли б експериментаторам вивчати розвиток бактеріальних клітин на прикладі однієї чи кількох особин протягом тривалого часу культивування. Слід також зауважити, що отримані експериментальні дані та висновки про розвиток спороутворюючих бактерій базувалися на аналізі окремих зразків, що отримані із глибинної культури (макрокультури). Вивченню розвитку окремих клітин та формування мікропопуляції мікроорганізмів з використанням прямих методів спостереження присвячені лише одиничні роботи.

Попередніми дослідженнями нами встановлений феномен агрегації клітин під час розвитку періодичної культури одного штаму бактерій – B.cereus 504 (Войцеховский В.Г., 1982). Залишилося нез’ясованим можливість агрегації серед інших видів та штамів спороутворюючих бактерій. Не досліджені особливості міжклітинної взаємодії під час агрегації, ультраструктура агрегатів, фактори, які впливають на процес агрегації, зміни хімічного складу клітин та синтезу біополімерів на різних фазах розвитку бактеріальної популяції, можливі механізми агрегації та її роль в онтогенезі мікроорганізмів.

У зв’язку з вище викладеним слід вважати актуальною проблему вивчення міжклітинної взаємодії у процесі розвитку та диференціації спороутворюючих бактерій.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у межах проекту Державного фонду фундаментальних досліджень Комітету з науково-технічного прогресу при Кабінеті Міністрів України під назвою: “Явище агрегації клітин в онтогенезі мікроорганізмів” (№5/385) та науково-дослідної роботи кафедри мікробіології, вірусології та імунології Національного медичного університету ім.О.О.Богомольця за темою: “Розробити тверді поживні середовища на основі синтетичних та природніх гелів для культивування та ідентифікації мікроорганізмів (№ держреєстрації 01.87.0011067).

Мета та задачі дослідження. Мета: встановити закономірність феномену агрегації клітин у різних видів спороутворюючих бактерій роду Bacillus та визначити його значення в онтогенезі мікроорганізмів.

Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні задачі:

1. Дослідити умови та етапи формування агрегатів клітин у процесі розвитку періодичних культур різних видів спороутворюючих бактерій з використанням методів фазово-контрастної та електронної мікроскопії.

2. Вивчити динаміку розвитку та міцність міжклітинних зв’язків у процесі агрегації та дезагрегації клітин періодичної культури бактерій.

3. Здійснити біохімічний та електрофоретичні дослідження біополімерів поверхневих шарів клітинної стінки та розчинних полімерів культуральної рідини на різних фазах розвитку періодичної культури спороутворюючих бактерій.

4. Встановити особливості мінерального обміну бактеріальних клітин на різних етапах розвитку з комплексним використанням растрової електронної мікроскопії та рентгеноспектрального мікроаналізу.

5. Дослідити властивості бактеріальних спор після багаторічного зберігання в лабораторних умовах, а саме, проростання, утворення вегетативних форм та їх здатність до агрегації.

6. Визначити можливості управління розвитком бацил у межах мікроциклічного та макроциклічного розвитку.

Об’єкт дослідження: феномен агрегації клітин умовно патогенних аеробних спороутворюючих бактерій.

Предмет дослідження: штами мікроорганізмів, періодичні культури бактерій, мікрокультури бактерій, біополімери клітинних стінок та розчинні полімери культуральної рідини, мінеральний склад бактерій на різних фазах розвитку.

Методи дослідження. Для вивчення особливостей міжклітинної взаємодії аеробних спороутворюючих бактерій використовували комплекс мікроскопічних, бактеріологічних, фізіко-хімічних, електронно-мікроскопічних методів досліджень із застосуванням растрового електронного мікроскопа та рентгенівського мікроаналізатора, методи мікрокультивування мікроорганізмів у камерах, які дозволяють здійснювати багатодобове спостереження за розвитком окремих бактеріальних клітин.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведених досліджень вперше встановлено, що в процесі розвитку періодичних культур різних видів умовно патогенних спороутворюючих бактерій роду Bacillus, вегетативні клітини після завершення експоненціальної фази розвитку об’єднуються в багатоклітинні агрегати. Процес формування агрегатів характеризувався спочатку зростанням сил міжклітинної взаємодії, досягненням їх максимуму, потім зменшенням і повним зникненням. Диференціація клітин від вегетативних до форм у стані спокою відбувалася в агрегатах, а після повного дозрівання спор наступала дезагрегація клітин. Таким чином, доведено, що в оптимальних умовах цикл розвитку глибинної культури досліджуваних мікроорганізмів супроводжується агрегацією клітин і завершується не лізисом та загибеллю популяції, а, навпаки, 100 % спороутворенням.

