НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

ЦИГАНЕНКО КАТЕРИНА СТЕПАНІВНА

УДК 582.288–11+577.18

ОЦІНКА АНТИБІОТИЧНОГО ТА ТОКСИГЕННОГО ПОТЕНЦІАЛУ ДЕЯКИХ

ВИДІВ МІКРОМІЦЕТІВ РОДУ ASPERGILLUS MICH.

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Зайченко Олександр Максимович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, керівник лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Варбанець Людмила Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

доктор біологічних наук Бухало Ася Сергіївна, Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, головний науковий співробітник відділу мікології

Провідна установа: Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова, кафедра мікробіології і вірусології, Міністерство освіти і науки України

Захист відбудеться “19” жовтня 2005 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Україна, Д 03680, Київ ДСП, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Україна, Д 03680, Київ ДСП, вул. Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано “ 16 ” вересня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

Актуальність теми. На сьогодні біосинтетичні властивості різних видів р. Аspergillus вивчені досить широко і, завдяки своїй здатності продукувати цінні біологічно активні речовини, знайшли застосування в практичній діяльності людини. Поряд з цим, велика кількість виділених сполук виявилась токсичною щодо тварин і рослин, що перешкоджало їх практичному використанню. Але, завдяки досить цікавому набору властивостей, вони продовжують викликати інтерес у вчених, виходячи саме з перспектив їх застосування (Тутельян с соавт., 1985; “Mycotoxins…”, 1984; Pitt, 2000).

Інші види зайняли своє місце в біотехнології як продуценти таких біологічно активних речовин, як антибіотики, ферменти, пігменти, органічні кислоти тощо, які використовуються в різних галузях промисловості, зокрема харчової та легкої, народного та сільського господарства, медицини та ветеринарії (Билай, 1961, 1965; Козловский с соавт., 1990). Досить згадати, що промисловим продуцентом лимонної кислоти є саме A. (Карклинь, 1966).

Але, поряд з цим, багато з виділених та описаних видів р.  Aspergillus досі залишаються поза увагою вчених щодо вивчення їх фізіологічних властивостей, в тому числі й здатності до синтезу біологічно активних речовин. Так, досі не проводилось системних досліджень щодо біологічної активності представників р. Aspergillus, а ті дані, що є в літературі, одержані переважно на окремих штамах. Яскравим прикладом недостатньо вивченого в цьому плані виду є A.Smith, який був вперше описаний Смітом у 1961 році (Билай с соавт., 1988).

Все викладене вище зумовлює актуальність проведення системних досліджень щодо вивчення біологічної активності великого набору штамів різних видів р. Aspergillus на їх здатність продукувати метаболіти, що можуть бути практично важливими. В нашій роботі було досліджено 128 штамів р. Aspergillus, які належать до 18 видів та 3 різновидностей. Така кількість об‘єктів дозволяла провести саме системне дослідження цього питання та з‘ясувати основні закономірності прояву біологічних властивостей. Отримані дані дали нам змогу відібрати маловивчений вид A.для подальших більш глибоких досліджень.

Актуальною є також розробка методів, які використовувались для виділення нового біологічно активного метаболіту, зокрема це застосування двохступеневої колонкової хроматографії з різними нерухливими фазами та елюентами, що раніше не використовувалось для виділення антибіотиків та токсинів з культуральних фільтратів мікроміцетів.

Зв‘язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за темами “Оцінка потенціалу біологічно активних речовин з малодосліджених видів роду Aspergillus для подальшого практичного застосування” (2004 – 2006 рр., держ. реєстраційний № 0104V003298), “Пошук нових біологічно активних сполук серед малодосліджених видів мікроміцетів для подальшого практичного застосування” (2005 – 2009 рр., держ. реєстраційний № 0105V001248) та “Збереження належного стану і функціонування об‘єкту, що становить національне надбання – Колекцію мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного” (постанова Кабінету Міністрів України № 1709 від 19.12.2001 р.).

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи була оцінка антибіотичних та токсигенних властивостей різних недостатньо досліджених видів р. Aspergillus з наміром виділення нових біологічно активних метаболітів, їх ідентифікації та вивчення деяких аспектів біологічної дії.

Досягнення поставленої мети передбачало вирішення ряду завдань:

– провести скринінг досліджуваних штамів р. Aspergillus за антибіотичними та фітотоксичними властивостями щодо широкого загалу тест-організмів та на його основі відібрати найбільш перспективні з них для подальшого поглибленого вивчення;

– дослідити фітотоксичну активність відібраних штамів щодо насіння бур‘янів та культурних рослин;

– дослідити особливості росту штаму-продуцента та визначити оптимальні умови культивування для підвищення активності культурального фільтрату;

– ізолювати та очистити біологічно активний метаболіт та отримати його у кристалічному вигляді;

– вивчити деякі фізико-хімічні та біологічні характеристики виділеного метаболіту, а також, по можливості, провести його ідентифікацію;

– вивести математичну модель процесу біосинтезу за заданими умовами.

