КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

БАРДАХІВСЬКА Квітослава Ігорівна

УДК 615.37:615.246.2:616-097

РОЗРОБКА ТА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ВИВЧЕННЯ ВЛАСТИВОСТЕЙ ВУГЛЕЦЕВИХ ДНК-ВМІСНИХ ІМУНОСОРБЕНТІВ З ПІДВИЩЕНОЮ ПОТУЖНІСТЮ

03.00.09 – Імунологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології

ім. Р.Є.Кавецького НАН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Ніколаєв Володимир Григорович,

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології

ім. Р.Є.Кавецького НАН України, завідувач відділом фізико-

хімічних механізмів сорбційної детоксикації

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Холодна Лідія Степанівна,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

професор кафедри мікробіології та загальної імунології

біологічного факультету

доктор медичних наук, професор, член-кореспондент АМН

України Чернушенко Катерина Федорівна, Інститут

фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г.Яновського АМН України,

завідувач лабораторії імунології

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця МОЗ

України, м.Київ

Захист дисертації відбудеться „24” січня 2006 р. о 16.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка, за адресою:

03127, м.Київ, проспект академіка Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд_____

Поштова адреса: 01033, м.Київ, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий „19” грудня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

к.б.н., доцент _______________Молчанець О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За останні десятиріччя помітно зросла кількість аутоімунних захворювань та патологій з аутоімунним компонентом: системного червоного вовчака (СЧВ), ревматоїдного артриту, псоріазу та псоріатичних артропатій, синдрому Шегрена, аутоімунних гепатитів та інших, які залишаються однією із найбільш складних проблем клінічної імунології (Дранник Г.Н., 2003; Фаворова О.О., 1998; Jacobson D.L. et al., 1997; Sinha A.A. et al., 1990).

Використання біоспецифічних сорбентів стає все більш розповсюдженим методом у комплексному лікуванні цих захворювань як у зв’язку з високою ефективністю, так і безпечністю їх застосування (Bosch T., 2003; Braun N., 2000; Gao C.L. et al., 1995; Howe R.B. et al., 1994; Julius U. et al., 1997; Levy J. et al., 2003; Nakaji S., 2001; Snyder H.W.Jr. et al., 1989). Синтезована велика кількість імуносорбентів, які здатні вилучати із крові конкретні білки, пептиди, ліпіди та їх похідні ( Nakaji S., 2001).

Окрему групу біоспецифічних селективних імуносорбентів складають ДНК-вмісні сорбенти, які вибірково вилучають з крові анти-ДНК антитіла, антитіла проти кардіоліпіну, циркулюючі імунні комплекси (ЦІК) при станах, пов’язаних з гіперпродукцією та нагромадженням цих речовин ( Амосова Е.Н. и др., 1997; Захараш М.П. и др., 1998; Li G. et al., 2002; Terman D.S. et al., 1977; Yang Y. et al., 1988). Крім цього, доведено, що вилучення антитіл із циркуляції не посилює їх синтез (Goldammer A. et al., 2002). На відміну від існуючих імуносорбентів, де для вилучення із плазми крові антитіл, компонентів комплементу, імунних комплексів тощо використовуються лише властивості іммобілізованого ліганду, синтезовані ДНК-вмісні імуносорбенти з підвищеною потужністю поєднують властивості вуглецевих матриць та ДНК. Така комбінація дозволяє використовувати їх для вилучення з плазми крові хворих не тільки анти-ДНК антитіл, а і білок-зв’язаних токсинів, речовин „середньої” молекулярної маси, прозапальних цитокінів.

Актуальним є також пошук методів поглиблення очистки плазми крові від анти-ДНК антитіл різної специфічності за рахунок розщеплення відповідних імунних комплексів.

Все це разом дасть змогу створити нову перспективну систему для екстракорпоральної терапії як аутоімунних захворювань, так і синдрому системної запальної реакції та інших станів, пов’язаних з гіперпродукцією прозапальних цитокінів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Проведені дослідження є фрагментом науково-дослідних робіт Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України за темами: “Теоретичні аспекти вилучення білок-зв’язаних та ДНК-тропних речовин з плазми крові пацієнтів з печінковою недостатністю та деякими імунозалежними захворюваннями” (державна реєстрація №0100U000698, строки виконання 2000-2002 рр.) і “Розробка та експериментальна оцінка нових гемо-, плазмоімуносорбентів на основі суперактивних вуглецевих матриць” (державна реєстрація №0103U000789, строки виконання 2003-2005 рр.).

Мета і завдання досліджень. Мета роботи: синтез нового покоління ДНК-вмісних імуносорбентів на основі високодисперсних, волокнистих та високопористих гранульованих вуглецевих матриць та оцінка їх специфічних та неспецифічних сорбційних властивостей.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися наступні завдання:

Синтезувати і оцінити специфічні та неспецифічні сорбційні властивості ДНК-вмісних імуносорбентів на основі високодисперсних, волокнистих і високоактивних гранульованих вуглецевих матриць.

Визначити концентрації антитіл проти нативної ДНК, денатурованої ДНК та ДНК-протеїнових комплексів, використовуючи метод твердофазного неконкурентного імуноферментного аналізу, в сироватках крові здорових донорів і хворих на деякі аутоімунні захворювання.

Дослідити вплив дилюції на ступінь адсорбції анти-ДНК антитіл.

Визначити властивості синтезованого високоактивного гранульованого імуносорбенту щодо вилучення прозапальних цитокінів.

Об’єкт дослідження: синтезовані ДНК-вмісні імуносорбенти на основі високодисперсних, волокнистих та високопористих гранульованих вуглецевих матриць, сироватка та плазма крові хворих та здорових донорів, модельні білок-вмісні суміші.

