Автореф
ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ЮРІЯ ФЕДЬКОВИЧА
ЧАЙКОВСЬКА Ганна Богданівна
УДК 636:2.577.1:597.551.2
РОЛЬ ЛІПІДІВ В АДАПТАЦІЇ МОЗКУ РИБ ДО ДІЇ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ
03.00.04 – біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Чернівці – 2005
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Тернопільському національному педагогічному університеті імені Володимира Гнатюка Міністерства освіти і науки України.
Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор
Грубінко Василь Васильович,
Тернопільський національний педагогічний
університет імені Володимира Гнатюка
завідувач кафедри загальної біології.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Мещишен Іван Федорович
Буковинський державний медичний університет,
завідувач кафедри медичної хімії;
кандидат біологічних наук
Коновець Ігор Миколайович,
Інститут гідробіології НАН України, відділ
екологічної фізіології водних тварин та іхтіології,
старший науковий співробітник.
Провідна установа: Київський національний університет
імені Тараса Шевченка, м. Київ.
Захист відбудеться 14 вересня 2005 р. 12.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05 в Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича за адресою: вул. Лесі Українки, 25 (III корп., ауд. № 81), Чернівці, 58012, Україна.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича за адресою: вул. Лесі Українки, 23, Чернівці, 58012, Україна.
Автореферат розісланий 12 серпня 2005 р.
Учений секретар
спеціалізованої вченої ради Копильчук Г.П.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. В організмі риб функціонує складна система біохімічної адаптації, яка формує певний рівень толерантності організму до стресових факторів середовища, включно токсичних. Ця система є набором структурно-метаболічних адаптацій, які забезпечуються практично всіма метаболічними компонентами клітин (Хочачка П., Сомеро Дж., 1988; Грубінко В.В., 1995, Курант В.З., 2003; Столяр О.Б., 2004).
Дослідженнями встановлено, що вміст ліпідів, співвідношення їх окремих фракцій та жирнокислотний склад у мозку тварин при дії екстремальних факторів навколишнього середовища істотно змінюється (Гершанович А.Д., 1991; Болгова О.М., 2000). Ці дані дають підставу вважати, що зміни спрямованості ліпідного обміну є складовою частиною комплексу неспецифічних реакцій у відповідь на будь-яку несприятливу дію, одним із чинників адаптації клітинного метаболізму за умов стресу.
Відомо, що для гідробіонтів серед значної кількості стрес-факторів найбільш небезпечними є солі важких металів (Евтушенко Н.Ю., 1992; Линник П.Н., 1999). Проте, кількісна сторона їх впливу і біохімічні механізми, які лежать в основі відповіді ліпідного обміну, особливо у мозку гідробіонтів, на сьогодні вивчені недостатньо. Вкрай обмежена інформація про вплив важких металів на ліпідний обмін у мозку риб позбавляє екотоксикологічні дослідження значної інформаційної бази біохімічних параметрів риб, які можна використовувати для діагностики екотоксикологічних ситуацій. Даний факт вплинув на вибір теми дисертаційної роботи. Наші дослідження присвячені важливій з теоретичної і практичної точки зору проблемі дослідження впливу розчинених у воді солей свинцю, міді, марганцю та цинку на різні сторони ліпідного обміну в головному мозку риб.
Зв’язок з науковими програмами і темами. Робота виконана в межах науково-дослідницької теми держбюджетної тематики Міністерства освіти і науки України “Токсикоспецифічні адаптації гідробіонтів та водних екосистем до дії іонів важких металів та їх регуляція (2001 – 2003 р., № держреєстрації 0101Y000303).
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було з’ясування впливу підвищених концентрацій солей водного середовища (свинцю, міді, цинку та марганцю) на вміст, динаміку та обмін ліпідів у головному мозку коропа та встановлення механізмів формування стійкості нервової системи риб до цих токсикантів.
Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:
- вивчити особливості накопичення свинцю, міді, цинку та марганцю в головному мозку коропа при підвищеній їх концентрації у водному середовищі;
- встановити вплив іонів свинцю, міді, цинку та марганцю на співвідношення окремих фракцій ліпідів та фосфоліпідів у головному мозку коропа;
- дослідити зміни складу жирнокислотних компонентів ліпідів мозку риб за дії токсикантів;
- вивчити вплив іонів досліджуваних металів на інтенсивність синтезу загальних ліпідів та їх окремих фракцій при використанні у якості попередника [1-14С]-ацетату та особливості його окислення у мозку коропа;
- розглянути можливість використання досліджених параметрів для діагностики небезпечності токсикантів у воді і її якості.
Об’єкт дослідження: ліпідний обмін в тканинах коропа за дії підвищених концентрацій іонів важких металів у воді.
Предмет дослідження: зміни загальноліпідного, фосфоліпідного та жирнокислотного складу головного мозку коропа при дії іонів важких металів.
Методи дослідження: біохімічні, біофізичні, варіаційно-статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. В результаті дослідження вперше отримано дані про накопичення свинцю, міді, цинку та марганцю у мозку коропа при підвищеній їх концентрації у воді. На субстратно-метаболічному рівні встановлено та проаналізовано зміни вмісту окремих фракцій ліпідів, фосфоліпідів, їх жирнокислотного складу та інтенсивності їх синтезу та окислення у мозку коропа при дії солей важких металів. Встановлено адаптивне значення окремих напрямків загальноліпідного та фосфоліпідного обміну та динаміки вищих жирних кислот у підтриманні енергетичного та метаболічного гомеостазу. Виявлено зміни ліпідного складу мозку коропа для оцінки фізіологічного та метаболічного гомеостазу організму риб.
Практичне значення роботи. Система фізіолого-біохімічних показників обміну загальних ліпідів, фосфоліпідів та вищих жирних кислот у головному мозку Сyprinus carpio L. об’єктивно відображає чутливість організму прісноводних промислових риб до токсичних впливів важких металів у водному середовищі і може слугувати основою для розроблення експрес-методів виявлення біохімічних пошкоджень у риб токсикантами та оцінки якості водного середовища для ставкового рибництва.
