Національна Академія Наук України

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного

Чернишов

Дмитро Петрович

УДК 581.821:537.533.35

СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНА ОРГАНІЗАЦІЯ КЛІТИН ЕПІДЕРМИ ОДНОРІЧНИХ ПАГОНІВ ЖОВТОЇ АКАЦІЇ

CARAGANA ARBORESCENS Lam.

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі клітинної біології та анатомії Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного Національної Академії Наук України.

Науковий керівник: член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук Кордюм Єлизавета Львівна, Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, завідуюча відділом клітинної біології та анатомії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Чугункова Тетяна Володимирівна, Інститут фізіології і генетики рослин НАН України, завідувач відділу генетичних основ гетерозису

кандидат біологічних наук Ситнянська Неоніла Павлівна, Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка НАН України, старший науковий співробітник відділу тропічних і субтропічних рослин

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченка

Захист відбудеться 28 квітня 2005 р. о 16-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 при Інституті клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 148.

Автореферат розіслано 21 березня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.А. Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пізнання субмікроскопічної організації клітини створює структурну основу для розуміння процесів росту та диференціювання клітин та розвитку організму. Крім того, особливості ультраструктури клітинних органел дозволяють судити, в тій чи іншій мірі, про їхній функціональний стан, отже про інтенсивність та спрямованість клітинного метаболізму (Сытник и др., 1983). Тому в останні тридцять років в літературі достатньо висвітлено ультраструктуру різних типів клітин вегетативних та генеративних органів (Мирославов, 1974, Glower, 2000, Ильинская, 2002, Мирославов, 2003). В той же час, наявні лише окремі дані щодо структурно-функціональної організації клітин епідермісу, хоча за своїми функціями та часто оригінальною структурою ця покривна тканина заслуговує на особливу увагу. Епідерміс бере участь у виконанні різноманітних функцій, таких як захист рослини, участь в процесі дихання, фотосинтезу, транспірації та секреції. Виконання настільки різноманітних функцій знаходить своє відображення в складній організації клітин епідерми. Заслуговує також на увагу наявність внутрішньоклітинних тілець-включень, що притаманні епідермальним клітинам та мають різне походження, структуру та функції (Murphy et al., 1995; Edwardson et al., 1997). З’ясування структурно-функціональних характеристик внутрішньоклітинних тілець-включень та їх природи поглиблює розуміння динаміки внутрішньоклітинних процесів, що відбуваються в епідермальних клітинах.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у рамках фундаментальних науково-дослідних робіт відділу клітинної біології та анатомії Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України: тема № 284 “Клітинні механізми адаптації рослин до змін водного режиму” та тема № 314 “Клітинні та молекулярні механізми фенотипічної пластичності у рослин”.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було вивчення структурно-функціональної організації клітин епідермісу молодих пагонів жовтої акації (Caragana arborecens Lam.) в процесі їх росту та диференціювання та з’ясування природи тілець, характерних для епідермісу цього виду. Для досягнення мети було поставлено наступні задачі:

Ё

Ё

Ё

Ё

Ё

Об’єкт дослідження – структурно-функціональна організація клітин епідермісу в процесі їх росту та диференціювання.

Предмет дослідження – морфологічні, ультраструктурні, цитохімічні та біохімічні характеристики клітин епідермісу в процесі їх росту та диференціювання.