Предмет дослідження: специфічні та неспецифічні сорбційні властивості синтезованих ДНК-вмісних імуносорбентів з підвищеною потужністю.

Методи досліджень. Імунологічні – для визначення рівнів анти-ДНК антитіл різної специфічності та прозапальних цитокінів методом твердофазного імуно-ферментного аналізу. Спектрофотометричні методи використовувалися для визначення неспецифічних сорбційних властивостей непокритих та покритих ДНК сорбентів та циркулюючих імунних комплексів в сироватці крові. Достовірність отриманих результатів досліджувалася статистичними методами з використанням t-критерію Стьюдента.

Наукова новизна одержаних результатів. Синтезоване нове покоління ДНК-вмісних вуглецевих сорбентів з підвищеною потужністю на основі високодисперсних, волокнистих і високопористих гранульованих вуглецевих матриць. Проведено вивчення властивостей одержаних сорбентів щодо вилучення анти-ДНК антитіл різної специфічності, білок-зв’язаних метаболітів, речовин “середньої” молекулярної маси, а також прозапальних цитокінів. Встановлений нелінійний характер відповіді концентрацій анти-ДНК антитіл на послідовні розведення сироваток або плазми крові хворих. Визначений вплив дилюції на ступінь адсорбції анти-ДНК антитіл.

Практичне значення одержаних результатів. Синтезовані ДНК-вмісні сорбенти на основі високодисперсних і високопористих вуглецевих матриць можуть використовуватися для лікування цілої ланки аутоімунних захворювань та патологій з аутоімунним компонентом. Комбінація ДНК-покриття і суперактивних вуглецевих матриць дає можливість ефективно вилучати із плазми крові як білок-зв’язані речовини, так і анти-ДНК антитіла, а також прозапальні цитокіни при станах, пов’язаних із розвитком синдрому системної запальної реакції.

Використання методу регіонарної гемодилюції дозволяє більш глибоко очищати плазму крові хворих від анти-ДНК антитіл за рахунок дисоціації відповідних імунних комплексів.

Особистий внесок здобувача. При виконанні дисертаційної роботи здобувачем була зібрана та проаналізована література за темою дисертації, самостійно проведений синтез нового покоління ДНК-вмісних імуносорбентів на основі високодисперсних, волокнистих і високопористих гранульованих вуглецевих матриць та визначені їх специфічні та неспецифічні сорбційні властивості, використовуючи спектрофотометричні та імунологічні методи досліджень. Самостійно досліджені рівні анти-ДНК антитіл у сироватці та плазмі крові здорових донорів та хворих. Проведена статистична обробка, узагальнення результатів досліджень, формулювання основних положень та висновків роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи були представлені на 6-му Національному конгресі “Человек и лекарство”, Москва, 1999; на Міжнародному семінарі “Ендоекологія 2000”, Київ, 2000; на науково-практичній конференції “Проблеми онкоімунології: наукові та прикладні аспекти”, Київ, 2003 та на двох міжнародних конгресах – 13-му Всесвітньому Конгресі Міжнародного товариства з штучних органів, Осака, Японія, 2001 і 9-му Конгресі Всесвітньої Асоціації з аферезу, Париж, Франція, 2002.

За матеріалами роботи була проведена доповідь на науковому семінарі у відділенні фармації та біомолекулярних наук в Університеті Брайтона, м. Брайтон, Великобританія, 2002.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових робіт, із них 6 статей та 8 тез доповідей.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 128 сторінках друкованого тексту та складається з вступу, аналітичного огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, 4 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків та додатку А. Робота ілюстрована 23 таблицями і 18 рисунками. Список використаних джерел містить 261 найменувань: 39-кирилицею і 222 - латиницею.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Розділ дисертації, в якому наведено огляд літератури, складається із 5 основних підрозділів, у яких на підставі перегляду робіт вітчизняних та зарубіжних авторів висвітлені сучасні відомості про значення анти-ДНК антитіл та прозапальних цитокінів при аутоімунних захворюваннях та станах, пов’язаних із розвитком синдрому системної запальної реакції. Оглянуто використання неспецифічних та біоспецифічних, зокрема, ДНК-вмісних сорбентів, для екстракорпоральної терапії аутоімунних захворювань. Показано значення імуносорбції як самостійного методу, так і методу в комплексному лікуванні аутоімунних захворювань та патологій з аутоімунним компонентом.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Характеристики матеріалів, що використовувалися для синтезу ДНК-вмісних імуносорбентів.

Для іммобілізації ДНК використовувалися високодисперсні, волокнисті та високопористі гранульовані вуглецеві адсорбенти.

Високодисперсний вуглецевий сорбент марки Norit A Supra являв собою порошок чорного кольору з розміром частинок 10-25 мкм і насипною масою 0,295 г/см3.

Волокнисті вуглецеві сорбенти марки АУВМ використовувалися 2 типів: 1 – мікроволокна з розміром 8x7x50 мкм і насипною масою 0,223 г/см3 та 2 – волокна довжиною 4-7 мм і насипною масою 0,07-0,09 г/см3.

Високопористі вуглецеві гранульовані сорбенти марки ГСГД мали насипну масу від 0,06 до 0,19 г/см3.

Для порівняння сорбційних властивостей застосовувалися також сорбенти марки СКН з насипною масою 0,4 г/см3 та Adsorba (“Gambra Medical”, Швеція) з насипною масою 0,51 г/см3.

Для іммобілізації використовувалася нативна ДНК з тимусу телят (нДНК) фірми “Sigma” (США) з молекулярною масою 9 млн. Дальтон. Денатуровану ДНК (дДНК) отримували шляхом нагрівання нативної ДНК до 1000 С протягом 30 хвилин в присутності формальдегіду з подальшим її швидким охолодженням на льоду, або використовували дДНК фірми “Sigma” (США). В окремих дослідах для порівняння властивостей ДНК в залежності від джерела їх одержання для іммобілізації застосовувалася ДНК з молочок оселедця (“Sigma”, США).

