Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна

Бєлоусова Ірина Борисівна

УДК 576.316.352:576.15:595.77:575.22:577.171.7

Функціональна активність політенних хромосом і прояв кількісних ознак у Drosophila melanogaster Meig. у зв'язку з генотипом і дією ювенільного гормону

03.00.15 - генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 2005 р.

Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна

Бєлоусова Ірина Борисівна

УДК 576.316.352:576.15:595.77:575.22:577.171.7

Функціональна активність політенних хромосом і прояв кількісних ознак у Drosophila melanogaster Meig. у зв'язку з генотипом і дією ювенільного гормону

03.00.15 - генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 2005 р.

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор,

заслужений діяч науки і техники України,

Шахбазов Валерій Гайович ,

Харківський національний університет

імені В. Н. Каразіна

Міністерства освіти і науки України,

професор кафедри генетики та цитології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Злотін Олександр Зиновійович, Харківський національний педагогічний університет імені Г. С. Сковороди Міністерства освіти і науки України, професор кафедри зоології;

кандидат біологічних наук, Суханов Святослав Всеволодович,

Інститут шовківництва УААН, завідувач лабораторії генетики, м. Мерефа

Провідна установа:

Київській національний університет імені Т. Г. Шевченка (кафедра загальної і молекулярної генетики), Міністерство освіти і науки України, м. Київ

Захист відбудеться “27” _грудня_ 2005 року о 15.15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 64.051.21 Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. III-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий __23 листопада_ 2005 року.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради

К 64.051.21 О. М. Федота

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення механізмів гормональної регуляції генетичної програми онтогенезу комах актуально як у теоретичному, так і в практичному плані. Незважаючи на численність фактичного матеріалу за данною проблемою та існування ряду гіпотез, запропонованих для пояснення регуляторних механізмів транскрипційної активности генів [Эшбернер М.,1974; Richards G., Ashburner M., 1981; Richards G., 1997], багато питань залишається невирішенними. У даному аспекті роль ювенільного гормону (ЮГ) в процессах регуляції генної активності в онтогенезі комах є недостатньо вивченою. У зв’язку з цим, дослідження впливу цього гормону на активність пуфінгу хромосом є актуальним, оскількі, ЮГ відіграє істотну роль у циклічності постембріонального розвитку комах, а також є антогоністом екдизону. Зміни співвідношення цих гормонів у онтогенезі комах викликають закономірні зміни активності генів [Полуэктова Е. В. и др., 1980; Буров Н. В., 1983; Дубровский Э. Б. и др., 1985; Ashburner M., 1990; Жимулев И. Ф., 1994].

Особливо значним є дослідження впливу аналогу ЮГ – метопрену на ступінь політенії хромосом. Актуальність досліджень у даному напрямку пов’язана з цим, що роль ювенільного гормону у процесах ендоредуплікації вивчена недостатньо, а наявні дані неповні і суперечливі [Буров Н.В., 1983; Жимулев И.Ф., 1994]. Одним із показників активності ядерного геному та інтенсивності метаболізму у дрозофіли є рівень политенії гігантських хромосом. У зв’язку з цим, ураховуя, що ювенільний гормон приймає активну участь у різних метаболічних процесах онтогенезу комах, доцільним є сумісне вивчення даного показника і компонентів пристосованості при дії цього гормону.

У свою чергу, найбільш ефективне використання гормональних препаратів на практиці для контролю розвитку комах неможливо без знання основних закономірностей і характеру змін, що виникають у прояві кількісних ознак при дії гормонального фактору. У зв'язку із цим становить інтерес вивчення прояву низки адаптивно важливих кількісних ознак на різному генетичному фоні при дії аналога ЮГ – метопрена, а також характеру зв'язку між їх проявом і функціональною активністю хромосом.

Одним із показників, які відображають загальний функціональний стан ядерного геному, є біоелектричні властивості клітинних ядер. Дослідження прояву даного показника під впливом аналога ЮГ – метопрену є актуальним і новим аспектом у вивченні проблеми гормонального контролю індивідуального розвітку комах.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота була виконана в межах наукової тематики відділу генетики науково-дослідного інституту біології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України і є складовою теми за номером держреєстрації 0103U004274 “Дослідження дії іонизуючого і неіонизуючого випромінювання на геном і механізмів стресового та антистресового впливу ”.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з’ясувати зміни структури і функцій політенних хромосом, адаптивно важливих ознак і біоелектричних властивостей клітинних ядер слинних залоз дрозофіли у зв'язку з дією аналога ювенільного гормону розвитку комах – метопрену.

Виходячи із загальної мети роботи, були поставлені наступні задачі:

-

-

-

-

-

Об'єкт дослідження – гормональна регуляція функціональної активності політенних хромосом слинних залоз дрозофіли.

Предмет дослідження – активність пуфінгу політенних хромосом, ступінь політенії хромосом, теплостійкість імаго, вихід імаго, маса тіла імаго, тривалість предімагінальних стадій розвитку, біоелектричні властивості клітинних ядер.