Методи дослідження – світлова, конфокальна, електронна мікроскопія, світлова та електронна цитохімія, вірусологічні та біохімічні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено вивчення структурно-функціональної організації клітин епідермісу C. arborescens, проаналізовано ультраструктуру та склад внутрішньоклітинних тілець та описано оригінальний біогенез ядерних та цитоплазматичних тілець в епідермальних клітинах цього виду, який триває навесні, від розпускання бруньок до завершення цвітіння, протягом 10-12 днів. Встановлено, що ядерні та цитоплазматичні тільця не мають вірусного походження; їх утворення притаманне здоровим епідермальним клітинам. Вперше показано, що ядерні та цитоплазматичні тільця мають рибонуклеопротеїдну природу. Вперше встановлено також появу та збільшення у відповідності до стадії біогенезу ядерних та цитоплазматичних тілець кількості білку молекулярною масою біля 64 кДа з епідермісу однорічних пагонів жовтої акації. Вважається, що ядерні та цитоплазматичні тільця є депо рибонуклеопротеїдів, які формуються в епідермальних клітинах з надзвичайно високим рівнем метаболізму та утилізуються цими клітинами під час формування насіння та плодів жовтої акації.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані можуть використовуватися в дослідницьких роботах щодо вивчення ультраструктурних та функціональних характеристик рослинних клітин, а також шляхів утворення та утилізації рибонуклеопротеїдних депо в клітинах із застосуванням молекулярно-біологічних методів. Одержаний матеріал є зручним при використанні у викладацькій діяльності при проведенні практичних занять із студентами спеціальностей “клітинна біологія”, “цитологія” та “вірусологія”.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто були розроблені завдання досліджень, сплановані та проведені експерименти. Особистий внесок здобувача полягає також в обробці та інтерпретації результатів роботи, аналізі літератури, написанні наукових статей. Спільно з науковим керівником розроблено напрямок та концепцію досліджень, основні ідеї роботи, структуру дисертаційної роботи, проведено вибір об’єктів.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені на засіданнях Вченої Ради Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (Київ, 1998 та 2000 рр.), на засіданнях лабораторії клітинної біології Інституту біологічних наук університету Уельсу, м. Аберестуїф, Велика Британія (Аберестуїф, 2000). Основні положення та результати роботи були оприлюднені на конференції молодих вчених "Актуальні питання ботаніки та екології" (Херсон, 1998), XI конгресі Федерації Європейських товариств фізіологів рослин (Варна, Болгарія, 1998), конференції молодих вчених з актуальних питань молекулярної біології, біохімії та генетики (Київ, 1999), IV з'їзді фізіологів рослин (Москва, Росія, 1999), міжнародній конференції "Біологія рослин - новому тисячоліттю" (Потчєфструм, Південно-Африканська республіка, 2000), VII молодіжній конференції ботаніків (Санкт-Петербург, Росія, 2000), на XII Європейському конгресі з електронної мікроскопії (Брно, Чеська республіка, 2000), на XI з'їзді Українського ботанічного товариства (Харків, 2001), на молодіжному науково-практичному семінарі з клітинної біології (Київ, 2001), на міжнародному трейнінг-курсі "Структура білку, динаміка, геном та функція" в Інституті просунутого навчання НАТО (Ерічє, Італія, 2001).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані у вигляді 5 статей у фахових реферованих журналах, що входять до переліку ВАК України та 7 тез у матеріалах з'їздів і конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, висновків та списку використаної літератури, який містить 273 найменувань. Роботу викладено на 123 сторінках, результати наведено у 3 таблицях та 62 рисунках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури проаналізовано сучасні уявлення про структурно-функціональну організацію епідермісу надземних органів дводольних рослин. Суттєву увагу приділено ультраструктурним особливостям епідермісу дводольних в залежності від функції, яку виконують ці клітини, та дії факторів навколишнього середовища. Показано, що ультраструктура ядра та ядерця змінюються в залежності від функціонального стану клітини. Детально висвітлено також питання наявності внутрішньоклітинних тілець-включень в епідермальних клітинах дводольних. Наведено класифікацію тілець-включень та висвітлено структуру та можливі функції цих утворень.

Матеріали та методи досліджень. Об’єктом дослідження було обрано епідерму черешків листків, квітконіжок та чашолистків однорічних пагонів жовтої акації Caragana arborescens Lam. (родина Fabaceae). Жовта акація відноситься до групи чагарників з прискореним циклом весняного розвитку; від розпускання бруньок до закінчення цвітіння проходить 10-12 днів, в залежності від температури навколишнього середовища. Ця особливість онтогенезу дає можливість вивчати процес диференціювання епідермальних клітин листків, квітконіжок та чашолистків майже одночасно. Крім того, цей об’єкт був обраний ще й тому, що ще в 1954 році в клітинах епідермісу було описано наявність специфічних тілець, які цим автором розглядалися в ті часи як новоутворені ядра, і хоча пізніше було доведено, що вони не містять ДНК, але їх структура та природа залишалися нез’ясованими (Кордюм и др., 1970).

Дослідження проводили, починаючи від початку розпускання бруньок до опадання пелюсток на наступних послідовних фазах онтогенезу рослин: розпускання бруньок (протодермальні клітини); початок бутонізації (розтягання клітин); цвітіння та утворення зав’язей (диференційовані клітини). З черешків, квітконіжок або чашолистків здирали смужки епідермісу, які використовували для подальших досліджень.

Матеріал збирали в парках міст Києва та Донецька (Україна), Гомеля (Білорусь) та Санкт-Петербурга (Росія) від початку до кінця травня. Від листопада до березня використовували зрізані гілки жовтої акації, які ставили на вигонку у живильний розчин Кнопа (Гродзинский и др., 1973) до розпускання бруньок та цвітіння квітів. Для візуалізації внутрішньоклітинних тілець смужки епідерми забарвлювали водним розчином Люголю.

Дослідження проводили на живому та фіксованому матеріалі. Смужки епідермісу фіксували 10% формаліном, у суміші Карнуа, 2,5% розчином глутарового альдегіду (Гродзинский и др., 1973).

Поверхню епідермальних клітин вивчали за допомогою скануючого електронного мікроскопа JSM 35 (Jeol, Японія) та конфокального лазерного мікроскопу LSM 5 Pascal (Carl Zeiss, Німеччина).

Для вивчення ультраструктурної організації клітин матеріал фіксували в 2,5% розчині глутаральдегіду на 0,1 М Na-какоділатному буфері рН 7,2, постфіксували в 1% розчині OsO4 на 0,1М Na-какоділатному буфері рН 7,2 та зневоднювали шляхом проведення матеріалу крізь зростаючі концентрації етанолу та ацетону. Матеріал полімерізували у суміші епоксидних смол (Doncheva et al., 1997). Ультратонкі зрізи об’єктів (30-50 нм) робили за допомогою скляних ножів на ультрамікротомі LKB 8800 (Швеція). Одержані зрізи наносили на бленди з формваровой плівкою та досліджували за допомогою трансмісійного електронного мікроскопа JEM 1200 EX (Jeol, Японія).

Для визначення наявності ДНК застосовували реакцію Фьольгена за стандартною методикою (Button et al., 2001), а також забарвлення 0,125% водним розчином азура В (2 години при 450С) (Гродзинский и др., 1973, Button et al., 2001). Для визначення наявності РНК застосовували обробку сумішшю розчинів метилового зеленого та піроніну за Унна (Гродзинский и др., 1973, Button et al., 2001).