Одержані дані можуть використовуватися при читанні нормативних та спецкурсів для студентів біологічних та екологічних спеціальностей вищих навчальних закладів.
Апробація результатів роботи. Результати досліджень, які проводилися в ході виконання дисертаційної роботи доповідались на ІІІ з’їзді Гідроекологічного товариства України (Україна, Тернопіль, 2001); VIII Українському біохімічному з’їзді (Україна, Чернівці, 2002); Всеросійській конференції „Современные проблемы водной токсикологии(Ярославль, 2002); Міжнародній конференції молодих вчених “Політ” (Україна, Київ, 2002).
Публікації. За результатами досліджень опубліковано 8 наукових публікацій, в яких викладено основний зміст наукових досліджень, з них 6 – у фахових виданнях.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно опрацьовано літературу, власноручно виконано експериментальну частину дисертаційної роботи, статистичну обробку результатів, аналіз отриманих результатів проведено за участю наукового керівника. Автором сформульовані висновки і запропоновані рекомендації за результатами проведених досліджень.
Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 139 сторінках комп’ютерного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 4 підрозділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних літературних джерел (всього 244 найменувань, з них 124 кирилицею та 120 латиницею). Робота проілюстрована 17 таблицями та 10 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. В розділі наведено аналіз наявної у вітчизняній та зарубіжній фаховій літературі інформації щодо значення ліпідів в забезпеченні функціонального гомеостазу мозку риб за дії екстремальних чинників зовнішнього середовища. Аналіз публікацій з даної проблеми дозволив дійти висновку, що в літературі практично відсутні відомості про вплив іонів важких металів на динаміку ліпідного складу мозку риб, що не лише не дозволяло дійти певних узагальнень щодо адаптивних можливостей мозку гідробіонтів, а й підійти до кількісної оцінки стану якості середовища за біохімічними показниками. Вирішенню цих проблем присвячена дана робота.
Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведено на дворічках коропа (Сyprinus caprio L.) масою 250 – 300 г. Риб утримували в акваріумах об’ємом 200 л, заповнених відстояною водопровідною водою за наступних умов: вміст О2 – 7,5±0,5 мг/л; СО2 – 2,5±0,3 мг/л; рН – 7,8±0,1. У кожному акваріумі утримувалось по 5 риб. Риб під час аклімації не годували. Досліджувався вплив на риб іонів Mn2+ при концентраціях відповідно 2,4 та 6,0 мг/л, Cu2+ - при 0,2 та 0,5 мг/л, Pb2+ – при 0,2 та 0,5 мг/л, Zn2+ – при 2,0 та 6,0 мг/л, що відповідають 2 та 5 санітарно-гігієнічним гранично-допустимим концентраціям (ГДК) (Сидоров В.С., Немова Н.Н., 2002). Необхідну концентрацію іонів металів у воді створювали розчиненням у ній відповідної кількості солей MnCl2·4H2O; CuSO4·5H2O; Pb(NO3)2; ZnSO4·5H2O. За контроль правили досліджувані показники в риб, які утримувалися у водному середовищі без додавання солей металів, але з тими ж іншими гідрохімічними показниками. Період аклімації риб становив 14 днів, що є достатнім для формування адаптивної відповіді на дію стрес - фактору (Хочачка П., Сомеро Дж., 1988).
Для дослідження вмісту міді, цинку, марганцю та свинцю в тканині мозку, останню спалювали в перегнаній нітратній кислоті у співвідношенні 1:5 (маса: об’єм). Вміст цинку, міді та марганцю визначали на атомно-адсорбційному спектрофотометрі С-115, свинцю на S-60 і виражали в міліграмах на кілограм вологої маси в тканині.
Ліпіди з гомогенату тканини екстрагували сумішшю хлороформу-метанолу (2:1) (Folch J., 1957). Масову частку ліпідів у тканині визначали ваговим методом (Кейтс М., 1975). Розділення ліпідів на окремі класи проводили методом висхідної одномірної тонкошарової хроматографії (Копытов Ю.П., 1983). Кількість неполярних ліпідів визначали біхроматним методом (Прохорова М.И., 1982). Вміст фосфоліпідів у тканині мозку визначали за кількістю неорганічного фосфору спектрофотометрично за методом Васьковського (Vaskovsky V.E., 1975). Розділення фосфоліпідів на окремі підкласи проводили методом висхідної двохмірної мікротонкошарової хроматографії (Копытов Ю.П., 1983).
Інтенсивність синтезу ліпідів у мозку коропа досліджували шляхом визначення зміни ступеня використання радіоактивно міченого ацетату на сцинтиляційному лічильнику LKB (Швеція). Дослідження інтенсивності енергетичних процесів у мозковій тканині риб проводили шляхом визначення радіоактивності 14СО2 на вказаному лічильнику (Вовк С.И., 1988).
Для визначення жирнокислотного складу мозку риб проводили розділення метилових ефірів жирних кислот на газорідинному хроматографі N-AWHMDS (Стефаник М.Б., Скорохид В.И., 1985).
Одержані цифрові дані опрацьовували статистично (Лакин Г.Ф., 1990).
Результати дослідження та їх обговорення
Особливості накопичення важких металів в мозку риб при підвищеній їх концентрації у водному середовищі. Проведені експериментальні дослідження дозволили встановити загальні тенденції зміни вмісту важких металів в мозку коропа залежно від концентрації їх іонів у воді. З наведених результатів (табл.1) видно, що рівень накопичення свинцю, міді, марганцю чи цинку індивідуальний для кожного з них і, очевидно, визначається їх хімічною активністю, здатністю до комплексоутворення, концентрацією у водному середовищі та специфікою взаємодії з клітинними структурами.