Методи дослідження – метод давлених ацетоорсеїнових препаратів політенних хромосом; цитоморфометричний метод; термотест; метод внутрішньоклітинного мікроелектрофорезу клітинних ядер, а також методи математичного аналізу отриманих результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Результати дослідження впливу ювенільного гормону на ступінь політенії гігантських хромосом Drosophila melanogaster, на пуфову активність політенних хромосом, на прояв низки кількісних ознак і на біоелектричні властивості клітинних ядер слинних залоз є новим і важливим доповненням у вивченні механізмів регуляції окремих стадій онтогенезу комах.

Вперше на політенних хромосомах слинних залоз Drosophila melanogaster у дослідах in vitro виявлений ряд пуфів, що специфічно реагують на аналог ЮГ – метопрен, що збігається із впливом гормону in vivo.

Новими є результати дослідження впливу метопрену на ендоредуплікацію політенних хромосом і прояв кількісних ознак дрозофіли. Виявлений стимулюючий ефект даного гормону на показник ступеня політенії хромосом, маси тіла імаго і теплостійкість дрозофіли. Показана залежність виявлених ефектів від генотипу мух і концентрації гормону у поживному середовищі. Отримані дані свідчать, що на фоні регуляції диференційної активності генів, ЮГ також впливає на ступінь помноження геному, регулюючи функцію ендоредуплікації політенних хромосом.

У роботі вперше отримані дані про вплив метопрену на біоелектричні властивості клітинних ядер дрозофіли in vitro. Показано, що дія ЮГ на пуфінг і ендоредуплікацію політенних хромосом відбувається на фоні низьких значень електрокінетичного потенціалу клітинних ядер.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані про вплив гормонального препарату метопрену на пуфову активність політенних хромосом можуть слугувати основою для розробки методів визначення й оцінки активності ювенільного гормону і його аналогів у культуральному середовищі. Практичне значення подібних тестів пов'язане з використанням ЮГ і виробництвом нових синтетичних препаратів – аналогів ЮГ для регуляції розвитку бджіл, шовкопряда, а також для боротьби з комахами-шкідниками й паразитами тварин.

Особистий внесок здобувача. Огляд літератури й експериментальна частина дисертаційної роботи виконані здобувачем повністю самостійно. Аналіз отриманих результатів проводився разом з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені в дисертацію, були повідомлені на Конференції по генетиці й молекулярній біології для студентів і молодих вчених, присвяченої 100-річчю генетики (Львів, 2000), на 7-ій Пущинській школі-конференції молодих вчених “Биология - наука ХХІ столетия” (Пущино, 2003), на конференції молодих вчених, аспірантів і студентів по молекулярній біології й генетиці “50 years of the double helix of DNA” (Київ, 2003), на наукової конференції молодих вчених, присвяченої 200-річчю заснування університету “Актуальні проблеми біології в дослідженнях молодих учених Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна” (Харків, 2003), на установчному з'їзді “First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology” (Львів, 2004), на VI Міжнародному симпозіумі “Биологические механизмы старения” (Харків, 2004), на науковій конференції, присвяченої 70-річчю кафедри генетики й цитології ХНУ ім. В.Н. Каразіна “Генетика в современном обществе” (Харків, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 12 друкованих праць: з них - 5 статей, з яких 3 статті у наукових фахових журналах і 7 тез.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація викладена на 145 сторінках тексту, включає вступ, огляд літератури, розділ “Матеріали і методи дослідження”, 3 розділи результатів власних досліджень і їх обговорення, заключення, висновки, список цитованої літератури із 230 найменувань та додатки. Дисертація містить 19 рисунків, 8 мікрофотографій політенних хромосом.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Матеріалом дослідження служили неселектована лінія дикого типу Oregon-R (Or-R), інбредні лінії Oregon-R (інбридинг 80-105 поколінь) і Swedish (Sw) (інбридинг 98-103 покоління) Drosophila melanogaster Meig., а також інбредна мутантна лінія forked (f) (інбридинг 105-125 поколінь; локалізація мутації 1-56.7; делеція; рецесивна; гомозиготи життєздатні; фенотипово проявляється в укорочених або обпалених щетинках); реципрокні гібриди F1 між інбредними лініями дикого типу Or-R і Sw, а також між інбредною лінією Or-R і інбредною мутантною лінією forked. Культуру дрозофіли підтримували у стандартних умовах термостату при температурі 22-24 С.

Досліджували вплив аналога ювенільного гормону - метопрену (ювемону) на активність пуфів онтогенезу, ступінь політенії хромосом, біоелектричні властивості клітинних ядер слинних залоз дрозофіли й адаптивно важливі ознаки.

Метопрен є інсектицидом гормональної дії, що пригнічує перетворення личинок або німф комах у життєздатні дорослі особини, а також має овіцидну дію. За хімічною природою метопрен являє собою ізопропіловий ефір 11-метокси-3,7,11-триметіл-2-транс-4-транс-додекадієнової кислоти [Одиноков В. Н. и др., 1992].

При впливі метопрену на пуфінг і біоелектричні властивості клітинних ядер дрозофіли умови експерименту включали 4 варіанти: контроль 1 (слинні залози без інкубації, які після витягування на стадії 0-годинної передлялечки відразу ж піддавали фарбуванню); контроль 2 (інкубація слинних залоз в 1 % розчині диметилсульфоксиду (DMSO) з експозицією 30 хвилин при 24 °С); у досліді 1 і досліді 2 слинні залози інкубували в розчинах метопрену в концентраціях 0,1 і 1 мкг/мл, відповідно, в 1 % розчині DMSO протягом 30 хвилин при 24 °С.

