НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

БОНДАРЕНКО

Оксана Юріївна

УДК 581.174

ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ ГРАН ХЛОРОПЛАСТІВ

03.00.12 – фізіологія рослин

А в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі біохіміі фотосинтезу Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Кочубей Світлана Михайлівна,

Інститут фізіології рослин і генетики

НАН України,

провідний науковий співробітник

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Шадчина Тамара Михайлівна

Інститут фізіології рослин і генетики

НАН України,

завідувач відділу

доктор біологічних наук

Паршикова Тетяна Вікторівна

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

завідувач кафедри

Провідна установа: Інститут клітинної біології і генетичної інженерії

НАН України

Захист відбудеться “16” червня 2005 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 при Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою 03022, Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України 03022, Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.

Автореферат розісланий “14” травня 2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Мордерер Є.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Особливості ультраструктурної організації мембранної системи хлоропластів вищих рослин є однією з важливих проблем теорії фотосинтезу. Фотосинтетичні мембрани являють собою не лише структурну основу функціонування оксигенного фотосинтезу, але й забезпечують високий ступінь адаптивності до мінливих умов зовнішнього середовища, що дозволяє досягати майже повного відновлення функції навіть за досить високих стресових навантажень. Наприкінці 80-х років минулого сторіччя склалися основні уявлення про ультраструктурну організацію хлоропластів вищих рослин. До числа основних властивостей відноситься гетерогенність, яка існує на різних ієрархічних рівнях організації. Зокрема у хлоропласті розрізняють такі головні компартменти як грани та міжгранальні тилакоїди. Грани представлені у вигляді стопок тилакоїдів, центральна частина яких знаходиться у тісному контакті один з одним, так звана область стикування. Міжгранальні тилакоїди є поодинокими, зануреними в строму. Нещодавно була виявлена третя специфічна зона тилакоїдної системи, яка представлена краєвими, або маргінальними, ділянками гранальних тилакоїдів, які мають безпосередній контакт зі стромою [Albertson, 1980]. Виявилось, що вони відрізняються від центральних областей гранальних тилакоїдів за біохімічним складом та функціональними властивостями [Albertson et al. 1995]. Кожен з цих трьох компартментів має особливу субструктуру, зумовлену складом та просторовим розташуванням супрамолекулярних мембранних комплексів, що є проявом латеральної гетерогенності тилакоїдів. В центрі уваги сучасних досліджень знаходяться три основних проблеми: 1) організація гранальних тилакоїдів, 2) механізм стикування тилакоїдів у грані, 3) взаємне розташування та взаємодія гранальних та міжгранальних тилакоїдів. Щодо першого питання, то пануючою є модель, згідно якої існує чітка межа між центральною та краєвою частинами, причому тільки в останній присутні комплекси фотосистеми І (ФСІ) у специфічному стані [Albertsson, 1995]. Згідно цієї моделі, повинно зберігатися стале співвідношення між площами центральної та краєвої частин гранальних тилакоїдів. Для всіх С3-рослин стан розробки другої проблеми такий, що стара теорія зарядової взаємодії замінюється уявленням про молекулярне розпізнавання. Причому розглядають взаємодію тільки між двома сусідніми тилакоїдами грани. Питання про те, чи всі гранальні тилакоїди взаємодіють однаково, не розглядається. Але дані останніх років, в тому числі й одержані в нашій лабораторії, дають підставу для сумніву що до такої думки.

Дві протилежні точки зору існують стосовно зв’язку між міжгранальними та гранальними тилакоїдами. Відповідно однієї з них можна досягти стану, коли грана зникає внаслідок майже повного розстикування у безсольовому середовищі [Sandby, 1985]. На противагу цьому існує уявлення про жорстку організацію ультраструктури, в якій ніколи не може бути переходу тилакоїдів одного типу в інший завдяки тому, що єдиний міжгранальний тилакоїд лише доторкається до гранальних, обкручуючи грану, як певний гелікоїд [Garab, Mustardy, 2003].

Таким чином, в цих проблемах ультраструктурної організації хлоропластів є пункти, які потребують подальшого вивчення. Зокрема постають питання про особливості латерального розподілу комплексів ФСІ та специфіку їх організації в різних компартментах; не визначено, чи можна запропонувати інший тип розташування та взаємодії між гранальними та міжгранальними тилакоїдами. Існує також потреба узагальнити дані про особливості організації окремих частин грани у вигляді моделі її організації.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках тематики відділу біохімії фотосинтезу Інституту фізіології рослин і генетики (програми фундаментальних досліджень “Особливості організації мембранної системи хлоропластів та її змін під дією зовнішніх чинників”, № державної реєстрації 0100U002923 ).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи була розробка моделі грани з урахуванням особливостей її трансверсальної гетерогенності, специфіки латерального розподілу основних супрамолекулярних комплексів у гранальних тилакоїдах і можливості змін співвідношення між центральною та маргінальною ділянками гранального тилакоїду.

У зв’язку з цим були поставлені такі задачі:

1) виділити фрагменти хлоропластів з мінімально пошкодженою гранальною системою для вивчення складу, властивостей та функціональних характеристик грани;

2) виділити фрагменти хлоропластів, які представляють центральну та маргінальну ділянки гранальних тилакоїдів та вивчити їх властивості;

3) отримати та дослідити фрагменти кінцевих мембран гранальних тилакоїдів;

4) виявити особливості стану ФСІ в різних областях грани;

5) розробити модель гранальних тилакоїдів на основі одержаних даних.

