ІНСТИТУТ ГІГІЄНИ ТА МЕДИЧНОЇ ЕКОЛОГІЇ ІМ. О.М.МАРЗЕЄВА

АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

БОЛТІНА ІРИНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 576.312.32.38:612.014.482

ЧАСТОТА АБЕРАЦІЙ ХРОМОСОМ В КУЛЬТУРІ ЛІМФОЦИТІВ ПЕРИФЕРИЧНОЇ КРОВІ ХВОРИХ НА ГЛІОМИ ГОЛОВНОГО МОЗКУ ПРИ ДІЇ МОДЕЛЬНИХ МУТАГЕНІВ МІТОМІЦИНУ ТА ДИМЕТОАТУ

03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті екогігієни та токсикології ім. Л.І. Медведя

МОЗ України

Науковий керівник –кандидат медичних наук,

зав. лабораторією мутагенезу

Інституту екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя

КРАВЧУК Олександр Павлович

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

провідний науковий співробітник відділу радіобіології

Інституту єксперементальної патології, онкології

та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького

ДЬОМІНА Емма Анатоліївна

доктор медичних наук, профессор,

зав. лабораторією цитогенетики відділу медичної генетики

Наукового центру радіаційної медицини АМН України

ПІЛІНСЬКА Марія Андріївна

Провідна установа – Інститут молекулярної біології та генетики, відділ генетики людини,

НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “ 09 ” червня 2005 року о 14 год. на засіданні спеціалізованної вченої ради Д 26.604.02 в Інституті гігієни та медичної екології ім. О.М.Марзеєва АМН України за адресою: м. Київ, вул. Попудренка 50

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М.Марзеєва АМН України.

Автореферат розісланий “ 01 ” квітня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Е.М. Омельченко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Профілактика та рання діагностика злоякісних новоутворень є однією з важливих соціально-біологічних завдань сучасної онкології. Міжнародна агенція з вивчення раку (МАВР) ще в 1993 році сповістила, що темпи зростання онкозахворювань (2,1 % на рік) значно перевищують темпи зростання населення у світі (1,7 % за рік) (UNSCEAR, 1993). Крім того, смертність від злоякісних новоутворень серед населення Землі виходить на друге – четверте місце, а у високо розвинутих країнах цей показник займає перше – друге місце (Якубовска Р.І., 2000). За оцінкою ВОЗ, більш ніж 75 % захворювань раком у людей обумовлені факторами зовнішнього середовища (сюди відносять паління цигарок, особливості харчування, застосування ліків, радіаційне та хімічне забруднення довкілля, особливості географічного місця проживання та інші соціально - культурні фактори). Все більше прихильників знаходить точка зору про те, що більшість злоякісних пухлин у людини (приблизно 80 %) викликано хімічними канцерогенами, до яких відносяться і деякі генетично активні пестициди і, зокрема, – стійкі хлорорганічні сполуки (Goldman L.R., 1995; Sandberg A. A., 1984).

Результати численних молекулярно-генетичних досліджень, які проводяться в багатьох країнах світу, дозволяють визначити, що рак – це хвороба геному, а саме - складний багатоетапний процес накопичення мутацій – змін в генетичних структурах клітин на геномному, хромосомному та генному рівнях (Чехун В.Ф., 2003). Існує декілька типів цитогенетичних порушень, роль яких у канцерогенезі активно обговорюється в наш час. Це – хромосомні аберації, мікроядра, анеуплоїдія, сестринські хроматидні обміни. З позиції генетичної нестабільності ракових клітин оцінюються і якісно нові ступені розвитку пухлини, що зв’язані з її прогресією. Показано, що біологічна прогресія пухлини та набування нею нових клінічних якостей, таких, як агресивність та більша злоякісність, є відображенням збільшення генетичних порушень у субпопуляціях клітин із змінними характеристиками. Крім того, цитогенетичні кількісні (гетероплоідія) та якісні (структурні) порушення каріотипу клітин є маркерами не тільки ступеню злоякісності пухлини, але і прогнозу захворювань (Якубовська Р.І., 2000; Kern J.A., 1993; Lasutka J.R. et al., 1999; Lernia R et al., 1987; Limoli C.L. et al., 1997). Структурні аберації хромосом розглядаються як найбільш вірогідні події, які пов’язані з малігінізацією. Цей зв’язок підтверджується тим, що значна кількість новоутворень характеризується хромосомними абераціями та мутаціями в генах, які відповідають за репарацію ДНК, супресію онкогенів, контроль клітинного циклу (Воробцова І.Є. із спів., 1999). Нещодавно скандинавські вчені показали, що ризик виникнення новоутворень збільшується у осіб, в яких відмічається підвищений спонтанний рівень аберацій хромосом, що можна розглядати як один із доказів ролі хромосомних аберацій у канцерогенезі (Hagmar L. et al, 1994). Отримані також переконливі дані про зв’язок чинників зовнішнього середовища із різними патологічними станами людини, у тому числі, і онкозахворюваннями. Оскільки відомості про сумарний внесок мутагенних факторів різної природи в індукцію онкопатології у людини недостатні, актуальним стає проведення комплексних генетико-гігієнічних досліджень серед різних груп населення (Курінний А.Й., 1986; Зозуля Ю.А., Грідіна Н.Я., 1998; Ревазова Ю.А., Журков В.С., 2001).