Політенні хромосоми дрозофіли досліджували на давлених ацетоорсеїнових препаратах слинних залоз, приготовлених за стандартною методикою [Полуэктова Е. В. и др., 1974]. Локалізацію пуфів проводили згідно виправлених карт Бріджеса [Lindsley D.E. et.al., 1968]. Пуфову активність досліджували в 7 локусах: 43E, 58DE, 60B (хромосома 2R), 85D, 100DE (хромосома 3R), 63E (хромосома 3L), 82EF (хромосома 3R). Про активність пуфінгу в політенних хромосомах судили за відношенням поперечних розмірів пуфів до ширини хромосоми в районі прилеглого диска, не залученого у процес пуфування, (відношення пуф/диск): 43E/44A, 58DE/58A, 60B/60C, 85D/85B, 100DE/100C, 63E/64B, 82EF/84D. Виміри проводили за допомогою окуляр-мікрометру при збільшенні мікроскопа 600. За даними авторадіографічних досліджень, розміри пуфів позитивно корелюють із рівнем транскрипції генів [Pelling G., 1964].

Різницю за ступенем політенії хромосом (СПХ) на цитологічних препаратах визначали цитоморфометричним методом [Страшнюк В. Ю. И др., 1995]: хромосоми з різним ступенем політенії розрізняються за шириною та інтенсивністю забарвлення ацетоорсеїном. Відомо, що до кінця третьої личинкової стадії хромосоми в клітинах слинних залоз Drosophila melanogaster проходять від шести до дев'яти циклів ендоредуплікації й досягають ступеня політенії 265С, 512С, 1024С, 2048С [82]. На цитологічних препаратах ці класи ядер характеризуються різною шириною й інтенсивністю забарвлення політенних хромосом ацетоорсеїном. У районі диска А22 хромосоми 2L, що приблизно відповідає середній ширині хромосом, поперечні розміри становлять відповідно: 1,6; 2,3; 3,2; 4,6 мкм. Визначали відсоткове співвідношення різних класів ядер з різним СПХ на тотальних препаратах слинних залоз. За результатами отриманих даних підраховували середнє значення політенії в кожному варіанті експерименту.

Теплостійкість імаго дрозофіли досліджували методом термотесту [Шахбазов В. Г., 1975]. Імаго дрозофіли прогрівали у водному термостаті при температурі 41 ?С і експозиції 20 хв. Умови експерименту в усіх варіантах були стандартними. Показником теплостійкості слугував відсоток імаго, що вижили після прогріву.

Плідність оцінювали, підраховуючи число дорослих мух у потомстві однієї пари особин. Швидкість предімагінального розвитку визначали за часом між початком відкладки батьківським поколінням яєць і виходом імаго. Використовували синхронізовані культури, отримані за 3 години яйцекладки при температурі 22-24 °С. Для визначення відмінності за масою тіла імаго використовували показник маси 100 особин. Даний показник вимірювали за допомогою торсіонних ваг.

Біоелектричні властивості клітинних ядер у слинних залозах дрозофіли досліджували за допомогою оригінального методу внутрішньоклітинного мікроелектрофорезу, розробленого на кафедрі генетики і цитології ХНУ імені В.Н. Каразіна [Шахбазов В. Г. и др., 1971]. Основним показником слугував відсоток електронегативних ядер - ЕНЯ,%. Напруженість поля в камері становила 7-8 В/см, сила струму - 0,7 мА.

Результати експериментів оброблені методами варіаційної статистики. Визначали середнє значення ознаки й помилку середнього. Вірогідність різниці між ознаками визначали за t-критерієм Ст’юдента. Проведено дисперсійний аналіз двохфакторних комплексів за методом Плохінського для визначення ролі генотипового і гормонального факторів у проявах досліджених кількісних ознак. Кореляцію між досліджуваними кількісними ознаками визначали за допомогою коефіцієнта рангової кореляції Спірмена.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив аналога ювенільного гормону метопрену на активність пуфінгу політенних хромосом дрозофіли в умовах in vitro. Об'єктом для даного дослідження слугувала неселектована лінія дикого типу Or-R. З огляду на стадієспецифічність картини пуфінгу, дослідження проводили на стадії 0-годинної передлялечки. У цей період титр ендогенного ювенільного гормону мінімальний, а рівень гормону екдизону підвищений і, відповідно, міжлиняльні пуфи інактивовані.

Досліджували вплив аналога ЮГ - метопрену на активність пуфів, що проявляють активність на різних стадіях онтогенезу. Для аналізу були взяті 5 міжлиняльних пуфів (43E, 58DE, 60B, 85D, 100DE) і 2 пізніх екдизонових пуфа (63Е, 82EF).

У контролі 1, на стадії 0-годинної передлялечки, пуфінг у міжлиняльних локусах не виявлений (рис. 2, А). Встановлена значна активність екдизонових пуфів 63Е і 82EF (рис. 1, Б).