Об’єкт дослідження - хлоропласти рослин гороху.

Предмет дослідження - структурна організація мембранної системи гран хлоропластів, склад та характеристики основних пігмент-білкових комплексів, представлених в різних компартментах грани, спектральні характеристики субтилакоїдних фрагментів.

Методи досліджень - фрагментація хлоропластів з використанням поверхнево-активної речовини з наступним диференційним центрифугуванням (для одержання фрагментів гран хлоропластів), світлова та електронна мікроскопія (для визначення розмірів та ультраструктури фрагментів), біофізичні методи (вимірювання спектрів поглинання та низькотемпературної флуоресценції), біохімічні методи (визначення пігментного та білкового складу фрагментів гран).

Наукова новизна одержаних результатів.

Розроблено нову методику, яка дозволяє отримувати фрагменти гранальної системи хлоропластів в найменш пошкодженому стані Вперше показано існування трансверсальної гетерогенності грани, яка обумовлена присутністю у її складі принаймні 2-х типів тилакоїдів та кінцевих мембран. Вперше за допомогою хімічної дезінтеграції хлоропластів отримані фрагменти, які відповідають різним ділянкам грани – центральній та краєвій частинам гранального тилакоїда і кінцевим мембранам грани. Вперше показано, що співвідношення величини центральної та краєвої ділянок тилакоїдів грани не є сталою величиною, а залежить від умов вирощування рослин, зокрема температури навколишнього середовища. Виявлено існування ФСІ в центральній ділянці гранального тилакоїду.

Запропоновано оригінальну модель організації грани, яка враховує її трансверсальну гетерогенність, а також структурні особливості різних ділянок гранальних тилакоїдів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати поглиблюють уявлення про організацію тилакоїдної системи хлоропластів. Ці дані є вагомим внеском у подальший розвиток теорії фотосинтезу.

Особистий внесок здобувача. Здобувач опрацювала відповідну літературу та оволоділа необхідними методами досліджень. Розробила модифіковану процедуру фрагментації. Приймала участь у плануванні експериментів, тестувала фрагменти тилакоїдів, на яких проводились вимірювання спектральних характеристик. Біохімічні дослідження, необхідна обробка результатів та їхній аналіз проведені здобувачем особисто. Частка особистої участі дисертанта складає понад 80%.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень були представлені на російській конференції з електронної мікроскопії (Черноголовка, 2002), Міжнародній конференції “Photosynthesis and Crop Production” (Київ, 2002), VIII Конференції молодих вчених “Сучасні напрямки у фізіології та генетиці рослин” (Київ, 2002), III З’їзді Українського товариства фізіологів рослин (Тернопіль, 2002), VIII молодіжній конференції ботаників (Санкт-Петербург, 2004), 14-му конгресі FESPB (Cracow, Poland, 2004), ІХ конференції молодих дослідників “Актуальні проблеми фізіології, генетики та біотехнології рослин та мікроорганізмів” (Київ, 2005).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 10 наукових робіт, в тому числі 4 статті у провідних фахових виданнях.

Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 153 сторінках друкованого тексту й складається із вступу, 3 розділів основної частини, підсумків, висновків, списку використаних джерел, який включає 186 найменувань. Робота містить 32 ілюстрації та 12 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

У першому розділі роботи подано огляд літератури, в якому узагальнені літературні дані стосовно ультраструктури хлоропластів, організації тилакоїдів грани, пігмент-білкового складу фотосинтетичних мембран, динамічних перебудов структури грани.

ОБ’ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Рослини гороху (Pisum sativum L.), які використовували в експериментах, вирощували в вегетаційному будиночку в грунтовій культурі при різних умовах (природнє освітлення та штучне затінення). Кожного дня фіксували умови температурного режиму та рівень освітленості на рівні рослин. Максимальна освітленість сягала 25000 - 30000 лк, при штучному затіненні 4000 лк. Температура варіювала від 15 до 300 С. Було введено показники нормованої температури та рівня освітленості. Нормована температура та освітленість визначались як відношення температури та освітленості спостереження до оптимальних значень, у якості яких були взяті, на основі багаторічного досвіду роботи з цією культурою, для температури - 15С і для освітленості - 30000 лк.

З повністю сформованого листя 14-денних рослин отримували хлоропласти другого класу за методикою [Островська та інш., 1975]. Середовище виділення містило 50 мМ трицинового буферу (рН 7,6), 0,4 М сахарози, 5 мМ MgCl2 та 10 мМ NaCl. Фрагментацію хлоропластів проводили шляхом дезінтеграції 0,3% дігітоніном у співвідношенні дігітонін/хлорофіл = 1/3, з наступним диференційним центрифугуванням за такими схемами:

1) 1300g - 10 хв., 20000g - 20 хв., 70000g - 30 хв., 145000g - 30 хв.

2) 1000g - 10 хв., 1300g - 10 хв., 20000g - 20 хв., 40000g - 20 хв., 70000g - 30 хв., 145000g - 30 хв.

3) 1000g - 10 хв., 1300g - 10 хв., 20000g - 20 хв., 40000g - 30 хв., 145000g - 30 хв.

Слід зазначити, що використання різних схем центрифугування обумовлене тим, що на початку досліджень більше уваги приділяли вивченню властивостей легких частинок. Після того, як виявилось, що при центрифугуванні 1000g та 1300g осідають специфічні частинки з особливими властивостями, було приділено увагу вивченню саме цих частинок, а осад при 145000g характеризував збірну фракцію легких частинок, що було потрібно для нормування виходу фракцій та приблизної оцінки стану легких фрагментів. В деяких експериментах проводили повторну одно- або двократну фрагментацію дігітоніном фракцій 1300g та 20000g при тому ж співвідношенні дігітонін/хлорофіл = 1/3.

