НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Бугайченко Лариса Анатоліївна

УДК (612.741.062+612.833.062):612.744

Зміни скорочувальної властивості м’яза і модуляція сегментарних рефлексів при розвитку м’язової втоми

03.00.13 – фізіологія людини та тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі фізіології рухів Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: | Доктор біологічних наук, Костюков Олександр Іванович, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділу фізіології рухів

Офіційні опоненти: | Доктор біологічних наук, професор Мірошниченко Микола Степанович, Київський національний університет ім. Т.Г. Шевченка, завідувач кафедри біофізики

Кандидат біологічних наук, Тамарова Зінаїда Андріївна, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, старший науковий співробітник відділу фізіології стовбура мозку

Провідна установа: | Кафедра нормальної фізіології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця

Захист відбудеться 15 березня 2005 року о 1400 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

Автореферат розісланий 15 лютого 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Монотонна фізична праця, яка базується на інтенсивних швидких одноманітних рухах, приводить до формування феномена м’язової втоми. М’язова втома істотно обмежує фізичні можливості організму, перешкоджає ефективній трудовій діяльності, може супроводжуватись мікротравмами і часто виступає як причина розвитку хронічної напруженості м’язів та їх хворобливої чутливості. М’язова втома, викликана тривалою активністю м’язів, супроводжується цілою низкою взаємопов’язаних процесів на клітинному рівні в м’язовій тканині і в нервово-м’язових синапсах (Fitts, 1982; Gandevia et al., 1995). Зміни динамічних властивостей скорочення і подовження м’язів при м’язовій втомі поки що залишаються недостатньо вивченими, хоча саме від функціонального стану м’язів залежать їх робочі властивості, а також реалізація сегментарних і низхідних моторних команд, на яких базується моторна поведінка тварин і людини. Аферентні сигнали, котрі супроводжують розвиток м’язової втоми, здійснюють істотні впливи як на спинальному, так і на супраспинальному рівнях (Gandevia 2001). При цьому поширюється больова імпульсація та реорганізуються сегментарні та супрасегментарні процеси. Дослідження останніх років показали, що активація м’язових ноцицепторів може істотно впливати на процеси керування моторною активністю, які забезпечуються різними рівнями моторної системи (Garland, McComas, 1990; Pettorossi et al., 1999; Farina et al., 2001; Brunetti et al., 2003). Вивчення змін взаємодії спинальних рефлекторних процесів при розвитку втоми і хворобливої чутливості м’яза становить істотний практичний інтерес в ряді аспектів фізіології праці (Johansson et al. 2004). Адекватне розуміння механізмів, що відповідають за розвиток пов’язаних з м’язовою втомою патологічних станів, неможливо, доки не будуть ідентифіковані причини таких процесів як на периферійному рівні, так і безпосередньо в центральній нервовій системі.

Зрозуміло, що в тестах на людях (Bigland-Ritchie et al., 1986; Woods et al., 1987; Garland et al., 1988; Macefield et al., 1991) досить важко або навіть принципово неможливо чітко розрізнити конкретні фактори, які зумовлюють модифікації імпульсної активності мотонейронів та зміни їх збудливості пов’язані з розвитком м’язової втоми (Gandevia, 2001). Для чіткішого вияснення механізмів розвитку м’язової втоми та її впливів необхідними є досліди на експериментальних тваринах. Таким чином, існує потреба провести аналітичне дослідження динамічних властивостей м’яза при його довготривалій стомлюючій активації, а також пов’язаних з розвитком м’язової втоми змін у взаємодії залучених у керування активністю такого м’яза сегментарних рефлексів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота „Дослідження скорочувальної властивості м’язу і зміни сегментарних рефлексів при розвитку м’язової втоми” відповідає планові науково-дослідної тематики відділу фізіології рухів Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України № 0102U000828. Частково ця робота виконувалась в рамках проекту „Muscle fatigue and pain and their effects on central nervous activity” за підтримки гранту INTAS 01-2130.

Мета і завдання дослідження. В нашій роботі ставилися мета проаналізувати зміни скорочувальної функції м’яза при його стомленні і при поширенні ефектів втоми від активних до неактивних м’язових волокон; а також зміни, котрі індукуються розвитком м’язової втоми у сегментарних рефлекторних механізмах, задіяних у керування даним м’язом. Для її досягнення було поставлено такі завдання:

Дослідити динаміку розвитку втоми у литковому м’язі кота при різних режимах стомлюючої стимуляції еферентних волокон, котрі іннервують цей м’яз.

З’ясувати модифікації динамічних властивостей скорочень волокон литкового м’яза, підданих та не підданих стомлюючій стимуляції (при розвитку феномену розповсюдження втоми від активних до неактивних волокон).

З’ясувати динаміку викликаної формуванням втоми триголового м’яза литки модуляції моносинаптичних рефлекторних розрядів в еферентних волокнах до цього м’яза.

З’ясувати роль сегментарних гальмівних рефлекторних процесів (пресинаптичного та зворотного гальмування) в розвитку втомаіндукованої модуляції моторного виходу сегментарних рефлекторних механізмів.

Дослідити індуковані втомою литкового м’язу зміни постсинаптичних процесів в окремих мотонейронах цього м’яза та імпульсної активності таких мотонейронів.