Оцінка ефективності зв’язування ДНК з вуглецевою матрицею

Ефективність іммобілізаціі ліганду оцінювали за десорбцією ДНК із дослідних зразків у надосадову рідину після їх інкубації з фізіологічним розчином або дистильованою водою при струшуванні протягом 6 годин. Проби, які містили імуносорбенти на основі високодисперсних і волокнистих вуглецевих матриць, центрифугували при 3 - 8 тисяч об./хв. протягом 15-20 хвилин. та пропускали через фільтри Millipore 0,45 (“Millipore Corp.”, США). Вміст ДНК в надосадовій рідині визначали за методом Спіріна А.С. (1958).

Визначення вмісту анти-ДНК антитіл в сироватці та плазмі крові.

Обстежено 163 хворого на аутоімунні захворювання та 14 хворих пострадіаційною нейросоматичною поліпатією віком від 25 до 65 років. Серед хворих на аутоімунні захворювання було: 93 особи з системним червоним вовчаком (СЧВ), 13 – з псоріазом, 30 – з псоріатичною артропатією, 10 – з ревматоїдним артритом, 15 – з хронічним аутоімунним гепатитом. Діагнози хворих визначені на основі комплексу клінічних та лабораторних критеріїв. Контрольна група – аналогічна основним за віком та статтю – становила 22 клінічно здорових донорів.

Рівень антитіл проти нДНК, дДНК та ДНК-протеїнового комплексу (ДНП) в сироватці або плазмі крові хворих та донорів визначали методом твердофазного неконкурентного імуноферментного аналізу (Цебецауер Л., 1984, 1988)

Оцінка неспецифічних та специфічних властивостей синтезованих імуносорбентів

Неспецифічні поглинальні властивості адсорбентів вивчали в експериментах по кінетиці адсорбції маркерних сполук – з буферного розчину креатиніну (113 Да) та водного розчину вітаміну В12 (1355 Да). Початкові концентрації були: для креатиніну – 0,3 мг/мл; для вітаміну В12 – 1 мг/мл. Рівноваги досягали в статичних умовах протягом 1 години, при температурі 25оС та співвідношенні сорбент:розчин = 50 мг : 10 мл. Концентрацію сорбатів в розчині визначали на спектрофотометрі СФ-26 при довжинах хвиль 235 та 296 нм відповідно для креатиніну та вітаміну В12. Об’єм сорбційних пор вугілля визначали ексікаторним методом за бензолом, а питому площу поверхні пор - за методом теплової десорбції азоту (Бакалинская О.Н. и др., 1988).

Кольоровість та мутність суспензій непокритих та покритих ДНК високодисперсних вуглецевих сорбентів визначалася фотометрично порівнянням проб з дистильованою водою. Вимірювали оптичну густину на ФЕК при довжинах хвиль 340 нм та 540 нм відповідно для визначення кольоровості і мутності в кюветах з товщиною шару 10мм. Значення кольоровості виражали в градусах, а мутності – в мг/дм3 (ГОСТ 3351-74).

Запиленість непокритих та покритих нативною тимусною ДНК вуглецевих сорбентів на основі Norit A Supra і мікроволокон АУВМ вивчали в стандартних тестах вимірюванням оптичної густини надосадових рідин при довжині хвилі 630 нм на спектрофотометрі СФ-26. В якості контролю використовували дистильовану воду (ТУ 88 УССР 107.002-91).

Концентрацію загального білка у розчинах вимірювали загальноприйнятим біуретовим методом на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 540 нм.

При проведенні мікроколонкових експериментів використовували активну плазму хворих на СЧВ, псоріатичну артропатію та із синдромом Шегрена з підвищеними рівнями анти-ДНК антитіл (анти-нДНК, анти-дДНК, анти-ДНП антитіл), колонки об’ємом 2,5 см3 та перистальтичний багатоканальний насос LKB (Швеція).

Для визначення ЦІК в сироватці крові використовували метод Haskova V.(1977) з поліетиленгліколем (ПЕГ-6000, “Sigma”, США)

Для дослідження використовували прозапальні цитокіни ІЛ-1в, ІЛ-6 та ФНП-б фірми "R&D Systems" (США): rh Il-1в Interleukin 1 beta recombinant human (E.coli derived), rh Il-6 Interleukin 6 recombinant human (E.coli derived), rh TNFб Tumor Necrosis Factor alpha recombinant human (E.coli derived). Суміш цитокінів ІЛ-1в, ІЛ-6 та ФНП-б по 1000 пкг/мл в 3% розчині бичого сироваткового альбуміну ("Sigma", США) приводили в контакт з адсорбентами в мікроколонкових експериментах (об’єм колонок 2,5 см3, швидкість перфузії 0,2 мл/хв., об’єм перфузованого розчину цитокінів по 12,5 мл на колонку). Концентрацію цитокінів ІЛ-1в, ІЛ-6 та ФНП-б до та після перфузії визначали за допомогою стандартних наборів для імуноферментного аналізу ("Diaclone Research", Франція). Оптичну густину вимірювали при довжині хвилі 450 нм на спектрофотометрі “Multiscan Plus MK 11” (Великобританія).

Статистичну обробку результатів проводили з використанням програми "Microsoft Excel": розраховували середнє арифметичне (М), середню квадратичну похибку (m). Вірогідність відмінностей визначали за t-критерієм Ст’юдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Синтез вуглецевих ДНК-вмісних імуносорбентів

Покращення ефективності сорбційних систем досягається кількома способами, а саме, зменшенням розмірів сорбційних елементів, підвищенням пористості вуглецевої матриці або збільшенням кількості іммобілізованої ДНК. Для синтезу ДНК-вмісних імуносорбентів з підвищеною потужністю використовували високодисперсні, волокнисті та високопористі гранульовані вуглецеві матриці.