Електронно-мікроскопічними дослідженнями встановлено, що агрегація вегетативних клітин виникає в результаті щільного контакту їх боковими поверхнями з наступним злиттям поверхневих шарів клітинних стінок. Після завершення спороутворення в клітинах агрегату та лізису параспоральних частин спорангіїв втрачалися попередні зв’язки між бактеріями і відбувався розпад агрегатів.

В результаті електрофоретичних досліджень встановлено, що на початкових етапах агрегації клітини здатні синтезувати специфічні розчинні біополімери, а культура саме в цій фазі розвитку індукує спорогенез у інших вегетативних клітин. Виявлені біополімери мають глікопротеїдну природу з молекулярною масою 41,0 і 33,5 кДа. Крім того, під час формування агрегатів бактеріальні клітини утворюють специфічні для цієї фази розвитку білки поверхневих шарів клітинної стінки (ММ 70,0–72,0 кДа), яким, можливо, і належить роль агрегуючих білків.

Вперше одержані дані про зміну вмісту хімічних елементів на різних фазах розвитку мікробної клітини. При вивчені мінерального складу у бактерій роду Bacillus встановлено, що вміст калію, натрію, кальцію, хлору, сірки, фосфору та кисню суттєво змінюється в клітинах на різних фазах розвитку періодичної культури. Проростаючі спори значною мірою втрачають більшість елементів, вегетативні форми бактерій під час агрегації накопичують калій, хлор, сірку та фосфор, що характеризує збільшення синтетичних та енергетичних процесів в клітинах. Таким чином, всебічне дослідження встановленого нами феномену агрегації клітин показало, що це закономірний процес, який має важливе значення в розвитку та диференціації клітин мікробної популяції.

На підставі одержаних результатів розроблена мікробіологічна модель, яка дозволяє вивчати онтогенез окремих бактеріальних клітин при постійному спостереженні за ними, діяти на них регуляторними факторами різного походження та змінювати стадії розвитку клітин в певному напрямку і, таким чином, досліджувати механізми диференціації та міжклітинної взаємодії.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлені закономірності розвитку умовно патогенних спороутворюючих бактерій мають значення при використанні їх у мікробіологічній промисловості для одержання діагностичних, лікувальних та профілактичних препаратів, біологічно активних речовин, біомаси спорових форм мікроорганізмів. Запропоновані методи мікрокультивування бактерій можуть бути використані для вивчення їх біологічних властивостей, дослідження механізмів дії антимікробних речовин. Одержані результати роботи можна використовувати при пошуку та створені препаратів – регуляторів поділу та диференціації клітин, які необхідні для застосування в різних галузях медицини.

Впровадження в практику. Розроблені камери для мікрокультивування бактерій використовуються в Інституті епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України для дослідження антимікробної дії хімічних сполук. Одержані результати використовуються у педагогічному процесі на кафедрах мікробіології, вірусології та імунології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця, Буковинської державної медичної академії, Дніпропетровської державної медичної академії.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. У дисертації викладені результати теоретичних та експериментальних досліджень, проведених переважно особисто. Фрагменти планових та грантованих НДР виконані здобувачем як виконавцем та відповідальним виконавцем вищеназваних наукових тем. Особисто автор провів аналіз літератури, мікроскопічні та мікробіологічні дослідження. Електронно-мікроскопічні та масспектральні дослідження проведені спільно з інженером-технологом вищої категорії Філімоненком О.П. та інженером 1 категорії Федоровим В.М. на базі лабораторії електронної мікроскопії та масспектрального аналізу НПО “Мікропроцесор” Київського НДІ Мікроприладів Центру фізіко-хімічних досліджень і високоточних вимірювань. Біохімічні та електрофоретичні дослідження проведені спільно з к.б.н., доцентом Михальським Л.О. та к.б.н, м.н.с Фуртат І.М. на базі кафедри мікробіології та прикладної імунології Київського національного університету імені Тараса Шевченко. *

Всі положення та висновки дисертаційної роботи належать автору. Автор самостійно написав та проаналізував усі друковані роботи.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що викладені в дисертаційній роботі були представлені на: VI Всесоюзній конференції по клінічні біохімії, морфології та імунології інфекційних захворювань “Новые возможности исследования состояния иммунитета при кишечных инфекциях” (Рига, 18-20 жовтня, 1983 р.); IX Всесоюзній конференції “Гигиени-ческое изучение биологического загрязнения окружающей среды” (Москва, 1983 р.); IV з’їзді Українського мікробіологічного товариства (Донецьк, 1984 р.); VII Мечніковській конференції “Современные вопросы вирусологии, микробиологии и иммунологии” (Одеса, 12-14 вересня 1984 р.); семінарі Всесоюзного мікробіологічного товариства “Физиология и генетика энтомопатоген-

___________________________________

* Автор висловлює щиру подяку вищеназваним співробітникам за надану консультативну та практичну допомогу при виконанні окремих фрагментів роботи.