Таблиця 1
Вміст цинку, марганцю, міді і свинцю в мозку коропа
(в мг/кг вологої тканини; Мm, n=5)
Контроль | 2 ГДК | 5 ГДК
Zn
6,03 ± 0,54 | 12,8 ± 0,09* | 6,99 ± 0,47
Mn
0,098 ± 0,0114 | 0,11 ± 0,015 | 0,19±0,021*
Cu
1,42 ± 0,21 | 1,94 ± 0,21* | 1,51 ± 0,11
Pb
0,13 ± 0,018 | 0,12 ± 0,021 | 0,16 ± 0,015
Примітка: * - ступінь вірогідності різниці досліджуваних показниках у риб дослідних груп порівняно до показників у риб контрольної групи
На основі проведених досліджень встановлено такий ряд зменшення концентрації вмісту досліджуваних металів в мозку коропа: Zn > Cu > Mn > Pb. Із збільшенням їх концентрації у воді до 2 і 5 ГДК зафіксовано істотні зміни показників ступеня накопичення в мозку.
Так, аналіз результатів вмісту цинку у мозку дослідних риб показав, що через 14 діб його рівень збільшився в 2,12 разів (Р<0,05) при 2 ГДК. При 5 ГДК суттєвих відхилень від контролю не спостерігається, що можна пояснити функціонуванням в мозку коропа специфічних адаптивних механізмів високої точності щодо підтримання гомеостазу цинку (McGeer J.C et al., 2000), як надзвичайно важливого в організмі риб мікроелемента (Vallee B.L., Falchuk K.H., 1993).
Незначний вміст марганцю у мозку при підвищенні концентрації його іонів у водному середовищі до 5 ГДК зростає в 1,94 рази (Р<0,05) порівняно з контролем. Відомо, що марганець для тварин метаболічно важливий іон (Loukin S., Kung C., 1995). З огляду на це, в процесі еволюції виробилися специфічні пристосування щодо підтримки необхідних внутрішньоклітинних рівнів марганцю. Один із них – це ізолювання іонів марганцю в мембранах, які мають специфічні переносники, що регулюють пул марганцю в клітині (Paidhungat M., Garrett S., 1988).
Для міді можна відмітити вірогідне зростання її рівня в мозку коропа при 2 ГДК. Одним із способів переведення іонів міді у нетоксичну для риб форму є зв’язування її з низькомолекулярними білками металотіонеїнами та іншими сірковмісними сполуками (Paris-Palacioosa S. et al., 2000) або транспортування іонів металу за допомогою специфічних переносників в ізольовані клітинні структури.
Щодо накопичення свинцю, то нами не виявлено значних відхилень у вмісті досліджуваного металу в мозку дослідних тварин порівняно з контрольними. Невисокий вміст свинцю у мозку риб, а також відсутність процесів його акумулювання при підвищеній у воді концентрації його іонів свідчить про функціонування гемато-енцефалічного бар’єру, який є непроникним для цього токсиканта (Marshal A.T., Talbot V., 1999). З іншого боку, дана тенденція може бути обумовлена виключно хімічним фактором – внаслідок адсорбції завислими частинками води свинець переходить у нерозчинні форми, що погано засвоюються організмом (Shu T. et al., 2000).
Отже, для кожного металу існують своєрідні закономірності накопичення у мозку коропа. Вірогідне збільшення вмісту цинку та міді при 2 ГДК, а також марганцю при 5 ГДК свідчить про здатність мозку депонувати значну кількість цих елементів, що є одним із механізмів адаптації до зростання концентрації їх іонів у воді. Разом з тим, мозок є бар’єром для іонів свинцю або функціонують механізми прискореного виведення даного токсиканта з нервової тканини.
Дослідження вмісту ліпідів та їх окремих фракцій у мозку коропа. Як показали результати наших досліджень, в мозку риб існує складний зв’язок між накопиченням важких металів та порушенням структури ліпідних компонентів. У цьому плані, насамперед, звертає на себе увагу значне збільшення вмісту загальних ліпідів в головному мозку коропа при інтоксикації іонами свинцю: у 1,21 рази при 2ГДК та у 2,31 рази – при 5 ГДК, іонами цинку - у 1,46 рази при 5 ГДК та вірогідне зменшення їх кількості при дії іонів марганцю, міді та цинку, відповідно в 1,23, 1,16 та 1,23 рази при 2 ГДК (рис.1).
Рис. 1. Вміст загальних ліпідів у мозку коропа при
інтоксикації іонами важких металів
Збільшення кількості загальних ліпідів в головному мозку коропа свідчить про підсилення анаболічних процесів з метою їх використання в адаптивних перебудовах в умовах токсичного стресу (Мельник Д.О., Михайлівський В.О., 2000).
Одним із можливих пояснень зменшення кількості загальних ліпідів при інтоксикації іонами важких металів може слугувати факт їх використання як енергетичних ресурсів організму (Шульман Г.Є., 1990).
Як з’ясувалося в наших наступних дослідженнях, збільшення кількості загальних ліпідів при дії іонів свинцю, насамперед, пов’язане із зміною кількості фосфоліпідів у їх складі: збільшення їх вмісту у 1,12 та у 1,52 рази відповідно при 2 і 5 ГДК (табл. 2). Ці дані узгоджуються з наявними в літературі даними про інтенсивність синтезу фосфоліпідів, як своєрідного захисту клітин організму від проникнення через їх мембрану токсикантів (Меерсон Ф.З., 1981). Вірогідне збільшення кількості фосфоліпідів спостерігається також при наявності у воді іонів міді в концентрації, що відповідає 2 ГДК - в 1,13 рази. Активуючий вплив міді на ліпотропну функцію фосфоліпідів, мозку риб пов’язаний із змінами, під її впливом активності ліполітичних ферментів (Nemcsok J. et al., 1995).