Для визначення природи внутрішньоклітинних тілець препарати обробляли барвниками на білки, ліпіди, крохмаль, РНК та ДНК. Можливу наявність білків у внутрішньоклітинних тільцях виявляли фарбуванням матеріалу сумішшю 1% розчина HgCl2 та 0,1% розчина бромфенолового синього на 2% водному розчині оцтової кислоти, а також 0,1% водним розчином міцного зеленого (Гродзинский и др., 1973, Button et al., 2001).

Можливу наявність аргентофільних білків у внутрішньоклітинних тільцях на рівні світлової мікроскопії виявляли імпрегнацією матеріалу 2% водним розчином AgNo3 при 700С протягом 4-15 год., в темноті (Doncheva et al., 1997).

Можливу наявність ліпідів та крохмалю у внутрішньоклітинних тільцях виявляли фарбуванням за звичайними методиками (Гродзинский и др., 1973).

Препарати досліджували за допомогою світлового мікроскопу Axioskop (Carl Zeiss, Німеччина).

Для виявлення можливої присутності аргентофільних білків у внутрішньоклітинних тільцях на рівні електронної мікроскопії, матеріал імпрегнували 2% водним розчином AgNO3 2 години при 600С, обробляли сумішшю 10% формола та 1% гідрохінону в співвідношенні 1:1, зневоднювали в зростаючих концентраціях етилових спиртів, проводили через суміш абсолютного етанолу та абсолютного ацетону та заключали в суміші епоксидних смол (Doncheva et al., 1997). Ультратонкі зрізи наносили на бленди з формваровою плівкою та аналізували за допомогою трансмісійного електронного мікроскопу JEM 1200 EX (Jeol, Японія).

Для підтвердження або спростування даних про можливу присутність білків у внутрішньоклітинних тільцях, проводили обробку ультратонких зрізів (30-50 нм) матеріалу 1% водним розчином пронази (Sigma, США), рН 7,2 (Doncheva et al., 1997) з наступним аналізом обробленого матеріалу під трансмісійним електронним мікроскопом JEM 1200 EX (Jeol, Японія).

Для визначення ДНК та РНК застосовували обробку матеріалу флуоресцентними барвниками. Для вивчення ДНК проводили забарвлення матеріалу розчином DAPI (2 мг/мл) на MTSB-буфері pH 6,9 (Button et al., 2001). Для вивчення ДНК та РНК проводили забарвлення 0,01% розчином акридінового оранжевого на PBS буфері pH 5,4 (Ng et al., 2004).

Контролі на присутність РНК. Обробка ферментами на рівні флуоресцентної мікроскопії. В якості контролів проводили обробку матеріалу А). 1% водним розчином РНКази протягом 15, 30 та 60 хвилин; Б). 1% водним розчином пронази протягом 15, 30 та 60 хвилин (обробка на присутність білків); В). Одночасну обробку 1% водним розчином пронази та 1% водним розчином РНКази протягом 15, 30 та 60 хвилин (обробка на рибонуклеопротеїдні комплекси). Дослідження проводили за допомогою конфокального лазерного мікроскопу LSM 5 Pascal (Carl Zeiss, Німеччина).

Для визначення спектру сумарних білків проводили виділення білків стандартним шляхом; одномірний електрофорез проводили в вертикальних ДДС-Na поліакриламідних гелях за методикою Лемлі (Laemmli, 1970). В якості маркерів було використано кіт XY-078-00-02 фірми Amersham, що складався з суміші білків молекулярними масами 94, 67, 43, 30, 20,1 та 14,4кДа. Розігнані пофарбовані гелі сканували та аналізували за допомогою комп’ютерного програмного забезпечення ImageMasterTM TotalLab версії номер 2 (Amersham).

Для визначення можливої присутності вірусної інфекції в рослинах жовтої акації було проведено: візуальне обстеження рослин жовтої акації в парках навесні та влітку, від початку розпускання бруньок до опадання пелюсток; біологічне тестування методом роснин-індикаторів; імунологічні методи (метод крапельної аглютинації та метод подвійної імунодифузії в агарі (Гнутова, 1985) з сироватками до вірусу мозаїки огірка (ВМО), вірусу мозаїки люцерни (ВМЛ), вірусу звичайної мозаїки гороху (ВЗМГ), вірусу жовтої мозаїки квасолі (ВЖМК), вірусу мозаїки редису (ВМР), вірусу бронзовості томатів (ВБТ), вірусу некрозу тютюну (ВНТ), вірусу кільцевої плямистості томатів (ВКПТ), вірусу кільцевої плямистості тютюну (ВКПТ), вірусу мозаїки різухи (ВМР), вірусу латентної кільцевої плямистості суниці (ВЛКПС), вірусу некротичної кільцевої плямистості сливи (ВНКПС), вірусу крапчастості гвоздики (ВКГ), вірусу рунистої карликовості томатів (ВРКТ), вірусу мозаїки орхідей (ВМОр), вірусу мозаїки жоржини (ВМЖ), вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ), X-вірусу картоплі (ХВК), S-вірусу картоплі (SВК), M-вірусу картоплі (MВК) та F-вірусу картоплі (FВК)); електронномікроскопічне вивчення ультратонких зрізів матеріалу, а також свіжого матеріалу методом розведеної суспензії.