Об‘єктом дослідження були 128 штамів мікроміцетів р. Aspergillus, а також набір тест-організмів, зокрема 3 штами дріжджоподібних грибів, 7 штамів бактеріальних тест-культур та 16 штамів зелених водоростей.

Предметом дослідження була оцінка антибіотичного та токсигенного потенціалу досліджуваних штамів р. Aspergillus щодо різних систематичних груп: грампозитивних і грамнегативних, в тому числі фітопатогенних, бактерій, дріжджоподібних грибів, зелених водоростей та насіння рослин.

Матеріали та методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використовували ряд методів дослідження, серед яких для визначення антибіотичних та фітотоксичних властивостей та для культивування об‘єктів дослідження застосовували мікробіологічні та мікологічні методи, для виділення біологічно активного метаболіту – біохімічні методи, для вивчення властивостей отриманого кристалічного препарату – біологічні та фізико-хімічні методи. На всіх етапах роботи також використовували математичні методи статистичної обробки отриманих результатів.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що:

– вперше з використанням значної кількості музейних та свіжовиділених штамів був досліджений антибіотичний та фітотоксичний потенціал різних видів мікроміцетів р. Aspergillus;

– вперше визначено здатність виду A.продукувати біологічно активну речовину, яка проявляє антибіотичні, фітотоксичні та гербіцидні властивості і не є токсичною для лабораторних тварин;

– відпрацьовані оптимальні умови біосинтезу досліджуваної речовини,

– здійснено виділення у кристалічному вигляді та часткову ідентифікацію біологічно активного метаболіту з A.3142.

Практичне значення одержаних результатів. Вивчення антибіотичних та токсигенних властивостей мікроміцетів р. Aspergillus дозволяє реально оцінити потенціал цього роду в плані пошуку серед їх метаболітів нових біологічно активних речовин, перспективних щодо практичного використання в різних галузях життєдіяльності людини.

Досліджуваний в нашій роботі вид A.продукує біологічно активні метаболіти, що проявляють різного спектру антибіотичні і фітотоксичні властивості, серед яких важливе місце займає гербіцидна активність щодо насіння мишію, щириці та інших бур‘янів. Ці властивості можуть бути перспективними щодо практичного використання отриманої сполуки в сільському господарстві, медицині і ветеринарії. Розроблена схема виділення нової біологічно активної речовини з культурального фільтрату A.3142 може бути використана як типова у подальших дослідженнях, спрямованих на виділення та ідентифікацію нових, перспективних для різних галузей народного господарства та медицини метаболітів.

Поряд з цим, отримані в ході роботи дані можуть суттєво поповнити фундаментальні знання щодо фізіології представників р. Aspergillus в цілому та деяких його видів зокрема. Результати роботи можуть бути використані у підручниках та методичних посібниках з мікології та біотехнології для учбових закладів різних рівнів.

Особистий внесок здобувача. Робота проведена в лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. Основна частина експериментального матеріалу, викладеного в дисертації, отримана автором самостійно під керівництвом д.б.н., проф. Зайченка О.М. Особиста участь дисертанта полягала в критичному аналізі даних літератури, розробці методичних підходів щодо виконання поставлених завдань, узагальненні одержаних результатів, статистичній обробці цифрового матеріалу.

Автором самостійно проведено скринінг 128 штамів р. Aspergillus за антибіотичними та фітотоксичними властивостями; встановлена фітотоксична активність A. 3142 та 1813 щодо насіння культурних рослин та бур‘янів; розроблені оптимальні умови для підвищення біологічної активності культурального фільтрату A. 3142; ізольована та очищена біологічно активна сполука “препарат АР 3142” та вивчені її властивості, а також побудовано математичну модель процесу біосинтезу за заданими умовами.

Постановка завдань, обговорення одержаних результатів та підготовка публікацій за результатами досліджень проводились спільно з науковим керівником д.б.н., проф. Зайченком О.М.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені на Міжнародній науково-теоретичній конференції молодих вчених “Молодь і досягнення у вирішенні проблем сучасності” (м. Чернівці, 31 жовтня – 1 листопада 2003 р.), на Десятому з`їзді Товариства мікробіологів України (м. Одеса, 15 – 17 вересня 2004 р.), на Третьому Всеросійському конгресі з медичної мікології (м. Москва, 24 – 25 березня 2005 р.), а також двічі доповідалися на конференціях молодих вчених Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України “Конкурс експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ” (м. Київ, 10 – 12 грудня 2002 р. та 25 – 26 листопада 2003 р.)