Гліальні пухлини відносяться до тих, що найбільш часто зустрічаються серед усіх новоутворень мозку. Зокрема, загальна нейроонкозахворюванність в Україні на теперішній час складає 10,2 на 100 тис. населення серед чоловіків та 7,6 – серед жінок. З 1989 по 1995 рік розповсюдженість злоякісних пухлин головного мозку підвищилась з 4,7 до 5,1 на 100 тис. серед чоловіків та з 3,4 до 3,8 на 100 тис. серед жінок. Первинні злоякісні пухлини головного мозку складають 1,3 % від загальної кількості пухлин різних органів та систем. Пухлини головного мозку поділяються на поза мозкові (в основному, доброякісні) і на внутрішньо мозкові різного ступеню злоякісності похідні елементів глії – гліоми. Згідно сучасним класифікаціям, розрізняють чотири ступені анаплазії гліом. Серед них найбільш часто зустрічаються гліобластоми - гліоми ІV ступеню анаплазії –25 %, анапластичні астроцитоми ІІІ ступеню анаплазії – 20 %, астроцитоми ІІ ступеню анаплазії - 5 %. Однак границі між ступенями анаплазії дуже умовні, тому розрізняють гліоми ІІ ступеню анаплазії (умовно доброякісні) та гліоми ІІІ - ІV ступеню анаплазії (злоякісні) (Зозуля Ю.А., Грідіна Н.Я., 1998; Melissa L., Athanassios P. et al., 1996).

Появі злоякісних пухлин мозку можуть сприяти різні фактори (-опромінення, ендогенні мутагени, деякі харчові добавки та, можливо, черепно-мозкові травми), ряд яких мають генотоксичні властивості (Зозуля Ю.А., Грідіна Н.Я., 1998; Rodvall Y., Anibom A., Spannare B., 1996). Цитогенетичні особливості лімфоцитів периферичної крові (як індикаторних клітин при дії мутагенів) у хворих на гліальні пухлини не були досліджені. Крім того, до теперішнього часу не вивчено вплив хлорорганічних пестицидів (ХОП) як потенційних мутагенів на геном онкологічних хворих, зокрема, хворих із пухлинами головного мозку.

Вищезазначене стало підставою для проведення даного дослідження.

Зв’язок із науковою тематикою організації. Дисертаційна робота є фрагментом виконання галузевих пріоритетних НДР "Еколого-генетична оцінка деяких регіонів України за сумарним мутагенним фоном; Розробка методичних підходів до біомоніторингу мутагенів в продуктах харчування” № держреєстрації 0192V0342994; НДР АМН України “Дослідження змін генів, що диференційно експресуються в гліомних пухлинах різного ступеню злоякісності” № держреєстрації 0101U004577; теми № 6/98 “Наукове обґрунтування методології Державної санітарно-гігієнічної експертизи, її нормативно-правового та інформаційного забезпечення. Оцінка небезпечності пестицидів та агрохімікатів за критерієм ендокринних порушень” № держреєстрації 0100U000255.

Метою даних досліджень є вивчення рівня мутаційної мінливості у лімфоцитах периферичної крові хворих на гліоми головного мозку. Для досягнення поставленої мети вирішувались такі завдання:

1. Визначити цитогенетичні показники (частоту та спектр аберацій хромосом, кількість анеуплоїдних, поліплоїдних та мультиаберантних клітин) у лімфоцитах периферичної крові хворих на гліоми головного мозку.

2. Визначити цитогенетичні показники у лімфоцитах периферичної крові хворих на гліоми головного мозку після дії модельних мутагенів (мітоміцину С та диметоату) in vitro.

3. Дослідити можливий кореляційний зв’язок між цитогенетичними показниками та сумарним вмістом хлорорганічних пестицидів в крові обстежених хворих на гліоми.

Об’єкт дослідження – рівень мутаційної мінливості при дії модельних мутагенів на лімфоцити периферичної крові людини in vitro в нормі та при патології.

Предмет дослідження – метафазні хромосоми лімфоцитів периферичної крові хворих на гліоми головного мозку, загальну соматичну патологію та здорових осіб в нормі та при дії in vitro модельних мутагенів – мітоміцину та диметоату.

Методи досліджень: цитогенетичні – класичний та з метаболічною активацією, математичні, статистичні

Наукова новизна. Вперше проведено дослідження частоти та спектру аберацій хромосом у соматичних немалігнізованих клітинах хворих на гліоми головного мозку в неекспонованих культурах та при дії модельних мутагенів in vitro. Показано, що із зростанням ступеню злоякісності пухлин зменшувалась чутливість лімфоцитів периферичної крові обстежених осіб до додаткового мутагенного навантаження in vitro як за частотою аберантних метафаз, так і за рівнем мультиаберантних клітин. Встановлено залежність цитогенетичного ефекту в лімфоцитах периферичної крові від сумарного вмісту ХОП у крові обстежених, які не мали професійного контакту з пестицидами.

Теоретичне значення. Отримані результати вказують на актуальність більш широкого використання показників цитогенетичного статусу соматичних клітин людини для генетико-гігієнічного моніторингу населення, оцінки потенційної мутагенної небезпечності екологічної ситуації, яка склалась в Україні, визначення груп ризику за критеріями підвищеної мутаційної мінливості.