Об’єкт дослідження. Зміни силової реакції литкового м’язу на його контрольоване подовження; зміни характеристик перехідних процесів скорочення та подовження м’язу в умовах сервоконтролю зовнішнього навантаження; динаміка змін моносинаптичного рефлексу при розвитку м’язової втоми, і можливий вплив на таку динаміку процесів зворотного і пресинаптичного гальмування; зміни у постсинаптичних реакціях мотонейронів литкового м’язу

Предмет дослідження. Вплив ефектів м’язової втоми на скорочувальні властивості втомлених і невтомлених м’язових волокон у складі інтактного м’язу, на ефективність активації гомонімних мотонейронів, викликаної електричною стимуляцією низькопорогових аферентів, що йдуть від м’язових пропріоцепторів й на природну активацію цих рецепторів у відповідь на подовження м’язу.

Методи дослідження. Експерименти на наркотизованих котах з використанням розподіленої стимуляції філаментів вентрального корінця для моделювання природної активації м’яза, і механічна стимуляція м’яза для здійснення контрольованих змін довжини або зовнішнього навантаження. Експерименти на децереброваних котах з використанням електрофізіологічних методів: стимуляції спінальних корінців і переферичних нервів, відведення масових потенціалів від корінців, внутрішньоклітинне відведення від окремих мотонейронів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше описано траєкторії скорочення і подовження м’яза при розповсюджені в ньому ефектів втоми і показано напрямок втомаіндукованих змін характеристик перехідних процесів. Впреше проаналізовано зміни силової реакції активного м’яза на його розтягування при поглибленні втоми. Вивчено динаміку втомаіндукованої модуляції сегментарної рефлекторної активностіта доведено, що при цьому відбувається істотне пригнічення активності мотонейронів стомленого м’язу в дузі моносинаптичного рефлексу. Одержані дані вказують на те, що однією з причин зменшення активності мотонейронів втомленого м’яза може бути посилення пресинаптичного гальмування. Продемонстровано викликане втомою триголового м’язу литки зменшення частоти імпульсації мотонейронів цього м’яза при його адекватній стимуляції (розтяганні), тобто при реалізації стретч-рефлексу. Запропоновано гіпотезу про один з механізмів втомаіндукованого гальмування передачі пропріоцептивних впливів до мотонейронів (стійку активацію аферентних ?-аксонів впродовж довготривалих скорочень м’яза і пов’язану з цим гомосинаптичну депресію синаптичної передачі).

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі дані можуть сприяти адекватному розумінню процесів перебудови сегментарних рефлексів, пов’язаних із м’язовою втомою, що може бути корисним в сфері фізіології праці та спорту, а також при розробці лікувальних та реабілітаційних заходів в клініці захворювань опорно-рухового апарату. Результати даного дослідження можуть бути використані при викладанні курсів фізіології біофізики і фізіології для спеціалістів і студентів біологічних та медичних спеціальностей.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом було самостійно виконано аналіз наукової літератури, проведено експериментальне дослідження, обробку, аналіз отриманих результатів, їх викладення та співставлення з літературними даними. Здобувач приймав активну участь у розробці концепції частин роботи, обговоренні та формулюванні висновків, що було проведено за участю наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації були представлені на Конференції молодих вчених Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАНУ „Перспективні напрями досліджень сучасної фізіології” (17-18 листопада 2003, Київ); Міжнародній літній школі-семінарі IBRO „Sensory and Integrative Neuroscience: from receptors to behavior” (18-31 серпня 2004, Москва) та на засіданні сектору нейрофізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані в 8 роботах, з яких 4 – статті у вітчизняних та зарубіжних наукових виданнях та 4 – тези доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 156 сторінках, містить 2 таблиці та 31 рисунок. Вона складається зі списку скорочень, вступу, огляду літератури, опису методів та результатів дослідження, обговорення результатів, висновків, а також списку використаної літератури, що нараховує 353 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В першому розділі дисертації зроблено огляд наявних відомостей стосовно механізмів м’язового скорочення і його центральної регуляції. Розглянуто феноменологію м’язової втоми, а також периферійні і центральні процеси, пов’язані з її розвитком. Феномен м’язової втоми визначається як істотне зменшення сили, яка розвивається при скороченні м’яза, внаслідок попередніх тривалих та/або інтенсивних скорочень цього м’яза. Результатом цього є зменшення величини та можливої тривалості максимального довільного зусилля. Аналіз відповідної інформації дозволяє дійти висновку, що причини розвитку м’язової втоми полягають у периферійних біофізичних і біохімічних процесах на рівні м’яза, а також у певних модифікаціях активності сегментарних і надсегментарних підрозділів системи керування моторною активністю.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Досліди були виконані на 39 дорослих котах обох статей масою від 2,8 до 5,0 кг. Динаміка м’язових скорочень при розвитку втоми вивчалась в гострих експериментах на наркотизованих пентобарбіталом натрію (50 мг/кг маси, внутрішньочеревно) тваринах (перша група дослідів). Пов’язану з м’язовою втомою модуляцію сегментарних рефлексів досліджували в гострих експериментах на децереброваних котах (друга група дослідів); операційну підготовку і міжколлікулярну перерізку стовбура мозка в цій групі виконували під інгаляційним наркозом (суміш галотану, закису азоту і кисню) плюс внутрішньовенне введення пентобарбіталу в мінімальних дозах (при необхідності, 2-5 мг/кг), після чого наркотизацію припиняли.