Статистична обробка результатів. Дослідження проводили в 5-и кратній повторності, в кожній з яких досліджували щонайменше 50 клітин протягом 7 років (1997 – 2004) за стандартними методиками (Лакин, 1980).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Морфологія епідермісу черешків, квітконіжок та чашолистків жовтої акації. Першим етапом роботи було вивчення морфології матеріалу. Встановлено, що епідерма черешків, квітконіжок та чашолистків однорядна, вкрита простими одноклітинними волосками довжиною до 3 мм. Епідерміс черешків листків відноситься до прямолінійного, а квітконіжок та чашолистків – до криволінійного. На поперечних зрізах стінки клітин потовщені нерівномірно, де найбільш товстою і щільною є зовнішня стінка, яка вкрита шаром кутикули. Антиклінальні стінки прямі. Продихи аномоцитного типу, містять пластиди з численними крохмальними зернами. Відразу після розпускання бруньок структура протодермальних клітин черешків, квітконіжок та чашолистків є типовою для меристематичних клітин. Зовнішня поверхня їх вкрита тонким шаром кутикули, яка має вигляд тонкої сильно борознистої безперервної плівки до 0,5 мкм завтовшки. Внутрішні стінки є тонкими – до 0,2 мкм, а зовнішні – до 1 мкм. На стадії розтягання епідермальних клітин товщина зовнішніх стінок клітин збільшується до 4 мкм, внутрішніх — до 0,3—0,5 мкм. Під час розтягання клітин кутикула залишається борознистою.

Таким чином, морфологія клітин епідерми черешків, квітконіжок та чашолистків жовтої акації не відрізняється від такої інших дводольних рослин.

Вірусологічний аналіз епідермісу черешків, квітконіжок та чашолистків жовтої акації. За візуальною оцінкою рослини жовтої акації, які було продіагностовано в парках м. Києва, м. Донецька, м. Гомеля та м. Санкт-Петербургу, визнано здоровими. Біологічним тестуванням з використанням роснин-індикаторів не встановлено наявність вірусної інфекції.

Серологічними аналізами та електронномікроскопічним тестуванням не встановлено наявності вірусної інфекції. Таким чином, проведені вірусологічні тести показали, що поява внутрішньоклітинних тілець в епідермальних клітинах жовтої акації не пов’язана з вірусною інфекцією.

Ультраструктура основних клітин епідермісу жовтої акації. Протодермальні клітини характеризуються наявністю округлого ядра, до 50,9 мкм в діаметрі, яке займає центральне положення в клітині. Зовнішня мембрана ядерної оболонки вкрита рибосомами. Ядро містить одне ядерце нуклеолонемного типу, 10,6 мкм у діаметрі, в якому розрізняється фібрилярний та гранулярний компоненти, при цьому гранулярний компонент неконденсований; присутні також ядерцеві вакуолі. Зазначені ультраструктурні характеристики вказують на помірно активний стан ядерця.

Пластидний апарат протодермальних клітин представлений лейкопластами, які розташовані біля ядра або внутрішньої тангентальної стінки у кількості один-два на зріз клітини, переважно округлої форми та сягають у діаметрі в середньому від 0,8 до 1,5 мкм. Округлі або овальні мітохондрії на зрізах мають розмір від 0,3 до 0,8 мкм. Їх популяційна щільність по відношенню до хлоропластів складає приблизно 3:1. Апарат Гольджі слабко розвинутий. Диктіосоми складаються з чотирьох-п’яти цистерн та локалізуються переважно біля ядра. Ендоплазматичний ретикулум майже відсутній. Рибосоми вільно розташовані в цитоплазмі та зібрані в полісоми. Вакуолярний аппарат протодермальних клітин представлений на зрізах кількома дрібними вакуолями з електронно прозорим вмістом. На початку росту протодермальних клітин розтяганням в ядрі клітин з’являються поодинокі кулясті ядерні тільця, які безпосередньо з’єднані з ядерцем.

Розтягання протодермальних клітин супроводжується зміною їх ультраструктурної організації. Ядро поступово зміщується з центру та зай-має ацентричне положення, а розмір ядерця більшується до 1,50,7 мкм. Ядерце нуклеолонемного типу, складається з фібрилярного та гранулярного компонентів, де гранулярний компонент сильно деконденсований, що вказує на активний стан ядерця. Особливістю ядра під час розтягання клітин є значне розширення перинуклеарного простору, іноді до 0,50,3 мкм. Ядерні тільця збільшуються в діаметрі до 1,50,5 мкм. Хлоропласти епідермальних клітин у фазі розтягання мають розмірі від 1,5 до 2 мкм. Розміри мітохондрій практично не змінюються у порівнянні з фазою протодермальних клітин. Кількість диктіосом та цистерн гранулярного та агранулярного ендоплазматичного ретикулуму збільшується. Невеликі за розміром вакуолі розташовані по всій площі клітини, а в цитоплазмі з’являються електронно щільні тільця діаметром від 0,5 до 1 мкм, які під час розтягання клітин збільшуються в діаметрі до 121,6 мкм.