Практичне значення. В результаті виконання роботи були оформлені:

- Свідоцтво про державну реєстрацію прав автора на твір ПА № 4301 “Метод изучения мутагенной активности веществ (метафазного анализа аберраций хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека) іn vitro с метаболической активацией, модифицированный в лаборатории мутагенеза“;

- Свідоцтво про реєстрацію авторського права на твір ПА № 8332 “Метод подсчета анеуплоидных клеток при метафазном анализе аберраций хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека”.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто здійснений інформаційний пошук та оцінка літературних даних, розроблена схема та обґрунтована методологія постановки експериментів, виконані експериментальні дослідження по вивченню частоти та спектру аберацій хромосом в культурі лімфоцитів периферичної крові хворих на гліоми головного мозку та контрольних груп, проведений аналіз отриманих даних щодо сумарного вмісту хлорорганічних пестицидів в крові обстежених осіб, підготовлені статті до публікації. Дослідження сумарного вмісту ХОП були проведені м.н.с. лабораторії моніторингу хімічних речовин Інституту медицини праці АМН України Є.Р. Заєць (керівник лабораторії, к.б.н. В.Ф. Демченко). Забір венозної крові здійснено разом із медичними працівниками закладів (Інститут Екогігієни та токсикології ім. Л.І. Медведя, Інститут нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова).

Апробація результатів дослідження. Матеріали, що включені до дисертаційної роботи, доповідалися на Конференції молодих вчених (Інститут медицини праці АМН України, 2000 р); Конференції молодих вчених (Інститут фармакології, 2000 р); Конференції “Генетичний моніторинг”, 2001 р; Х з’їзді онкологів України, 2001 р; І з’їзді токсикологів України, 2001 р; ІІІ науково-практичній конференції “Проблеми онкогенетики: наукові та прикладні аспекти”, 2002 р; ІІІ з’їзді медичних генетиків України з міжнародною участю, 2002 р; науково-практичній конференції з міжнародною участю “Онкологія-ХХІ”, 2003 р; науково-практичній конференції “Актуальні проблеми токсикології, гігієни та аналітичної хімії пестицидів та агрохімікатів”, 2003р.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 друкованих праць, з яких 2 свідоцтва про права автора; 4 статті та коротке повідомлення, які опубліковані у профільних журналах; 11 тез, які надруковані в матеріалах з’їздів та конференцій.

Обсяг та структура роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, глави, що містить результати власних досліджень, їх обговорення, висновків, вказівника цитованої літератури. Робота викладена на 118 сторінках машинопису, ілюстрована 43 таблицями, 3 діаграмами, одним малюнком. Бібліографічний вказівник має 170 робіт, з яких іншомовних - 51(30 %), посилань 2000-2004 р. – 46 (27 %).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи експериментальних досліджень. Дослідження були проведені на культурі лімфоцитів периферичної крові людини in vitro – у класичному варіані та з метаболічною активацією. У роботі були використані наступні реагенти та матеріали: вітчизняні - поживне середовище “Ігла”, пеніциліну натрієва сіль, калій хлористий, магній хлористий, вода для ін’єкцій, спирт етиловий ректифікований, льодяна оцтова кислота, натрію хлорид, циклофосфан, диметоат; фірми Sigma (США) - фітогемаглютінін (РНА Р), Гімза (барвник), мітоміцин С, глюкозо-6-фосфат, НАДФ, фосфатний буфер (у таблетках), фенобарбітал; фірми Polfa (Польща) - гепарин USP, фірми Merk (Німеччина) – колхіцин.

Культивування лімфоцитів периферичної крові людини проводили відповідно до методу Хангерфорда (1965) з нашими модифікаціями, упродовж 52-х годин. Отримання препаратів метафазних хромосом та аналіз рівномірно забарвлених хромосом з груповим каріотипуванням проводили згідно з загальноприйнятими методами (Захаров А.Ф. із спів., 1982). Ураховували всі структурні аберації хроматидного та хромосомного типів, числові аберації (анеуплоїдні та поліплоїдні клітини). Вивчали розподіл анеуплоїдних клітин на гіпо- (кількість хромосом у метафазі становила менше 44) та гіперплоїдні (кількість хромосом у метафазі була більшою за 48).

При вивченні впливу модельних мутагенів на індукцію аберацій хромосом в лімфоцитах периферичної крові обстежених груп in vitro за 24 години до кінця інкубації в культуру додавали водні розчини диметоату в концентрації 0,025 мкг/мл чи мітоміцину С в концентрації 10 мкг/мл. В експериментах з метаболічною активацією через 26 годин після початку інкубації до культуральної суміші додавали, інкубуючи упродовж двох годин, наступні інгредієнти: по 0,2 мл розчину диметоату в концентраціях 25,0; 2,5; 0,25; 0,025 та 0,0025 мкг на 1 мл культурального середовища, по 0,5 мл суміші кофакторів (0,1 М розчин MgCl2/KCl; 1М розчин глюкозо-6-фосфату; 0,1 М розчин NADF; 0,2 М фосфатний буфер (рН 7,4); вода для ін’єкцій) та 0,5 мл мікросомальної фракції гомогенату печінки щурів, яку готували за методичними рекомендаціями D.M. Maron, B.N. Ames (1983). Індукцію ферментів мікросомального окислення здійснювали за допомогою 0,1% розчину (у питній воді) фенобарбіталу, який давали тваринам протягом 5-ти діб. В якості позитивного контролю у цьому експерименті використовували циклофосфан у концентрації 20 мкг/мл.