Таблиця 2
Вміст індивідуальних ліпідів (% від загальної кількості ліпідів) в мозку коропа при дії іонів важких металів (Мm, n=5)
Фрак-ції | контроль | Pb2+ | Zn2+ | Mn2+ | Cu2+
2 ГДК
ФЛ
ХЛ
НЖК
ТАГ
ЕХЛ | 13,44±0,43
11,74±0,70
22,23±0,57
33,05±1,19
19,54±1,01 | 15,02±0,45*
13,96±0,44*
23,50±1,03
29,46±1,19
18,06±0,46 | 13,52±0,67
15,14±0,19*
22,46±1,24
31,08±0,97
17,98±0,81 | 14,48±0,72
10,90±0,66
24,24±0,62*
30,36±0,89
20,02±1,13 | 15,24±0,16*
15,25±1,06*
23,20±1,95
30,01±1,80
16,30±1,68
5 ГДК
ФЛ
ХЛ
НЖК
ТАГ
ЕХЛ | 13,44±1,43
11,74±0,70
22,23±0,57
33,05±1,19
19,54±1,01 | 20,44±1,74*
9,96 ± 0,80
28,54±1,16*
34,18 ± 2,36
16,86±0,97* | 16,18 ±1,09
9,34 ± 0,86
27,20±1,86*
33,83 ± 3,11
19,36 ± 1,54 | 15,40 ±1,69
9,74 ± 0,61
28,50±2,58*
36,70 ± 2,89
23,64 ± 2,83 | 11,20 ±1,17
10,75 ± 1,28
25,25±1,07*
35,55 ± 2,85
24,12 ± 1,77
Примітка: умовні позначення: ФЛ – фосфоліпіди, ХЛ – холестерол, НЖК - неетерифіковані жирні кислоти, ТАГ – триацилгліцероли, ЕХЛ – ефіри холестеролу
Відносний вміст холестеролу у загальній кількості ліпідів тканини мозку коропа значно більший у дослідних риб порівняно з контрольними при дії іонів свинцю, цинку та міді в концентрації, що відповідає 2 ГДК: відповідно у 1,19; 1,29 та 1,30 рази (Р<0,05). Дані зміни, як правило, супроводжуються зниженням катіонної проникності мембрани (Freedman R.B., 1991), інгібуванням більшості ліполітичних ферментів (Kayama M., Shimada H., 1992). При 5 ГДК зміни вмісту холестеролу відсутні.
Зміни у відносному вмісті ефірнозв’язаного холестеролу у тканині головного мозку коропа при дії іонів свинцю в концентрації, що відповідає 5 ГДК протилежні за напрямком до змін відносного вмісту вільного холестеролу. Токсичний вплив, ймовірно, спричиняє лабілізацію плазматичної мембрани і надходження в цитоплазму кислих гідролаз, в тому числі гліцерид ліпази та гідролази ефірів холестеролу, активність яких і визначає дані зміни (Kayama M., Shimada H., 1992).
Аналіз вмісту неетерифікованих жирних кислот свідчить про збільшення їх частки при дії іонів важких металів в концентрації, що відповідає 5 ГДК: в 1,28; 1,22; 1,29 та 1,14 рази відповідно при дії іонів свинцю, цинку, марганцю та міді. Аналогічні зміни характерні і для іонів марганцю в концентрації, що відповідає 2 ГДК: збільшення відносного вмісту неетерифікованих жирних кислот (P<0,05).
Частка триацилгліцеролів у складі ліпідів у тканині головного мозку коропа в дослідних риб змінюється відносно мало (P<0,5–0,1).
Загалом, одержані нами дані свідчать про збільшення загального вмісту загальних ліпідів та фосфоліпідів при інтоксикації іонами свинцю; зменшення кількості загальних ліпідів на фоні збільшення вмісту фосфоліпідів при дії іонів міді; зменшення кількості загальних ліпідів при дії іонів цинку та марганцю в концентрації, що відповідає 2 ГДК, та їх збільшення при 5 ГДК; тенденцію до збільшення неетерифікованих жирних кислот за дії усіх досліджуваних металів при 5 ГДК та збільшення відносної частки холестеролу при дії іонів свинцю, міді та цинку в концентрації, що відповідає 2 ГДК.
Вміст загальних фосфоліпідів і співвідношення їх окремих представників при дії солей важких металів. Вивчення змін у вмісті фосфоліпідів в мозку риб при дії токсикантів показало, що іони важких металів активно впливають на метаболізм фосфоліпідів в мозку коропа, зміщуючи його спрямованість в бік утворення так званих „адаптивних метаболітів” фосфоліпідного складу (табл. 3).
Зокрема, при дії іонів свинцю в головному мозку риб спостерігається вірогідне зниження вмісту фосфотидилхоліну на 10,7% порівняно з контролем, та на 12,1 і 11,9% відповідно при дії іонів міді та марганцю. Фосфотидилхолін є найбільш насиченим фосфоліпідом мозку риб, тому, відповідно, зменшення його загальної кількості призводить до збільшення індекса ненасиченості ліпідів нейрональних мембран. Зниження частки фосфотидилхоліну можна пояснити з таких позицій. По-перше, активацією синтезу фосфатидилетаноламіну (вміст останнього збільшується на 14,6% при дії свинцю, на 13,8 та 7,24% при дії іонів марганцю та міді (2 ГДК). При 5 ГДК ці показники є більш чітко вираженими: на 25,9; 24,50 та 16,05% відповідно за дії солей свинцю, міді та марганцю. По-друге, деградацією фосфатидилхоліну з наступним накопиченням лізофосфатидилхоліну та вільних жирних кислот (Exton J.H., 1994) (вміст лізофосфатидилхоліну зростає при дії іонів свинцю та міді: відповідно на 27,6 % та 9,21 % відносно контролю при 2 ГДК та на 33,6 і 36,8 % при 5 ГДК). По-третє, зменшення вмісту фосфатидилхоліну у мозку коропа супроводжується збільшенням вмісту сфінгомієліну в ліпідах його нейрональних мембран.