А

Б

Рис. 1. Розміри пуфів політенних хромосом дрозофіли при дії метопрену в дослідах in vitro

(А - міжлиняльні пуфи; Б - пізні екдизонові пуфи):

контроль 1 - слинні залози без інкубації (стадія 0-годинної передлялечки); контроль 2 - інкубація слинних залоз в 1 %-му розчині DMSO; дослід 1 - концентрація метопрену 0,1 мкг/мл в 1%-му розчині DMSO; дослід 2 - концентрація метопрену 1 мкг/мл в 1 %-му розчині DMSO.

* - P>0,95, ** - P>0,999 Відмінність від контролю 1; *** Відмінність від досліду 1 - P>0,999

У контролі 2 (інкубація в 1 % розчині DMSO) утворення міжлиняльних пуфів не спостерігали. Показано достовірне збільшення розмірів екдизонових пуфів 63Е и 82EF у контролі 2 відносно контролю 1 (Р>0,999). Різниця для пуфа 63Е склала 16,48 % (Р>0,999), пуф 82EF збільшився на 10,13 % (Р>0,999). Видимі відмінності в розмірах пуфів можна пояснити тим, що при інкубації залоз у даному розчині відбувається розпушення хромосом із-за зниження іонної сили розчину і, можливо, під впливом органічного компоненту розчину [Груздев А. Д., 1971].

Дослід 1 (концентрація метопрену 0,1 мкг/мл) характеризувався активацією трьох міжлиняльних пуфів 43E, 85D і 58DE (рис.1, А). У досліді 2 (концентрація метопрену 1 мкг/мл) спостерігали індукцію усіх 5-ти міжлиняльних пуфів, досліджених у роботі, найбільш великими були пуфи в локусах 58DE, 60B і 43E і 85D (Р>0,999) (рис. 2, Б). Що стосується пуфа 100DE (хромосома 3R), то його активність у даних умовах була незначною і, як правило, не перевищувала 1 бала та проявлялася, в основному, у розпушенні й зникненні диска. Розміри пуфа 100DE у досліді 2 збільшилися на 60,7 % (Р>0,999) у порівнянні з дослідом 1. Різниця пуфа 60B у досліді 2 відносно досліду 1 склала 43,3 % (Р>0,999). Пуф 58DE при підвищенні концентрації метопрену збільшився на 21,8 % (Р>0,999).

А

43E 58DE, 60B 85D

Б

Рис. 2. Пуфи, що індукуються метопреном у політенних хромосомах Drosophila melanogaster на стадії 0-годинної передлялечки: А – контроль; Б – концентрація метопрену 1 мкг/мл в 1 %-му розчині DMSO, експозиція 30 хв.

Екдизонові пуфи 63Е і 82EF достовірно регресували під впливом метопрену (рис. 1, Б). У порівнянні з контролем 1 розміри пуфа 63Е зменшилися на 12,6 % (Р>0,95) у досліді 1 і на 8,2 % (Р>0,95) у досліді 2. Відносно контролю 2 різниця складала 25,0 % (Р>0,999) у досліді 1 і 21,2 % (Р>0,999) у досліді 2. Розміри пуфа 82EF у досліді 1 зменшилися на 14,6 % (Р>0,95), а в досліді 2 на 13,6 % (Р>0,95) у порівнянні з контролем 1. По відношенню до контролю 2 розміри даного пуфа зменшилися на 23,2 % (Р>0,95) у досліді 1 і на 21,9 % (Р>0,95) у досліді 2.

Отримані дані свідчать, що регресія пуфів 63Е і 82EF у досліді є не просто результатом відмивання екдизону, а відбувається під активним впливом метопрену. Ці дані свідчать про участь ЮГ у регресії пізніх екдизонових пуфів, що є важливим доповненням до тріггерної схеми каскадної регуляції екдизонових генів Ешбернера-Річардса (Richards, 1997). Отримані результати показали залежність ефекту від концентрації гормону: при концентрації 0,1 мкг/мл активується менше число пуфів, ніж при концентрації 1 мкг/мл. Таким чином, встановлено, що досліджувані пуфи мають різну чутливість до дії метопрену. Концентрація гормону 1 мкг/мл є достатньою для активації пуфінгу у всіх досліджуваних локусах.

Вплив аналогу ювенільного гормону метопрену на ендоредуплікацію політенних хромосом дрозофіли. На теперішній час вплив гормонів на ендоредуплікацію політенних хромосом вивчено недостатньо. В якості об’єкту дослідження використовували неселектовану лінію Or-R Drosophila melanogaster. Препарат метопрену в концентраціях 0,1 и 1 мкг/мл додавали у поживне середовище, в якому развивались личинки дрозофіли. Ступінь політенії хромосом досліджували у личинок наприкінці 3-ї стадії розвитку.

Аналіз відсоткового співвідношення ядер з різним ступенем політенії хромосом показав значне збільшення частки ядер з максимальним рівнем політенії (2048С) під впливом гормонального фактору (рис.3). Одночасно спостерігали зниження кількости ядер з меншими

Рис. 3. Ступінь політенії гігантських хромосом Drosophila melanogaster при дії метопрену:

контроль – відсутність метопрену у середовищі; дослід 1 - концентрація метопрену в середовищі 0,1 мкг/мл; дослід 2 - концентрація метопрену в середовищі 1 мкг/мл.