Публікації. Результати дисертаційної роботи представлені в 6 статтях, опублікованих в наукових профільних журналах та в 2 тезах, опублікованих за матеріалами з`їзду та конгресу.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 134 сторінках машинописного тексту і складається з розділів “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали і методи дослідження”, “Антибіотичний та фітотоксичний потенціал деяких видів мікроміцетів роду Aspergillus”, “Виділення та деякі властивості біологічно активного метаболіту з A. 3142”, “Заключення”, “Висновки”, “Список використаних джерел”, який містить 193 посилання (з яких 145 іноземних авторів). Робота містить 23 таблиці та 13 рисунків.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з 2 підрозділів, в першому з яких розглядаються питання історії розвитку та загальної характеристики процесу скринінгу різних організмів для пошуку нових біологічно активних речовин, аналізу схеми цього процесу. Другий підрозділ присвячений біологічно активним речовинам мікроміцетів р. Aspergillus в цілому, а також докладному розгляду властивостей антибіотиків, мікотоксинів та фітотоксинів, продуцентами яких гриби цього роду.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Об‘єктами дослідження були 128 штамів мікроміцетів р. Aspergillus, які належать до 18 видів та 3 різновидностей, які були виділені з 1988 по 2003 роки з ґрунтів різних областей України, повітря приміщень, лісової підстилки, а також з зони відчуження ЧАЕС. В наше розпорядження вони були надані з музею відділу фізіології і систематики мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології НАН України, за що ми щиро вдячні.

Поряд з цим, об‘єктами дослідження як тест-організми слугували 3 штами дріжджоподібних грибів, отриманих з відділу фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАНУ, 7 штамів бактеріальних тест-культур, з яких 3 штами грампозитивних бактерій, отриманих з відділу антибіотиків, та 4 штами грамнегативних, в тому числі фітопатогенних, бактерій, отриманих з відділу фітопатогенних бактерій цього ж Інституту, а також 16 штамів зелених водоростей р. Chlorella, отриманих з відділу фікології Інституту ботаніки НАНУ. Поряд з цим, в роботі використовували насіння культурних рослин, яке було комерційного походження, та насіння бур‘янів, яке збирали влітку 2002 року.

Методи культивування грибів. Для дослідження антибіотичних, фітотоксичних та антифунгальних властивостей використовували культуральні фільтрати мікроміцетів, які отримували при поверхневому культивуванні на стандартному середовищі Чапека з 20 г/л глюкози як джерела вуглецю і 1 г/л NaNO3 як джерела азоту. Засів проводили суспензією конідій (1 • 108 кл/мл) з пробірок зі скошеним агаризованим суслом. Культивування здійснювали при 26 оС впродовж 14 діб (“Методы...”, 1982; ).

При дослідженні динаміки накопичення біологічно активного метаболіту також використовували глибинне культивування на круговій качалці зі швидкістю 220 об/хв. Культивування здійснювали при 26 оС, проби відбирали кожні 24 години впродовж 14 діб. Питому швидкість росту (?) розраховували за методом Ієрусалімського (1963).

Скринінг різних штамів р. Aspergillus за біологічними властивостями здійснювали за допомогою методу лунок у агарі, який для визначення антибіотичної активності містив бактеріальні тест-культури, антифунгальної активності – дріжджоподібні гриби, фітотоксичної активності – зелені водорості. Фітотоксичну активність культуральних фільтратів штамів A. 3142 і 1813 щодо рослин визначали методом біопроби на насінні рослин (“Методы...”, 1982).

Метод виділення та очистки біологічно активного метаболіту. Перед виділенням біологічно активного метаболіту нами були оптимізовані умови культивування штаму A. 3142 для підвищення активності його культурального фільтрату. Поживне середовище оптимізували за вмістом джерел вуглецевого та азотного живлення та їх співвідношення, а також за вихідним значенням показника рН. При визначенні умов культивування A. 3142 вирощували поверхнево впродовж 14 діб при різних значеннях температури, в різних умовах аерації, наявності та відсутності освітлення, а також в динаміці при глибинному культивуванні.

На стадії виділення біологічно активного метаболіту культуральний фільтрат A. 3142 упарювали під зниженим тиском до маслянистого стану, який наносили на колонку і фракціонували. В роботі використовували двохступеневу колонкову хроматографію, де при фракціонуванні на першому етапі як нерухливу фазу застосовували окис алюмінію ІІ ст. активності за Брокманом (“Reanal”, Угорщина) та 0,1 н розчин соляної кислоти як елюент, а на другому етапі – як нерухливу фазу Toyopearl HW-40 (“Toyo Soda MFG”, Японія) та дистильовану воду як елюент (Лурье, 1978).

Очистку отриманої речовини здійснювали шляхом перекристалізації із суміші метанол : н-гексан. Чистоту отриманих кристалів було підтверджено даними тонкошарової хроматографії в трьох різних системах розчинників, яку здійснювали на пластинах “Silufol” UV 254 (“Kavalier”, Чехія). При візуалізації активної речовини та біоавтографічних даних була отримана одна пляма.

Математична модель процесу біосинтезу біологічно активного метаболіту з A. 3142 була побудована за вмістом компонентів вуглецевого та азотного живлення у поживному середовищі за допомогою методу повного факторного експерименту (ПФЕ) другого порядку (Бондарь с соавт., 1976).