Збільшення частки сфінгомієліну при інтоксикації іонами свинцю та марганцю (відповідно на 37,2% та на 12,79 % відносно контролю при 2 ГДК) а також іонами міді в концентрації, що відповідає 5 ГДК (на 21,3% (P<0,05), може свідчити про активацію його синтезу із фосфатидилхоліну.
Таблиця 3
Вміст індивідуальних фракцій фосфоліпідів (в % від загальної кількості фосфоліпідів) в мозку коропа при дії іонів важких металів (Мm, n=5)
Фракції | контроль | Pb2+Zn2+Mn2+Cu2+
2 ГДК | ЛФХ
ФІ
СФМ
ФХ
ФС
ФЭА | 1,52±0,12
2,76±0,52
2,58±0,29
47,76±1,19
6,72±0,50
36,46±1,07 | 1,94±0,08*
2,28±0,55
3,54±0,74
42,68±2,08*
5,78±0,58
41,8±2,29* | 1,66±0,68
2,50±0,27
2,40 ± 0,27
48,50±0,99
6,72±0,39
37,12±0,51 | 1,34±0,36
2,48±0,41
2,91±0,26
42,10±1,26*
6,16±0,92
41,50±1,07* | 1,82± 0,06*
2,22±0,30
2,24±0,31
42,00±1,01*
6,01±0,76
39,10± 1,45 | 5 ГДК | ЛФХ
ФІ
СФМ
ФХ
ФС
ФЭА | 1,52±0,12
2,76±0,52
2,58±0,29
47,76±4,19
6,72±0,50
36,46±3,07 | 2,03,25**
2,49±2,43
2,94±0,28
40,31±4,03*
6,33,59
45,9±3,94* | 1,70±0,51
2,91±0,21
2,24±0,30
48,963,42
6,10,51
38,09±4,39* | 1,54 ± 0,21
3,02,41
4,41±0,39*
42,40±3,99*
6,59±0,77
42,31±3,41* | 2,08±0,19*
3,18,21
3,10,32
37,61±3,01*
9,60,61
45,41±4,48 |
Примітка: ЛФХ – лізофосфатидилхолін, ФІ – фосфатидилінозитид, СФМ – сфінгомієлін, ФХ - фосфатидилхолін, ФС – фосфатилсерин, ФЭА–фосфатидилетаноламін.
Отже, можна вважати, що метаболізм фосфоліпідів при дії іонів важких металів характеризується такими змінами: метилювання фосфатилетаноламіну з утворенням фосфатидилхоліну при дії іонів свинцю, міді та марганцю; деградацією фосфатидилхоліну під дією фосфоліпази А1 і А2 з наступним накопиченням лізофосфатидилхоліну за дії свинцю та міді; перенесення фосфорилхоліну фосфатидилхоліну з утворенням сфінгомієліну.
Динаміка жирнокислотного складу ліпідів мозку коропа при дії іонів важких металів. Важливою адаптивною властивістю метаболізму у мозку риб при дії токсикантів є здатність до зміни жирнокислотного складу ліпідів (Гершанович А.Д., 1991). Характерною особливістю відповіді нервової тканини на токсичні концентрації важких металів стало зростання вмісту вільних жирних кислот при концентрації їх іонів, що відповідає 5 ГДК (рис. 2). Так, вміст вільних жирних кислот головного мозку коропа при дії іонів міді та цинку збільшується відповідно у 1,42 та 2,1 рази відносно з контрольною групою риб. При дії іонів свинцю концентрація вільних жирних кислот зростає при обох концентраціях: у 1,23 рази при 2 ГДК та у 1,27 рази при 5 ГДК.
Домінування в мієлінових ліпідах насичених довголанцюгових жирних кислот, яке ми спостерігаємо при дії іонів свинцю, концентрація яких відповідає 2 ГДК (рис. 3.), деякі автори (Sheridan M.A. et all., 1985) розглядають як фактор, який надає мієліновій мембрані необхідну структурну стабільність за рахунок щільної упаковки вуглеводневих ланцюгів та їх метаболічної інертності шляхом зменшення мікров’язкості і стабільності. Аналогічні зміни виявлені при дії іонів цинку в концентрації, що відповідає 5 ГДК – збільшення рівня насичених жирних кислот в головному мозку коропа у 1,53 рази.
Рис. 2. Вміст сумарних жирних кислот Рис. 3. Вміст насичених жирних кислот
при інтоксикації іонами важких металів при інтоксикації іонами важких металів
Результати дослідження вмісту ненасичених жирних кислот свідчать про зменшення їх кількості в головному мозку риб, яких утримували у воді, в якій концентрація іонів досліджуваних металів відповідала 2 ГДК (рис.4). При дії іонів цинку кількість ненасичених жирних кислот зменшилася у 1,28 рази, при дії іонів марганцю – у 1,36 рази, при дії іонів міді – у 1,37 рази. В літературі (Крепс Е.М., 1981) зменшення пулу ненасичених жирних кислот пов’язують із їх використанням в енергетичному метаболізмі в умовах дії зовнішнього стресу, де вони виступають субстратом для енергозабезпечення.
Із збільшенням у воді концентрації іонів важких металів до 5 ГДК відбувається компенсаторне збільшення вмісту ненасичених жирних кислот в головному мозку коропа лускатого. В умовах свинцевої інтоксикації показники рівня ненасичених жирних кислот зросли у 1,32 рази, при цинковій – у 2,3 рази, при дії іонів марганцю та міді відповідно у 1,28 та 1,56 рази.