*Відмінність від контролю - Р>0,95; **Відмінність від контролю - Р>0,99

ступенями політенії 256С и 512С. Таким чином, було показано збільшення середніх значень СПХ під впливом метопрену.

У досліді 1 різниця відносно контролю склала 22,0 % у самок (Р>0,99) і 23,2 % у самців (Р>0,99). У досліді 2 ця різниця склала 8,8 % у самок і стільки ж у самців (Р>0,95).

Дані про стимуляцію ендоредуплікації під впливом аналога ЮГ - метопрену узгоджуються з даними про те, що політенізація хромосом в онтогенезі дрозофіли відбувається у міжлиняльному періоді [Rodman, 1967].

Вплив аналога ювенільного гормону – метопрену на прояв адаптивно важливих ознак дрозофіли. Одним з важливих кількісних ознак є теплостійкість, що відображує неспецифічну стійкість організмів [Шахбазов В.Г., 1975]. Питання про вплив на даний показник різних екзогенних і ендогенних факторів актуальне як у теоретичному, так і в практичному плані. Отримані дані свідчать про збільшення теплостійкості самок імаго в умовах досліду 1 при концентрації гормону 0,1 мкг/мл на 37,4 % (P>0,95) у порівнянні з контролем (Таблиця 1). У досліді 2, де концентрація гормону становила 1 мкг/мл, навпроти, теплостійкість самок дрозофіли знизилася на 26,1 % (P>0,95). У самців проявлялися подібні тенденції зміни даного показника, але відмінності між контролем і дослідними варіантами були недостовірні.

Показник маси тіла імаго також є важливою ознакою, що відображає стійкість організмів. У досліді 1 встановлено значне збільшення маси тіла імаго на 35,8 % у самок і на 35,5 % у самців(P>0,95). У досліді 2 показано незначне збільшення маси тіла на 8,5 % у самок (P>0,95), а у

Таблиця 1

Вплив метопрену на адаптивно важливі ознаки дрозофіли (лінія Oregon-R)

Варианти експерименту | Стать | Маса 100 особин, мг | Тепло-

стійкість імаго, % виживших особин | Плідність

(кількість імаго, що вийшли) | Тривалість предімагінального

розвитку, год

Контроль | самки | 106 1,8 | 35,3 2,7 | 95,7 4,6 | 263,0 ± 2,9

самці | 76 1,5 | 40,7 2,7 | 274,0 ± 2,6

Дослід 1

(конц. метопрену

0,1 мкг/мл | самки | 144 2,3* | 48,5 5,4* | 66,5 0,5** | 272,0 ± 1,9**

самці | 103 2,0* | 46,8 4,5 | 279,0 ± 1,8*

Дослід 2

(конц. метопрену

1 мкг/мл | самки | 115 1,9* | 26,1 2,4* | 90,3 6,6 | 265,0 ± 1,6

самці | 78 1,5 | 36,1 2,8 | 271,0 ± 1,4

Контроль – відсутність метопрену у середовищі; дослід 1 - концентрація метопрену в середовищі 0,1 мкг/мл; дослід 2 - концентрація метопрену в середовищі 1 мкг/мл.

*Відмінність від контролю - Р>0,95; ** Відмінність від контролю - Р>0,99

самців даний показник практично не змінився. Відсутність змін за даними ознаками у самців можливо пов’язана з цим, що статі відрізняються за нормою реакції на дію гормонального фактора.

Вихід імаго знизився у досліді 1 під дією метопрену на 43,9 % (P>0,99). У досліді 2 різниця по даному показнику в порівнянні з контролем була недостовірна.

Показано також вплив метопрену на тривалість розвитку дрозофіли (Таблиця 1). У досліді 1 під впливом гормону в поживному середовищі спостерігалося збільшення тривалості

предімагінального розвитку у самок на 3,4 % (P>0,99), у самців на 1,8 % (P>0,95) відносно контролю. Тривалість розвитку у досліді 2 не відрізнялась від контролю. Аналіз отриманих даних показав наявність статевих відмінностей по тривалості розвитку у всіх варіантах експерименту. У контролі самки розвивалися швидше самців на 4,2 %, у досліді 1 - на 2,6 %, у досліді 2 - на 2,3 % (P>0,99).

Встановлено тісну позитивну кореляція між показниками СПХ і маси тіла імаго: r = 0,77 (P>0,99). Достовірної кореляції між СПХ і теплостійкістю не виявлено. Показана тісна негативна кореляція між теплостійкістю імаго й швидкістю розвитку: r = - 0,75 (P>0,95).

За даними І. Ю. Раушенбах і співавторів при стресі у імаго дрозофіли підвищується рівень ЮГ у гемолімфі. Це призводить до затримки дозрівання та відкладання яєць, і дає можливість популяції адаптуватися до несприятливих умов середовища. Підвищення теплостійкості імаго й уповільнення швидкості розвитку в умовах впливу метопрену (0,1 мкг/мл) погоджується з даними інших авторів [Гренбэк Л. Г. и др., 1997; Раушенбах И. Ю. И др., 2001] про важливу роль ЮГ у антистресовому захисті у комах.