Отримані осади ресуспендували в середовищі виділення хлоропластів. Виходи фракцій розраховували як співвідношення суми хлорофілу фракції до сумарного хлорофілу аліквоти хлоропластів, взятих для фрагментації. Концентрацію хлорофілу визначали за методом Арнона [Lichtenthaler H.K, 1987]. Для отримання зображень хлоропластів та субхлоропластних частинок використовували світлову та електронну мікроскопію. За допомогою світлового мікроскопа “Jenaval” Analytik Jena одержували зображення хлоропластів та фрагментів, які містилися у фракціях 1000g та 1300g, у вигляді цифрових масивів, які використовували для визначення середнього розміру частинок із застосуванням стандартного пакету обробки зображень Adobe Photoshop 6.1. та MapInfo, адаптованої до роботи з мікрозображеннями. Середній розмір вісей та площ частинок розраховували за вимірюванням 200 частинок, відхилення від середнього підраховувалося як середнє квадратичне відхилення з достовірним інтервалом 5 %. Для електронної мікроскопії осади хлоропластів та фрагментів фіксували 2,5 % глутаральдегідом. Електронно-мікроскопічне фотографування нашого матеріалу було проведено в Інституті ботаніки ім. М.Г. Холодного НАНУ, після чого нами здійснено кількісний аналіз зображень. Ці дослідження поряд з оцінками розмірів частинок надали інформацію щодо їх ультраструктури.

Оцінка розмірів частинок субтилакоїдних фрагментів проводилась також із використанням абсорбційної спектроскопії по величині ослаблення світла в області 750-850 нм, де практично відсутнє поглинання хлорофілу. Нами розроблений параметр k=A680/A850, який є відношенням інтенсивностей у спектрі поглинання при 680 і 850 нм. Виявилось, що співвідношення величин k для різних фракцій приблизно дорівнювало відношенню довжин довгих вісей відповідних частинок. Тому цей параметр застосовували для швидкої оцінки розмірів частинок при масових аналізах.

Низькотемпературні спектри флуоресценції (77 К) і спектри збудження флуоресценції вимірювали на універсальній спектрофлуориметричній установці, розробленій у відділі. Для низькотемпературних вимірювань виготовляли тонкі повітряно-сухі плівки, оптичне поглинання яких не перевищувало 15 %. Вимірювання низькотемпературних спектрів флуоресценції проводилось у діапазоні 650-800 нм у цифровому вигляді з кроком відбору інформації 0,5 нм. Спектри збудження флуоресценції вимірювались у діапазоні 630-720 нм у цифровому вигляді з кроком 0,5 нм. Детекцію флуоресценції здійснювали на довжині хвилі 735 нм, яка відповідає випромінюванню найближчої антени реакційного центру ФСІ, що дозволяє фіксувати саме ті форми хлорофілу, з яких енергія світла переноситься до реакційного центру ФСІ. Співвідношення сигнал/шум не перевищувало 1 %.

Біохімічний аналіз білкового складу кожної фракції проводили гель-електрофоретичним розділенням протеїнів в буферній суміші Лаеммлі [Laemmli, 1970]. Потужність електричного струму при електрофорезі складала 1,5 Вт на пластину. Розподільний гель містив 12 % акріламіду, 0,1 % бісакріламіду, 6 М мочевину, 0,375 М Tris-HCl (pH 8,9), 0,003 % персульфату амонію, 0,0003 % TEMED. Концентруючий гель містив 8 % акріламіду, 0,1 % бісакріламіду, 6 М мочевину, 0,175 М Tris-HCl (pH 6,8), 0,003 % персульфату амонію, 0,0003 % TEMED. Зразки, що містили 5 мкг хлорофілу, інкубували 16 годин при кімнатній температурі з додаванням 1/6 від об’єму суспензії буферу, який складався з 12 % SDS, та 18 % гліцерину. Перед інкубацією в зразки додавали меркаптоетанол до кінцевої концентрації в зразках 10%. Після проведення електрофорезу гель фіксували у водному розчині, що містив 10 % оцтової кислоти та 30 % етилового спирту. Фарбували гелі органічним барвником Brilliant Blue R у водному розчині 10 % оцтової кислоти з додаванням 30% етанолу 12 годин при кімнатній температурі. Після відмивання зайвої фарби гелі висушували на склі між пластинками целофану при кімнатній температурі. Висушені гелі сканували на сканері “Mustek ScanExpress 12000P”, після чого обробляли за допомогою комп’ютерної програми обробки гелей “ScnImage”. Для ідентифікації смуг використовували суміш маркерних білків фірми “SIGMA”, США. Суміш містила білки з молекулярними масами в діапазоні 29 - 116 кДа.

Показник співвідношення хлорофілів a/b розраховували за методикою Вернон [Vernon, 1960]. Кількісний вміст білку визначали за методикою Лоурі [Дж. Кумбс и др., 1989] з використанням реактиву Фоліна. Вміст білку в зразках визначали по кривій калібровки, яку було побудовано шляхом використання розчинів з відомими концентраціями білку бічачого альбуміну.