Кількість іммобілізованої ДНК з тимусу теляти становила від 1 до 64 мг на 1 г сорбентів. Слід відзначити, що для синтезу імуносорбентів можливе використання ДНК з інших джерел, зокрема, з молочок оселедця, що може значно зменшити вартість матеріалу при одночасному повному збереженні специфічних сорбційних властивостей синтезованих сорбентів щодо вилучення анти-нДНК, анти-дДНК та анти-ДНП антитіл.

Іммобілізацію ДНК проводили шляхом її адсорбції з водного розчину на поверхню вуглецевих матриць з подальшим висушуванням дослідних зразків у термостаті при 600С протягом 24 годин. Після інкубації отриманих сорбентів з фізіологічним розчином при кімнатній температурі протягом 6 годин спостерігалася десорбція ДНК в надосадову рідину, причому десорбція ДНК зростала із збільшенням адсорбованої на поверхні вуглецевих матриць ДНК. В зв’язку з цим, для отримання імуносорбентів з міцно зв’язаним біолігандом необхідна додаткова фіксація ДНК. З цією метою використовуються різноманітні фізичні або хімічні ініціатори. Застосування методу ультрафіолетового опромінення імуносорбентів в присутності 960 етиловому спирті протягом 30 хвилин давало можливість додатково фіксувати ДНК на поверхні вуглецевих матриць. Відсутність десорбції ДНК в надосадову рідину після інкубації імуносорбентів з фізіологічним розчином свідчила про міцність іммобілізації ДНК.

При електронному скануванні поверхні непокритих та покритих ДНК вуглецевих волокон було показано, з одного боку, гомогенність покриття сорбенту шаром ДНК, а з другого боку, те, що ДНК тільки частково покривала вхід в макропори на поверхні вуглецевого матеріалу (рис.1). Цим, імовірно, і обумовлено збереження неспецифічних властивостей високоактивних вуглецевих матриць поряд із специфічними сорбційними властивостями синтезованих імуносорбентів.

АУВМ+ДНК АУВМ

Рис.1 Зображення поверхні непокритих та покритих ДНК вуглецевих волокон

Вміст анти-ДНК антитіл та ЦІК в сироватці крові хворих та здорових донорів

В патогенезі багатьох аутоімунних захворювань значну роль відіграють антитіла проти ДНК, які вважаються надійними маркерами хвороби і часто виявляються ще до розвитку клінічних проявів імунопатологічного процесу. Було проведено дослідження вмісту анти-ДНК антитіл у сироватках пацієнтів (рис.2). Ступінь розведення сироваток становила 1:100, 1:200, 1:400, оскільки саме рівень виявлених антитіл при розведенні 1:120 і вище прийнято вважати позитивним. При цьому у хворих всіх досліджених груп в тій чи іншій мірі були виявлені підвищені концентрації всіх трьох типів анти-ДНК антитіл.

1 – здорові донори 5 – ревматоїдний артрит

2 – СЧВ 6 – хронічний аутоімунний гепатит

3 – псоріаз (шкірні форми) 7 – пострадіаційна нейросоматична поліпатія

4 – псоріатична артропатія

Рис.2 Вміст анти-ДНК антитіл в сироватці крові

Крім цього, при послідовному розведенні сироваток крові хворих в 100, 200 та 400 разів в усіх випадках спостерігався нелінійний характер відповіді концентрацій анти-ДНК антитіл, тобто, рівень цих концентрацій знижувався в меншому ступені, ніж цього можна було чекати, виходячи з пропорційної моделі дилюції. В той же час, в контрольній групі здорових донорів спостерігалася чітка лінійна залежність концентрацій анти-ДНК антитіл від ступеню розведення сироваток. Отримані дані вказують на те, що певна частина анти-ДНК антитіл в сироватці хворих, можливо, перебуває не у вільній розчинній формі, а у складі відповідних імунних комплексів, які здатні досить легко дисоціювати.

В сироватках хворих на системний червоний вовчак та псоріатичну артропатію визначалися концентрації циркулюючих імунних комплексів шляхом селективної преципітації імунних комплексів в ПЕГ-6000 (рис.3).

1 – здорові донори

2 – СЧВ

3 – псоріатична артропатія

Рис.3 Преципітація ЦІК в ПЕГ-6000 (ум.од.екст.)

При використанні 4,166% ПЕГ-6000 в боратному буфері рівні ЦІК у хворих в 4,3 рази перевищували такі значення у здорових донорів, а при 7,2% ПЕГ-6000 – в 1,8 разів.

Із отриманих даних можна припустити, що певна частина ЦІК містять саме анти-ДНК антитіла, які легко дисоціюють при розведенні, що і обумовлює нелінійність розведень сироваток.

Слід відзначити, що різниця між рівнями анти-ДНК антитіл в сироватці та плазмі крові хворих не спостерігалася. Такі дані були отримані на прикладі хворих на СЧВ та псоріатичну артропатію.

Оцінка специфічних сорбційних властивостей синтезованих імуносорбентів

Вилучення анти-ДНК антитіл з плазми крові

При збільшенні кількості іммобілізованої ДНК на поверхні високодисперсних вуглецевих сорбентів їх неспецифічна сорбційна ємність щодо вітаміну В12 та креатиніну помітно зменшувалася. При цьому, збільшення кількості ДНК вдвічі давало лише 5-7% додаткову адсорбцію антитіл при вивченні специфічних сорбційних властивостей. Це свідчить про недоцільність використання значних кількостей ДНК для іммобілізації.