Вплив генотипу на ступінь політенії гігантських хромосом дрозофіли у зв'язку з відмінностями за адаптивно важливими ознаками і дією метопрену. Дослідження ступеня політенії гігантських хромосом слинних залоз дрозофіли у зв'язку з різницею ліній і гібридів по пристосованості проведено на інбредних лініях Sw і Or-R і реципрокних гібридах F1 між ними.

Аналіз препаратів політенних хромосом слинних залоз дрозофіли показав, що СПХ у лінії Sw у середньому на 11,0 % вище, ніж у лінії Or-R, причому відсоток ядер з високим рівнем політенії в лінії Sw також вище (P>0,999). СПХ у гібридів F1 Sw Or-R і Or-R Sw має проміжне значення у порівнянні з даним показником у батьківських ліній (рис. 4).

У лінії Sw, що відрізняється більшим СПХ, імаго мали також більшу масу в порівнянні з лінією Or-R (Таблиця 2). У гібрида F1 Sw Or-R маса тіла як самок, так і самців була на рівні кращої з батьківських ліній. У самок F1 Or-R Sw мало місце проміжне успадкування, а самці цього гібрида мали найменшу масу тіла у порівнянні з іншими генотипами. Отже, у гібридів виявлений материнський ефект за цим показником. Цей результат свідчить про важливу роль цитоплазми в успадкуванні маси тіла у дрозофіли.

У лінії Sw був відзначений більший вихід імаго, ниж у лінії Or-R на 28,5 % (P>0,95). Міжлінійні гібриди перевищували за цією ознакою лінію Or-R: гібрид F1 Sw Or-R на 55,3 % (P>0,95), а гібрид F1 Or-R Sw на 39,5 % (P>0,95). Відмінності за виходом імаго між гібридами і

Рис. 4. Вплив генотипу на ступінь політенії гігантських хромосом Drosophila melanogaster.

кращою з батьківських ліній Sw, а також між самими гібридами недостовірні. Ефект гетерозису за даною ознакою у досліджуваних гібридів не виявлений.

Різниця у виході самців і самок була недостовірна у батьківських ліній і у гібрида F1 Or-R Sw. У гібрида F1 SwOr-R вихід самок перевищував вихід самців на 15,6 % (P>0,95).

Таблиця 2

Вплив генотипу на адаптивно важливі ознаки дрозофіли

Лінії й гібриди F1 |

Стать | Маса 100 особин, мг | Плідність (кількість імаго, що вийшли)

Swedish | самки | 142 2,3 | 80 18,9

самці | 102 1,8

Oregon-R | самки | 118 2,0 | 58 10,6

самці | 90 1,5

F1 Swedish x

Oregon-R | самки | 138 1,5 | 90,1 21,6

самці | 100 1,2

F1 Oregon-R Swedish | самки | 127 2,2 | 81,1 7,9

самці | 80 1,8

Таким чином, отримані результати свідчать про наявність у Drosophila melanogaster відмінностей за показником СПХ, що відображає функцію ендоредуплікації політенних хромосом і характеризує дозу генів у клітинному ядрі.

На інбредних лініях forked і Oregon-R і реципрокних гібридах F1 між ними досліджували ступінь політенії гігантських хромосом слинних залоз дрозофіли у зв'язку з різницею ліній і гібридів по пристосованості та впливом аналога ЮГ – метопрену. Гормон у концентрації 0,1 мкг/мл додавали у поживне середовище, де розвивалися личинки дрозофіли. Показано, що в контролі (рис. 5) лінія forked відрізняється більш високим ступенем політенії у порівнянні з лінією Or-R. Різниця склала 5,3 % (Р>0,95), причому відсоток ядер з високим ступенем політенії 1024С у лінії forked також був вищий (Р>0,999). СПХ у гібрида F1 f Or-R був у середньому на 6,1 % вище у порівнянні з гібридом F1 Or-R f (Р>0,99). У гібрида F1 f Or-R середні значення СПХ були на рівні кращої з батьківських ліній.

Рис. 5. Вплив генотипу на ступінь політенії гігантських хромосом дрозофіли у зв'язку з дією метопрену:

контроль – відсутність метопрену у середовищі; дослід 1 - концентрація метопрену в середовищі 0,1 мкг/мл.

* - Відмінність від контролю - Р>0,95; ** Відмінність від контролю - Р>0,99

У досліді під впливом метопрену СПХ у лінії Or-R збільшився в середньому на 8,5 % у порівнянні з контролем (Р>0,999). У гібрида F1 Or-R f показник ступеня політенії хромосом підвищився під дією метопрену на 4,0 % (Р>0,95). Відсоток ядер з високим рівнем політенії також достовірно збільшився, а кількість ядер з меншим ступенем політенії знизилась як у ліній, так і у гібридів (Р>0,95). Різниця по показнику СПХ у досліді порівняно з контролем у лінії forked і гібрида F1 f Or-R була недостовірною.