ных бацилл - продуцентов средств защиты растений” (Оболєнск, 27-29 лютого 1984 р.); VII Всесоюзному з’їзді мікробіологічного товариства (Алма-Ата, 1985 р.); ХІ Українському республіканському з’їзді мікробіологів, епідеміологів та паразитологів (Одеса, 9-11 жовтня, 1985 р.); Всесоюзному семінарі “Вопросы антибактериальной терапии инфекционных осложнений в неинфекционной клинике” (Москва, 17-18 листопада, 1987 р.); І міській науково-практичній конференції винахідників та раціоналізаторів “Изобретательство и рационализаторство на современном этапе развития медицины” (Київ, 27-29 жовтня, 1988); XII Українському з’їзді мікробіологів, епідеміологів та паразитологів (Харків, 25-27 вересня, 1991 р.); Міжнародній науковій конференції “Идеи И.И.Мечникова в развитии современного естествознания” (Харків, 28-30 жовтня, 1995 р.); Міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні питання епідеміології на рубежі ХХІ століття” (Харків, 21-22 вересня, 2000 р.); Міжнародній конференції “Стратегия и тактика применения антисептиков в медицине” (Вінниця, 3-4 жовтня, 2000 р.); Науково-практичній конференції з міжнародною участю “Проблемні питання лікування дітей” (Київ, 17-18 травня, 2001 р.); Науково-практичній конференції “Медикаментозна та немедика-ментозна профілактика та відновне лікування в клінічній практиці” (Київ, 14-15 червня, 2001 р.).

Публікації. За результатами роботи опубліковано 50 наукових праць, з яких 24 статті у фахових виданнях, визначених ВАК України, 2 авторських свідоцтва, 5 патентів, 19 робіт у матеріалах з’їздів, конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 5 розділів власних досліджень, обговорення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій, додатку. Роботу викладено на стор. основного тексту, ілюстровано таблицями і рисунками. Бібліографія складається з джерел, серед яких україно- та російськомовних і іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Головним об’єктом дослідження був феномен агрегації клітин періодичних культур умовно патогенних спороутворюючих бактерій роду Bacillus. У дослідженнях використовували еталонні штами аеробних спороутворюючих мікроорганізмів, які були отримані із ДНДІСК ім. Л.О.Тарасевича (РФ, м.Москва). Це такі штами: B.mesentericus 66, B.mesentericus 1027 typе “E”, B.mesentericus 1026 typе “E”, B.mesentericus 1026 typе “D”, B.cereus ССM, B.cereus 2527, B.cereus 4/43, B.cereus 8035, B.cereus 24, B.megaterium 654, B.megaterium 2550, B.megaterium 89, B.subtilis 83, B.subtilis 7241. Крім того вивчалась культура оригінального штаму мікроорганізмів – B.megaterium H, який був виділений із грунту чл.-кор. НАН України Д.Г.Затулою. Відмінною особливістю даного штаму є те, що його спорова і вегетативна форма мають перехресно-реагуючі антигени з тканинами злоякісних пухлин (Д.Г.Затула, 1982). Також вивчалась культура B.mesentericus AB-56, яка мала антагоністичні властивості відносно штаму B.megaterium H. Обидва штами отримані із музею живих культур Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України. Також використовували штами Bacillus spр., Streptococcus pyogenes, Penicillium notatum 997 отримані на кафедрі епідеміології Національного медичного університету ім. акад. О.О.Богомольця.

Поживні середовища. Для культивування мікроорганізмів, одержання чистих культур, накопичення їх біомаси використовували такі поживні середовища: м’ясо-пептонний бульйон, перевар по Хоттінгеру, МПА, кров’яний МПА. Основні експерименти проведені в рідкому середовищі “ВВГ”, яке лімітоване за вмістом пептонів і за своїм хімічним складом сприяло повноцінному циклу розвитку досліджуваних мікроорганізмів, тобто 100 % спороутворенню. Для мікрокультивування бактерій використовували розроблену нами із співавторами (Гашинський В.В., Широбоков В.П., Крайнюкова Т.І., Марченко М.М. та ін.) і запатентовану синтетичну основу для твердого поживного середовища – поліакріламідний гель.

Накопичення біомаси спор. Спорову біомасу отримували за допомогою методів, розроблених нами у попередній роботі (Войцеховський В.Г.,1982), використовуючи для цього культивування мікроорганізмів в рідкому середовищі, а також на твердих поживних середовищах із поліакриламідною основою. З 1975 року були отримані біомаси спор різних видів бацил (в об’ємі в середньому по 100 мл з концентрацією спор до 10 млрд/мл). Спори отримали для проведення експериментів, а також були закладені для довготривалого досліду, мета якого – з’ясувати життєздатність спор в процесі їх зберігання в лабораторних умовах.