Отриманий в результаті дослідження цифровий матеріал обчислювали методами статистичної обробки, із знаходженням середньої арифметичної та її похибки для абсолютних та відносних величин і критерію вірогідності за Стюдентом. Вірогідними вважали відмінності при Р 0,05. Кореляційний аналіз проводився загальноприйнятою методикою з використанням програм Microsoft Exel.

Характеристика обстежених груп та обсяг вивченого матеріалу. В якості основної (дослідної) групи обстежено групу хворих (67 осіб) із вперше встановленим діагнозом - гліоми головного мозку, які поступили до Інституту нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова до лікування. За контроль взято результати обстеження 20-ти мешканців м. Києва, які заперечували свідомий професійний чи побутовий контакт із мутагенними факторами і були практично здорові за визначенням медогляду спеціалістів Інституту екогігієни та токсикології ім. Л.І. Медведя. Умовним контролем були 30 осіб хворих на патологію шлунково-кишкового тракту (за винятком онкопатології) до лікування, госпіталізовані до клініки Інституту екогігієни та токсикології ім. Л.І. Медведя (в подальшому – хворі без новоутворень), які мешкали в місті Києві та заперечували свідомий професійний чи побутовий контакт з мутагенними факторами.

У всіх обстежених, крім цитогенетичних показників, визначали носійство ХОП. Кров для обох досліджень отримували одномоментно. Обсяг вивченого матеріалу представлений у табл. 1.

Треба зазначити, що для порівняльного аналізу із 118-ти обстежених було відібрано 87 осіб, оскільки не у всіх хворих можна було отримати достатню кількість метафаз із задовільним розкидом хромосом.

Із 36-ти онкохворих у 10-ти пацієнтів (4 жінки та 6 чоловіків) спостерігались відносно доброякісні гліоми (ІІ ступеню анаплазії); середній вік пацієнтів – 40,8 років (діапазон коливання віку - від 18 до 61 років); 6 осіб- мешканці міста, 4 осіб- мешканці села. У 26-ти осіб (20 жінок та 6 чоловіків) діагностовані злоякісні гліоми (ІІІ – ІV ступеню анаплазії); середній вік пацієнтів - 45,0 років (діапазон коливання віку – від 23 до 63 років); 22 особи мешкали у місті, 6 - у селі.

В групу умовного контролю включено 30 осіб (20 жінок та 10 чоловіків), хворих на соматичну патологію (без новоутворень) з середнім віком 37,4 років (діапазон коливання віку – від 21 до 63 років); всі - мешканці міста.

Групу контролю (20 осіб, з яких 12 жінок та 8 чоловіків) складали практично здорові особи, мешканці міста, з. середнім віком – 33 роки (діапазон коливання віку – від 21 до 45 років).

Таблиця 1.

Обсяг вивченого матеріалу

Групи обстежених | Кількість обстеже-них | Методи дослідження

Цитогенетичний | Хрома-тогра-фічний

Кількість проаналізованих клітин | Кіль-кість зразків

Без впли-ву | Модифікація | Усьо-го

Мітоміци-ном | Диметоа-том

Здорові особи | 20 | 3555 | 1490 | 1000 | 6045 | 20

Хворі | без онкопатології | 31 | 5770 | 1775 | 1165 | 8710 | 31

на гліоми | 67 (36) | 4710 | 1175 | 565 | 6450 | 67

Тест на індукцію АХ у культурі ЛПК in vitro | 400 | 200 | 1860 | 2460

Усього | 118 (87) | 14435 | 4640 | 4590 | 23665 | 118

Результати досліджень та їх обговорення.

Показано, що із зростанням ступеню злоякісності гліом кількість культур, чутливих до дії ФГА, знижується. Так, у контролі (здорові особи) проаналізовано 100 % зразків. У групі хворих без онкопатології відсоток придатних для аналізу культур складав 96,7 %; у хворих на доброякісні гліоми - 77,0 %; у хворих на злоякісні гліоми - 49 %. Згідно з думкою Фролова В.М. (1993), в онкологічних хворих значно зменшена кількість Т-лімфоцитів та знижений імунітет, що, у свою чергу, може призвести до зниження їхньої реактивності на ФГА. Це положення підтверджують ще ряд авторів (Акіфьєв А.П. 1993; Олейник Е.К. із спів. 1997, 2000; Останін О.О. із спів. 2003).

В табл. 2 представлені результати аналізу анеуплоідії в лімфоцитах периферичної крові осіб з обстежених груп.

Таблиця 2.

Середньогрупова частота анеуплоїдних клітин, їхній розподіл та діапазон індивідуальних коливань у лімфоцитах периферичної крові осіб з обстежених груп.