Як видно з рис. 5 вплив гормону нівелює генетичні відмінності між особинами за показником СПХ. На цьому фоні лінії й гібриди виявили різну чутливість до дії метопрену. Так, лінія Or-R і гібрид F1 Or-R f виявилися більш сприйнятливі до впливу гормонального фактору в порівнянні з лінією forked і гібридом F1 f Or-R. Ці дані свідчать про роль ЮГ в процесах ендоредуплікації політенних хромосом.

За допомогою двохфакторного дисперсійного аналізу показано, що сила впливу генотипу на показник СПХ склала 37,6 ± 0,7 %, а сила впливу гормонального фактору склала відповідно 37,1 ± 0,4 % (Р>0,999).

У контролі лінія Or-R перевищувала лінію forked за теплостійкістю самок на 65,9 % (P>0,99), у самців різниця не достовірна. Маса тіла імаго була більшою в лінії forked .

Імаго обох гібридів у контролі проявляли більшу теплостійкість, ніж інбредні батьківські лінії (Таблиця 3). Самки гібрида F1 f x Or-R перевищували кращу батьківську лінію Or-R на 24,2%, самці - на 47,6 % (P>0,95). Гібрид F1 Or-R x f також перевищував по даному показнику кращу з батьківських ліній. Різниця склала 45,5 % у самок і 74,5 % у самців (P>0,999). Таким чином, по теплостійкості у гібридів виявився ефект гетерозису.

За виходом імаго відмінностей між інбредними лініями не виявлено. Гібрид F1 f x Or-R перевищував по даному показнику вихідну батьківську лінію на 32,0 %, а гібрид F1 Or-R x f – на 78,0 % (P>0,999) (Таблиця 3). Таким чином, гібриди за даним показником проявляли ефект гетерозису.

У досліді спостерігали збільшення теплостійкості імаго під впливом метопрену у порівнянні з контролем у лінії forked в середньому на 81,0 % у самок і на 78,4 % у самців(P>0,999).

Таблиця 3

Зміна показників пристосованості інбредних ліній і гібридів F1 дрозофіли під впливом метопрену |

Лінії, гібриди F1 | Теплостійкість імаго, % виживших особин | Маса тіла 100 особин, мг | Плідність (кількість імаго, що вийшли)

самки | самці | самки | самці

Контроль | f | 17,9±2,8 | 14,8±1,4 | 126,5±1,5 | 90,5±1,5 | 45,0±3,4

Or-R | 29,7±2,7 | 23,1±6,0 | 117,0±1,3 | 76,0±1,7 | 40,3±2,5

f Or-R | 36,9±3,2 | 34,1±3,4 | 125,0±2,1 | 87,0±1,1 | 59,4±3,2

Or-R f | 43,2±3,8 | 40,3±3,1 | 116,0±2,0 | 81,0±1,2 | 80,1±2,6

Дослід | f | 32,4±4,1** | 26,4±3,5** | 126,0±2,0 | 85,0±1,5* | 34,2±2,0**

Or-R | 40,7±3,7** | 37,4±6,9 | 118,5±1,9 | 91,0±1,2** | 34,4±1,6*

f Or-R | 41,8±3,5 | 44,2±4,4* | 130,0±2,5 | 91,5±1,5* | 52,6±3,0*

Orf | 51,6±5,8 | 36,9±3,3 | 118,0±2,2 | 86,5±1,6* | 53,3±3,8**

Контроль – відсутність метопрену у середовищі; дослід – концентрація метопрену в середовищі 0,1 мкг/мл.

* Відмінність від контролю - P>0,95; ** Відмінність від контролю - P>0,99

У лінії Or-R теплостійкість збільшилася в середньому на 37,0 % у самок і на 61,9 % у самців (P>0,999). Міжлінійні відмінності по теплостійкості у досліді не виявлені. Ці дані говорять про важливу роль ювенільного гормону в механізмі антистресового захисту. На відміну від інбредних ліній у гібридів достовірних відмінностей за даним показником у досліді і контролі не виявлено, що свідчить про кращий онтогенетичний гомеостаз гібридів.

У досліді гібриди також проявляли ефект гетерозису за показником виходу імаго: гібрид F1 f x Or-R перевищував кращу з батьківських ліній forked на 53,8 %, у гібрида F1 Or-R x f даний показник був більше на 54,9 %, ніж у лінії Or-R (P>0,999). Причому ефект гетерозису у гібрида F1 Or-R x f був виражений слабше в умовах дії гормонального фактору в порівнянні з контрольними умовами (P>0,999). Різниця склала 50,3 % (P>0,999).

Відмінності по виходу імаго у гібрида F1 f x Or-R між контролем і дослідом не виявлені. Значних змін за показником маси тіла імаго під впливом метопрену не виявлено.

Установлено середню позитивну кореляцію між показниками СПХ і маси тіла імаго в ліній і міжлінійних гібридів: r = 0,65 (P>0,99).

Дисперсійний аналіз отриманих даних показав, що сила впливу гормонального фактору на теплостійкість імаго склала 62,5 ± 2,2 % (P>0,999), а на вихід імаго - 45,0 ± 0,9 % (P>0,999). У свою чергу, сила впливу генотипу на теплостійкість і вихід імаго склала, відповідно, 21,2 ± 1,1 % і 12,0 ± 0,6 % (P>0,999).