Стандартними етапами операційної підготовки були: трахеостомія, канюлювання яремної вени для введення препаратів і загальної сонної артерії для моніторингу артеріального тиску, ламінектомія у поперековому відділі та препарування дорсальних і вентральних спінальних корінців, основних нервів задньої кінцівки і м’язів литки. Нерви, за виключенням n. gastrocnemius-soleus (G-S), перерізали. Для першої групи дослідів препарували литковий м’яз (m. gastrocnemius, G), для другої групи дослідів – триголовий м’яз литки, тобто обидві головки литкового м’язу і камбалоподібний м’яз (m. soleus, S). У перебігу препарування м’язів намагалися максимально зберегти їх кровопостачання. Виділяли сухожилля м’язу разом зі невеликим фрагментом п’яткової кістки (для приєднання м’яза до механостимулятора). Температуру тварини і вазелінової оливи в ванночках на раньових поверхнях підтримували на рівні 37,5-38 С° за допомогою контактних інфрачервоних нагрівачів. Стимуляцію нервів та корінців здійснювали прямокутними поштовхами струму тривалістю 0,2 мс.

Тестування скорочувальних властивостей m. G проводили за допомогою розподіленої стимуляції еферентів, котрі йдуть до цього м’язу у складі ВК L7. Дистальний відрізок даного корінця розділяли на п’ять філаментів приблизно однакової величини і накладали на стимулюючі електроди. Розподілена стимуляція по п’яти каналах дозволяла отримати гладкий тетанус м’яза при відносно невеликих частотах стимуляції окремих філаментів (10 с-1). Силу стимуляції окремих філаментів підбирали так, щоб викликати приблизно рівні за амплітудою ізометричні скорочення м'яза. Такий спосіб стимуляції забезпечував моделювання в експерименті асинхронного надходження еферентної активності до м’яза.

Втома-залежні зміни динаміки м’язового скорочення вивчали при формуванні стану втоми в частині m. G. В тих дослідах, в котрих вивчали ефекти втоми в активованій частці м’яза, втома м’яза наступала через часте повторювання тестів, які проводили на тлі тривалого тетанічного скорочення, що викликалось стимуляцією дистального відрізку ВК L7 (див. вище). А в дослідах, в яких вивчали ефекти втоми, що розповсюджуються на неактивовану частку м’яза, стимулювали дистальний відрізок ВК S1 (беручи до уваги, що аксони мотонейронів m. G містяться у цих корінцях приблизно в однаковій кількості). Сила стомлюючої стимуляції дистальної частини ВК S1 у 1,3 рази перевищувала поріг виникнення скорочення м’яза. 20-секундні інтервали стимуляції з частотою 50 с-1 чергували з 10 - секундними періодами відпочинку. Загальний час стимуляції – 10 хв. При цьому сила ізометричного тетанічного скорочення досягала 15-25 Н і зменшувалася по завершенню стомлюючої стимуляції на 10-60 %.

Тестові процедури, що являли собою механічні впливи на активний м’яз, здійснювали за допомоги сервокерованого механостимулятора. Впродовж тестів здійснювали сервоконтроль одного з параметрів – навантаження або довжини, з можливістю переходу з одного режиму роботи в інший. Після досягнення м'язом максимуму ізометричного тетануса його: 1) розтягували лінійно по трапецієподібній траєкторії, при цьому розглядалася силова реакція м’язу; 2) здійснювали перехід від ізометричного режиму до керування навантаженням; навантаження змінювали ступінчасто у бік додаткового навантаження або розвантаження, при цьому реєстрували траєкторії подовження або скорочення м’яза. Силову реакцію м’язів вивчали в дослідах, в котрих досліджували ефекти втоми в активованій частці м’яза, а траєкторії подовження/скорочення м’язу вивчали в дослідах, в котрих досліджували ефекти втоми що розповсюджуються на неактивовану частку м’яза.

В другій групі дослідів (по вивченню пов’язаної з м’язовою втомою модуляцією сегментарних рефлексів) втома м’яза наступала стимуляцію дистального відрізку ВК S1. Загальний час стомлюючої стимуляції ВК S1 становив 10 - 12 хвилин у дослідах по вивченню динаміки змін МСР, і 1-3 хвилини у дослідах по вивченню постсинаптичних реакцій мотонейронів. Впродовж стомлюючої стимуляції сила тетанічного скорочення зменшувалася на 25-30 % від початкового значення.

В дослідах по вивченню втомазалежних змін моносинаптичного рефлексу, перерізаний дистально ВК L7 поділяли на 6 приблизно однакових філаментів, один з філаментів використовували для запису МСР, один з решти – для активації системи зворотного гальмування. МСР викликали двома стимулами нерву G-S з інтервалом 2 мс. Сила струму стимуляції ВК S1 у 1,3 рази перевищувала поріг виникнення МСР, його амплітуда становила 60 – 70 % від максимально можливої. При вивченні впливів пресинаптичного і зворотного гальмувань на амплітуду МСР, стимули G-S кондиціонували парою стимулів нерва PBSt або філамента VR L7, суміжного до того, з якого здійснювався запис МСР, інтервал між кондиціонуючим і тестуючим стимулами був 20 мс.

Реєстрацію мотонейронної активності здійснювали скляними мікроелектродами внутрішньоклітинно. Сигнал від мікроелектроду записували по постійному струму, у якості мікроелектроду використовували мікропіпетки, що були заповнені 0,6 M розчином K2SO4 (опір 1,5 – 4,5 M?). Переміщення мікроелектроду в тканині спинного мозку здійснювали за допомогою електромеханічного мікроманіпулятора (крок 0,5 мкм).