Групи обстежених | Частота анеуплоїдних клітин, % | Діапазон коливань, %

Загальна | Гіпоплоїдія | Гіперплоїдія

Здорові особи | 7,9 0,45 | 60,0 | 40,0 | 4,0 – 14,0

Хво-рі |

без новоутворень | 10,3 0,4* | 64,4 | 35,6 | 5,0 – 22,0

на доброякісні гліоми | 15,1 0,8 * | 74,2 | 25,8 | 10,0 – 24,0

на злоякісні гліоми | 20,4 0,6 * | 82,4 | 17,6 | 14,0 – 39,5

Примітка. * Р 0,05

В результаті проведених досліджень встановлено статистично достовірне підвищення рівня анеуплоїдних клітин в лімфоцитах периферичної крові у онкохворих залежно від ступеню злоякісності гліом. Так, середньогрупова частота анеуплоїдних клітин в групі хворих на злоякісні пухлини (20,40,6 %) була достовірно вищою, ніж в групі хворих на доброякісні пухлини (15,10,8 %) та в групах умовного контролю (10,30,4 % у хворих без онкопатології та 7,90,45 % у здорових осіб). Слід відзначити, що анеуплоїдні клітини були знайдені при аналізі лімфоцитів периферичної крові хворих на меланому (Монахов А.С. із спів., 2002) та рак шлунково-кишкового тракту (Монахов А.С. із спів., 1993; 2001).

Діапазон індивідуальних коливань частоти анеуплоїдії також зростав залежно від ступеню злоякісності гліом: найменший розбіг спостерігався у здорових осіб (4,0 – 14,0%), потім йде група хворих на загальну соматичну патологію (5,0 – 22,0%), група хворих на доброякісні гліоми (10,0 – 24,0%) і, нарешті, - група хворих на злоякісні гліоми (14,0 – 39,5%).

Щодо частоти гіпо- та гіперплоїдних клітин виявлено, що із збільшенням ступеню злоякісності гліом збільшувався рівень гіпоплоїдних клітин (від 60,0% у здорових до 82,4% у хворих на злоякісні гліоми), і, навпаки, зменшувався рівень гіперплоїдних клітин (від 40 % у здорових до 17,6% у хворих на злоякісні гліоми).

При цитогенетичному обстеженні нами були виявлені поліплоїдні клітини у лімфоцитах периферичної крові у 100 % хворих на злоякісні гліоми головного мозку. Їх кількість зростає із збільшенням ступеню злоякісності (від 0,05% у здорових до 0,7 % у хворих на злоякісні гліоми). Можливо, це є однією із захисних функцій організму проти пухлини (Ільінських М.М. із спів. 1986, 2003) (рис 1).

Рис. 1. Частота поліплоїдних клітин в обстежених групах, %.

Під час оцінки репрезентативності вибірки було визначено, що частота аберацій хромосом не залежить від віку та статі людини, що підтверджується літературними даними (Бочков М.П. 1993; 2001). Разом із цим, було зазначено, що 59 % хворих на гліоми головного мозку належить до вікової групи 40-60 років. Вікове збільшення кількості пухлин головного мозку пов’язують із природними наслідками інформаційної ентропії геному, яка збільшується з роками (Зайнулін В.Г., Москальов О.О., 2000; Зозуля Ю.О., Грідіна Н.Я. 1998). Згідно з думкою М.М.Ільїнських (2003), із віком у соматичних клітинах організму збільшується кількість генетичних порушень. Оскільки хромосомні аберації індукуються тими ж факторами, що і рак, та зустрічаються у більшості пухлин, деякі автори (Hagman L et al., 1994; Tucker J., Preston R, 1996) пропонують використовувати їх у якості маркера наявності пухлини при розрахунках онкологічного ризику. Крім того, як показали дослідження І.Є. Воробцової (1999) щодо вікової динаміки стабільних хромосомних аберацій, маючи достовірну калібровану криву вік-ефект, можна визначати “біологічний вік” людини, і, як слідство – реальний ризик розвитку у неї патології (включаючи онкопатологію); виявляти “аутсайдерів”, тобто осіб з достовірно високою частотою хромосомних аберацій, які підлягають детальному цитогенетичному обстеженню.

В результаті проведених досліджень (які наведені в табл. 3) встановлено, що середньогруповий рівень метафаз з абераціями хромосом у здорових осіб (1,70,2%) знаходився в межах, характерних для спонтанного хромосомного мутагенезу у здорових осіб. Середньогрупова частота аберантних метафаз у хворих без онкопатології складала 2,60,2% і була достовірно вища за частоту метафаз з абераціями у контрольній групі. Середньогрупова частота метафаз з абераціями в підгрупі хворих на доброякісні гліоми складала 3,40,4% і достовірно перевищувала частоту метафаз з абераціями в обох контрольних групах. Середньогрупова частота метафаз з абераціями у хворих на злоякісні гліоми складала 4,5+0,3 % і була достовірно вища за частоту метафаз з абераціями у всіх трьох групах обстежених. Таким чином, частота аберантних метафаз достовірно підвищувалась із зростанням ступеню злоякісності гліом головного мозку.

Таблиця 3.