Результати досліджень опрацьовані статистично [Лакін, 1993]. Середні значення розраховували за даними не менше п’яти дослідів. У таблицях наведені середні арифметичні значення та середньо-квадратичні відхилення.

ДОСЛІДЖЕННЯ ОРГАНІЗАЦІЇ ГРАН ХЛОРОПЛАСТІВ

РОЗПОДІЛ ФРАГМЕНТІВ ЗА ФРАКЦІЯМИ

Результати дігітонінової фрагментації показали, що величина виходу різних фракцій частинок тилакоїдної системи хлоропластів відрізнялась залежно від умов вирощування рослин. Аналіз даних, наведених в таблиці 1, показує, що виходи фрагментів фракцій 1000g, 1300g зменшуються при підвищенні температури. Між величинами їх виходу та середнім значенням температури о 12-тій годині дня за період вирощування матеріалу існує тісна кореляція - коефіцієнт кореляції r=0,89 та r=0,98,

Таблиця 1

Розподіл фрагментів хлоропластів за фракціями

Фракція

Вихід фракції, % | Сума виходів фракцій, % | Середня температура oC | Середня освітленість Лк | 1000g

1300g

20000g

40000g

145000g | 12 + 2

45 + 3

25 + 3

7 + 1

3 + 0.5 |

92 + 2

11,5

норм 0,77 |

25000

норм 0,83 | 1000g

1300g

20000g

40000g

145000g | 3 + 1

4 + 1,5

67 + 5

10 + 2

7 + 1 |

92 + 2

24.6

норм 1,64 |

30000

норм 1,0Примітка.усереднення проведено за 6-ма дослідами.

для фракцій 1000g та 1300g відповідно. При підвищенні температури вирощування виходи фракції 40000g збільшуються, що вказує на зменшення щільності стиковки тилакоїдів грани. Коефіцієнт кореляції між виходом та середньодобовою температурою для цієї фракції невисокий - r=0,60. Аналогічні зміни виходу в залежності від температури були у фракції 20000g, і з таким самим ступенем кореляції, r=0,61. Кореляції між показниками освітленості та виходу фракцій не спостерігається. Тому можна вважати, що варіації виходу фракцій залежать від температури, а не від освітленості.

ОЦІНКА РОЗМІРІВ ФРАГМЕНТІВ ТИЛАКОЇДІВ

Аналіз спектрів поглинання хлоропластів і субхлоропластних фрагментів при кімнатній температурі показав, що величина k, k=A680/A850, збільшувалась при зменшенні розмірів частинок, тобто для частинок, які осаджувалися при центрифугуванні на більших швидкостях, величина k була більшою. У таблиці 2 наведено середні величини параметру k для хлоропластів та різних субхлоропластних частинок.

Співставлення розмірів хлоропластів та частинок фракцій 1000g та 1300g дозволило встановити кореляцію між розмірами хлоропластів та частинок 1000g, коефіцієнт кореляції r=0,92. Обернена кореляція існує між розміром цих частинок та їхнім виходом, r=0,99. Для частинок фракції 1300g кореляція з розміром хлоропластів або з виходом частинок не спостерігається, але існує слабка обернена кореляція розміру з середньою середньодобовою температурою, r=0,49, та більш висока з середньою освітленістю, r=0,98. Причому остання має місце тільки для рослин, які вирощувались без затінення.

Таблиця 2

Середні величини параметру k для хлоропластів та різних субхлоропластних частинок

Об’єкт | k | kфр/kхл

хлоропласти | 6,7 1,0 | 1

1000g | 10,4 1,4 | 1,5

1300g | 13,8 2,1 | 2

20000g | 29,1 7,0 | 4,3

40000g | 61,7 12,9 | 9,2

145000g | 64,7 9,5 | 9,6

Примітка. наведені середні значення за 6-ма дослідами.

Зображення хлоропластів, одержані за допомогою світлового мікроскопу, подібні до відомих раніше [Гамаюнова, 1975], вони мають вигляд тіл еліпсоподібної форми з довгою віссю 5,2 0,8 та короткою 3,7 0,5 мкм, площа близько 15 мкм2. Для хлоропластів та частинок 1000g та 1300g були побудовані криві розподілу за розмірами та розраховані їх напівширини. Фракції хлоропластів однорідні за розмірами і не містять сторонніх включень. Напівширина розподілу хлоропластів за розмірами дорівнює 1,6 мкм. Суспензії фракцій 1000g та 1300g теж досить однорідні і містять частинки, які подібні між собою за розміром та формою в межах кожної з фракцій. Напівширини розподілу частинок цих фракцій за розмірами дорівнюють 0,3 та 0,4 мкм для фракцій 1000g та 1300g відповідно.

В табл.3 наведено середні величини розмірів хлоропластів та частинок фракцій 1000g та 1300g з зображень, отриманих за допомогою світлового мікроскопа.

Таблиця 3

Середні величини розмірів хлоропластів та частинок фракцій 1000g та 1300g

Об’єкт | Довжина довгої вісі, мкм | Довжина короткої вісі,мкм | Площа,мкм2

Хлоропласти | 5,2 0,8 | 3,7 0,5 | 15,0 4,0

1000g | 1,3 0,2 | 0,8 0,1 | 0,87 0,17

1300g | 0,9 0,2 | 0,6 0,1 | 0,47 0, 07

Примітка. усереднення проведено за 6-ма дослідами.