Хімічну стимуляцію м’язу у дослідах по вивченню постсинаптичних реакцій мотонейронів здійснювали оцтовою сіллю брадикініну (Sigma), яку розчиняли в tyrode до концентрації 100 м? мл-1 (сукупний об’єм ін’єкції – 1 мл).

Тест реакції мотонейронів полягав у розтягуванні м’яза повільними хвилями синусоїдальної форми, максимальна амплітуда розтягування становила 8,8 мм. В експериментах довжина м’яза при найбільшому розтяганні була на декілька мм менше за довжину м’яза при максимально зігнутій стопі.

Статистичну обробку результатів було виконано за допомогою дисперсійного аналізу. Якщо відмінності між групами було знайдено, тоді застосовували апостеріорний аналіз для визначення різниці між компонентами, для виявлення статистичної достовірності змін МСР або частоти імпульсації мотонейронів на рівні значущості Р<0,05. За фактор внутрішньогрупової мінливості приймалися інтенсивність втоми (дослідження силової реакції м’язу) або часові інтервали виміру (дослідження змін моносинаптичного рефлексу і постсинаптичних реакцій мотонейронів).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Влив втоми на характеристики скорочення та подовження м’язу. Довжина м’яза утримувалася постійною близько довжини спокою протягом усього досліду, за виключенням тестової процедури, коли його довжина (верхня траєкторія на рис. 1 А) змінювалась по траєкторії, що була близькою до трапеції. Після того, як вмикали розподілену стимуляцію вентрального корінця, м’яз скорочувався в ізометричному режимі, сила скорочення виходила на плато (P0, рис. 1 А). Після цього м’яз розтягували на 5 мм і фіксували довжину м’яза на новому рівні. Через 4 с після цього довжина м’яза була знов зменшена до попереднього значення. Втома м’яза досягалась через часте повторювання тестів. У силовій реакції м’яза на його розтягування виділяють статичний і динамічний компоненти. Одночасно з розвитком м’язової втоми (зменшення P0 на рис. 1 А) відбувалось також і зменшення силової реакції м’язу на його розтягування. Компоненти цієї силової реакції при цьому демонстрували різну залежність від втоми (рис. 1 Б): при поглибленні втоми динамічний зменшувався більш швидко у порвнянні зі статичним. Стрімке зменшення динамічного компоненту за рубежем 30 % втоми, змусило нас провести наступне, більш ретельне дослідження динаміки подовження і скорочення стомленого м’яза. Як було показано в (Westerblad, Allen 1992; Fitts, 1994; Sjogaard, McComas, 1995), прогресування м’язової втоми за 30-ти % позначку супроводжується зменшенням кількості Ca2+, який вивільняється на кожний потенціал дії, і одначасним погіршення електромеханічного сполучення. Нашою метою було дослідити саме ефекти погіршеного електромеханічного сполучення, уникнувши інших причин втоми (зменшення концентрації АТФ, збільшення неорганічного фосфату тощо). Для цього, спираючись на відомості стосовно ефектів втоми, які розповсюджуються у м’язовій тканині від стомлених до раніше неактивних м’язових волокон (Kostyukov et al., 2002), було вирішено провести наступну серію експериментів. Частина м’язових волокон у складі литкового м’язу була стомлена впродовж кондиціонуючої стомлюючої стимуляції (рис. 2 А). Тестування іншої частини волокон у складі литкового м’язу виявило наступні зміни у його скорочувальних властивостях. По-перше, зменшилась сила (P0), яку здатен був розвивати м’яз в ізометричному режимі; по-друге, відбувся зсув кривої навантаження-швидкість вліво, тобто в діапазон менших значень швидкості. Дослідження перехідного процесу встановлення нової довжини м’язу при зміні зовнішнього навантаження проводилося згідно з моделлю, запропонованою у роботі (Kostyukov, 1987), згідно з нею траєкторія скорочення або подовження (відповідно, при ?P<0 або ?P>0), розглядалася як алгебраїчна сума двох компонентів. Перший компонент розглядався як ступінчаста функція, і уявляв собою реакцію безінерційного елементу (БЕ), що мав суто еластичну природу і відображав пасивні механічні властивості м’язової тканини. Другий компонент – повільний експоненціальний перехід до нового значення довжини, можна вважати реакцією аперіодичного елементу (АЕ), який в значній мірі відображав активні процеси м’язового скорочення, що пов’язані з функціонуванням актиноміозинових містків. Кількісний аналіз перехідного процесу здійснювався на основі суми БЕ+АЕ. Така модель забезпечувала задовільний опис перехідного процесу в межах часового проміжку приблизно від 2 до 6 с. Отримані в експерименті траєкторії зміни довжини L було описано за допомогою рівнянь: для скорочення (1) і для подовження (2),

(1)

(2)

де А – асимптотичне значення кінцевої довжини м’яза, 1-k – відносна вага БЕ, ? – константа часу перехідного процесу. Якість апроксимації була досить високою (r2 > 0,99). На рис. 2 Б, В показано апроксимації траєкторій зміни довжини м’яза при

скороченні і подовженні, викликанні відповідно зменшенням або збільшенням зовнішнього навантаження. Швидкість перехідного процесу знаходили за значенням першої похідної в початковий момент зміни довжини.