В результаті проведених досліджень по порівнянню неспецифічних та специфічних сорбційних властивостей ДНК-вмісних імуносорбентів на основі високодисперсних та волокнистих вуглецевих матриць було показано, що волокнисті ДНК-вмісні сорбенти дещо краще зберігають властивості вуглецевої матриці щодо адсорбції маркерних сполук із водних та буферних розчинів.

Водночас, в експериментах з плазмою крові хворих на СЧВ було виявлено, що для 50% зниження рівнів анти-ДНК антитіл сорбентів на основі волокон АУВМ необхідно в 5-7 разів менше, ніж на основі порошкового активованого вугілля Norit A Supra. Можна припустити, що це пов’язано з кращими структурно-сорбційними параметрами волокон АУВМ, а також їх більшою сумарною зовнішньою поверхнею.

При визначенні ефективності різноманітних імуносорбентів у відношенні видалення анти-ДНК антитіл зазвичай використовується плазма крові хворих на СЧВ. Це пов’язано з тим, що анти-ДНК антитіла були вперше виявлені саме в сироватці крові хворих на СЧВ, їх високими рівнями при цьому захворюванні, а також з тим, що анти-нДНК антитіла є високоспецифічними для СЧВ і беруть участь в патогенезі найбільш серйозного ускладнення СЧВ – вовчакового нефриту. В наших дослідженнях використовувалася плазма крові хворих не тільки на СЧВ, але і з псоріатичною артропатією та із синдромом Шегрена. В мікроколонкових експериментах була показана ефективність використання ДНК-вмісних вуглецевих імуносорбентів з підвищеною потужністю щодо вилучення анти-ДНК антитіл із плазми крові незалежно від форми аутоімунного захворювання. Отримані дані вказують на перспективність застосування нового покоління імуносорбентів не тільки у хворих на СЧВ, а і при будь-яких станах, пов’язаних з гіперпродукцією та нагромадженням анти-ДНК антитіл.

Показано також, що із збільшенням пористості вуглецевих матриць різниця у показниках неспецифічної сорбції маркерних сполук між непокритими та покритими ДНК сорбентами зменшувалася. Покриття мас-фрактального пірополімеру ГСГД нативною тимусною ДНК практично не впливало на ступінь адсорбції з модельних розчинів маркерних сполук малої та середньої молекулярної маси, а саме, креатиніну та вітаміну В12. Це свідчить про те, що із збільшенням пористості вуглецеві сорбенти стають „нечутливими” до присутності на їх поверхні біоліганду, що дає можливість використовувати синтезовані комбіновані сорбенти як для специфічної адсорбції анти-ДНК антитіл, так і для неспецифічної сорбції білок-зв’язаних токсинів.

Вплив дилюції на ступінь адсорбції антитіл.

Актуальним був також пошук методів поглиблення очистки плазми крові хворих на аутоімунні захворювання та пострадіаційну нейросоматичну поліпатію від анти-ДНК антитіл. Зокрема, в мікроколонкових дослідах було показано, що перфузія плазми крові протягом 60 хвилин не вичерпує ємність ДНК-вмісних сорбентів на основі високопористих гранульованих матриць щодо вилучення анти-ДНК антитіл (Табл.1) . Додаткова рециркуляція плазми протягом 60 хвилин дозволяє збільшувати адсорбцію цих речовин на 8-10%, а 120-хвилинна рециркуляція – всього на 1-2% в порівнянні з 60-хвилинною. Таким чином, для покращення адсорбції анти-ДНК антитіл з плазми крові в рециркуляційних системах оптимальним можна вважати проведення додаткової рециркуляції плазми протягом 60 хвилин.

Таблиця 1

Адсорбція анти-ДНК антитіл з плазми крові високопористими ДНК-вмісними імуносорбентами (%)

Умови перфузії плазми анти-нДНК антитіла анти-дДНК антитіла анти-ДНП антитіла

60 хвилин 49,9±2,18 34,7±0,59 37,6±0,26

Рециркуляція, 60 хв. 57,8±2,33* 46,0 ±0,95* 46,0±2,36

Рециркуляція, 120 хв. 59,5±0,75* 47,25±0,50* 47,7±0,75*

Примітка: * - p < 0,05 ( у порівнянні із даними при перфузії протягом 60 хвилин).

На основі нелінійної відповіді при послідовних розведеннях сироваток хворих було зроблено припущення, що певна частина анти-ДНК антитіл знаходиться не у вільній розчинній формі, а у складі відповідних імунних комплексів, які легко дисоціюють при розведенні. Цей факт може мати практичне значення, а саме, для використання такого підходу як регіонарна гемодилюція у комплексі екстракорпоральних терапевтичних заходів для більш ефективного вилучення патогенних анти-ДНК антитіл із циркуляції при тому чи іншому аутоімунному захворюванні. В мікроколонкових експериментах було показано, що дилюція, тобто розведення плазми, в 2-5 разів перед перфузією дозволяє знизити рівні анти-ДНК антитіл на 10-15% більше у порівнянні з нерозведеною плазмою хворих на СЧВ, псоріатичну артропатію та із синдромом Шегрена (Табл.2). Метод випробуваний в клініці у хворих з пострадіаційною нейросоматичною поліпатією, що приводило до зниження системної концентрації анти-ДНК антитіл на 58-65%.

Таблиця 2

Адсорбція анти-ДНК антитіл з нерозведеної та розведеної плазми крові високопористими ДНК-вмісними імуносорбентами (%)

Ступінь розведення плазми крові анти-нДНК антитіла анти-дДНК антитіла анти-ДНП антитіла

Нерозведена 49,9±2,18 34,7±0,59 37,6±0,26

Розведена в 2 рази 54,0±1,25 50,5 ±2,20* 50,8±0,70*

Розведена в 5 разів 59,8±1,85* 52,20±1,40* 53,6±0,42*

Примітка: * - p < 0,05 ( у порівнянні із даними при перфузії нерозведеної плазми).