З таблиці 3 видно, що частинки фракції 1300g виявилися у 1,8 разів меншими ніж частинки фракції 1000g. Порівнянно з хлоропластами частинки фракцій 1000g та 1300g у 17 та 32 рази менші. Порівняння параметрів частинок показує, що для них відношення величин k1000g/k1300g = 1,5 є близьким до співвідношення площ зображень, яке дорівнює 1,8. Таким чином можна вважати, що для субхлоропластних частинок відношення величин k може служити для порівняльної оцінки розмірів цих частинок, а параметр k можна вважати спектральним параметром оцінки розмірів субхлоропластних частинок.

Як видно з таблиці 2, варіювання середнього розміру хлоропластів, оціненого за показником k, дорівнює 15%. Аналогічні варіювання розмірів в межах 13 та 15 % спостерігаються для частинок фракцій 1000g та 1300g, відповідно. Це вказує на те, що отримані частинки є цілком визначеними фрагментами хлоропластів, оскільки, ізольовані з хлоропластів рослин, які вирощували у різні періоди літнього сезону, вони виявляють варіабельність за розмірами не більшу, ніж варіабельність розмірів хлоропластів.

Оцінки розмірів субхлоропластніх фрагментів були одержані також за електронно-мікроскопічними зображеннями поряд з даними щодо ультраструктури досліджених частинок. В таблиці 4 наведені розміри частинок фракцій, визначені за лінійними розмірами їх довгих вісей.

Таблиця 4

Оцінки розмірів субхлоропластних фрагментів

Фракція | Довжина довгої вісі за електр. мікроскопічним зображ., мкм | Довжина довгої вісі за іншими джерелами, мкм |

Джерело

1000g |

1,2 0,1 |

1,3 0,2 | за нашими даними світлової мікроскопії

1300g |

0,9 0,1 |

0,9 0,2 | за нашими даними світлової мікроскопії

20000g |

0,6 0,0 |

0,6 | за даними А.І. Ширяєва (1978)

40000g |

0,3 0,0 |

0,15 | за даними роботи (Wollenberger et al., 1995)

Як видно з таблиці 4 наші дані для частинок фракцій 1000g та 1300g, одержані методами світлової та електронної мікроскопії, практично співпадають. Аналогічна ситуація з частинками фракції 20000g, розміри яких однакові за нашими вимірюваннями та літературними даними. Для фракції 40000g спостерігається майже 2-кратна розбіжність з даними роботи Волленбергера (Wollenberger et al., 1995), що може пояснюватись відмінністю в розмірах відповідних ділянок тилакоїдів гороху та шпинату, з яким працювали автори вказаної роботи.

БІОХІМІЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ФРАГМЕНТІВ ТИЛАКОЇДІВ

Проведено аналіз вмісту хлорофілів a і b та протеїнового складу в мембранах субтилакоїдних частинок різних фракцій. Співвідношення хлорофілів a/b та хлорофіл/білок наведені в таблиці 5. З наведених даних видно, що у фракції 1000g спостерігається зниження величини співвідношення хлорофілів a/b на 15 % порівняно з такою в хлоропластах, що вказує на зменшення вмісту ФСІ, основного носія хлорофілу a. Зменшення показника хлорофіл/білок на 19 % порівняно з хлоропластами в цій фракції вказує на зменшення відносної кількості непігментованих супрамолекулярних комплексів. У фракції 1300g спостерігається ще більш суттєве зменшення співвідношення хлорофілів a/b - порівняно з хлоропластами він зменшується на 22 % та є найнижчим серед його значень для інших фракцій.

Збільшення величини співвідношення хлорофілів a/b спостерігається в ряду 1300g-20000g-40000g-145000g. Слід відзначити, що різниця у величинах співвідношення хлорофілів a/b, наведених у табл. 5 не є статистично достовірною. Це зумовлено високою варіабельністю цієї величини залежно від умов вирощування. Але величини відношення хлорофілів a/b хлоропласти/частинки, середні для яких розраховані для кожного окремого з 6 дослідів, а потім усереднені, виявляє достовірні відмінності.

Таблиця 5

Показники співвідношення хлорофілів a/b та хлорофіл/білок в хлоропластах та дігітонінових фрагментах

Зразок | Співвідношення хлорофілів a/b | Хл a/b хл-ти / хл a/b частинки | Співвідношення хлорофіл/білок

хлоропласти | 2,45 + 0,40 | - | 0,18 + 0,03

1000g | 2,08 + 0,15 | 1,24 + 0,04 | 0,22 + 0,05

1300g | 1,85 + 0,08 | 1,32 + 0,03 | 0,20 + 0,05

20000g | 2,51 + 0,40 | 1,16 + 0,07 | 0,17 + 0,03

40000g | 3,45 + 0,45 | 0,75 + 0,07 | 0,20 + 0,02

145000g | 3,95 + 0,45 | 0,61 + 0,06 | 0,10 + 0,02

Для визначення білкового складу субтилакоїдних фрагментів та порівняльної характеристики з білковим складом хлоропластів було проведено електрофоретичне розділення протеїнів хлоропластів та фракцій гранальних тилакоїдів з використанням білкових маркерів в ПААГ. Відносний вміст основних ПБК розраховуали по площі під відповідними смугами на денситограмах. Вміст ФСІ - по площі смуги СРІ , ФСІІ - сумі площ смуг СР43, СР47, 33кДа білку, СЗКІІ - сумі площ смуг,СР24, СР26, СР29; АТФазного комплексу - СF0, CF1.