Одержання культуральної рідини спороутворюючих бактерій. Культуральну рідину спороутворюючих бактерій одержували з метою визначення зміни білкових та вуглеводних компонентів в її складі на різних фазах розвитку періодичної культури бактерій. Процес накопичення культуральної рідини здійснювали за наступною модифікацією. Мікроорганізми культивували у колбах об’ємом 3 л в 500 мл поживного середовища “ВВГ” (див. п.2.2.1) при температурі 30? С. Через певні проміжки часу, які відповідали послідовним фазам розвитку періодичної культури відбирали піпетками Мора зразки проб і переносили їх у пробірки.

Для одержання культуральної рідини проби центрифугували в режимі 1000 об/хв протягом 20 хвилин. Надосадову рідину зливали в пробірки та закривали резиновими корками.

Камери для вивчення розвитку бактерій в мікрокультурах. Дослідження розвитку спороутворюючих бактерій в мікрокультурах здійснювали в спеціальних камерах, розроблених і запатентованих спільно з Гашинським В.В. Камери для мікрокультивування бактерій складалися із предметного скла, блоків із поліакріламідного гелю, покровного скла, герметизуючої замазки. На блоки із поліакріламідного гелю, розміщені на предметному склі, засівали спеціальними мікропіпетками від однієї до кількох десятків бактеріальних клітин. Саме така методика дозволяла досліджувати процеси розвитку окремих бактеріальних клітин, та виявляти особливості міжклітинних взаємодій, в тому числі агрегацію бактерій.

Електронно-мікроскопічне дослідження агрегатів клітин спороутворюючих бактерій у процесі розвитку періодичної культури. Електронно-мікроскопічні дослідження здійснювали в растровому електронному мікроскопі (РЕМ), де можна було побачити реальну структуру досліджуваних об’єктів та топографію їх поверхні. Для цього використовували РЕМ фірми Hitachi типу S-806. Зовнішній вигляд досліджуваних об’єктів, що представлений на мікрофотографіях РЕМ, отриманий в режимі вторинної електронної емісії. Параметри приладу (струм зонду, прискорювана напруга, робоча відстань, діафрагма та інші) добиралися, виходячи з умов отримання найкращого зображення.

Вивчення спектрів елементного складу мікробних об’єктів із використанням рентгенівського мікроаналізатора (РМА). Для дослідження мікробних зразків ми використовували комплекс РЕМ-РМА, в якому РЕМ – растровий ЕМ фірми YEOL YSM 845, а РМА – система Link Analytical M 200. Першим етапом досліджень було отримання зображення об’єкта на екрані мікроскопа. Для порівняння різних об’єктів умови спостережень підтримувались одними і тими ж прийомами. Нами використовувалося прискорена напруга U –10 КЕВ, струм зонду – 6х10 –10 А, робоча відстань – 48 мм, збільшення – х12000. Спектри якісного хімічного складу мікробного об’єкту знімалися двома способами: з окремої вибраної площі на зразку, яка містила велику кількість бактерій і в місці розташування однієї бактеріальної клітини.

На основі отриманих спектрів робили висновок про наявність даного хімічного елемента, а також про його кількість відносно кількості іншого елемента. Таким чином, для порівняння зразків можна використовувати відношення висоти піків окремих елементів.

Одержання поверхневих біополімерів бактеріальних клітин та визначення їх фізико-хімічних характеристик. Для одержання препаратів поверхневих біополімерів зразки клітинної біомаси відбирали на етапах культивування, які відповідали всім фазам розвитку періодичної культури. Препарати поверхневих біополімерів одержували екстракцією із інтактних клітин відповідного віку. Бактерії осаджували із культурального середовища центрифугуванням при 8 тис. об/хв протягом 15 хв. та відмивали тричі стерильним ФР. Відмиті клітини ресуспендували у спеціальному буфері екстракції такого складу: 1% DS-Na у ФР, pH 4,5 (Михальський Л.О. із співавт., 2001). Екстракцію проводили при постійному перемішуванні на магнітній мішалці протягом 2 год при кімнатній температурі. Екстракти відділяли центрифугуванням (8 тис. об/хв, 20 хв) та піддавали подальшому аналізу. Матеріалом для дослідження була також культуральна рідина після осадження бактеріальних клітин. Контролем виступало стерильне поживне середовище. Культуральну рідину у об’ємі приблизно 80 мл ліофілізували і розчиняли в 1,5 мл дистильованої води для концентрування матеріалу. Проводили діаліз проти 0,15 М розчину NaCl при 40 С протягом 18 год. Після діалізу у зразках визначали кількість біополімерів.