Кінець розтягання епідермальних клітин характеризується тим, що ці клітини припиняють ріст, і їх розмір становить 501,8 х 1002,9 мкм. Ядро займає ацентричне положення в клітині, а ядерце зменшується в діаметрі (0,5 - 1 мкм), при цьому фібрилярний та гранулярний компонент його міцно упаковані, і поверхня ядерця має рівні контури. Щільна будова ядерця вказує на те, що ядерце стає неактивним. Вакуолі зливаються в одну центральну вакуоль, яка займає основний об’єм клітини. Хлоропласти та мітохондрії залишаються подібними до тих на стадії розтягання клітин, а кількість диктіосом зменшується до однієї на зріз. Ендоплазматичний ретикулум представлений лише окремими цистернами гранулярного типу. У повністю диференційованих клітинах епідермісу черешків, квітконіжок та чашолистків жовтої акації ядерні та цитоплазматичні тільця відсутні.

Біогенез ядерних та цитоплазматичних тілець жовтої акації. Вивчення ультраструктури епідермальних клітин під час диференціювання показало, що внутрішньоклітинні тільця мають біогенез унікального характеру. Стадії біогенезу тілець схематично представлені на рис. 1.

Рис. 1 Схема біогенезу ядерних та цитоплазматичних тілець в епідермальних клітинах відносно росту та розвитку вегетативних та генеративних органів жовтої акації

Початок розтягання протодермальних клітин співпадає з утворенням поодиноких сферичних тілець, які мають з ядерцем безпосередній зв’язок та представлені невеликими утвореннями на поверхні ядерця діаметром від 0,1 до 0,2 мкм (рис. 1 а, б; 2 а). Ядерні тільця складаються з коротких фібрил діаметром 6-7 нм, при чому щільність упаковки фібрил набагато перевищує щільність упаковки фібрил ядерця. Під час розтягання клітин протодерми відбувається ріст ядерних тілець, при цьому вони лишаються фізично зв’язаними з ядерцем, а їх діаметр збільшується до 1,5 – 2 мкм. Збільшення розміру ядерних тілець збігається в часі з ультраструктурними перебудовами ядра – значним розширенням перинуклеарного простору, збільшенням ядерних пор (рис. 1 б, в, г, д; 2 б) та дезагрегацією компонентів ядерця, що свідчить про його підвищену активність.

Далі, під час розтягання клітин, в цитоплазмі з’являються цитоплазматичні тільця, які за своєю текстурою ідентичні ядерним тільцям. Утворення цитоплазматичних тілець відбувається безпосередньо біля ядерної оболонки (рис.1 в, г, д; 2 б). Спочатку в цитоплазмі з коротких фібрил утворюється невелике тіло, яке часто оточене рибосомами. Під час розтягання клітин цитоплазматичне збільшується в діаметрі до 5±1,2 мкм та навколо нього утворюється гомогенна зона меншої електронної щільності за тільце радіусом біля 1±0,5 мкм, яка не має оточуючої мембрани та яка пронизана цистернами гранулярного ендоплазматичного ретикулуму (рис. 1 е; 2 в). Під час розтягання клітин радіус гомогенної зони збільшується до 7±1,3 мкм. Отже, в цей час в клітинах присутні два типи тілець: в ядрі – ядерне та в цитоплазмі – цитоплазматичне (рис. 1 д; 2 а, б, в). Розширення перинуклеарного простору, утворення довгих виростів зовнішньої мембрани ядра та збільшення ядерних пор під час появи цитоплазматичних тілець, а також подібність текстури цитоплазматичних та ядерних тілець дають підставу вважати, що цитоплазматичні тільця побудовані з матеріалу ядерного походження. Можна припустити, що формування цитоплазматичних тілець в цитоплазмі відбувається після транспортування з ядра крізь ядерні пори компонентів ядерних тілець. Під час утворення гомогенної зони навколо цитоплазматичних тілець ядерні тільця зникають.

Рис. 2. Фрагменти епідермальних клітин на послідовних етапах біогенезу ЯТ та ЦТ. а – ядро з ядерцем та ЯТ, б – ЦТ та ядро з ЯТ, в – ЦТ з оточуючою гомогенною зоною, г, д – ЦТ, які полімеризуються, е – фрагмент цитоплазми з частками впорядковано розташованих фібрил. Скорочення: Я – ядро, Яд – ядерце, ЯТ – ядерне тільце, ЦТ – цитоплазматичне тільце, ЗОТ – зона, що оточує ЦТ, УФ – упорядковані фібрили, В – вакуоль, П – пластида

Цитоплазматичні тільця часто містять електронно-прозорі ділянки, які за розмірами схожі до вакуолей ядерця; кількість вакуолей змінюється під час біогенезу тілець.

Під час цвітіння жовтої акації, коли епідермальні клітини диференційовані, вміст цитоплазматичних тілець полімеризується, і пучки паралельно упорядкованих фібрил, де кожна фібрила має діаметр біля 10±0,2 нм та крок упаковки фібрил приблизно 18±0,2 нм, виходять з цитоплазматичного тільця та радіально пронизують його гомогенну зону (рис. 1 з, и, к; 2 г, д). Як ми вже відмічали, в клітині утворюється одне цитоплазматичне тільце, однак може спостерігатися присутність до 3 цитоплазматичних тілець на клітину.

Наприкінці фази розтягання, під час закінчення цвітіння жовтої акації, відбувається дезагрегація цитоплазматичних тілець, при цьому пучки паралельно упакованих фібрил розходяться по гомогенній зоні (рис. 1 л, м; 2 д, е).