Спостережуване зменшення швидкості скорочення м’язу після проведення кондиціонуючої стомлюючої стимуляції характеризувалось: збільшенням постійних часу процесу і відносної ваги аперіодичного елементу (результати двоекспоненціальної апроксимації траєкторій). Навпаки, зменшення швидкості подовження м’язу характеризувалось: зменшенням постійної часу процесу і відносної ваги аперіодичного елементу (результати одноекспоненціальної апроксимації траєкторій руху).

Постсинаптичні реакції мотонейронів при формуванні м’язової втоми було проаналізовано по результатам 12 дослідів (12 спинальних мотонейронів, ідентифікованих як ті, що іннервують триголовий м’яз литки). Розтягування литкового м’язу викликає в гомонімних мотонейронах сумацію ЗПСП у виразну хвилю деполяризації мембрани (рис. 3 А, 4 А, 5). При розтягуванні м’язу, разом з виразними хвилями деполяризації спостерігали генерацію спайків на верхівках хвиль деполяризації у відповідь на великоамплітудні компоненту руху (рис. 3 А). Після проведення декількох тестів з розтягуванням м’язу, розпочинали його стомлюючу стимуляцію. Сесія стомлючої стимуляції м’язу складались з п’яти 12-ти секундних періодів стимуляції з частотою 40 с-1 та 70-ти мілісекундними паузами між ними. В даному досліді застосували 3 сесії поспіль, з інтервалом в 1 с (рис. 3 Б). Впродовж стомлючої стимуляції спостерігали посилення синаптичного шуму і швидкі хвилі деполяризації при розслабленні м’язу; сила м’язу впродовж стомлючої стимуляції зменшувалась. Одразу по її закінченню спостерігали зменшення кількості спайків у відповідь на розтягання м’язу, і зменшення частоти імпульсації мотонейрону (рис. 3 А). На рис. 3 В показано статистичний аналіз змін миттєвої частоти імпульсації мотонейрону для одного з дослідів. В наступних тестах з розтягуванням м’язу спостерігали відновлення частоти імпульсації мотонейрону. Повтори стомлюючої стимуляції викликали більш виразне зменшення частоти імпульсації одразу після завершення (рис. 3 В).

Також вивчали ефекти ін’єкції брадикініну в триголовий м’яз литки на викликанний його розтягуванням ЗПСП в гомонімних мотонейронах. Після введення брадікініну в м’яз (внутрішньом’язова ін’єкція, 6 точок) спостерігалось пригнічення імпульсної активності мотонейрону (рис. 4). При використанні даної концентрації кров’яний тиск залишався практично без змін, рівень мембранного потенціалу був достатньо стабільним. Схожі ефекти спостерігали для двох різних мотонейронів триголового м’язу литки. Ін’єкції викликали пригнічення імпульсної активності мотонейрона у відповідь на розтягування м’язу, з наступним її відновленням (рис. 4 Б). Пригнічення імпульсації спостерігали одразу після ін’єкції, відновлення імпульсної активності відбувалось протягом періоду 500-800 с після ін’єкції. Статистично значима різниця для миттєвих частот імпульсації була віднайдена для обох досліджених мотонейронів (P<0,05) для груп контролю, одразу післе ін’єкції брадикініну і через 8-13 хвилин. Спостережуване зменшення частоти імпульсації мотонейронів після внутрішньом’язової ін’єкції брадікініну і наступне достовірне відновлення було подібним до довготривалих ефектів стомлюючої стимуляції м’яза.

Підвищення інтенсивності пригнічення ЗПСП після повторення стомлюючих скороченнях м’яза. Для наступного аналізу втомазалежних змін ЗПСП під час тестування стретч-рефлексу, записи мембранного потенціалу було піддано низькочастотній фільтрації, постійна часу 0,05 с (рис. 5А). Відфільтровані записи було синхронізовано зі змінами довжини м’язу. Нами було виявлено зменшення амплітуди ЗПСП після повторення стомлюючої стимуляції м’яза (рис. 5 Б, В).

На рис. 6 наведено один з випадків, коли стомлююча стимуляція супроводжувалась появою ЗПСП, синхронізованих зі стимулами вентрального корінця. Ці ЗПСП можна було легко розрізнити на записі мембранного потенціалу. Після процедури синхронізації зі стимулами стомлюючої стимуляції (рамка на рис. 5) і усереднення, було показано зменшення амплітуди таких ЗПСП впродовж стомлюючої стимуляції. Оскільки сила стимуляції була 1,5 моторного порогу, то походження ЗПСП можна пояснити лише активацією ?-аксонів, що іннервують і м’язові волокна, і м’язові веретена. Подібні ЗПСП впродовж стомлюючої стимуляції дистальної частини вентрального корінця, як і більш складні постсинаптичні реакції, ми спостерігали досить часто.

Для мотонейрону, наведеного на рис. 6, було характерним сильне пригнічення імпульсної активності в тестах стретч-рефлексу після стомлюючої стимуляції. Таке пригнічення імпульсної активності, пов’язане із втомою, не можна було віднести на рахунок погіршення умов запису, оскільки мембранний потенціал і амплітуда потенціалу дії суттєво не змінювались. Зменшення амплітуди ЗПСП впродовж періодів стомлюючої стимуляції дозволяє висунути припущення про зменшення чутливості фузімоторних волокон до активації ?-аксонів впродовж стомлюючої стимуляції або/та до гомосинаптичної депресії вивільнення медіатору з пресинаптичного закінчення аферентів групи Іа.