Біологічні та фізико-хімічні методи аналізу. Як кількісну характеристику біологічної активності на кожній стадії фракціонування визначали мінімальну пригнічуючу концентрацію (МПК), яку знаходили методом двохкратних серійних розведень. Як тест-культуру використовували суспензію (5 • 106 кл/ мл) Bacillus subtilis 617, як рідке поживне середовище – картопляний бульйон.

Токсичність препарату з культурального фільтрату A. parvulus 3142 щодо теплокровних визначали методом шкірної проби на кролику (“Ветеринарно-санитарная...оценка кормов”, 1987) та при підшкірному та внутрішньобрюшинному введенні мишам (“Методы...”, 1982).

Елементний склад, який включав визначення азоту, сірки та галогенів, визначали методом сплавлення з натрієм (Черонис, 1960).

Температуру плавлення отриманої кристалічної речовини визначали за Кофлером та обчислювали як середні значення з 5 – 6 вимірювань (Лазуревский с соавт., 1966).

УФ-спектри та спектри видимого світла розчину досліджуваного препарату у дистильованій воді реєстрували на спектрофотометрі “Specord (Німеччина).

Всі досліди були виконані в 3 – 6 повторностях, і дані представлені як середні показники. Статистичну обробку результатів здійснювали за допомогою прикладного пакету Microsoft Excel 2000 та Sigma Stat 2.0.

РОЗДІЛ 3. АНТИБІОТИЧНИЙ ТА ФІТОТОКСИЧНИЙ ПОТЕНЦІАЛ ДЕЯКИХ ВИДІВ МІКРОМІЦЕТІВ РОДУ ASPERGILLUS

Результати скринінгу 128 штамів р. Aspergillus за антибіотичними, фітотоксичними та антифунгальними властивостями представлені в таблиці 1.

Як видно з наведених даних, переважна більшість досліджених штамів р. Aspergillus пригнічує ріст тест-культур. При цьому їх можна розділити на декілька груп, зокрема: за антибіотичними властивостями – штами з широким та вузьким спектром антибіотичної дії; за фітотоксичними властивостями – штами з високою та низькою фітотоксичною активністю; штами, які проявляють антифунгальні властивості та неактивні штами.

Так, до мікроміцетів з широким спектром антибіотичної дії щодо бактеріальних тест-культур можна віднести майже всі досліджені штами A., A., більшість штамів A., половину досліджених штамів A. та поодинокі штами A., A. terreus var. aureus, A., A., A., A. та A., які проявляли активність майже щодо всіх досліджених бактеріальних тест-культур.

Всі інші досліджені штами мали вузький спектр антибіотичної дії. Так, деякі штами A., A., A., A., A., A., A., A., A., A. та A. проявляли активність лише щодо грамнегативних бактеріальних тест-культур; виключно щодо всіх грампозитивних тест-культур були активними по одному з штамів A. та A.. Деякі штами з цієї групи проявляли вибіркову активність лише щодо однієї з бактеріальних тест-культур, які з успіхом можуть бути використані при розробці нових методик визначення речовин як індикаторні культури.

Слід зазначити, що незначна кількість штамів A., A. var. africanus, A., A. та A. не проявляла антибіотичної активності щодо жодного тест-організму.

Більшість досліджених штамів проявляла переважно бактеріостатичну дію щодо грамнегативних бактеріальних тест-культур. В той же час, прояв бактерицидної дії був характерним щодо грампозитивних тест-культур.

В таблиці 1 наведені також результати скринінгу досліджуваних мікроміцетів за антифунгальними властивостями щодо трьох штамів дріжджоподібних грибів. Отримані дані свідчать, що переважна більшість штамів р. Aspergillus не проявляє антифунгальної активності. Ця властивість була притаманна лише поодиноким штамам A. A. A.A., A., A., A. та A..

Таблиця 1

Антибіотична активність культуральних фільтратів досліджуваних

штамів р. Aspergillus щодо різних тест-організмів

№

п/п

Види, різновидності

Кількість

дослід-

жених

штамів | Кількість штамів, що проявляють активність | антибіотичну,

спектру дії | фітотоксичну | анти-

фунгальну |

широкого | вузького | високу | низьку | 1 | Aspergillus | 2 | 0 | 2 | 0 | 1 | 0 | 2 | A. | 1 | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 | 3 | A. | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0

4 | A. | 10 | 0 | 9 | 5 | 3 | 0 | 5 | A. | 4 | 0 | 4 | 1 | 1 | 0 | 6 | A. var. columnaris | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 7 | A. | 5 | 1 | 4 | 4 | 1 | 1 | 8 | A. | 5 | 5 | 0 | 3 | 0 | 0 | 9 | A. | 13 | 12 | 1 | 9 | 4 | 6 | 10 | A. | 20 | 9 | 11 | 10 | 10 | 2 | 11 | A. | 5 | 0 | 2 | 0 | 3 | 0 | 12 | A. | 12 | 8 | 4 | 9 | 3 | 4 | 13 | A. var. africanus | 3 | 0 | 1 | 0 | 2 | 0 | 14 | A. var. aureus | 1 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 15 | A. | 14 | 3 | 10 | 0 | 10 | 5 | 16 | A. | 19 | 1 | 14 | 1 | 7 | 6 | 17 | Emericella fruticulosa (A.) | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 18 | E. nidulans (A. | 2 | 0 | 2 | 0 | 1 | 0 | 19 | Fennellia nivea (A.) | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 21 | Neosartorya fischeri (A.) | 2 | 0 | 2 | 0 | 1 | 0 | 20 | Petromyces alliaceus (A.) | 5 | 1 | 4 | 0 | 2 | 2 |