Вивчення кількісного складу бiополiмерiв у препаратах. Вміст білків у препаратах визначали за методом Лоурі (Lowri et al.,1951), а вміст вуглеводів - антроновим методом (И.Я. Захарова, Л.В. Косенко, 1982 ).

Електрофорез у системі поліакриламідний гель-натрій додецилсульфат (DS-Na-ПААГ). Електрофорез препаратів проводили у системі DS-Na- ПААГ за Laemmli у модифікації (Laemmli, 1970) із застосуванням 14% гелей. Електрофорез проводили у комерцiйному апаратi для вертикального електрофорезу (“Хийу Каллур”, Естонія) при 90 В i 30 мА на гелеву пластину протягом 2,5 год при 40 С. Для вiзуалiзації електрофореграм використовували фарбування гелей кумасi блакитним R-250 та нейтральне фарбування нiтратом срiбла (Позур и др.,1995). Для визначення молекулярних мас (ММ) використовували набір маркерних білків LMW: фосфорилаза В (97,4 кДа), альбумін (66,2 кДа), овальбумін (45,0 кДа), карбонатангідраза (31,0 кДа), інгібітор трипсину (21,5 кДа), лізоцим (14,4 кДа) виробництва “Pharmacia” (Швеція). Молекулярні маси біополімерів розраховували за спеціальною комп’ютерною програмою (Михальський Л.О. із співавт., 2001).

Методи статистичної обробки результатів. Усі отримамані кількісні результати досліджень підлягали статистичній обробці загальноприйнятими методами варіаційної і кореляційної статистики з використанням значень середньої арифметичної (М), помилки середньої арифметичної (m), критерію Стьдента (t), рівня значущості (р). Крім того, використовували комп’ютерну програму “STATISTICA for Windows Release 5.1”.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Агрегація вегетатавних клітин у процесі розвитку періодичних культур спороутворюючих бактерій. Дослідження періодичних культур бактерій роду Bacillus здійснювали в таких умовах культивування, які забезпечували повноцінний, тобто, еволюційно сформований цикл їх розвитку, неодмінними етапами якого є проростання спор, утворення вегетативних форм, їх розмноження з подальшим формуванням нових клітин в стані спокою. Під час розвитку періодичної культури в рідкому поживному середовищі через кожні 30 хвилин вимірювали оптичну густину, досліджували зміну морфології мікробних клітин в камерах для мікрокультивування бактерій. Це дало можливість одночасно та об’єктивно здійснювати комплексну (графічну, морфологічну і фізіологічну) оцінку змін, що відбувалися в популяції мікроорганізмів.

Після завершення експоненціальної фази розвитку клітини досліджуваних мікроорганізмів втрачали рухливість, припиняли розмноження і поступово починали зближуватись та об’єднуватись між собою, утворюючи, таким чином, агрегати. Така закономірність виявилася характерною для різних штамів і видів досліджуваних мікроорганізмів (B.mesentericus, B. subtilis,

B. megaterium, B. cereus). Тривалість процесу агрегації вегетативних клітин становила 5-7 годин. Спочатку бактеральні агрегати складалися з 2-3 клітин, пізніше кількість бактерій в агрегатах збільшувалася до десятків, а надалі сотень та тисяч клітин (рис.1).

Рис. 1. Феномен агрегації клітин під час розвитку періодичної культури спороутворюючих бактерій B. cereus 24.

1 – експоненціальна фаза; 2, 3 – фаза агрегації вегетативних клітин; 4 – 6 – фаза споруляції агрегованих клітин та розпаду агрегатів. Фазово-контрастна мікроскопія, х 900.

Показники оптичної густини періодичної культури під час експоненціальної фази розвитку збільшилися десятикратно (від 0,018 до 0,198), і, навпаки, після об’єднання більшості клітин в агрегати, оптична густина культури зменшувалася (від 0,198 до 0,155). Зменшення оптичної густини не було пов’язано з частковим відмиранням клітин, як вважалося раніше, а виникало в результаті того, що культура з агрегованими бактеріями мала кращі світлопропускаючі властивості (рис. 2).

Рис. 2. Криві розвитку періодичних культур спороутворюючих бактерій у циклі: спори – вегетативні клітини – розмноження – агрегація – споруляція в агрегатах – розпад агрегатів – спори

1 – B.subtilis 7241; 2 – B.cereus CCM; 3 – B.mesentericus 66; 4 – B.megaterium 2550;

А – проростання спор; Б – еспоненціальна фаза; В – агрегація вегетативних клітин; Г – споруляція агрегованих клітин; Д – розпад агрегатів; Є – спори в стані спокою.