Рис. 4. Вміст ненасичених жирних кислот
при інтоксикації іонами важких металів
Збільшення в спектрі ненасичених жирних кислот відображає їх участь в мембранних процесах, які протидіють зниженню “текучості” ліпідів мембранних клітин, і, в свою чергу, забезпечують адаптацію організму до цих змін.
Аналіз жирнокислотного складу ліпідів мозку риб свідчить про значну різницю у відносному вмісті окремих жирних кислот у загальних ліпідах мозку коропа при підвищені концентрації у воді іонів токсикантів. Зокрема, при наявності у воді іонів свинцю спостерігається зміна напрямків обміну жирних кислот в бік зростання рівня їх ненасиченості: при 2 ГДК воно відбувається за рахунок збільшення відносного вмісту С22-поліненасичених жирних кислот, а при 5 ГДК – жирних кислот С18-поліненасиченого ряду. При дії солей марганцю в концентрації, що відповідає 2 ГДК, у загальних ліпідах мозку риб значно зростає відносний вміст С20- і С22-поліненасичених жирних кислот (P < 0,05), поряд із зменшенням відносного вмісту лінолевої кислоти (в 2,34 рази відносно контролю). При 5 ГДК відбувається зменшення рівня кислот С20- та С22-рядів та збільшення кількості лінолевої кислоти (в 2,2 рази відносно контролю). З цих даних випливає, що під впливом іонів марганцю перетворення лінолевої кислоти у більш ненасичені жирні кислоти і використання їх у синтезі ліпідів у мозку коропа при 5 ГДК, на відміну від 2 ГДК, знижується.
Зміни жирнокислотного складу загальних ліпідів мозку риб за дії іонів міді при 2 і 5 ГДК певною мірою подібні між собою. Виявлено значно більший відносний вміст лінолевої кислоти: в 1,17 разів при 2 ГДК (P<0,005) та в 1,74 рази при 5 ГДК (P<0,001). Також спостерігається зменшення вмісту ейкозатриєнової, арахідонової, ейкозапентаєнової, докозатриєнової і докозагексаєнової кислот (Р<0,01 – 0,001), та вірогідні різниці у вмісті деяких мінорних жирних кислот – маргаринової, стеаринової (Р<0,02 – 0,001). З результатів дослідження випливає, що при дії іонів міді в головному мозку коропа зменшується синтез поліненасичених жирних кислот, попередником яких є лінолева кислота. Внаслідок цього у головному мозку коропа при інтоксикації іонами міддю різко знижуються рідинні властивості мембран, а тим самим механізм його адаптації до токсичних впливів (Kniprath W.G., Mead J.F., 1996).
Іони цинку в концентрації 2 ГДК не є токсичними для даної ланки метаболізму. Про це свідчать незначні зміни жирнокислотного складу ліпідів головного мозку коропа при даній інтоксикації. Проте, при збільшенні концентрації досліджуваного металу до 5 ГДК ці зміни є більш суттєвими: збільшення ненасиченості жирнокислотного складу пов’язане із значним збільшенням рівня лінолевої (в 3,5 рази), та ліноленової (в 2,86 рази) (Р<0,001) жирних кислот відносно контролю. Поряд з цим, рівень жирних кислот С20 - (ейкозадиєнової, ейкозатриєнової, арахідонової, ейкозапентаєнової) та С22-рядів (докозатриєнової, докозапентаєнової, докозагексаєнової) вірогідно зменшується (Р<0,05–0,001).
Дослідженнями жирнокислотного складу мозку риб встановлено, що при дії іонів важких металів відбувається компенсаторне збільшення рівня ненасиченості загальних ліпідів нейрональних мембран в діапазоні надпорогових концентрацій токсикантів, тобто має місце загальна тенденція до підвищення рівня ненасичених жирних кислот під час адаптації організму риб до дії токсикантів в концентрації, що відповідає 5 ГДК, яка визначається домінуванням жирних кислот лінолевого та ліноленового рядів.
Дослідженнями комплексної дії сезонних змін та іонів важких металів на динаміку жирнокислотного складу мозку риб виявлено значно менший відносний вміст ряду поліненасичених жирних кислот, попередником яких є лінолева та ліноленова жирні кислоти, у складі загальних ліпідів мозку коропа у зимовий період, порівняно з весною. У весняний період вплив іонів свинцю, міді, цинку та марганцю на жирнокислотний склад загальних ліпідів мозку коропа виражається значно меншою мірою, ніж у зимовий період, а зміни у відносному вмісті деяких жирних кислот у складі ліпідів протилежні за спрямуванням.
Використання [1-14С]-ацетату у синтезі окремих фракцій ліпідів та особливості його окислення у головному мозку риб при дії іонів важких металів. Окремий етап нашої роботи становило дослідження ступеня використання [1-14С]-ацетату у синтезі окремих фракцій ліпідів у тканині головного мозку коропа при наявності у воді підвищених концентрацій іонів свинцю, міді, марганцю та цинку (табл. 4 ).