З наведених у таблиці 1 даних можна бачити, що не всі досліджувані штами проявляють фітотоксичну активність щодо зелених водоростей. Велику групу складали штами з високою фітотоксичною активністю, а саме: A., A., A., A., A., A., A., A. var. aureus, A. та A., які були активними майже щодо всіх водоростевих тест-культур.

Інші штами проявляли незначну фітотоксичну активність. Серед цієї групи слід виділити штами A., A., A., A. var. africanus, A., A., A., A. sydowii, A., A. var. columnaris, A., A., A., A., A. та A.. А деяка кількість штамів A., A. var. africanus, A., A., A., A., A., A., A., A., A., A. та A. взагалі не проявляли фітотоксичної активності щодо досліджених водоростевих тест-культур.

При порівнянні антибіотичних та фітотоксичних властивостей досліджуваних штамів р. Aspergillus можна зробити висновок, що у більшості випадків широкий спектр антибіотичної дії та висока фітотоксична активність притаманна різним штамам. Поряд з цим, 26 % штамів мають як антибіотичну активність широкого спектру дії, так й високу фітотоксичну активність; 10 % штамів – антибіотичну активність вузького спектру дії та високу фітотоксичну активність; 12 % штамів – антибіотичну активність широкого спектру дії та низьку фітотоксичну активність; 24 % штамів – низьку як антибіотичну, так і фітотоксичну активність. Окрім цього, 23 % складали штами, що проявляли лише антибіотичну або фітотоксичну активність. 5 % досліджуваних штамів виявилось неактивними.

На основі наведених даних можна зробити висновок, що загал досліджених представників р. Aspergillus характеризується досить високим як антибіотичним, так й фітотоксичним потенціалом, що дійсно зумовлює перспективність подальшої роботи з ними на предмет виявлення нових біологічно активних речовин.

Особливо цікавими видаються нам подальші дослідження штамів A., оскільки цей вид досі не був об’єктом пошуку біологічно активних речовин, але, як свідчать одержані нами дані, представлений досить широким спектром активностей. Окрім цього, цей вид у нашій роботі був представлений найбільшою кількістю штамів (20), виділених з радіоактивних ґрунтів та лісової підстілки зони відчуження ЧАЕС.

Для подальшого дослідження фітотоксичних властивостей щодо насіння рослин ми відібрали штами A. 3142 та 1813, які проявляли антибіотичну активність широкого спектру дії та високу фітотоксичну активність щодо зелених водоростей. Дані, наведені у таблиці 2, засвідчують, що культуральний фільтрат A. 3142 повністю пригнічує проростання насіння мишію та пригнічує проростання насіння щириці на 27 %. В той же час, він пригнічує також проростання насіння деяких культурних рослин, зокрема, пшениці на 40 %, гороху на 25 % та огірків на 27 %, в той час як культуральний фільтрат A. 1813 пригнічує проростання насіння лише таких бур’янів як мишій (на 45 %) та злинка (на 27 %), не впливаючи при цьому на проростання насіння культурних рослин.

Поряд з цим, в ході роботи було з‘ясовано, що культуральні фільтрати, які проявляють фітотоксичну активність впливають також на проростання та розвиток проростків та корінців насіння досліджених рослин. Так, культуральний фільтрат A. 3142 хоч і не виявив значного впливу на кількість пророслого насіння злинки, галинсоги та редису, але значно впливав на ріст проростків злинки та корінців галинсоги і редису, а також справляв суттєвий негативний вплив на ріст проростків і корінців пшениці, гороху та огірка, до яких проявляв фітотоксичну активність. В той же час, культуральний фільтрат A. 1813 значно впливав на ріст проростків щириці, кукурудзи, гороху і огірка та корінців полину, щириці, редису і огірка, кількість пророслого насіння яких не давала нам змоги зробити висновок щодо наявності фітотоксичної активності до насіння цих рослин, а також пригнічував ріст проростків злинки, до якої проявляв високу фітотоксичну активність.