Видалення прозапальних цитокінів з модельних розчинів

Останнім часом все більший інтерес викликає вивчення ролі цитокінів при різноманітних аутоімунних захворюваннях та запальних реакціях, оскільки порушення балансу в системі цитокінів – важливий механізм розвитку багатьох патологічних процесів. Для зниження концентрації прозапальних цитокінів зокрема, ФНПб та ІЛ-1, використовуються відповідні розчинні рецептори та блокуючі антитіла, які здатні зв’язувати ці цитокіни. Застосування препаратів на основі блокуючих антитіл та розчинних рецепторів ФНПб є популярним методом лікування багатьох аутоімунних та запальних захворювань. Проте, застосування ФНП-б-нейтралізуючої терапії може приводити до виникнення ланки серйозних ускладнень, а саме, активації латентного туберкульозу, пневмоцистної пневмонії, кандидозів та інших інфекцій. В зв'язку з цим, можливо, більш ефективним і безпечним методом лікування може бути не блокування цитокінів, а їх вилучення з циркуляції.

Однією із задач досліджень було визначити властивості синтезованих ДНК-вмісних сорбентів на основі гранульованих високопористих вуглецевих матриць у відношенні вилучення прозапальних цитокінів ФНПб, ІЛ-1в та ІЛ-6 з модельних білкових розчинів. В мікроколонкових експериментах було показано, що вуглецеві

мас-фрактальні сорбенти ГСГД є ефективним засобом для вилучення прозапальних цитокінів. Покриття їх поверхні нативною тимусною ДНК не тільки не зменшує, але і суттєво збільшує поглинання цих речовин комбінованим сорбентом. При перерахунку цих показників у нанограми на 1 г вуглецевих сорбентів було виявлено, що сорбент ГСГД поглинав значну кількість не тільки прозапальних цитокінів, але і загального білка. ДНК-покриття приводило до зменшення адсорбції загального білка більше, ніж у 1,5 рази і при цьому збільшувало поглинання прозапальних цитокінів (табл.3).

Таблиця 3

Сорбція прозапальних цитокінів та загального білка вуглецевими адсорбентами ( Mm)

Адсорбент ІЛ-6,

нг/г сорбента ІЛ-1 в,

нг/г сорбента ФНП-б,

нг/г сорбента Загальний білок,

мг/г сорбента

Adsorba® 0,41±0,08 0,06±0,02 2,78±0,30 0,50±0,15

СКН 5,09±0,50* 4,10±0,45* 2,98±0,25 12,00±1,15*

ГСГД 42,89±0,55* 44,51±0,40* 42,22±0,60* 169,14±3,45*

ГСГД+ДНК 45,04±0,65* 45,69±0,35* 44,74±0,55* 96,00±2,78*

Примітка: * - p < 0,001 ( у порівнянні із сорбентом Adsorba®)

Таким чином, цілком імовірно, що синтезовані ДНК-вмісні вуглецеві імуносорбенти з підвищеною потужністю, отримані за рахунок комбінації ДНК-покриття та суперактивних вуглецевих матриць, можуть ефективно використовуватися для екстракорпоральної терапії не тільки аутоімунних захворювань, а і синдрому системної запальної реакції та інших станів, пов’язаних з гіперпродукцією прозапальних цитокінів.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення аспектів проблеми створення нових ефективних засобів та методів, що можуть використовуватися при лікуванні як аутоімунних захворювань, так і сидрому системної запальної реакції та інших станів, пов’язаних з гіперпродукцією прозапальних цитокінів.

Синтезовані ДНК-вмісні імуносорбенти з підвищеною потужністю

поєднують властивості вуглецевих матриць та ДНК, що дозволяє їх використовувати для вилучення з плазми крові хворих не тільки анти-ДНК антитіла, а і білок-зв’язані метаболіти, речовини „середньої” молекулярної маси, прозапальні цитокіни.

Для синтезу імуносорбентів можливе використання ДНК не тільки з

тимусу телят, а і з інших джерел, наприклад, з молочок оселедця, що може значно зменшити вартість матеріалу при одночасному збереженні специфічних сорбційних властивостей сорбентів щодо вилучення анти-ДНК антитіл.

Встановлено недоцільність використання значних кількостей ДНК для

іммобілізації на вуглецевих матрицях.

У хворих на аутоімунні захворювання та пострадіаційну нейросоматичну

поліпатію виявлені не тільки підвищені концентрації анти-ДНК антитіл, а і нелінійний характер відповіді концентрацій анти-ДНК антитіл при послідовних розведеннях, що вказує на те, що певна частина анти-ДНК антитіл знаходиться не у вільній розчинній формі, а у складі відповідних імунних комплексів, які здатні досить легко дисоціювати.

ДНК-вмісні імуносорбенти з підвищеною потужністю виявляють високу

ефективність щодо вилучення антитіл проти ДНК із плазми крові хворих на різні аутоімунні захворювання, що вказує на перспективність їх застосування при будь-яких станах, пов’язаних із гіперпродукцією та нагромадженням анти-ДНК антитіл.

Із збільшенням пористості вуглецевих матриць різниця у показниках

неспецифічної сорбції маркерних сполук між непокритими та покритими ДНК сорбентами значно зменшується, тобто вони стають „нечутливими” до присутності на їх поверхні біоліганду.

Для поглиблення очистки плазми крові хворих від анти-ДНК

антитіл доцільно використовувати метод дилюції, тобто, попереднього розведення плазми крові, а також метод додаткової рециркуляції плазми.