Отже, виявлена нами фаза агрегації вегетативних клітин як доказ невипадковості існування феномену агрегації мікроорганізмів, могла б бути ще названа фазою припинення поділу клітин і початку підготовки культури до спороутворення. Це так звана “стаціонарна” фаза за загально визнаною термінологією. В наших умовах експерименту використаний термін “стаціонарна” не повністю і не зовсім точно, а лише частково віддзеркалює уявлення про зміст стаціонарної фази, в якій раніше автори бачили тільки рівновагу між розмноженням і відмиранням клітин. Здійснені мікробіологічні дослідження із застосуванням нової, розробленої нами експериментальної технології спостереження за долею клітин у процесі їх розвитку, без сумніву показали, що в наших умовах експерименту це не фаза рівноваги розмноження і відмирання клітин, тому що обидва ці процеси в ній відсутні. Отже, стаціонарність в даному випадку слід розуміти, як якісну стабілізацію без відмирання клітин. Абсолютно такий же характер розвитку відбувався у різний термін спостережень, що свідчить про невипадковий характер зазначених фаз і можливість постійного відновлення цього етапу, навіть після тривалого часу зберігання спор (протягом 25 років).

Після повного завершення агрегації бактерій періодичної культури її подальший розвиток переходив у якісно нову фазу, характерною ознакою якої була диференціація клітин. Аналіз морфології бактерій у зразках засвідчував, що переважним і принциповим процесом на даному етапі розвитку культури є спороутворення, яке здійснювалося в клітинах, об’єднаних в агрегати. Процес спороутворення бактеріальних клітин був динамічний: спочатку у складі агрегатів переважали передспори, потім вони набували рефрактильності і протягом 2-3 годин в усіх клітинах знаходилися дозріваючі спори (див. рис. 1). Зростання та коливання оптичної густини культури на даному етапі розвитку було пов’язане із зміною світлопоглинаючих властивостей клітин, що перебували на різних стадіях спороутворення (див. рис. 2). Після повного дозрівання спор та лізису параспоральних частин спорангіїв (20-24 години культивування) агрегати, які складалися повністю із спорових форм, починали поступово руйнуватися, а оптична густина періодичної культури досягала свого максимуму. Завершення циклу розвитку культури характеризувалося повним руйнуванням агрегатів, після чого культура складалася виключно із зрілих розрізнених спор. Таким чином, встановлено, що розвиток періодичних культур різних видів досліджуваних спороутворюючих бактерій в лімітованому за вмістом пептонів поживному середовищі неодмінно проходитиме фазу агрегації вегетативних клітин з наступною споруляцією їх у складі агрегатів, розпадом агрегатів і переходом життєздатних клітин у стан довготривалого анабіозу.

Динаміка формування агрегатів та розвиток сил міжклітинної взаємодії в процесі агрегації бактерій. Агрегація вегетативних клітин займає центральне місце серед встановлених нами особливостей розвитку періодичних культур різних видів спороутворюючих бактерій. У зв’язку з цим були проведені дослідження , задачею яких було з’ясувати: як швидко і яка доля клітин бактеріальної популяції включається в процес агрегації. Для цього кожні 30 хвилин відбирали зразки культури, що розвивалася в рідкому поживному середовищі, починаючи з фази прискорення темпів розмноження досліджуваних мікроорганізмів, та здійснювали підрахунок клітин в камерах для мікрокультивування бактерій, а також їх фотографування з метою оцінки послідовних змін у взаємному розташуванні мікроорганізмів. Динаміка включення вегетативних клітин в агрегати, на прикладі культури B.cereus 24, в залежності від часу культивування представлена в табл. 1 і на рис.3.

Таблиця 1

Результати вивчення переходу вегетативних клітин в агрегати в залежності

від часу культивування періодичної макрокультури

№

проби | Час від початку

агрегації, хв. | Кількість клітин в пробі, n | Кількість клітин в агрегатах | Довірчий інтервал | Ознаки споруляції

М | М m, %

1 | 30 | 658 | 27 | 4,100,77 | 2,021-6,179 | -

2 | 60 | 660 | 62 | 9,391,13 | 6,339-12,441 | -

3 | 90 | 654 | 126 | 19,271,54 | 15,112-23,428 | -

4 | 120 | 655 | 206 | 31,451,81 | 26,563-36,337 | -

5 | 150 | 653 | 258 | 39,511,91 | 34,353-44,667 | -

6 | 180 | 662 | 318 | 48,041,94 | 42,802-53,278 | -

7 | 210 | 650 | 430 | 66,151,85 | 60,885-71,415 | -

8 | 240 | 650 | 567 | 87,231,31 | 83,693-90,767 | -

9 | 270 | 661 | 594 | 89,961,17 | 86,801-93,119 | +

10 | 300 | 600 | 600 | 100,00 | 100-100 | +

Рис. 3. Динаміка включення вегетативних клітин спороутворюючих бактерій в агрегати.