Таблиця 2

Фітотоксична активність A. 3142 та 1813 щодо насіння рослин |

Контроль | Кількість насіння (%), що проросла після

обробки культуральними фільтратами

Насіння рослин | росту,

% | A. parvulus 3142 | A. parvulus 1813

Бур'яни

Полин | 100 | 93 ± 1,6 | 93 ± 1,2

Щириця | 100 | 73 ± 1,2 | 99 ± 0,7

Мишій | 100 | 0 | 55 ± 1,3

Плоскуха | 100 | 80 ± 1,6 | 100

Галинсога | 100 | 79 ± 1,9 | 100

Злинка | 100 | 96 ± 1,4 | 73 ± 0,8

Культурні рослини

Капуста | 100 | 81 ± 1,6 | 99 ± 1,0

Редис | 100 | 100 | 100

Кукурудза | 100 | 100 | 100

Пшениця | 100 | 60 ± 1,4 | 100

Горох | 100 | 75 ± 1,0 | 100

Огірок | 100 | 73 ± 1,2 | 77 ± 0,8

Виявлення фітотоксичної активності культуральних фільтратів у двох штамів A. щодо насіння рослин, зокрема бур‘янів, може свідчити про перспективність вивчення їх фізіологічних властивостей з метою отримання сполук з гербіцидною активністю, практично важливих для сільського господарства.

РОЗДІЛ 4. ВИДІЛЕННЯ ТА ДЕЯКІ ВЛАСТИВОСТІ БІОЛОГІЧНО

АКТИВНОГО МЕТАБОЛІТУ З A. 3142

З метою поглиблення знань щодо фізіології A. 3142 нами була проведена серія досліджень, спрямованих на досягнення умов, за яких активність культурального фільтрату A. 3142 набувала б максимального значення. В якості факторів, значущих для біосинтезу біологічно активної речовини, були відібрані наступні: вплив хімічних факторів – показника рН поживного середовища, джерел вуглецевого та азотного живлення і їх співвідношення; вплив фізичних факторів – температури, освітлення, умов масообміну та способу культивування.

Отримані дані свідчать, що культуральний фільтрат A. 3142 набував максимальної біологічної активності при наступних умовах: глибинне культивування, глюкоза (30 г/л) і нітрат натрію (1,5 г/л) як джерела вуглецевого та азотного живлення у співвідношенні 20 : 1, температура 26 оС, рН поживного середовища 4,8, масообмін 0,30 гО2/л·год, наявність освітлення.

Результати вивчення динаміки росту A. parvulus 3142 та накопичення активного метаболіту при різних способах культивування наведені на рисунках 1 і 2.

Було з‘ясовано, що в перші дві доби як при поверхневому, так і при глибинному культивуванні спостерігається досить незначний приріст міцелію, який складав у середньому 0,05 мг/мл. Стаціонарна фаза росту наступала при поверхневому культивуванні (рис. 1) на 10 – 11 добу, а при глибинному культивуванні (рис. 2) на 7 добу. Після цього концентрація біомаси поступово знижувалась, що можливо пов‘язано з процесами автолізу після використання джерел живлення. Питома швидкість росту культури сягала свого максимального значення в експоненціальній фазі росту (на 3 добу) як при поверхневому (? = 0,172 год-1), так і при глибинному (? = 0,272 год-1) культивуванні. В наступний період цей показник поступово знижувався і набував мінімального значення на стадіях автолізу в обох випадках культивування.

Що стосується накопичення біологічно активного метаболіту, то збільшення його синтезу було пропорційним збільшенню біомаси у обох випадках культивування, але, як видно з даних, наведених на рис. 1 і 2, зміщувалось відносно доби культивування. Так, при поверхневому культивуванні максимальний рівень накопичення біологічно активного метаболіту спостерігався на 7 добу та після розрахунків становив 27,5 мг/мл, а при глибинному методі культивування – на 6 добу і становив 28,8 мг/мл.

Окрім вище згаданих показників, ми вивчали також динаміку зміни показника рН в середовищі при поверхневому та глибинному культивуванні, а також вміст сухих речовин у середовищі, який складається з маси компонентів речовин поживного середовища та маси синтезованих під час росту метаболітів. Було показано, що в процесі як поверхневого, так і глибинного культивування показник рН підвищується до значень 6,24 і 6,41, відповідно, що може свідчити про наявність основних груп у молекулах синтезованої активної речовини.

Разом з цим, при обох способах культивування прослідковується однакова закономірність вмісту у середовищі культивування сухих речовин, де впродовж всього часу культивування концентрація сухих речовин поступово знижується. зокрема при поверхневому культивуванні до 5,64 мг/мл, а при глибинному – до 5,72 мг/мл.

Метою наступного етапу роботи було виділення у кристалічному вигляді біологічно активного метаболіту A. 3142. На 8 добу культивування досліджуваного мікроміцету збирали культуральну рідину та фільтрували за допомогою вакуум-фільтру, після чого отриманий культуральний фільтрат концентрували.

При спробі сконцентрувати культуральний фільтрат шляхом діалізу за допомогою поліетиленгліколю-6000, нами був встановлений факт втрати активної речовини, що могло свідчити про її невисоку молекулярну масу. З огляду на це, культуральний фільтрат A. parvulus 3142 упарювали під зниженим тиском до маслянистого стану. Отриманий розчин наносили на колонку з окисом алюмінію і фракціонували.