Основні кількісні цитогенетичні показники в лімфоцитах периферичної крові обстеженних осіб

Показники | Групи

Здорові особи | Хворі

без новоутворень | на доброякісні гліоми | на злоякісні гліоми

Кількість обстежених | 20 | 30 | 10 | 26

Загальна кількість метафаз | 3555 | 5770 | 1885 | 4250

Середньогрупова частота метафаз з абераціями, % | 1,7 0,2 | 2,6 0,2* | 3,4 0,4* | 4,5 0,3*

Діапазон індивідуальних коливань, % | 0,5 – 2,5 | 1,0 – 4,0 | 2,5 – 5,0 | 3,6 – 5,5

Кількість аберацій

на 100 клітин | 1,7 | 2,8 | 3,6 | 5,0

на аберантну метафазу | 1,07 | 1,08 | 1,06 | 1,10

Кількість обстежених, у яких рівень аберацій перевищував 3 %

Абсолютна | 0 | 11 | 8 | 26

В відсотках | 0 | 36,7 | 80 | 100

Примітка. * -р < 0,05

При аналізі частоти структурних аберацій хромосом на одну аберантну метафазу та на 100 клітин виявилось, що ці показники були найвищі у хворих на злоякісні гліоми.

В лімфоцитах периферичної крові здорових осіб аберації спостерігали у хромосомах усіх груп, за виключенням груп F і G. У хворих на соматичну патологію аберації знаходили у всіх групах, крім групи F. У хворих на гліоми були пошкоджені представники всіх груп хромосом, але 50 % всіх аберацій було знайдено в групі С, що відповідає літературним даним (Зозуля Ю.О., Грідіна Н.Я., 1998; Чудиновська Н.В., 1992; Cermano I.M. et al., 1989).

Як видно з даних, наведених в табл. 4, в усіх обстежених групах частота аберацій хроматидного типу перевищувала рівень аберацій хромосомного типу і складала у % по відношенню до всіх аберацій та на 100 клітин: у здорових осіб – 64,0% та 1,1 на 100 клітин, у хворих без онкопатології – 69,5% та 2,0 на 100 клітин, у хворих на доброякісні гліоми – 85,0% та 3,0 на 100 клітин, у хворих на злоякісні гліоми – 78,0% та 3,9 на 100 клітин, відповідно.

Таблиця 4.

Спектр аберацій хроматидного типу в обстеженних осіб

Групи обстежених | Усього | Одиночні фрагменти | Обміни

% | На 100 кл. | % | На 100 кл. | % | На 100 кл.

Здорові особи | 39 | 64 | 1,1 | 37 | 60 | 1,04 | 2 | 4 | 0,06

Хво-рі | без новоутворень | 114 | 69,5 | 2 | 105 | 64 | 1,8 | 9 | 5,5 | 0,16

на доброякісні гліоми | 57 | 85 | 3 | 53 | 79 | 2,8 | 4 | 6 | 0,2

на злоякісні гліоми | 166 | 78 | 3,9 | 145 | 68 | 3,4 | 21 | 10 | 0,5

Серед аберацій хроматидного типу переважну кількість становили одиночні ацентричні фрагменти. Їхня частка складала у % по відношенню до всіх аберацій та на 100 клітин: у контролі – 60,0% та 1,0 на 100 клітин, у хворих без онкопатології – 64,0% та 1,8 на 100 клітин, у хворих на доброякісні гліоми – 79,0% та 2,8 на 100 клітин, у хворих на злоякісні гліоми – 68,0% та 3,4 на 100 клітин, відповідно. Хроматидні обміни становили: у здорових осіб – 4,0 % та 0,06 на 100 клітин, у хворих без онкопатології – 5,5 % та 0,16 на 100 клітин, у хворих на доброякісні гліоми – 6,0 % та 0,20 на 100 клітин, у хворих на злоякісні гліоми – 10 % та 0,50 на 100 клітин, відповідно.

Серед аберацій хромосомного типу (табл. 5) переважну більшість становили парні ацентричні фрагменти. Їхня частота була нижчою у групах з онкозахворюваннями ніж в контрольних групах - у % по відношенню до всіх аберацій та на 100 клітин: 9,0 % та 0,32 на 100 клітин і 17,0 % та 0,87 на 100 клітин проти 25,5 % та 0,73 на 100 клітин і 36,0 % та 0,62 на 100 клітин. Дицентричні хромосоми знайдено тільки у хворих без онкопатології (1,2 % та 0,03 на 100 клітин) та у хворих на злоякісні гліоми (1,0 % та 0,05 на 100 клітин), але ці показники не перевищували середньопопуляційної норми (Bender M. et al., 1987; Поліщук Л.З., 1995). Ацентричні кільця були відсутні у здорових осіб. У решти хворих вони складали у % по відношенню до всіх аберацій та на 100 клітин: у хворих без онкопатології – 3,8 % та 0,1 на 100 клітин, у хворих на доброякісні гліоми – 6,0 % та 0,2 на 100 клітин, у хворих на злоякісні гліоми – 4,0 % та 0,2 на 100 клітин, що було трохи вище середньо популяційної норми (0,2 – 1,1 %) (Бочков М.П., Чеботарьов О.М., 1989; Мазник Н.О., 1987).

Таблиця 5.

Спектр аберацій хромосомного типу в обстеженних осіб

Групи обстежених | Усього | Парні фрагменти | Дицентрики | Ацентричні кільця

% | На 100 кл. | % | На 100 кл. | % | На 100 кл. | % | На 100 кл.