Покриття високопористого сорбенту ГСГД нативною тимусною

ДНК виявляє додаткову адсорбцію прозапальних цитокінів при одночасному зменшенні адсорбції загального білка, що вказує на ефективність його застосування при станах, пов’язаних з розвитком синдрому системної запальної реакції.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Николаев В.Г., Сарнацкая В.В., Бардахивская К.И., Сусак Я.М., Снежкова Е.А., Черномыз В.Д., Цимбалюк Р.С., Уваров В.Ю., Гурина Н.М. Новые подходы к сорбционной терапии заболеваний печени // Эфферентная терапия. – 2003. – Том 9, № 1. – С.26-39.

Zakharash M.P., Ivanova N.V., Maslenny V.N., Sakhno L.A., Gurina N.M., Sklyarenko V.G., Shmatko L.L., Snezhkova E.A., Bardakhivskaya K.I., Sarnatskaya V.V., Nikolaev V.G. Progress and prospects of adsorption therapy in the treatment of postradiation neurosomatic polypathia // International Journal of Radiation Medicine. – 2003. – №5(1-2). – P.256-262.

Бардахівська К.І., Гуріна Н.М., Ніколаєв В.Г. Біоспецифічні сорбенти для лікування імунозалежних захворювань // Актуальные проблемы медицины и биологии. – 2004. - №1. – С.273-283.

Бардахівська К.І., Гуріна Н.М., Ніколаєв В.Г. Антитіла проти ДНК та прозапальні цитокіни при імунозалежних захворюваннях // Актуальные проблемы медицины и биологии. – 2004. - №1. – С.291-302.

Бардахівська К.І., Гуріна Н.М., Михаловський С.В., Ніколаєв В.Г. Вилучення прозапальних цитокінів неспецифічними та біоспецифічним вуглецевими сорбентами // Імунологія та алергологія. – 2004. - №3. – С. 34-35.

Бардахівська К.І., Гуріна Н.М., Ніколаєв В.Г. Спектр ДНК-тропних речовин у хворих на імунозалежні захворювання// Імунологія та алергологія. – 2005. - №1. – С. 25-28.

Бардахивская К.И., Снежкова Е.А., Николаев В.Г., Маляренко В.В. Быстрые сорбционные системы на основе ДНК-содержащих сорбентов // YI Российский Национальный конгресс “Человек и лекарство”: Тезисы докладов. – Москва, 1999. – С.386.

Снежкова Е.А., Бардахивская К.И., Николаев В.Г., Белоглазов В.А., Король В.Н., Яременко О.Б. Гранулированные углеродные ДНК-содержащие гемоиммуно-сорбенты: поглотительные свойства и некоторые результаты клинического применения // YI Российский Национальный конгресс “Человек и лекарство”: Тезисы докладов. – Москва, 1999. – С.472.

Zakharash M.P., Pinchuk L.B., Ivanova N.V., Snezhkova E.A., Sklyarenko V.G., Maslenny V.N., Bardakhivskaya K.I., Sidorenko A.S., Sarnatskaya V.V., Tkachenko Yu.Ya., Mazur V.M. and Nikolaev V.G. Adsorptive treatment of radiation and postradiation syndroms: update and prospects // Int. Seminar “Sorption methods and technologies in settlement of ecological and endoecological problems of the Chernobyl accident”: Program & Abstracts. – Kiev – Ukraine, 2000. – P.75.

Bardakhivskaya K., Snezhkova E., Zakharash M., Maslenny V., Korneeva L., Sklyarenko V., Nikolaev V. Non-linear response of DNA-bound substances concentration on plasmadilution as a base for new type of hemoimmunoadsorptive technique // Artif. Organs. – 2001. - Vol. 25, N 10. – P.785.

Bardakhivskaya K., Nikolaev V. DNA-containing plasmoimmunosorbents on the base of activated charcoal powder and carbonic microfibers // Artif. Organs. – 2001. – Vol. 25, N 10. – P.786.

Bardakhivskaya K.I., Nikolaev A.V., Snezhkova E.A., Yushko L.A., Sarnatskaya V.V., Gordeliy V.I., Nikolaev V.G. Influence of DNA coating on adsorptive properties of high- porosity carbonic materials // 9th Congress of the World Apheresis Association: Abstract Book. – Paris – France, 2002. – P.54.

Bardakhivskaya K.I., Snezhkova E.A., Maslenny V.N., Nikolaev V.G. Moderate enhancement of carbonic matrix does not change spesific adsorption onto DNA- containing synthetic charcoals // 9th Congress of the World Apheresis Association: Abstract Book. – Paris – France, 2002. – P.54.

Бардахивская К.И. Адсорбция проинфламаторных цитокинов новыми адсорбентами на основе высокоактивных углеродных матриц и нативной ДНК // Онкология (приложение к журналу “Экспериментальная онкология): Матеріали науково-практичної конференції “Проблеми онкоімунології: наукові та прикладні аспекти”. – 2003. – Т.5, №2. – С.173- 174.

АНОТАЦІЯ

Бардахівська К.І. „Розробка та експериментальне вивчення властивостей вуглецевих ДНК-вмісних імуносорбентів з підвищеною потужністю”. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук зі спеціальності 03.00.09 – імунологія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2005.

Дисертацію присвячено розробці нового покоління вуглецевих ДНК-вмісних імуносорбентів з підвищеною потужністю та вивчення їх специфічних та неспецифічних сорбційних властивостей.

Синтезовані ДНК-вмісні імуносорбенти з підвищеною потужністю поєднують властивості вуглецевих матриць та ДНК, що дозволяє їх використовувати для вилучення з плазми крові хворих не тільки анти-ДНК антитіла, а і білок-зв’язані метаболіти, речовини „середньої” молекулярної маси.