Було встановлено, що після першої стадії фракціонування на колонці з окисом алюмінію (рис. 3) сконцентрованого культурального фільтрату найбільш активними щодо B. 617 виявились фракції №№ 6 – 9, а максимум цієї активності був характерним для фракції № 7, яка в той же час була представлена і максимумом вмісту сухих речовин. Інший максимум, характерний для фракції № 3, був зумовлений наявністю в ньому пігментних сполук, які не проявляли біологічної активності.

При визначенні МПК найбільш антибіотично активної фракції, отриманої після першої стадії фракціонування ріст тест-культури не спостерігався при розведенні 1 , для якого характерна концентрація сухих речовин активної фракції 2 мг/мл, тобто МПК досліджуваної сполуки складає 2 мг сухих речовин/мл.

На другому етапі фракціонування сконцентрованого культурального фільтрату на колонці з Toyopearl HW-40 (рис. 4) було встановлено, що найбільш активними виявились фракції №№ 2 – 5 з максимумом у фракції № 2, представленої також і максимумом вмісту сухих речовин. Після упарювання цієї фракції нами було отримано речовину, яка при подальшій очистці шляхом перекристалізації із суміші метанол : н-гексан була виділена у вигляді пластинчатих кристалів світложовтого кольору. В подальшому для цієї речовини ми вводимо умовну назву – “препарат АР 3142”.

МПК найбільш активної фракції, отриманої після другого етапу фракціонування, відповідала розведенню 1 , для якого характерна концентрація активного метаболіту 0,14 мг/мл, тобто МПК досліджуваного “препарату АР 3142” становила 0,14 мг кристалічної речовини/мл і, таким чином, після другої стадії фракціонування була досягнута його очистка в 14 разів.

Чистоту отриманих кристалів було підтверджено також даними тонкошарової хроматографії в трьох різних системах розчинників (бутанол, насичений водою; мурашина кислота : вода (1 : 1); етанол : вода (1 : 1)). При візуалізації активної речовини та біоавтографічних даних була отримана одна пляма.

Слід зазначити, що застосування двохступеневої колонкової хроматографії з двома різними системами нерухлива фаза-елюент для виділення та очистки антибіотичної речовини є новим підходом, оскільки раніше для цієї мети застосовували виключно одноступеневу хроматографію з постійною нерухливою фазою та набором органічних розчинників як елюентів.

На основі наведених раніше даних щодо фракціонування біологічно активного метаболіту можна представити наступну узагальнену схему отримання цієї речовини у кристалічному вигляді (рис. 5).

Хімічну ідентифікацію кристалічного “препарату АР 3142” проводили за допомогою елементного аналізу. Було з‘ясовано, що ця речовини складається лише з основних компонентів органічних сполук, зокрема вуглецю, водню та кисню. Досліди щодо виявлення інших елементів, які, найчастіше присутні в складі органічних речовин, дали негативний результат. Так, якісними реакціями була підтверджена відсутність азоту та сірки, в складі досліджуваної речовини не було виявлено також елементів групи галогенів.

Було з‘ясовано також, що кристали “препарату АР 3142” при визначенні температури плавлення при температурі 52 оС перетворювались у білу непрозору речовину, що, найбільш вірогідно, було пов‘язано з їх дегідратацією. При цьому речовина не втрачала біологічної активності. Подальше нагрівання супроводжувалось обвуглюванням, яке спостерігалось при температурі 273 оС. Таким чином, характерною температурою для цієї сполуки можна вважати температуру розкладу – 273 оС.

Отримання посівного матеріалу A. 3142

(скошений сусло-агар, 10 діб)

?

Культивування на рідкому середовищі

(220 об/хв., Т = 26 оС, 8 діб)

?

Вакуум-фільтрація > біомаса

?

Вакуум-упарювання

(культуральний фільтрат)

?

Очищення від пігментів > пігмент

(колонкова хроматографія на Al2O3

з елюцією 0,1 н HCl)

?

Вакуум-упарювання

(найбільш активна фракція)

?

Фракціонування

(колонкова хроматографія на Toyopearl HW-40

з елюцією H2O дист.)

?

Вакуум-упарювання

(фракція з активною речовиною)

?

Перекристалізація

(суміш метанол : н-гексан)

?

кристалічний “препарат АР 3142”

Рис. 5. Загальна схема отримання кристалічного препарату з A. 3142.

Поряд з цим, аналіз спектральних характеристик водного розчину “препарату АР 3142” у видимій та в ультрафіолетовій областях спектру засвідчує наявність чіткого максимуму в УФ частині спектру при довжині хвилі 265 нм (Е = 37800) (рис. 6). Порівнюючи це значення з табличними значенням максимумів поглинання основних класів органічних сполук в області 200 – 800 нм можна зробити припущення, що в структурі молекули досліджуваної сполуки можуть міститись від 3-х до 6 спряжених подвійних зв’язків, атоми йоду, азоту та карбоксильна група. Однак, елементний аналіз цієї речовини показав відсутність в структурі атомів азоту та галогенів. Таким чином, можна зробити висновок, що ця речовина може бути ненасиченою поліеновою сполукою, яка містить карбоксильну групу.