Таблиця 4
Радіоактивність окремих класів ліпідів головного мозку коропа при інкубації з [1-14C]-ацетатом за дії іонів важких металів (М±m, n=5)
Фрак-ції | контроль | Рв2+ | Сu2+ | Zn2+ | Mn2+
2 ГДК
ЗЛ
ФЛ
АЦГ
ХЛ
ЕХЛ
НЖК | 3,710,08
1,80±0,03
0,92±0,02
0,51±0,03
0,29±0,005
0,19±0,05 | 1,840,04*
0,14±0,002*
0,52±0,02*
0,41±0,05
0,26±0,02
0,47±0,05* | 1,96 0,06*
0,67±0,07*
0,54±0,07*
0,35±0,03*
0,13±0,015*
0,26±0,02* | 1,950,027*
0,65±0,05*
0,23±0,01*
0,18±0,01*
0,26±0,02*
0,63±0,05 | 0,65 0,05*
0,14±0,04*
0,14±0,06*
0,13±0,02*
0,12±0,02*
0,13±0,05
5 ГДК
ЗЛ
ФЛ
АЦГ
ХЛ
ЕХЛ
НЖК | 3,71 0,08
1,80±0,03
0,92±0,02
0,51±0,03
0,29±0,005
0,19±0,05 | 2,510,035*
0,70±0,04*
0,99±0,06
0,24±0,02*
0,31±0,02
0,27±0,03 | 3,170,09
0,88±0,35*
0,39±0,02*
0,50±0,03
0,27±0,01
0,84±0,09* | 2,51 0,08*
0,65±0,08*
0,16±0,02*
0,86±0,11*
0,38±0,03
0,47±0,05* | 0,630,072*
0,09±0,01*
0,12±0,02*
0,13±0,04*
0,15±0,03*
0,15±0.05*
Примітка: радіоактивність окремих класів ліпідів виражена в тисячах в-розпадів/100 мг тканини/хвилину; умовні позначення: ЗЛ – загальні ліпіди, ФЛ – фосфоліпіди, ХЛ – холестерол, АЦГ - ацилгліцероли, НЖК - неетерифіковані жирні кислоти, ЕХЛ – ефіри холестеролу
Проведені нами дослідження показали, що після 14-денної експозиції риб у воді з концентрацією мікроелементів, що відповідає 2 і 5 ГДК інтенсивність включення мітки в загальні ліпіди мозку риб в більшості випадків вірогідно зменшувалася порівняно з контролем: у 2,06 рази при дії іонів свинцю, у 1,89 рази – іонів міді, у 1,91 рази- іонів цинку та у 5,71 рази при дії іонів марганцю. При збільшенні у воді вмісту іонів металів до 5 ГДК спостерігається аналогічна тенденція зміни досліджуваного показника в мозку риб: відповідно на 32,4%, 14,6%, 22,4%, 83,1%.
Розглядаючи в динаміці дію кожної у відповідності концентрації іонів важких металів на використання міченого ацетату натрію в синтезі окремих класів ліпідів, слід відмітити низьку радіоактивність фосфоліпідів, синтезованих гомогенатами головного мозку риб при 2 ГДК: іонами свинцю у 6,3 рази, іонами міді – у 1,4 рази, іонами цинку – у 1,5 рази, іонами марганцю – у 2,34 рази. При 5 ГДК ці показники відповідно такі: у 1,74; 1,75; 1,88; 3,42 рази. Ці дані свідчать про те, що ацетат в даних умовах не включається до складу фосфоліпідів, а пріоритетно бере участь в інших метаболічних шляхах.
З іншого боку, іони важких металів, у більшості випадків сприяють синтезу холестеролу з [1-14С]-ацетату. Найбільша радіоактивність холестеролу виявлена у дослідних риб при дії іонів цинку в концентрації 5 ГДК (на 49,6 % порівняно з контролем, Р<0,05), а найменша – при дії тих самих іонів в концентрації 2 ГДК (на 33,8 % Р<0,05). Протилежна за напрямком тенденція спостерігається при дії іонів свинцю: збільшення радіоактивності холестеролу на 65,6 % (Р<0,001) при 2 ГДК, та її зменшення на 20,2 % (Р<0,05) при 5 ГДК. При дії іонів міді та марганцю радіоактивність холестеролу при обох концентраціях зростає (Р<0,01-0,05). Як бачимо, іони важких металів, у більшості випадків сприяють синтезу холестеролу з [1-14С]-ацетату. Висока радіоактивність вільного та ефірнозв’язаного холестеролу свідчить також і про те, що ацетат у головному мозку риб при дії іонів важких металів використовується, головним чином, у синтезі структурних ліпідів, що є дуже важливим у формуванні адаптації.
Щодо неетерифікованих жирних кислот, то спостерігається загальна тенденція до збільшення їх радіоактивності при дії всіх досліджуваних металів за обох інтоксикацій. Так, при 2 ГДК радіоактивність неетерифікованих жирних кислот збільшується в 5,1; 2,6; 6,3 та 3,96 рази (Р<0,01-0,05) відповідно при дії іонів свинцю, міді, цинку та марганцю. При 5 ГДК дані показники наступні: в 2,1; 5,29; 3,65; 4,73 рази порівняно з контролем. Інтенсивність синтезу ацилгліцеролів з [1-14С]-ацетату знижується при дії підвищених концентрацій іонів важких металів, виняток становлять катіони свинцю. Радіоактивність ацилгліцеролів, при їх дії становить 28,8 % - при 2 ГДК та 39,4 % - при 5 ГДК, порівняно з 7,8 % в контрольних риб. Можна припустити, що свинець сприяє накопиченню ацилгліцеролів, як основого енергетичного резерву клітини, для подальшого використання в процесах адаптивного спрямування.
Відомо, що одним із факторів пошкодження органів і тканин в умовах стресу є виникнення дисбалансу синтезу та розпаду ліпідів із переважанням катаболічних процесів. Спираючись на це, нами досліджено особливості окислення 14С-ацетату у головному мозку риб при дії солей важких металів (табл. 5).
Таблиця 5
Радіоактивність 14СО2 при інкубації гомогенатів головного мозку риб з [1-14C]-ацетату при дії іонів важких металів (в Я-?озпадах/100мг вологої тканини/хв.; М±m, n=5)
контроль | Рв2+ | Сu2+ | Zn2+ | Mn2+
2 ГДК
104,3 ± 5,3 | 90,2±6,3* | 90,5±7,6 | 102,7±11,3 | 116,8±10,9
5 ГДК
104,3 ± 5,3 | 145,09±10,1* | 94,52±8,7 | 98,10±9,2 | 137,25±10,2
Примітка: * - ступінь вірогідності різниці досліджуваних показниках у риб дослідних груп порівняно до показників у риб контрольної групи
Високою здатністю активувати процеси окислення ліпідів володіють іони марганцю при 2ГДК – 116,8 ?-розпадів/100мг вологої тканини/хв. При дії інших металів, в даній концентрації, протікання окислювальних процесів в головному мозку риб здійснюється на рівні фізіологічної норми (Р<0,5).