А – побудовано на підставі прямих підрахунків клітин в одному полі при застосуванні імерсійної системи; Б – дані табл. 1 враховували загальну кількість клітин в пробі; В – об’ємне зображення динаміки агрегації.

Таким чином, було встановлено, що агрегація вегетативних клітин відбувається протягом досить короткого часу (5-7 годин, в залежності від виду бактерій), якщо враховувати за її початок момент появи морфологічних ознак агрегації, а завершенням вважати час 100 % переходу клітин в агрегати і появи перших ознак споруляції в окремих клітинах. І хоча агрегати ще певний час будуть існувати, проте це вже будуть інші за змістом агрегати, в яких в результаті диференціації все менше залишатиметься вегетативних клітин і переважатимуть їх спорові форми.

У зв’язку з тим, що проміжки між клітинами в процесі агрегації поступово зменшувались, виникло припущення про існування певних сил, які забезпечують міжклітинні зв’язки. Так, у фазі інтенсивного розмноження рухливі клітини після випадкового зіткнення одна з одною, не злипалися, а досить швидко розходились, ніби відштовхуючись. Згодом такі зіткнення призводили до того, що клітини залишались у контакті, втрачаючи рухливість і обєднуючись у все більші за розміром і різної форми групи. За допомогою фазово-контрастної мікроскопії здійснювали оцінку морфології міжклітинних зв’язків. При світовій мікроскопії та збільшенні в 900 разів між клітинами, об’єднаними в малі агрегати, помітним був певний простір, що могло свідчити про відсутність навіть часткового склеювання в новоутворених з’єднаннях клітин. При досягненні максимальних розмірів агрегатів з поглинанням вільних клітин розмежувальний простір був помітний тільки на периферії агрегатів, де клітини частіше контактували не полюсами, як при народженні, а своїми тілами. В центральній частині агрегатів багатошарове переплетіння клітин не дозволяло дослідити суть контактів, хоч і створювалось враження про досить міцне склеювання клітин.

Для визначення сил міжклітинної взаємодії та динаміки їх розвитку був застосований метод піпетування – руйнування агрегатів шляхом багаторазового їх пропускання через вузький отвір спеціальної мікропіпетки. Ефективність цього методу визначали за оптичною густиною культури до і після такої дії.

Слід визнати, даючи оцінку частини дослідів по з`ясуванню наявності певних сил, що обраний метод не достатньо характеризував процес появи і розвитку міжклітинних контактів. На точність розрахунків суттєво впливав приріст оптичної густини не тільки за рахунок руйнування агрегатів. Нас зацікавили взаємини клітин в самих агрегатах.

Для з`ясування динаміки контактних зв`язків вегетативних клітин в агрегатах різної зрілості довелось клітинну суспензію, в якій формувались агрегати, розділити на фракції, маючи на меті відділити агреговані клітини від вільних форм. Випробувавши кілька методів, ми зупинили свій вибір на фракціонуванні шляхом центрифугування відповідних зразків макрокультури. Агрегати клітин переходили в осад (при певній кількості обертів) значно швидше вільних клітин, які залишались в надосадовій рідині.

Пам`ятаючи про можливий вплив центрифугування на процес агрегації клітин, в контрольних дослідах суспензію таких же клітин (рівнозначної густини) фракціонували, але без ознак агрегації. Контроль за впливом центрифугування на динаміку зв’язків здійснювали мікроскопією зразків. Таким способом одержали кілька фракцій агрегатів з різною кількістю агрегованих клітин, що відповідали різним стадіям процесу агрегації. Кожну фракцію після декантації ресуспензували до повного руйнування агрегатів в нативному поживному середовищі шляхом піпетування. Виявилось, що кожна з фракцій диференціювалась за кількістю проходжень через отвір піпетки (табл. 2).

Таблиця 2

Результати впливу фракціонування і піпетування агрегатів вегетативних клітин

на міцність міжклітинних зв`язків

№

фрак-ції | Кількість

клітин в агрегаті, % | Кількість піпетувань: | Довірчий

інтервал

(I99)

абсо-лютна | Р, % | m, %

1 | 10-12 | 12 | 1,791 | 0,513 | 0,404-3,176*

2 | 30-35 | 16 | 2,388 | 0,591 | 0,793-3,983*

3 | 50-57 | 48 | 7,146 | 0,998 | 4,470-9,858

4 | 70-74 | 58 | 8,653 | 1,083 | 5,735-11,569

5 | 80-85 | 120 | 17,910 | 1,481 | 13,918-21,908

6 | 90-94 | 340 | 50,746 | 1,931 | 45,533-55,959

7 | 97-100 | 670 | 100,000 | 0 | 0

8 | 100 | 500 | 74,626 | 1,615 | 70,316-79,036

9 | 100 | 100 | 14,925 | 1,375 | 11,213-18,637

10 | 100 | 10 | 1,492 | 0,469 | 0,226-2,758*

Конт-роль | 0 | 4 | 0,597 | 0,298 | -0,207-1,401

*-порівняно з контролем різниця не достовірна з вірогідністю в 99 % при n = 670.