Зміни моносинаптичного рефлексу триголового м’язу литки внаслідок його втоми. Супутні зміни інтенсивності зворотного та пресинаптичного гальмувань. Вивчали зміни моносинаптичного рефлексу литкового м’яза (МСР) протягом тривалого часу після формування втоми у литковому м’язі (внаслідок тривалих стомлюючих скорочень) в 17 гострих експериментах на децереброваних котах. Паралельно вивчали можливий внесок процесів пресинаптичного та зворотного гальмувань у зміни МСР в цей період. Стомлення м’яза (зменшення його сили) відбувалось внаслідок тривалого його скорочення впродовж 10 – 15 хвилин внаслідок стимуляції аксонів у складі дистальної частини вентрального корінця (рис. 7 А). Тестування моносинаптичного рефлексу проводили до і після формування м’язової втоми впродовж години. Моносинаптичний рефлекс викликали парою стимулів з інтервалом 2 мс. Кожна тестова серія складалася з 12 МСР – тестів кожні 7 с. Кондиціонування моносинаптичного рефлексу здійснювали попередньою стимуляцією нерва PBSt або проксимальної частини перерізаного філаменту вентрального корінця (рис. 7 Б). Тестові серії МСР з кондиціонуванням проводили одразу після серій з некондиціонованими МСР.

Для статистичного аналізу таких змін, дані усіх експериментів було віднесено до 6 інтервалів так, щоб в кожному з них була однакова кількість вимірювань (рис. 8 Б). Для кожного з експериментів значення амплітуд МСР було нормалізовано відповідно для контрольного значення (перед стомлюючою стимуляцією). Одразу по закінченню стомлюючої стимуляції або трохи пізніше спостерігали зменшення амплітуди МСР. На рис. 8 Б показано узагальнені результати 21 процедури по вивченню втоми в 16 різних експериментах; в 5 експериментах процедура була виконана для іншої кінцівки. Відміткою „0” на шкалі часу позначено середину першого тестового періоду, що розпочинали одразу по закінченню СС, наступні інтервали часу відповідають 5-14 хв., 15-25 хв., 26-40 хв., 41-65 хв. після завершення стомлюючої стимуляції. М ± m (середнє ± стандартизована похибка середнього) було визначено для кожного часового проміжку (стовпчик для контрольного рівня зафарбовано). Одразу після проведення стомлючої стимуляції амплітуда МСР-відповіді значно зменшувалась до 0,63±0,04 від контрольного значення, відновлення розпочиналося приблизно через 20 хвилин, і амплітуда МСР становила 0,90±0,02 від початкового рівня через 50 хвилин.

Що стосується паралельного вивчення інтенсивності зворотного гальмування, то щоб оцінити його інтенсивність, був уведений індекс інтенсивності гальмування І,

(3)

де M і Mк – усереднені значення для амплітуд некондиціонованих і кондиціонованих МСР, відповідно (I=0 означає відсутність гальмування, а I=1 – повне пригнічення МСР). Відразу після завершення стомлюючої стимуляції інтенсивність гальмування зменшувалася (рис. 8 А, В), і тільки приблизно через 40 хвилин починала відновлюватись (рис. 8 В). Подібна тенденція спостерігали в 8 дослідах. Часові інтервали для вивчення інтенсивності зворотного гальмування були: 0 хв., 8 - 14 хв., 15 - 30 хв., 31 - 57 хв. (по закінченню стомлюючої стимуляції). Відносне зменшення амплітуди МСР при кондиціонуючій антидромній стимуляції вентрального корінця L7 зменшувалося від 0,23±0,02 (контроль), досягаючи мінімуму (0,15±0,015) приблизно на 11 хвилині після стомлюючої стимуляції, з подальшим відновленням до 0,22±0,05 на 44 хвилині.

Щоб оцінити зміни в інтенсивності пресинаптичного гальмування МСР, пов’язані із втомою, використовували стимуляцію нерву PBSt. Як кондиціонований, так і некондиціонований МСР зменшувалися після стомлюючої стимуляції, але пригнічення кондиціонованого МСР значно збільшувалось після проведення стомлюючої стимуляції (рис. 9 А). В наших експериментах індекс гальмування, (що обчислювався по такій же формулі, як і для тестів зі зворотнім гальмуванням) збільшувався, досягаючи максимуму близько 40-ї хвилини після припинення стомлюючої стимуляції. Далі його інтенсивність поступово наближувались до початкового рівня (рис. 9 Б). Від контрольного значення 0,20±0,02 до стомлюючої стимуляції, індекс гальмування досягав максимального значення 0,44±0,04 через 12 хвилин після стомлюючої стимуляції, з подальшим відновленням через 53 хвилини 0,26±0,01. Часові інтервали вивчення інтенсивності пресинаптичного гальмування були: 5 - 18 хв., 21 - 35 хв., 36 - 60 хв. Точна форма траєкторії зміни індексу варіювала в різних експериментах, але статистичний показав саме таку тенденція – початкове підвищення інтенсивності гальмування після стомлюючих м’язових скорочень і наступне відновлення початкового рівня. Подібну тенденцію було виведено зі спостережень в 9 дослідах.