Таблиця 6

Співвідношення вмісту основних ПБК у різних фракціях гранальних тилакоїдів |

хлоропласти | 1000g | 1300g | 20000g | 40000g

ФСІ/ФСІІ | 0,42+0,05 | 0,36+0,05 | 0,33+0,05 | 0,44+0,05 | 0,8+0,1

ФСІ/СЗКІІ | 0,34+0,05 | 0,24+0,03 | 0,28+0,03 | 0,35+0,05 | 0,6+0,1

ФСІІ/СЗКІІ | 0,78+0,03 | 0,70+0,03 | 0,72+0,03 | 0,7+0,03 | 0,4+0,05

З таблиці 6 видно, що співвідношення інтенсивності смуг ФСІ/ФСІІ у фракції 1000g зменшується в середньому на 14 %, а ФСІ/СЗКІІ на 30 %, порівняно з такими показниками в хлоропластах. При цьому, співвідношення ФСІІ/СЗКІІ змінюється несуттєво. На зменшення вмісту ФСІ, основного носія хлорофілу a, підтверджують також зниження співвідношення хлорофілів a/b. На зменшення кількості непігментованих супрамолекулярних комплексів у фракції 1000g порівняно з хлоропластами вказує збільшення співвідношення хлорофіл/білок (див. табл. 5).

У фракції 1300g спостерігається також зменшення співвідношень інтенсивності смуг на електрофореграмах: ФСІ/ФСІІ в середньому на 24 %, порівняно з хлоропластами та на 8 % від такого показника у фракції 1000g. На підтвердження суттєвої втрати ФСІ, у частинках фракції 1300g співвідношення хлорофілів a/b є найбільш низьким з усіх фракцій.

Аналіз фореграм фракції 20000g показав іншу відносну насиченість частинок основними супрамолекулярними комплексами ніж частинок фракцій 1000g та 1300g. Вона більш насичена протеїнами комплексу ФСІ порівняно навіть з хлоропластами - інтенсивність смуг зони СРІ вище. В той же час знижується інтенсивність смуг зони світлозбирального комплексу ФСІІ та мінорних хл a/b-білків. З табл. 6 видно, що співвідношення ФСІ/СЗКІІ істотно зростає, порівняно з таким показником в фракціях 1000g та 1300g, що також свідчить про зменшення в частинках концентрації СЗКІІ. У фракції 20000g спостерігається знижений вміст ФСІІ, порівняно з описаними вище частинками. За більшістю показників фракція 20000g ближча до тилакоїдів строми - підвищений вміст ФСІ, зменшена концентрація ФСІІ та світлозбрального комплексу. Але наявність всіх компонентів гранальних тилакоїдів та відносно високий їх вміст свідчать про те, що це фрагменти гранальної системи. Відсутність смуг CF1 та CF0, в яких локалізуються протеїни АТФазного комплексу, на електрофореграмах фракції 20000g є вагомим аргументом на користь того твердження, що частинки цієї фракції походять з гранальних тилакоїдів, розташованих всередині грани, і які не мають контакту зі стромою.

Фореграми частинок 40000g істотно відрізняються від хлоропластів та інших частинок за наявністю та інтенсивністю основних смуг. Виявлено підвищену інтенсивність смуг зон СРІ - ФСІ, CF1, CF0 - АТФазного комплексу. На фоні цього істотно зменшується інтенсивність смуг зони СЗКІІ, СР43, майже зникає смуга СР43 та білку кисень-виділяючого комплексу з молекулярною масою 33 кДа. Тільки в матеріалі, вирощеному при досить високих температурах, спостерігаються ці смуги, але слабо забарвлені - факт низької концентрації комплексу ФСІІ. Дані таблиці 6 по відносному вмісту основних супрамолекулярних комплесів виявляють підвищення співвідношення ФСІ/ФСІІ вдвічі відносно такого показника у фракції 20000g, тобто концентрація ФСІ вища. Це підтверджується й високим значенням співвідношення хлорофілів a/b. Співвідношення ФСІІ/СЗКІІ знижується теж досить істотно, що вказує на зниження концентрації ФСІІ відносно світлозбирального комплексу в даній фракції.

Фракція легких фрагментів 145000g найбільш насичена компонентами ФСІ, на це вказує висока, вища ніж у фракції 40000g, величина співвідношення хлорофілів a/b (див. табл.5). На електрофореграмах частинок цієї фракції досить чітко позначені всі компоненти ФСІ. Підвищена інтенсивність смуг зон СРІ, СF1, CF0, редуковані смуги СР47, СР43, 33 кДа та смуги 24, 26, 29 кДа, зони локалізації протеїнів СЗКІІ. Всі ці спостереження підтверджують, що частинки цієї фракції насичені комплексами, характерними для міжгранальних тилакоїдів. Таким чином, аналіз електрофореграм різних фракцій субтилакоїдних частинок та хлоропластів дозволив виявити особливості наповнюваності частинок компонентами основних білкових комплексів.

СПЕКТРАЛЬНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ СУБТИЛАКОЇДНИХ ФРАГМЕНТІВ

Хлоропласти та субхлоропластні фрагменти, отримані при дігітоніновій фрагментації значно відрізнялись за спектрами низькотемпературної флуоресценції. В спектрах фракцій 1000g та 1300g (Рис.1,A-2,A-3) суттєво зменшувалась інтенсивність довгохвильової смуги з максимумом біля 735 нм, яку випромінює ФСІ, в 2,1 + 0,2 рази у фракції 1000g та в 2,6 + 0,1 рази у фракції 1300g порівняно з хлоропластами. Інтенсивність цієї смуги в спектрі фракції 1300g на 20 % нижче ніж у фракції 1000g. Слід відмітити, що середні відхилення у величинах інтенсивності довгохвильової смуги невеликі. При тому, що в експериментах, проведених з матеріалом, вирощеним в різні періоди літнього сезону, інтенсивність довгохвильової смуги в спектрі хлоропластів істотно варіювала. Це вказує на те, що отримані фрагменти є певною частиною хлоропластів, в яких однаковим чином зменшується вміст ФСІ. Аналогічне

Рис. 1. Спектри низькотемпературної флуоресценції (77 К) хлоропластів та субхлоро-пластних фрагментів, де А: 1 – хлоропласти, 2 – 1000g, 3 – 1300g, 4 – 20 000g;

Б: 1 – хлоропласти, 2 – 40 000g при низькому виході, 3 – 40 000g при високому виході.

Спектри нормовані в максимумі випромінювання.

зменшення вмісту ФСІ спостерігалось на фореграмах, де інтенсивність смуги СРІ зменшувалась в ряду хлоропласти-1000g-1300g. В усіх експериментах спостерігали короткохвильове зміщення смуги 735 нм в середньому на 3 та на 4 нм у спектрах фракцій 1000g та 1300g відповідно. Змінювалась структура короткохвильової смуги – відносна інтенсивність плеча біля 695 нм збільшувалась в середньому на 17 % для 1000g та на 25 % для 1300g у порівнянні з хлоропластами. Цей факт може вказувати на зміну складу комплексу ФСІІ у фрагментах, присутніх у фракції 1000g та 1300g. Очевидно, в останніх підвищується вміст антени СР47, випроміненню якої належить смуга з максимумом 695 нм. Дійсно, при аналізі фореграм хлоропластів та частинок фракцій 1000g та 1300g, в фракціях фрагментів спостерігається збільшення інтенсивності смуги СР47. Спектри низькотемпературної флуоресценції фракцій 20000g (рис.1, A-4.) неістотно відрізнялись в експериментах, де спостерігався різний ступінь виходу. Оцінки співвідношення вмісту комплексів ФСІІ/ФСІ, проведені по спектрам флуоресценції показали, що для фракції 20000g вони лишалися практично незміненими у випадках високих та низьких показників відносного виходу фракції. Аналогічна оцінка для фракції 40000g (рис.1, Б-2, Б-3) показала різницю вмісту комплексів в 8 разів. Розрахунки проводили, використовуючи співвідношення І687/І735, виходячи з того, що величини І687 та І735 характеризують інтенсивність флуоресценції, що випромінюється ФСІІ та ФСІ, відповідно. Величини квантових виходів цього випромінення приймали рівними їх нижній границі – 1 % для ФСІІ та 5 % для ФСІ. Спектри низькотемпературної флуоресценції частинок фракції 40000g значно відрізнялись у випадках високого та низького виходів фракції. При високому виході в спектрі спостерігалась висока інтенсивність смуг флуоресценції ФСІІ, 687 та 696 нм, що вказує на більш високий вміст комплексів ФСІІ. Співвідношення ФСІІ/ФСІ для частинок цієї фракції змінювалося від 1 до 5 при різних виходах.

Характерною особливістю спектрів низькотемпературної флуоресценції фракції 70000g є низька інтенсивність короткохвильової смуги, середнє значення співвідношення інтенсивностей коротко- та довгохвильової смуг дорівнює 0,07 + 0,02, положення довгохвильового максимуму 735 + 1 нм. В спектрах флуоресценції фракції 145000g співвідношення інтенсивностей короткохвильової та довгохвильової смуг значно вище – 0,23 + 0,06, положення довгохвильового максимума 731 + 1 нм. Таким чином, спектри низькотемпературної флуоресценції двох фракцій легких частинок відрізнялись за співвідношенням інтенсивностей коротко- та довгохвильової смуг, положенням максимума довгохвильової смуги, крім того в кожному з експериментів інтегральний вихід флуоресценції для фракції 70000g був вище порівняно з тим же показником для фракції 145000g.

ІДЕНТИФІКАЦІЯ ФРАГМЕНТІВ

За результатами спектроскопічних та біохімічних аналізів, а також співставлення їх з відомими даними інших дослідників, було визначено певні області тилакоїдної системи, з яких походять частинки кожної з отриманих фракцій.

Частинки фракції 1000g, хоча й осідали при тих же швидкостях, що й хлоропласти, але відрізнялись від них за всіма показниками. Вони були меншими за розмірами у 17 разів, одночасно являли собою однорідну за розмірами фракцію. Частинки фракції 1000g являють собою майже незмінену систему гран хлоропласта, яка не розпалася на окремі грани, на що вказувало збіднення ФСІ. Це підтверджено даними аналізу білкового складу, який показав, що частинки фракції 1000g характеризуються низьким вмістом комплексів ФСІ та непігментованих комплексів, а концентрація комплексів ФСІІ та СЗКІІ була підвищена. Відносний вміст комплексів ФСІ та ФСІІ підтверджений також результатами аналізу спектрів низькотемпературної флуоресценції: збільшення інтенсивності короткохвильової смуги та зменшення інтенсивності довгохвильової смуг, порівняно з хлоропластами. Електронно-мікроскопічні зображення ультратонких зрізів частинок фракції 1000g виявили, що це багатотилакоїдні утворення з вилученими міжгранальними тилакоїдами.