При 5 ГДК кількість виділеного радіоактивного СО2, утвореного в результаті окислення ацетату, зростає під впливом іонів марганцю і свинцю – відповідно на 31,6 та 39,1 % порівняно з контролем (Р<0,05). Цей факт може свідчити про метаболічний стрес і деструктивні зміни в нервовій тканині при 5 ГДК, в умовах якого забезпечення організму риб енергією за рахунок окислення ацетату є метаболічно виправданим шляхом, який активується виключно при стресових станах організму.
Отже, окислювальний катаболізм ліпідів в головному мозку коропа – важлива складова частина інтегрального фізіолого-біохімічного механізму, який забезпечує в організмі риб енергетичний гомеостаз при інтоксикації.
ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі наведені дані про закономірності накопичення цинку, міді, марганцю і свинцю у головному мозку коропа та встановлено взаємозв’язок між їх вмістом в нервовій тканині та біохімічними ефектами їх впливу на динаміку ліпідного складу головного мозку коропа при підвищеній концентрації іонів цинку, міді, марганцю та свинцю у воді.
1. Підвищення у воді концентрації іонів важких металів призводить до накопичення у головному мозку коропа цинку та міді при 2 ГДК, а також марганцю при 5 ГДК. Зміни вмісту свинцю в умовах інтоксикації не виявлені.
2. Іони свинцю змінюють спрямування ліпідної ланки метаболізму в мозку коропа в напрямку збільшення вмісту загальних ліпідів за рахунок збільшення у їх складі фосфоліпідів та неетерифікованих жирних кислот. Натомість, за дії іонів міді вміст загальних ліпідів на фоні збільшення кількості фосфоліпідів при 2 ГДК зменшується. За дії іонів цинку та марганцю вміст загальних ліпідів у мозку коропа при 2 ГДК зменшується, а при 5 ГДК – зростає.
3. За дії іонів свинцю, цинку та марганцю при 2 ГДК вміст холестеролу в мозку коропа підвищується, а при 5 ГДК – зростає рівень неетерифікованих жирних кислот.
4. За дії іонів важких металів мобілізується пул фосфоліпідів у напрямку протидії токсичному впливу, який характеризується наступними змінами: збільшення вмісту фосфатидилетаноламіну, деградація фосфатидилхоліну з наступним накопиченням лізофосфатидилхоліну, збільшення сфінгомієліну в мозку коропа. Іони цинку на фоні несприятливого впливу токсикантів проявляють захисну дію при стресових впливах на риб.
5. Динаміка вмісту жирних кислот головного мозку коропа свідчить про компенсаторне збільшення їх загального вмісту у мозку коропа при 5 ГДК шляхом зростання у їх складі поліненасичених жирних кислот лінолевого та ліноленового рядів. Сезонні зміни переходу до активного способу життя підсилюють токсичний вплив досліджуваних металів на динаміку жирнокислотного складу.
6. Ступінь використання [1-14С]-ацетату у синтезі загальних ліпідів та фосфоліпідів мозку коропа зменшується при дії всіх досліджуваних металів за обох концентрацій. Інтенсивність синтезу холестеролу, його ефірів та ацилгліцеролів вірогідно зменшується, поряд із підвищенням синтезу неетерифікованих жирних кислот.
7. Продукція 14СО2 за рахунок окиснення [1-14С]-ацетату у головному мозку дослідних риб значно вища (Р<0,05 – 0,001) за дії іонів марганцю та свинцю та істотно не змінюється при дії іонів міді та цинку.
8. Зміни складу загальних ліпідів та вмісту фосфоліпідів (фосфатидилхоліну, лізофосфатидилхоліну, сфінгомієліну, фосфатидилетаноламіну), холестеролу, ненасичених жирних кислот, а також продукцію 14СО2 можна використовувати як біотести для оцінки токсичного впливу води, забрудненої іонами важких металів.
9. Іони важких металів в організмі коропа викликають структурно-функціональні зміни ліпідів мозку риб, спрямовані на зниження проникності іонів металів у нервову клітину, зміну метаболізму ліпідів у напрямку їх використання як енергетичних субстратів, створення пулу окремих фракцій фосфоліпідів та жирних кислот, що беруть участь у формуванні енцефалічного бар’єру захисту від проникнення важких металів.
Список наукових праць, опублікованих за темою дисертації
1. Маньора Г.Б., Грубинко В.В. Динамика липидного состава мозга рыб при интоксикации ионами тяжелых металлов //Гидробиол. журн. – 2004. – Т. 40, № 5. – С. 49 – 56.
2. Маньора Г.Б., Грубінко В.В. Адаптивні перебудови жирнокислотного складу мозку риб за умов дії свинцю //Доповіді НАН України. -2003. - № 11. – С. 167 – 170.
3. Маньора Г.Б., Бродін С.В., Грубінко В.В. Особливості окислення 14С-ацетату та динаміка ліпідного складу мозку риб при дії солей важких металів //Наук. записки Тернопільського держ. пед. ун-ту ім. Володимира Гнатюка. Серія: Біологія. — Спеціальний випуск: Гідробіологія.--- 2001. — Т. 3, №14. — С. 211-213.
Дисертантка брала участь у плануванні експерименту, хроматографічний аналіз досліджуваних проб виконала із Бродіним С.В., разом із співробітниками Львівського інституту біології тварин УААН методом мічених ізотопів отримала кінцеві результати. Із співавторами здійснювала обговорення результатів, написала рукопис статті.
4. Маньора Г.Б., Грубінко В.В. Вплив іонів марганцю і міді на жирнокислотний склад ліпідів мозку риб: сезонні особливості //Біологія