Отже, наведені вище факти показали, що м’язова втома литкового м’язу супроводжується зменшенням моносинаптичного рефлексу у відповідь на електричне подразнення нерва м’язу. Пригнічення МСР тривало довгий період часу після завершення м’язових скорочень. Варто зауважити, що втома була досить сильною: ізометрична сила тетанічного скорочення м’язу зменшувалась на 30 - 50 % від початкового значення. Було показано, що в час найбільшого пригнічення моносинаптичного рефлексу відбувалось підвищення інтенсивності пресинаптичного гальмування, наступне відновлення амплітуди МСР супроводжувалось поверненням його інтенсивності до контрольного рівня. Одночасно зі зменшенням МСР і посиленням інтенсивності пресинаптичного гальмування, пов’язаних з розвитком м’язової втоми, відбувалось ослаблення зворотного гальмування. Інтенсивності зворотного та пресинаптичного гальмувань змінювались у протилежних напрямках при формуванні втоми.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Нами досліджено ефекти втоми м’яза на особливості перебігу його скорочення і подовження (етап виконання моторної команди), і на активність мотонейронів (етап формування кінцевої моторної команди). Вивчено зміни динамічних властивостей скорочення і подовження литкового м’язу при його втомі; зміни реакцій мотонейронів на розтягування гомонімного м’язу після його втоми; моносинаптичну рефлекторну відповідь мотонейронного пулу на електричну активацію аферентів групи Іа у складі нерва м’язу, що стомлювався.

При втомі м’язу відбувалося зменшенням активного опору м’яза до його розтягування. В рамках сучасних уявлень про механізм м’язового скорочення, активний опір чинять актин-міозинові містки (активні протеїнові структури), пасивний опір – легкі ланцюги міозину, тітіну, небуліну (пасивні протеїнові структури, елементи цитоскелету) (Гурфинкель, Левик, 1985; Maruyama 1997). При зменшенні сили тетанічного скорочення не більш, ніж на 30 %, зменшення активного і пасивного опору відбувалося рівномірно. З поглибленням втоми, відбувалося помітне зменшення активного опору, і його частка у сумарній силовій реакції зменшувалася. Форма динамічного компонента також змінювалася – сила зменшувалась після зупинки розтягнення швидше, ніж це спостерігали для „свіжого” м’яза. Одним з завдань наших досліджень було вивчення змін динаміки скорочення і подовження м’язу в залежності від розповсюдження ефектів втоми. Відомо, що ефекти втоми розповсюджуються у м’язовій тканині від стомлених до раніше неактивних м’язових волокон (Kostyukov et al., 2002). Одним з основних механізмів поширення втоми в м’язовій тканині можливо є порушення проведення потенціалу дії. Було показано, що для однакових відносних змін у навантаженні, що викликали скорочення або подовження м’яза (при його збільшенні) – відбувались певні зміни характеристик, що описували зміну довжини м’яза, в залежності від напрямку руху м’язу. Для втомленого м’яза у більшості випадків було показано зменшення швидкості подовження і скорочення. За результатами апроксимації реальних траєкторій двоекспоненціальною функцією, уповільнення скорочення м’язу відбувалось через збільшення постійних часу процесу, і відбувалось збільшення відносної ваги аперіодичного елементу З іншого боку, уповільнення подовження м’язу відбувалось через зменшення відносної ваги аперіодичного елементу і супроводжувалось зменшенням постійної часу процесу.

Результати експериментів вказують на зменшення участі скорочувального елементу в опорі м’язу до зовнішнього навантаження. При розтягуванні м’язу – додатковим навантаженням (контроль сили) або подовженням (контроль довжини) – прискорюється встановлення нового значення рівноваги. Схоже, що погіршення активації м’язових волокон супроводжується уповільненням роботи скорочувального апарату й/або зменшенням його внеску в реакцію м’яза на навантаження.

Були досліджені зміни активності мотонейронів при стомленні гомонімного м’язу. Адже зміна реакцій мотонейронів суттєво впливає на кількість м’язових волокон, що активуються.

Були використані 2 шляхи активації мотонейронів: електричне подразнення первинних аферентів у складі м’язового нерву даного м’язу і природне подразнення – розтягування відповідного м’язу.

Нами було показано, що при активації мотонейронів і в перший спосіб, і в другий – відбувається послаблення рефлекторної відповіді мотонейронів. Ця подія знайшла відображення і в зменшенні потенціалу вентрального корінця, який по суті є сумою потенціалів дії, що росповсюджуються по аксонам мотонейронного пулу; і зменшення частоти імпульсації поодинокого мотонейрону у відповідь на стандартне тестове розтягування м’язу. Навіть за умов, що втома м’язу супроводжується погіршенням рецепторної функції м’язових веретен і відбувається спотворення сигналу про зміну довжини м’яза – ця подія не може бути єдиною причиною зменшення імпульсної активності гомонімних мотонейронів. Слід зазначити, що в пригніченні моносинаптичного рефлекторного розряду мотонейронів після стомлюючої стимуляції можна не приймати до уваги зміни в рецепторній ланці рефлекторної дуги.