У видимій частині спектру нами не було відмічено максимумів поглинання, що може характеризувати також і відсутність забарвлення.

Дослідження біологічних властивостей отриманого “препарату АР 3142” показало досить високу антибіотичну активність, яку засвідчує значення мінімальної пригнічуючої концентрації щодо B. 617 (0,14 мг/мл), та нетоксичність даного препарату для лабораторних тварин.

Дослідження токсигенних властивостей препарату методом шкірної проби на кролях засвідчило його безпечність. Водний розчин “препарату АР 3142” в жодному випадку не спричиняв навіть гіперемії.

Підшкірне введення мишам культуральної рідини також не справляло ніякої дії. Але, як при підшкірній, так і при внутрішньобрюшинній ін‘єкції водного розчину “препарату АР 3142” у дозі 500 мг/кг на 3 добу спостереження у 50 % мишей в місцях введення з‘являлась область гіперемії ІІІ ступеню діаметром 6 – 7 мм, яка характеризувалась зникненням покрову шерсті, набряком, інколи виразками. Поряд з тим, дослідні миші не втрачали апетиту та були активними, а вже на 6 добу спостереження область гіперемії вкривалась суцільною кірочкою. Загиблих мишей в досліді не було. Таким чином, на даній стадії дослідження препарат можна вважати умовно не токсичним для теплокровних.

Завершальним етапом нашої роботи стала побудова математичної моделі процесу біосинтезу біологічно активного метаболіту за вмістом компонентів вуглецевого та азотного живлення у поживному середовищі. За вихідний параметр нами була прийнята маса синтезованої біологічно активної речовини (мг). Після проведення серії дослідів та визначення середніх значень вихідного параметру yср., матриця планування, яка включала паралельні досліди для ПФЕ типу 22, буде мати наступний вигляд:

№ досліду | х0 | План | Змінні стану | Розрахунки | х1 | х2 | х1х2 | yu1 | yu2 | yu | yu | yu-yu | (yu-yu)2 | su2 | 1

2

3

4 | +1

+1

+1

+1 | +1–

1

+1–

1 | +1

+1–

1–

1 | +1–

1–

1

+1 | 31,25

28,75

28,75

26,25 | 30,00

28,75

30,00

27,50 | 30,63

28,75

29,38

26,86 | 30,78

28,60

29,22

27,04 | -0,15

0,15

0,16

0,18 | 0,023

0,023

0,026

0,032

?=0,104 | 0,7813

0

0,7813

0,7813

?=2,34 |

Для визначення коефіцієнтів математичної моделі були проведені розрахунки коефіцієнтів рівняння регресії у матричній формі, які дорівнювали b0 = 28,91, b1 = 1,09, b2 = 0,78, b12 = -0,16. Наступним етапом розрахунків був статистичний аналіз рівняння регресії, де перш за все обчислювали помилку досліду, а потім перевіряли значущість коефіцієнтів регресії та адекватність лінійного рівняння регресії.

Обчислена помилка досліду дорівнювалась 0,0533. Розрахунки показали, що коефіцієнти b0, b1 та b2 є значущими, а коефіцієнт взаємодії b12 виявився не значущим. В цьому разі рівняння математичної моделі процесу синтезу біологічно активної речовини A. 3142 має наступний вигляд:

y = 28,91 + 1,09 * x1 + 0,78 * x2

Доведена адекватність отриманого рівняння математичної моделі може дозволити використовувати його як інтерполяційну формулу для розрахунків виходу активного метаболіту при різних концентраціях вуглецевого та азотного компонентів поживного середовища, які знаходяться між заданими нами верхнім та нижнім рівнями.

В середині 70-х років минулого століття Чао П.-Д. з співавторами виділили та ідентифікували два метаболіти з A., однак, дані щодо біологічної активності цих речовин відсутні. Описані сполуки за структурами були віднесені до речовин хінонової природи і отримали назву аспарвенон та парвуленон. “Препарат АР 3142”, за результатами наших досліджень, не належить до класу хінонів, а є ненасиченим полієном і містить карбоксильну групу. Це дає нам підстави зробити висновок, що “препарат АР 3142” є дійсно новим метаболітом, який проявляє широкий спектр біологічних активностей.

ВИСНОВКИ

1. Проведено скринінг 128 штамів мікроміцетів р. Aspergillus, які належать до 18 видів та 3 різновидностей, за антибіотичними та фітотоксичними властивостями щодо широкого загалу тест-організмів: бактерій, в тому числі фітопатогенних, дріжджоподібних грибів та зелених водоростей.

2. Вcі штами за дослідженими властивостями можна розподілити на 6 груп: 1) штами з широким спектром антибіотичної дії та високою фітотоксичною активністю (26 %); 2) штами з вузьким спектром антибіотичної дії та високою фітотоксичною активністю (12 %); 3) штами з