На стадії диференційованих епідермальних клітин внутрішньоклітинні тільця, як ядерні, так і цитоплазматичні, відсутні в епідермальних клітинах черешків листків, квітконіжок та чашолистків однорічних пагонів жовтої акації.

Ультраструктурні та гістохімічні особливості ядерних та цитоплазматичних тілець жовтої акації. Світлова мікроскопія. Реакція на ДНК та РНК. Для встановлення присутності нуклеїнових кислот у ядерних та цитоплазматичних тілець проведено ряд гістохімічних реакцій з використанням фарбників. Реакціями Фьольгена та фарбуванням DAPI не виявляється присутність ДНК у ядерних та цитоплазматичних тільцях.

При фарбуванні розчином азура В ядра та внутрішньоклітинні тільця епідермальних клітин забарвлюються у різні кольори: зелений свідчить про наявність ДНК, а фіолетовий – РНК. При цитохімічному тестуванні ядра фарбуються у зелений колір, а ядерця – у яскраво фіолетовий, при цьому внутрішньоклітинні тільця фіолетові, що може свідчити про можливу наявність РНК в цих утвореннях. При обробці метиловим зеленим - піроніном ядра та тільця забарвлюються різним шляхом. Зелений колір свідчить про наявність ДНК, а червоний - РНК. При реакції з метиловим зеленим-піроніном ядра набувають зеленого кольору, ядерця – червоного, а цитоплазматичні тільця при цьому теж червоні. Цими даними також припускається можлива присутність РНК в цитоплазматичних тільцях.

При фарбуванні матеріалу розчином акридинового оранжевого ядерні та цитоплазматичні тільця забарвлюються в яскраво червоний колір, а ядра при цьому зелені; всередині ядер розташовані яскраво червоні ядерця. Проведено наступні контролі: обробка А). 1% водним розчином пронази протягом 15, 30 та 60 хвилин; Б). 1% водним розчином РНКази протягом 15, 30 та 60 хвилин; В). Одночасна обробка 1% водним розчином пронази та 1% водним розчином РНКази протягом 15, 30 та 60 хвилин. Встановлено, що після незалежної обробки проназою та РНКазою колір тілець обох типів та ядерець майже не змінюється: після обробки проназою колір ядерних та цитоплазматичних тілець, так само як і ядерця, взагалі не змінюється, а при обробці окремо РНКазою ядерце, ядерні та цитоплазматичні тільця з яскраво оранжевих червоних перетворюються в слабко оранжеві. Комплексна обробка двома ферментами (проназа + РНКаза) вже за 15 хвилин призводить до певної втрати кольору, за 30 хвилин – до значної втрати яскраво оранжевого кольору, а за 60 хвилин призводить до повного знебарвлювання ядерця та внутрішньоклітинних тілець.

Отже, фарбуванням акридиновим оранжевим з одночасним проведенням контролів показано, що ані ядерні, ані цитоплазматичні тільця не містять ДНК, тоді як РНК присутня в цих тільцях.

Таким чином, цитохімічними тестами доведено, що внутрішньоклітинні тільця епідермальних клітин однорічних пагонів жовтої акації містять РНК.

Реакція на білки. Обробка матеріалу бромфеноловим синім призводить до того, що і ядра, і цитоплазматичні тільця набувають фіолетово-синього забарвлення. При фарбуванні епідермальних клітин клітин на основні білки розчином міцного зеленого і ядра, і тільця позитивно стають яскраво зеленими. При обробці сумішшю 10% формола та 1% гідрохінона на аргентофільні білки як ядерця, так і ядерні та цитоплазматичні тільця забарвлюються в коричневі кольори, що вказує на присутність аргентофільних білків у внутрішньоклітинних тільцях.

Реакція на крохмаль та ліпіди. При фарбуванні зразків розчином Люголю на крохмаль ані ядра, ані тільця не фарбуються. Цитохімічним фарбуванням не виявляється також присутності ліпідів у ядерних та цитоплазматичних тільцях.

Електронна мікроскопія. Реакція на присутність білків. При обробці ультратонких зрізів з внутрішньоклітинними тільцями 1% водним розчином пронази відбуваються зміни текстури як ядерних, так і цитоплазматичних тілець: проназа руйнує вміст тілець. Таким чином, електронно мікроскопічною цитохімією підтверджено наявність білків у тільцях.

Електронна мікроскопія. Реакція на присутність аргентофільних білків. При обробці ультратонких зрізів епідермальних клітин жовтої акації із тільцями 2% розчином AgNO3 встановлено, що гранули срібла осідають як на ядерних, так і на цитоплазматичних тільцях.

Дані електрофорезу сумарних білків. Проведеним одномірним електрофорезом сумарних білків матеріалу черешків листків, квітконіжок та чашолистків жовтої акації встановлено наявність біля 24 білкових смужок у треках з молекулярними масами від близько 29 до 160 kDa, серед яких білок молекулярною масою близько 64 кДа присутній лише в черешках, квітконіжках та чашолистках. Кількість цього білку збільшується у відповідності до стадій біогенезу тілець та сягає максимуму на стадії цвітіння квіток, тоді як в зрілих листках рослини цей білок не знайдений. Таким чином, білок масою близько 64 кДа є унікальним тим, що його поява та зміни його кількості відбуваються у послідовності до фаз біогенезу внутрішньоклітинних тілець.