При дослідженні вмісту анти-ДНК антитіл у хворих встановлений нелінійний характер відповіді концентрацій антитіл на послідовні розведення сироватки. Ефективність вилучення антитіл із плазми крові хворих на різні аутоімунні захворювання вказує на перспективність застосування ДНК-вмісних імуносорбентів при будь-яких станах, пов’язаних з гіперпродукцією та нагромадженням анти-ДНК антитіл. Для поглиблення очистки плазми крові від антитіл можна використовувати методи регіонарної гемодилюції та додаткової рециркуляції плазми.

Покриття високопористого сорбенту нативною ДНК дає додаткову адсорбцію прозапальних цитокінів, що вказує на можливість його застосування також при станах, пов’язаних із розвитком синдрому системної запальної реакції.

Ключові слова: імуносорбенти, вуглецеві сорбенти, аутоімунні захворювання, анти-ДНК антитіла, прозапальні цитокіни.

АННОТАЦИЯ

Бардахивская К.И. „Разработка и экспериментальное изучение свойств углеродных ДНК-содержащих иммуносорбентов повышенной мощности”. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.09 – иммунология. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2005.

Диссертация посвящена разработке нового поколения углеродных ДНК-содержащих иммуносорбентов повышенной мощности и изучению их специфических и неспецифических сорбционных свойств.

Синтезированные ДНК-содержащие иммуносорбенты повышенной мощности сочетают свойства углеродных матриц и ДНК, что позволяет применять их для удаления из плазмы крови не только анти-ДНК антител, но и белок-связанных метаболитов, веществ “средней” молекулярной массы.

Для синтеза ДНК-содержащих иммуносорбентов повышенной мощности использовали высокодисперсные, волокнистые и высокопористые углеродные матрицы. Количество иммобилизированной ДНК из тимуса теленка составляло от 1 до 64 мг на 1 г углеродных сорбентов. Для синтеза иммуносорбентов возможно также использование ДНК, полученной из других источников, что может значительно уменьшить стоимость материала при одновременном полном сохранении специфических поглотительных свойств синтезированных сорбентов в отношении удаления анти-нДНК, анти-дДНК и анти-ДНП антител.

При исследовании содержания анти-ДНК антител в сыворотках крови больных с аутоиммунными заболеваниями и пострадиационную нейро-соматическую полипатию были обнаружены не только повышенные уровни антител, но и нелинейный характер ответа концентраций антител на последовательные разведения сыворотки. Это указывает на то, что определенная часть антител находится не в свободно растворенной форме, а в составе соответствующих иммунных комплексов, способных легко диссоциировать.

Увеличение количества иммобилизированной ДНК вдвое, т.е. с 16 мг до 32 мг ДНК на 1 г углеродных матриц, давало лишь 5-7% дополнительную адсорбцию определяемых антител при изучении специфических поглотительных свойств ДНК-содержащих сорбентов на основе высокодисперсных углеродных матриц. Это свидетельствует о нецелесообразности использования значительных количеств ДНК для иммобилизации.

В экспериментах с плазмой больных с СКВ было показано, что для 50%-ного снижения уровней анти-ДНК антител ДНК-содержащих сорбентов на основе волокон АУВМ необходимо в 5-7 раз меньше, чем высокодисперсных порошковых углей, что может быть связано с лучшими структурно-сорбционными параметрами волокон АУВМ и их большей суммарной внешней поверхностью.

Показана эффективность использования ДНК-содержащих иммуносорбентов в отношении удаления анти-ДНК антител из плазмы крови больных с различными аутоиммунными заболеваниями, что указывает на перспективность их применения при любых состояниях, связанных с гиперпродукцией и нагромождением анти-ДНК антител.

Покрытие масс-фрактального пирополимера ГСГД нативной тимусной ДНК практически не влияло на степень адсорбции маркерных соединений малой и средней молекулярной массы. Это свидетельствует о том, что при увеличении пористости углеродные сорбенты становятся “нечувствительными” к присутствию на их поверхности биолиганда, что дает возможность использовать синтезированные комбинированные сорбенты как для специфического удаления анти-ДНК антител, так и для неспецифической сорбции белок-связанных токсинов.

Для углубления очистки плазмы от анти-ДНК антител можно использовать метод дилюции, т.е. предварительного разведения плазмы крови, а также метод дополнительной рециркуляции плазмы. В микроколоночных экспериментах показано, что предварительное разбавление плазмы в 2-5 раз перед перфузией позволяет снизить уровни анти-ДНК антител на 10-15% больше по сравнению с цельной плазмой больных с СКВ, псориатической артропатией и синдромом Шегрена.

Одной из задач исследования было определение свойств синтезированных ДНК-содержащих сорбентов на основе высокопористых гранулированных матриц ГСГД в отношении удаления провоспалительных цитокинов ФНОб, ИЛ-1в и ИЛ-6 из модельных белковых растворов. В микроколоночных экспериментах было показано, что сорбенты ГСГД являются эффективным средством для удаления провоспалительных цитокинов. Покрытие их поверхности нативной ДНК из тимуса теленка не только не уменьшает, но и существенно увеличивает поглощение этих веществ комбинированным сорбентом, снижая при этом адсорбцию общего белка более, чем в 1,5 раза.

Таким образом, синтезированные углеродные ДНК-содержащие иммуно-сорбенты повышенной мощности, полученные за счет комбинации ДНК-покрытия и суперактивных углеродных матриц, могут эффективно использоваться для экстракорпоральной терапии не только аутоиммунных заболеваний, но и синдрома системной воспалительной реакции и других состояний, связанных с гиперпродукцией провоспалительных цитокинов.

Ключевые слова: иммуносорбенты, углеродные сорбенты,