Здорові особи | 22 | 36 | 0,62 | 22 | 36 | 0,62

Хворі | без новоутворень | 50 | 30,5 | 0,87 | 42 | 25,5 | 0,73 | 2 | 1,2 | 0,03 | 6 | 3,8 | 0,1

на доброякісні гліоми | 10 | 15 | 0,53 | 6 | 9 | 0,32 | 4 | 6 | 0,2

на злоякісні гліоми | 47 | 22 | 1,1 | 37 | 17 | 0,87 | 2 | 1 | 0,05 | 8 | 4 | 0,2

Таким чином, при аналізі структурних хромосомних аберацій у лімфоцитах периферичної крові у хворих на гліоми головного мозку виявлено достовірне збільшення частоти різних типів пошкоджень хромосом порівняно з контрольною групою. Отримані результати співпадають із даними інших дослідників, які також показали збільшення порівняно з контролем частоти структурних змін у лімфоцитах периферичної крові хворих на рак іншої локалізації (Поліщук Л.З., Несіна І.П., 1995; Barrios L. et al., 1990; Limoli C.L. et al., 1997).

При цитогенетичному аналізі в усіх обстежених групах були виявлені мультиаберантні клітини (МАК), характеристика яких представлена в табл. 6.

Таблиця 6.

Середньогрупова частота мультиаберантних клітин в обстежених групах

Групи обстежених | Кількість обстежених | Частота МАК, %

Усього | у яких знайдено МАК

n | %

Здорові особи | 20 | 1 | 5,0 | 1,6 1,0

Хворі | без новоутворень | 30 | 8 | 26,6 | 6,6 1,9 *

на доброякісні гліоми | 10 | 3 | 30,0 | 6,3 1,4 *

на злоякісні гліоми | 26 | 14 | 54,0 | 11,4 2,3 *

Примітка. * -р < 0,01.

Середньогрупова частота мультиаберантних клітин у здорових осіб складала 1,61,0 %. У решти груп хворих частота МАК була достовірно вища за контрольні показники і дорівнювала: у хворих без онкопатології - 6,61,9 %, у хворих на доброякісні гліоми - 6,31,4 %, у хворих на злоякісні пухлини - 11,42,3 %. Таким чином, із зростанням ступеню злоякісності гліом значно зростала частота мультиаберантних клітин.

Кількість обстежених осіб, у яких були виявлені мультиаберантні клітини, складала по групах: у здорових осіб – 5,0 %, у хворих без онкопатології – 26,6 %, у хворих на доброякісні гліоми – 30,0 %, у хворих на злоякісні гліоми – 54,0 %. Тобто, із зростанням ступеню злоякісності пухлин достовірно зросла кількість хворих, у яких було виявлено МАК.

Відомості про вміст мультиаберантних клітин у лімфоцитах периферичної крові осіб, які зазнали впливу мутагенних факторів, є у роботах Пілінської М.А. (1994), Знаєвської І.А. (1997), Севанькаева А.В. (2000), Чеботарева А.Н. (2000). При обстежені лімфоцитів периферичної крові 50-ти хворих на рак ендометрію Несіною І.П. та Воробйовою Л.І. (1995) у 14-ти хворих (28 %) були знайдені МАК. Не виключно, що мутагенні фактори (як зовнішні, так і внутрішні) сприяють змінам як на хромосомному, так і на генному рівні; при цьому можуть пошкоджуватися групи генів, які приймають участь у процесах репарації та реплікації ДНК. Цей фактор (мутація генів), в свою чергу, може призвести до появи клітин із великою кількістю пошкоджень. При цьому хромосомні аберації можуть виникати не тільки в одному, а в декількох локусах. Таким чином, виникає “ланцюговий процес” появи хромосомних аберацій (Чеботарьов О.М., 2000). Проте, не виключено, що у здорових осіб, у яких не порушені системи репарації, ці клітини елімінуються.

Для дослідження можливої модифікації цитогенетичного ефекту в лімфоцитах периферичної крові у осіб з обстежених нами груп in vitro в якості модельних індукторов було обрано 2 прямі мутагени - диметоат (в найменшій концентрації, в якій було виявлено достовірне підвищення частоти аберації хромосом - 0,025 мкг/мл) та мітоміцин С (у концентрації, в якій він використовувався як позитивний контроль – 10 мкг/мл) (рис. 2).

Рис. 2. Частота аберацій хромосом в культурі лімфоцитів периферичної крові у осіб з обстежених груп при дії модельних мутагенів мітоміцину С та диметоату in vitro

Як видно з рис.2, середньогрупова частота метафаз з хромосомними абераціями при дії диметоату була достовірно вища у всіх обстежених групах порівняно з інтактними культурами і становила: у здорових осіб – 8,20,8 %, у хворих без онкопатології – 6,70,7 %, у хворих на доброякісні гліоми 7,21,4 %, у хворих на злоякісні гліоми 6,90,7 %, але різниця поміж групами виявилася статистично недостовірною.

Середньогрупова частота аберантних метафаз при дії мітоміцину С також була достовірно вища у всіх обстежених групах порівняно з інтактними культурами і становила: у здорових осіб - 13,90,88 %, у хворих без онкопатології - 12,10,7 %, у хворих на доброякісні гліоми -11,01,4 %, у хворих на злоякісні гліоми - 9,90,75 %. В двох останніх групах частота метафаз з абераціями була достовірно нижча за показники в контрольній групі.