Зміна біоелектричних властивостей клітинних ядер дрозофіли в онтогенезі та при дії аналога ювенільного гормону – метопрену in vitro. Динаміка біоелектричних властивостей клітинних ядер в онтогенезі дрозофіли характеризується значними коливаннями [Шахбазов В. Г. и др., 1986; Горенская О. В. и др., 1997 ].

Нами виявлені зміни біоелектричних властивостей клітинних ядер в онтогенезі дрозофіли (рис.6, А). Отримані результати показали, що електронегативність клітинних ядер (ЕНЯ) у міжлиньковий період у 3-му линьковому віці значно нижче в порівнянні з 0-годинною передлялечкою, що характеризується високим показником ЕНЯ клітинних ядер. На стадії 0-годинної передлялечки даний показник збільшується у самок на 76,2 %, у самців - на 74,8 % (Р>0,999). Таким чином, можна зробити висновок, що на стадії 0-годинної передлялечки показник біоелектричних властивостей клітинних ядер значно вище, ніж у личинок 3-го віку в міжлиняльний період розвитку, що збігається с даними інших авторів [Горенская О.В. и др., 1997; Горенская О.В. и др., 2003].

Дослідження впливу метопрену на показник ЕНЯ клітинних ядер слинних залоз дрозофіли проводили на стадії 0-годинної передлялечки (рис. 6, Б). Нами встановлена наступна закономірність: контроль 2 (інкубація залоз в 1 % розчині DMSO) відрізнявся дещо зниженим показником ЕНЯ у порівнянні з контролем 1 (слинні залози без інкубації). Цей результат можна пояснити відсутністю екдизона у середовищі, у той час як у гемолімфі у 0-годинної передлялечки його рівень збільшений.

У досліді 1 (концентрація метопрену 0,1 мкг/мл), імовірно по цієї ж причині, спостерігалося достовірне зниження показника ЕНЯ по відношенню до контролю 1 (Р>0,99), відносно контролю 2 різниці не спостерігали. У досліді 2 (концентрація метопрену 1 мкг/мл) відзначене значне зниження показника ЕНЯ стосовно контролю 1 і до контролю 2: рухливість клітинних ядер була близької до нуля як у самок, так і у самців.

А

Б

Рис. 6. Відмінності за показником біоелектричних властивостей клітинних ядер в слинних залозах дрозофіли: А - на різних стадіях онтогенезу; Б - під дією метопрену в дослідах in vitro:

контроль 1 - слинні залози без інкубації (стадія 0-годинної передлялечки); контроль 2 - інкубація слинних залоз в 1 %-му розчині DMSO; дослід 1 - концентрація метопрену 0,1 мкг/мл в 1 %-му розчині DMSO; дослід 2 - концентрація метопрену 1 мкг/мл в 1 %-му розчині DMSO.

*Відмінність від міжлиняльного періоду; ** Відмінність від контролю 1 - P>0,999

Відмінності у досліді 1 і досліді 2 погоджуються з одержаними даними про вплив різних концентрацій метопрену на активність пуфінгу в політенних хромосомах дрозофіли. Нами було встановлено, що при концентрації гормону 1 мкг/мл активується більше число пуфів, ніж при 0,1мкг/мл.

Отримані дані показали, що метопрен, якій є аналогом ЮГ, знижує електрокінетичний потенціал клітинних ядер, що протилежно дії екдизону. Таким чином, показано, що різні набори генів (міжлиняльні й екдизонові) функціонують у різних цитофізіологічних умовах, що відображає множинний характер дії гормонів, і ендоредуплікація політенних хромосом відбувається при низьких значеннях ЕНЯ.

ВИСНОВКИ

1. Установлено взаємозв'язок між активністю пуфіювання, ендоредуплікацією політенних хромосом і електрокінетичними властивостями клітинних ядер (ЕНЯ), а також впливом на ці процеси аналогу ювенільного гормону – метопрену. Показано, що активність міжлиняльних пуфів і ендоредуплікація хромосом, які регулюються ЮГ, відбуваються на фоні низьких значень показника ЕНЯ.

2. Вперше на основі аналізу пуфінгу політенних хромосом у дослідах in vitro на слинних залозах Drosophila melanogaster показана індукція ряду міжлиняльних пуфів - 43E, 58DE, 60B, 85D, 100DE - під впливом аналогу ЮГ метопрену, і, на прикладі локусів 63Е и 82ЕF, участь даного гормону у регресії пізніх екдизонових пуфів. Показано, що для пуфів 43E, 58DE і 85D пріговою є концентрація гормону 0,1 мкг/мл, а для пуфів 60B і 100DE – 1мкг/мл.

3. Міжлінійні відмінності по СПХ корелюють із різною пристосованістю інбредних ліній дрозофіли. У міжлінійних гібридів мало місце проміжне успадкування СПХ, або даний показник був на рівні кращої з батьківських ліній.

4. Ступінь політенії гігантських хромосом за розвитку личинок дрозофіли у поживному середовищі, що містить аналог ЮГ – метопрен, збільшується. Ефект залежить від генотипу мух і концентрації гормону. При концентрації метопрену 0,1 мкг/мл СПХ збільшується на 22,0% у самок і на 23,2 % у