Обговорення одержаних даних. В результаті досліджень структурно-функціональної організації епідермісу однорічних пагонів жовтої акації показано, що морфологія цих клітин суттєво не відрізняється від такої інших видів (Данилова, 1980; Баранова, 1992). Морфологія епідермісу однорічних пагонів жовтої акації є типовою для дводольних рослин, а за формою основних епідермальних клітин епідерміс черешків листків відноситься до прямолінійного типу, а квітконіжок та чашолистків – до криволінійного типу.

За ультраструктурними характеристиками клітини епідермісу однорічних пагонів жовтої акації на стадіях диференціювання від меристематичних до зрілих є типовими. Ультраструктурні характеристики протодермальних клітин однорічних пагонів жовтої акації під час розтягання наступні. Як і у інших представників (Яковлєва, 1990; Баранова, 1988; Akers et al., 1987; Glower, 2001), хлоропласти збільшуються в діаметрі, а розміри мітохондрій лишаються такими, як і у протодермальних клітин, але їх кількість збільшується, вакуолі починають зливатися; кількість диктіосом та цистерн ендоплазматичного ретикулуму збільшується, а ядро змінює свою локалізацію та набуває ацентричного положення в клітині. Однак, значною особливістю нашого об’єкту є зміни ультраструктурної організації ядер протодермальних клітин однорічних пагонів жовтої акації під час розтягання: в локальних місцях об’єм перинуклеарного простору збільшується в кілька разів, що призводить до утворення випинань зовнішньої мембрани ядерної оболонки в цитоплазму, відбувається також збільшення ядерних пор. Подібні явища не були описані в протодермальних клітинах, що розтягаються, у інших представників дводольних. Подібно до інших інших клітин під час розтягання (Соболь, 2001), ядерце збільшується в діаметрі, а його текструра стає рихлою, при цьому гранулярний компонент ядерця стає сильно деконденсованим, і ядерце набуває яскраво вираженого нуклеолонемного типу. На поверхні ядерця з’являються ядерні тільця, які будуть охарактеризовані нами пізніше, при описанні біогенезу ядерних тілець. З літературних даних відомо, що ядерце може бути представлено одним з дев'яти основних морфологічних типів: компактне, нуклеолонемне, серцевине, ретикулярне, вакуолізоване, кільцеве, сегреговане, щільно-фібрилярне та у вигляді вільних фібрилярних центрів. Дані про різну функціональну активність описаних морфологічних типів ядерець дозволяють виділити серед них високоактивні, помірноактивні, малоактивні та неактивні. До високоактивних ядерець, безперечно, належать компактні та нуклеолонемні ядерця, а також ядерця типу кора-серцевина (Челидзе, 1988). Нуклеолонемний тип ядерець епідермісу однорічних пагонів жовтої акації свідчить про активний стан синтетичних процесів, які відбуваються в клітинах.

Подібно до інших об’єктів (Luck et al., 1982; Lafontaine et al., 1991; Lafontaine et al., 1995; Gulemetova et al., 1998; Chamberland et al., 1999), під час розтягання протодермальних клітин на поверхні ядерця з’являються тільця, які зв’язані з ядерцем. За будовою ядерні тільця являють собою структури з коротких фібрил діаметром 6-7 нм, які щільно переплетені та, завдяки своїй упаковці, формують тіло тільця, яке в кілька разів щільніше за ядерце. Особливою характеристикою внутрішньоклітинних тілець жовтої акації, на відміну від інших об’єктів, є те, що вони мають послідовні фази свого розвитку – біогенез. Спочатку розміри ядерних тілець невеликі, до 0,1-0,2 мкм у діаметрі, що притаманно і ядерним тільцям інших рослин (Boundonck et al., 1998; Shaw et al., 1998; Echeverria et al., 1999; Sleeman et al., 1999), але, під час розтягання клітин епідерми жовтої акації, на відміну від інших рослинних об’єктів, діаметр цих тілець збільшується до 1-1,5 мкм, і вони, на відміну від інших прикладів, залишаються фізично зв’язаними з ядерцем. За невеликим винятком (Gulemetova, 1998), в літературі описана поява ядерних тілець в диференційованих клітинах, тоді як в нашому випадку поява цих утворень відбувається в протодермальних клітинах, а збільшення їх розмірів – під час розтягання клітин. Особливістю ядерних тілець нашого об’єкту є також те, що під час розтягання клітин розміри тілець можуть перевищувати розміри ядерець. Як відомо з літератури, у більшості випадків ядерні тільця мають рибонуклеопротеїдну природу (Luck et al., 1982; Lafontaine et al., 1991; Lafontaine et al., 1995; Gulemetova et al., 1998; Chamberland et al., 1999).