В результаті проведених досліджень встановлено, що середньогрупова частота анеуплоїдних клітин у ЛПК осіб при дії модельних мутагенів (і мітоміцину С і диметоату) не відрізнялась від середньогрупової частоти без впливу препаратів.

В таблиці 7 наведено дані щодо надспонтаного рівня та діапазону коливань частоти аберантних метафаз при дії модельних мутагенів. Надспонтаним рівнем вважали різницю між частотою аберантних метафаз при дії мутагену та їх спонтанною частотою (без мутагенного впливу).

Середньогруповий надспонтанний рівень аберантних метафаз під впливом обох модельних мутагенів зменшувався із зростанням ступеню злоякісності гліом (табл. 7), що може бути пов’язано як із зниженням чутливості хромосомного апарату соматичних клітин у онкопацієнтів до генотоксичної дії, так і з елімінацією аберантних клітин.

В усіх обстежених групах надспонтанний рівень аберантних метафаз був майже в два рази вищий при дії мітоміцину С, ніж при дії диметоату, і знижувався від 12,22 % до 5,44% та від 6,52 % до 2,44%, відповідно, тобто реакція хромосомного апарату лімфоцитів на додаткове мутагенне навантаження була односпрямована.

Таблиця 7.

Середньогрупова надспонтанна частота аберантних метафаз в обстежених групах при дії модельних мутагенів in vitro, %

Групи обстежених | Показники при дії

диметоату | мітоміцину С

Надспонтанні рівні | Діапазон коливань | Надспонтанні рівні | Діапазон коливань

Здорові особи | 6,5 | 7,0 – 10,0 | 12,2 | 12,0 – 16,0

Хво-рі | без новоутворень | 4,1 | 4,7 – 8,0 | 9,5 | 10,0 – 14,0

на доброякісні гліоми | 3,8 | 5,3 – 9,3 | 7,6 | 10,0 – 12,0

на злоякісні гліоми | 2,4 | 5,0 – 9,0 | 5,4 | 7,1 – 14,0

Як видно з даних, наведених в табл. 8, частота МАК при дії мітоміцину С складала: у контрольній групі (здорові особи) - 33,03,2 %, у хворих без онкопатології - 29,53,1 %, у хворих на доброякісні гліоми - 23,35,4 % і була достовірно вищою за частоту МАК без впливу мутагену. У хворих на злоякісні пухлини частота МАК дорівнювала 11,32,5 % і не відрізнялась від такої без впливу мутагену (11,4 2,3).

При дії диметоату частота МАК складала: у контрольній групі (здорові особи) - 10,93,4 %, у хворих без онкопатології - 16,74,1 % і була достовірно вищою за частоту МАК без впливу пестициду. У хворих на доброякісні гліоми частота МАК дорівнювала 8,75,8 %, у хворих на злоякісні пухлини - 11,32,5 %, що достовірно не відрізнялось від частоти МАК без впливу мутагену.

У хворих на злоякісні гліоми частота МАК у лімфоцитах периферичної крові при дії in vitro як мітоміцину С, так і диметоату знаходилась на однаковому рівні, що свідчить про ідентичну відповідь хромосомного апарату лімфоцитів периферичної крові на дію обох модельних мутагенів, незважаючи на різні механізми їх генотоксичної дії.

Таблиця 8

Середньогрупова частота мультиаберантних клітин при дії мітоміцину С та диметоату в обстежених групах

Групи обстежених | Частота МАК, % | Кількість обстежених

Без впливу | З мітомі-цином С | З димето-атом | При дії мітоміцину С | При дії диметоату

Усього | У яких знайдені МАК | Усього | У яких знайдені МАК

n | % | n | %

Здорові особи | 1,61,0 | 33,0+3,2 | 10,9+3,4 | 20 | 19 | 95,0 | 10 | 8 | 80,0

Хворі | без новоутворень | 6,61,9 | 29,5+3,1 | 16,7+4,1 | 18 | 18 | 100 | 13 | 10 | 77,0

на доброякісні гліоми | 6,31,4 | 23,3+5,4 | 8,7+5,8 | 6 | 6 | 100 | 4 | 2 | 50,0

на злоякісні гліоми | 11,42,3 | 11,3+2,5 | 9,4+3,2 | 18 | 12 | 66,7 | 13 | 6 | 46,0

Таким чином, із зростанням ступеню злоякісності пухлин зменшувалась чутливість лімфоцитів периферичної крові обстежених осіб до додаткового мутагенного навантаження – не тільки за частотою аберантних метафаз, але і за тестом МАК.

Кількість обстежених осіб, у яких було виявлено МАК при дії модельних мутагенів, також зменшувалась із зростанням злоякісності гліом.

Можливо, у онкохворих виникають такі зміни геному, які не сумісні з нормальним функціонуванням клітин, і, як слідство, більша частка пошкоджених клітин елімінується.

Як відомо, ступінь генетичних змін в клітинах людини залежить від взаємодії екзо- та ендогенних факторів. До ендогенних чинників, які могли мати вплив на стабільність хромосомного апарату людини, можна віднести хлоровмісні