Найбільшу кількість піпетувань (670) довелось здійснювати для повного руйнування агрегатів, які об’єднали всі вегетативні клітини (97-100 %). Якщо цю кількість прийняти за 100 % і вважати, що на цей момент сили міжклітинних контактів були найвищими, то за таких умов стає можливим визначити міцність агрегатів у відносних величинах. Так, для руйнування агрегатів четвертої фракції затрачено 58 піпетувань, що становить 8,653 71,083 % від максимальної міцності агрегатів.

Дані табл. 2 показують, що в перших двох фракціях агрегованих клітин сили зв’язку між ними були ледь помітними (1,8 і 2,4 %), такими, що достовірно не відрізнялися від контролю. Проте процес формування агрегатів продовжувався, міцність їх поступово (в межах п`яти фракцій) зростала. Різке збільшення міцності агрегатів відбулося в наступних двох фракціях (від 50,7461,931 до 100%). Цей період характеризувався утворенням максимальних за розмірами агрегатів, які включали від 90 до 100 % вегетативних клітин.

Співставлюючи дві криві (рис. 4), можна помітити, що агрегати вегетативних клітин, досягши максимальних розмірів, продовжували існувати протягом певного часу, зберігаючи стаціонарність. В той час сили міжклітинних зв`язків почали втрачати свою інтенсивність (крива 2 після піку різко знижувалась). Це співпало із диференціацією вегетативних клітин у спорову форму. Розміри агрегатів зберігались до повного завершення споруляції, після чого вони спонтанно і раптово розсипались. Повне руйнування (дезагрегація) агрегатів співпало з втратою сил притягування, які змінились відштовхуванням.

Рис. 4. Співвідношення інтенсивності агрегації (1) і темпів росту міжклітинних зв’язків в агрегатах (2). Графік побудовано за даними табл. 2.

Таким чином, вдалось з’ясувати, що в процесі розвитку спороутворюючих бактерій міняються міжклітинні зв’язки, як за своїм характером, так і силою: на початкових етапах розвитку, коли спори трансформувались у первинні вегетативні клітини і коли останні інтенсивно розмножувались, все більше заповнюючи простір в поживному середовищі, діяли відштовхувальні сили. Зміни в характері сил звязку наступили в період завершення експоненціальної фази розвитку. В цей час почало зростати контактне гальмування між клітинами, яке переростало в притягальну силу, обєднуючи вегетативні клітини в міцні агрегати. Створювалось враження про найвірогідніше призначення об’єднання клітин в агрегати як своєрідні генетично обумовлені морфологічні структури, в яких здійснювався процес спороутворення. На таку думку наводила і та обставина, що як тільки завершилась фаза споруляції, змінився і характер міжклітинних звязків в агрегатах. Повне і швидке руйнування агрегатів, суцільне 100 % вивільнення спорових форм клітин із агрегатів, переконливо засвідчувало про закінчення функції агрегатів, про відсутність потреби в них у подальшій долі культури, а, отже, і в подальших затратах енергії на підтримку міжклітинних сил взаємодії. Наведені факти переконливо вказували на невипадковість явища агрегації клітин, як самостійного, фізіологічного періоду розвитку бацил.

Виникло дуже важливе питання про природу міжклітинних зв`язків, виявлених у процесі розвитку культури. Наведені нижче дані частково дадуть можливість наблизитись до отримання відповіді на поставлене питання.

Електрофоретичні дослідження поверхневих біополімерів клітинної стінки та полімерів культуальної рідини в процесі агрегації бактерій. У процесі агрегації бактерій виникають тісні міжклітинні контакти, міцність яких має свою динаміку розвитку. Тому, мабуть, важливе значення у формуванні агрегатів, а також і в їх розпаді можуть мати біополімери поверхневих шарів клітинних стінок (КС). Крім того, не виключено, що певне значення у цьому процесі відіграють розчинні полімери, які потрапляють у культуральну рідину (КР) на різних фазах розвитку періодичної культури. У зв’язку з цим була проведена серія експериментів з метою дослідження поверхневих біополімерів клітинних стінок, а також розчинних полімерів