Фракція 1300g теж однорідна і містить частинки, менші за розміром порівняно з частинками фракції 1000g. Вони ще більш збіднені комплексами ФСІ, що випливає з того, що випромінювана довгохвильова флуоресценція 735 нм була найнижчою за інтенсивністю, та низький рівень вмісту білків ФСІ. Концентрація комплексів ФСІІ найвища з усіх фракцій. З цих даних випливає, що ці частинки найбільш близькі за своїми характеристиками до центральної області гранальних тилакоїдів. Було також з’ясовано, що комплекси ФСІ, які присутні в цих ділянках гранальних тилакоїдів, мають найбільшу за розміром світлозбиральну антену, ніж ці комплекси з інших областей гранальної системи.

Частинки фракції 40000g є ділянками краєвих частин гранальних тилакоїдів. Про це свідчить переважна за інтенсивністю смуга 735 нм у спектрі низькотемпературної флуоресценції, а також наявність ФСІ у значній концентрації та істотно зменшена кількість білків ФСІІ та СЗКІІ. Наявність великої кількості АТФ-синтазного комплексу свідчить про походження частинок даної фракції з ділянок тилакоїдної системи, експонованих у строму. При високих температурах вирощування, коли збільшувався вихід фракції, змінювався характер наповнення ПБК даної фракції: збільшувалась концентрація білків ФСІІ та СЗКІІ. Цей факт вказує на те, що при збільшенні площі крайових ділянок грани, яке проявляється у зміні відносного виходу фракції 40000g, змінюється і їхній склад.

Фракція 20000g суттєво відрізняється від інших фракцій за багатьма показниками. Наявність білків ФСІ в істотних концентраціях вказує на наближення частинок даної фракції до міжгранальних тилакоїдів, але відсутність АТФ-синтазного комплексу та висока концентрація комплексів ФСІІ та СЗКІІ, які притаманні гранальним тилакоїдам, дає підставу вважати, що ці частинки походять з внутрішніх частин грани, але відрізняються від суто тилакоїдів грани. Повторна фрагментація частинок фракцій 1300g та 20000g показала, що 80 % перших фрагментується на більш дрібні частинки, в протилежність частинки 20000g майже не можна було розібрати на менші фрагменти. Спектральні характеристики частинок, що походять з повторно фрагментованої фракції 1300g значно відрізняються від частинок, що походять з фракції 20000g. Враховуючи всі виявлені особливості частинок цієї фракції було зроблено припущення, що вони походять з специфічних тилакоїдів, розташованих всередині грани й відрізняються характером взаємодії з іншими гранальними тилакоїдами, тобто є нетиповими гранальними тилакоїдами.

Частинки фракції 70000g за даними біохімічних та біофізичних показників надзвичайно збагачені ФСІ, яка відрізняється від комплексів ФСІ з інших ділянок тилакоїдної системи розміром світлозбиральної антени. Про це свідчить високий показник співвідношення a/b, висока інтенсивність довгохвильової смуги та дуже незначна інтенсивність короткохвильової смуги на спектрах низькотемпературної флуоресценції. За цими характеристиками ці частинки відповідають фрагментам кінцевих мембран грани. Це мембрани, які контактують з гранальним тилакоїдом одним боком, а іншим боком експоновані в строму.

Результати проведених досліджень підводять до висновку про трансверсальну гетерогенність грани, яка обумовлена присутністю у її складі двох типів тилакоїдів, відмінних за складом, - суто гранальних та “нетипових”, а також кінцевих мембран. У гранальних тилакоїдах можна виділити центральну та краєву області, відмінні за організацією.

Частинки всіх, вище описаних та ідентифікованих фракцій, нами було отримано методом хімічної деструкції хлоропластів та вперше доведено, що цей підхід дає результати, подібні до одержаних при механічній дезінтеграції хлоропластів.

МОДЕЛЬ ОРГАНІЗАЦІЇ ГРАНАЛЬНИХ ТИЛАКОЇДІВ

За даними роботи розроблено оригінальну модель організації грани хлоропластів, основними особливостями якої є наступне.

Рис. 2. Модель організації грани хлоропластів гороху.

1.

2.

3.

4.

ВИСНОВКИ

1. Вперше виділено два нові типи субхлоропластних фрагментів з хлоропластів гороху, одержано характеристики частинок за розмірами, ультраструктурою, спектральними параметрами та білковим складом. Перші з них являють собою систему гран з видаленими міжгранальними тилакоїдами, а другі являють собою центральними ділянками гранальних тилакоїдів.

2. Виділено та ідентифіковано на основі присутності АТФазного комплексу частинок з краєвих областей гранальних тилакоїдів, одержано їх характеристики й показано, що при підвищенні температури вирощування рослин паралельно із зростанням виходу цих частинок збільшується вміст поліпептидів ФСІІ та СЗКІІ.

3. Варіації виходу фрагментів краєвих областей гранальних тилакоїдів вказує на можливість змін співвідношення стикованої та нестикованої частин гранальних тилакоїдів, зокрема при варіаціях температурних умов вирощування.

4. Виділено новий тип фрагментів гран, які відрізняються за своїми характеристиками від інших ділянок грани, а за відсутністю в їх складі АТФазного комплексу можуть бути розглянутими, як фрагменти тилакоїдів, що містяться всередині грани. Ці тилакоїди названі нетиповими.

5. Розмір та склад світлозбиральної антени комплексів ФСІ, розташованих на різних ділянках гранальних тилакоїдів, відмінні, що випливає із співставлення інтегральної інтенсивності та