В ряді досліджень висловлювали гіпотезу, що зменшення частоти імпульсації ?-мотонейронів у людини при м’язовій втомі відбувається внаслідок рефлекторного гальмування при активації аферентів III і IV груп (Bigland-Ritchie et al., 1986; Woods et al., 1987; Garland et al., 1988). Один з можливих субстратів для гальмування екстензорних ?-мотонейронів внаслідок активації аферентів III і IV груп може бути пов’язаний з функціонуванням т.зв. системи флексорного рефлексу. В цю систему входять чисельні гальмуючі інтернейрони, оскільки велика кількість спинальних інтернейронів мають входи від аферентів III і IV груп (Schomburg, 1990; Jankowska, 1992). Також, в дослідженнях на людях була запропонована гіпотеза підсилення пресинаптичного гальмування як при м’язовій втомі (Avela et al., 2001), так і при хімічній активації м’язових аферентів III і IV груп (Pettorossi et al., 1999), в останньому ослідженні висувалась для пояснення змін амплітуди моносинаптичного рефлексу при м’язовій втомі у дослідах на пацюках.

Нами було показано, що пресинаптичне гальмування напевне може бути тим механізмом, що обмежує активність мотонейронів при втомі. Адже пригнічення моносинаптичного рефлексу відбувалося на фоні посилення пресинаптичного гальмування, а його відновлення супроводжувалось послабленням гальмування. Обернена залежність між інтенсивністю гальмування і амплітудою моносинаптичного рефлексу у часі при м’язовому стомлені.

Гіпотеза про обмеження активності мотонейронів через посилення активності клітин Реншоу виявилась малоймовірною, адже в наших дослідженнях інтенсивність зворотного гальмування зменшувалась одночасно зі зменшенням амплітуди моносинаптичного рефлексу. Пригнічення зворотного гальмування при втомі повинно зменшувати гальмівний вплив на мотонейрони. Навіть якщо при втомі і відбувається модуляція активності клітин Реншоу впливами від високопорогових аферентів (Windhorst et al., 1997), зменшення рівня імпульсної активності мотонейронів могло бути домінуючим. Таким чином, зміни в активності клітин Реншоу були недостатніми для компенсації впливів інших процесів, що приводили до зменшення моносинаптичного рефлексу.

Причиною зменшення рефлекторної відповіді мотонейронів може бути обмеження аферентного припливу. На користь такого припущення говорить той факт, що при внутрішньоклітинній реєстрації мембранного потенціалу, останній був стабільним.

Головним ефектом стомлюючих м’язових скорочень було пригнічення ЗПСП та імпульсної активності мотонейронів одразу по їх закінченню і відновлення впродовж наступних тестових розтягувань. Повторення періодів стомлючої стимуляції збільшували ефекти пригнічення. Єдиним виключенням з цього правила було короткотривале підвищення синаптичної активації мотонейронів одразу по закінченню стомлюючої стимуляції, і яке майже повністю зникало після першого тестового розтягування м’язу. Встановлено, що цей феномен в-основному є ефектом післядії в м’язових веретенах внаслідок гістерезисних властивостей інтрафузальних волокон і гістерезисних властивостей м’язової тканини (Proske et al., 1993; Kostyukov, Cherkassky, 1997; Kostyukov, 1998). Такі властивості стосуються і пасивного розтягування веретен після завершення стомлюючого скорочення і збільшення механічної жорсткості інтрафузальних волокон після скорочення внаслідок супутньої активації через ?-аксони під час стомлюючої стимуляції. Свідоцтом цього була наявність ЗПСП в гомонімних мотонейронах, стабільно пов’язаних зі стимулами при стимуляції аксонів у складі перерізаного вентрального корінця. Активація в-?еретен була зареєстрована раніше при скороченнях малогомілкового м’язу кота (Kouchtir et al., 1995). В наших дослідженнях, амплітуда ЗПСП впродовж стомлючої стимуляції зменшувалась. Пояснень цьому може бути декілька. По-перше, можуть погіршуватись реепторні властивості м’язових веретен. По-друге, високочастотна активність аферентів, яка відбувається паралельно з активацією скелетних м’язових волокон, може привести до виснаження запасів медіатору в терміналях, і викликати, таким чином, гомосинаптичну депресію в моносинаптичних зв’язках Іа-аферентів з мотонейронами (Capek, Esplin, 1977). По-третє, особливу роль також може відігравати пресинаптичне гальмування Іа –аферентів, як це було зауважено в дослідженнях на людях (Rossi et al., 1999) і в нашому дослідженні на децереброваних котах (Kalezic et al., 2004).

Таким чином, можна вважати, що одною з причин неможливості довгий час підтримувати постійну силу м’яза in vivo є дисфасилітація мотонейронів через обмеження припливу активуючих аферентних сигналів, що зазвичай є зворотнім зв’язком для підтримання певної довжини/зусилля м’яза, і спотворення сигналу про стан м’яза.

ВИСНОВКИ

Досліджено зміни скорочувальної властивості литкового м’язу при формуванні втоми цього м’яза, викликаної тривалою стимуляцією еферентних волокон, котрі іннервують цей м’яз, та пов’язану з розвитком м’язової втоми модуляцію сегментарних рефлекторних процесів, задіяних в регуляцію активності цього м’язу.

1. Динаміка м’язового скорочення в умовах сервокерованих змін довжини м’яза модифікується при розвитку втоми цього м’яза. Статичний і динамічний компоненти силової реакції триголового м’яза литки кота на розтягнення характеризуються неоднаковою чутливістю до втоми різної глибини. При індукованому втомою гострому (більшому за 30 %) зменшенні сили ізометричного тетанічного скорочення, динамічний компонент силової реакції швидко зменшується, тоді як зменшення статичного компонента розвивається повільніше.

2. Стомлення частини волокон м’яза істотно впливає на динаміку скорочення інших попередньо не активованих м’язових волокон. При цьому