Під час подальшого розтягання клітин однорічних пагонів жовтої акації ультраструктурна характеристика клітин лишається, так як і у інших об’єктів (Мирославов, 1974; Баранова, 1988, Баранова, 1992), типовою для клітин цього типу. Ядро лишається ацентрично розташованим, розміри та кількість хлоропластів та мітохондрій не змінюються у порівнянні з ранніми стадіями розтягання, а кількість диктіосом та цистерн ендоплазматичного ретикулуму не змінюється. Вакуолі зливаються в одну центральну вакуоль, яка відтісняє ядро у бік клітини. Ядро при цьому, на відміну від ядер епідермальних клітин інших об’єктів, зазнає певних ультраструктурних змін. Розширення перинуклеарного простору супроводжується появою в цитоплазмі, біля зовнішньої мембрани ядерної оболонки, цитоплазматичних тілець, які за своєю текстурою ідентичні ядерним тільцям. Цей етап - наступний крок біогенезу тілець в епідермальних клітинах однорічних пагонів жовтої акації. В літературі відсутні дані про одночасне формування ідентичних тілець як в ядрі, так і в цитоплазмі. У нашому випадку формування цитоплазматичних тілець збігається в часі з розширенням перинуклеарного простору, збільшенням пор ядерної мембрани та вельми активним станом ядерця. У зв’язку з тим, що за текстурою та хімічним складом внутрішньоядерні тільця подібні цитоплазматичним, можна припустити, що після синтезу в ядерці та первинної акумуляції у вигляді внутрішньоядерного тільця, компоненти цього утворення у якості макромолекулярних структур мігрують до цитоплазми крізь ядерні пори, де і збираються de novo в цитоплазматичні тільця. Таким чином, процес диференціювання клітин епідермісу черешків листків, квітконіжок та чашолистків жовтої акації від протодермальних до диференційованих супроводжується разючими ультраструктурними змінами клітин, особливо під час розтягання протодермальних клітин.

Наступні кроки біогенезу ядерних та цитоплазматичних тілець є унікальними і ніколи не описані ще для інших об’єктів. Впродовж подальшого розтягання епідермальних клітин відбувається ріст цитоплазматичних тілець, при цьому ядерні тільця більше не спостерігаються в ядрі. При цьому відбувається ріст цитоплазматичних тілець та оточення їх гомогенною зоною, яка пронизується цистернами гранулярного ендоплазматичного ретикулуму. При цьому цитоплазматичне тільце зростає в діаметрі до 5-6 мкм, а загальний діаметр цитоплазматичного тільця разом з гомогенною зоною зростає до 10-12 мкм. Наступні етапи біогенезу тілець включають полімеризацію вмісту цитоплазматичних тілець та формування пучки паралельно упорядкованих фібрил, які радіально виходять з цитоплазматичних тілець у їх гомогенні зони. При цьому самі цитоплазматичні тільця починають дисоціювати. Пізніше, наприкінці розтягання клітин, пучки паралельно упорядкованих фібрил розходяться в цитоплазмі. В диференційованих вакуолізованих епідермальних клітинах, після опадання пелюсток та утворення зав’язей, цитоплазматичні тільця присутні, а ядро містить одне ядерце щільного малоактивного типу.

Закономірним виникає питання про природу ядерних та цитоплазматичних тілець. Як було зазначено раніше, внутрішньоклітинні тільця-включення рослин можуть бути представлені утвореннями вірусної природи або бути такими, що притаманні нормальній здоровій рослинній клітині (Чернышёв, 2000). Результатом різних вірусологічних тестів показано, що ядерні та цитоплазматичні тільця епідермальних клітин молодих пагонів жовтої акації не мають вірусної етіології Імовірніше за все, що ці тільця утворюються в нормальних здорових клітинах.

Послідовність етапів біогенезу ядерних тілець (ЯТ) та цитоплазматичних тілець (ЦТ) відносно росту розтяганням та диференціювання клітин може бути представлено наступним чином:

Ядерце (меристематичні протодермальні клітини) > Ядерце + ЯТ (початок росту клітин розтяганням) > Ядерце + ЯТ + ЦТ (ріст клітин розтяганням) > Ядерце + ЦТ, оточене гомогенною білковою зоною (наприкінці росту клітин розтяганням) > Ядерце + полімеризація ЦТ та його утилізація (кінець росту клітин) > Ядерце (диференційовані епідермальні клітини).

Застосування цитохімічних тестів показує, що ядерні та цитоплазматичні тільця не містять ДНК, ліпідів та крохмалю та складаються з РНК, яка щільно упакована з білками (табл. 1) переважно у вигляді коротких тонких фібрил приблизно 6 нм завтовшки.

Порівняння складу та біогенезу цитоплазматичних тілець в епідермальних клітинах жовтої акації, описаних нами, та клітинах гаметофіту моху (Ligrone, 1985) показує як їх схожість за рибонуклеопротеїновою природою (навіть за дією пронази та рибонуклеази), так і принципові відмінності щодо їх подальшого унікального біогенезу в епідермальних клітинах та функціонального значення. Цитоплазматичні тільця жовтої акації утворюються в епідермальних клітинах під час їх росту розтяганням – періоду, який характеризується найвищою метаболічною активністю (Сингер, 1998), що підтверджується і на рівні ультраструктурної організації клітини та свідчить, зокрема, про високу активність транскрипції рРНК та інтенсивний макромолекулярний транспорт між ядром та цитоплазмою, який відбувається через ядерні пори, кількість яких в значній мірі залежить від розміру клітин та рівня біосинтезу (Сингер, 1998).

Таблиця 1

Результати забарвлення ядерця, ядерних (ЯТ) та цитоплазматичних (ЦТ) тілець в епідермальних клітинах черешків листків та квітконіжок жовтої акації в процесі їх розтягання та диференціювання

Хімічний

Компонент | Тест | Реакція

Ядерце | ЯТ | ЦТ

Ліпіди | Судан IV | - | - | -

Крохмаль |