МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ЧЕРНЕНКО Наталя Анатоліївна

УДК 616.024-009.27.612.37+557.146.1

ПАТОГЕНЕТИЧНІ МЕХАНІЗМИ ЕПІЛЕПТОГЕНЕЗУ
В ОНТОГЕНЕТИЧНОМУ АСПЕКТІ

(експериментальне дослідження)

14.03.04 - патологічна фізіологія

А в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового

ступеня кандидата медичних наук

Одеса - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті
Міністерства охорони здоров’я України.

Науковий керівник: | доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Шандра Олексій Антонович, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри нормальної фізіології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Годлевський Леонід Семенович,
Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри біологічної фізики, інформатики та медичної апаратури

доктор медичних наук, професор Клименко Микола Олексійович,
Харківський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри патологічної фізіології

Провідна установа: Інститут ендокринології та обміну речовин ім.
В.П. Комісаренка АМН України, відділ ендокринології репродукції та адаптації, м. Київ

Захист відбудеться “06” квітня 2005 р. о 11.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті МОЗ України (65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 2)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського державного медичного університету: (65026, м. Одеса, Валіховський пров., 3)

Автореферат розісланий “05” березня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

к.мед.н., доцент

Годован В.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема виникнення і розвитку епілептичної активності (ЕпА) є однією з таких, в рішенні якої збігаються інтереси фахівців різних галузей медицини (Крыжановский Г.Н. и соавт., 1980-2003; Шандра А.А. и соавт., 1985-2002; Фролькіс В.В., 1998; Lopes da Silva F.H. et al., 1995; McNamara J.O., 1999; Loscher W., 2002). Привертає до себе увагу феномен “резистентності” ЕпА у відношенні до проводжуваного лікування (Shandra A. et al., 1996; Loscher W. et al., 2004). Слід зазначити, що вказаний аспект в епілептології є актуальним, оскільки йдеться про досить значний контингент хворих на епілепсію, у яких неможливо досягти контролю за судомними нападами. У більшості з вказаних пацієнтів епілепсія розпочалася в дитячому або в ранньому дитячому (перинатальному) періоді. Механізми феномену “резистентності” у відношенні до протиепілептичного лікування слід шукати в онтогенетичному розвитку організму (Moshe S.L. et al., 2003).

За даними літератури, новонароджені та статево незрілі тварини є малочутливими до епілептиформних впливів, проте, погляди на вказану проблему є неповними та суперечливими (Западнюк В.Г., 1965; Захария Е.А., 1974; Синицкий В.М., 1976; Фролькіс В.В., 1998). Ймовірно, це зумовлено тим, що нейронам незрілих тварин притаманні низька проникність їхніх мебран, а також висока резистентність до подразнення (Kriegstein A.R. et al., 1987). З іншого боку, низка досліджень свідчить про те, що мозок незрілих тварин є більш чутливим до судомних впливів (Moshe S.L., Cornblath M., 1993), що пояснюється переважанням збуджуючих постсинаптичних потенціалів над гальмівними постсинаптичними потенціалами, а також загальною слабкістю або відсутністю гальмівних процесів. Moshe S.L., Sperberg E.F. (1990) доводять, що вікові зміни постіктальної рефрактерності обумовлені недосконалістю гальмівних систем мозку у незрілих тварин, включаючи активність підкіркових ядер. Після появи ознак підвищеної збудливості у незрілих щурів подальша динаміка збільшення епілептогенних відповідей на кіндлінгові стимуляції є більш швидкою, ніж у дорослих тварин (Moshe S.L. et al., 1983, 1988, 1991; Albala B.J. et al., 1984, 1986; Moshe S.L., 1987, 2000). У незрілих щурів на 2 і 3 тижнях життя спостерігаються періоди підвищеної чутливості до судомних реакцій, незважаючи на те, що поріг виникнення ЕпА у них є вищим, ніж у дорослих тварин (Baram T. et al., 1993). Можна вважати, що формування ЕпА в ранньому постнатальному періоді сприяє її подальшому стійкому перебігу, а також переходу в “резистентну” форму (Losher W. et al., 1993). З точки зору розвитку “резистентності”, привертає до себе увагу не тільки модель кіндлінгу, але й “посткіндлінг”, а також такі стійкі до антиепілептичних засобів моделі ЕпА як епілептичний статус (ЕС) і посттравматична епілепсія.

Таким чином, дослідження базисних механізмів формування ЕпА в ранньому постнатальному періоді з використанням моделей кіндлінгу, ЕС і посттравматичної епілепсії буде сприяти вивченню патотофізіологічних механізмів епілептогенезу та механізмів розвитку резистентності.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом НДР Одеського державного медичного університету “Вивчити механізми розвитку резистентних форм епілепсії на прикладі експериментального епілептичного статусу посткіндлінгу у щурів різного віку з метою розробки фармакологічних методів їх корекції” (№ державної реєстрації 0100U006465). Дисертант є співвиконавцем даної теми.

Мета роботи: з’ясування патофізіологічних механізмів розвитку та припинення гострої та хронічної епілептичної активності в ранньому постнатальному періоді.

Завдання дослідження:

1. Визначити особливості розвитку генералізованих судомних реакцій, що викликані у молодих щурів за допомогою пентилентетразолу, пікротоксину і каїнової кислоти.

2. Порівняти динаміку формування пікротоксинового кіндлінгу у 20 денних і дорослих щурів.

3. Вивчити вплив карбамазепіну і вальпроєвої кислоти на ЕпА в умовах пікротоксин-викликаного кіндлінгу в молодих щурів.

4. З'ясувати особливості формування епілептичного статусу у молодих щурів і протисудомні ефекти карбамазепіну і вальпроєвої кислоти в цих умовах.

5. Вивчити механізми викликаної ЕпА в дослідах на переживаючих зрізах гіпокампа молодих щурів.

6. Провести аналіз розвитку посттравматичної судомної активності у молодих щурів і динаміку генералізованих судом, індукованих пікротоксином, каїновою кислотою та пілокарпіном, в посттравматичному періоді.

Об'єкт дослідження – гостра й хронічна епілептична активність, відтворена в експериментальних умовах.

Предмет дослідження – патогенетичні механізми епілептичного синдрому, у щурів в ранньому та пізньому постнатальному періодах.

Методи дослідження. Для досягнення поставленої мети були використані електрофізіологічні, морфологічні та статистичні методи.

Наукова новизна. Показано, що генералізовані пентилентетразол-, пікротоксин- і каїнат-викликані судоми у незрілих щурів мають різну інтенсивність у порівнянні з судомами у дорослих щурів. При цьому, інтенсивність
пентилентетразол-, і пікротоксин-викликаних судомних реакцій переважає у щурів 20 денного віку, а інтенсивність каїнат-викликаних генералізованих судом однакова як в ранньому, так і в пізньому постнатальному періодах, що свідчить про недосконалість системи ГАМК-ергічного гальмівного контролю в ранньому постнатальному періоді. Вперше встановлено, що пікротоксин-індукований кіндлінг у щурят формується швидше порівняно з дорослими щурами. Доведено, що кіндлінг-викликана ЕпА у молодих щурів є стійкою до дії карбамазепіну і вальпроєвої кислоти. Вперше показано, що ЕС у незрілих щурів, викликаний застосуванням каїнової кислоти, характеризується більш коротким інтеріктальним інтервалом між першими судомними проявами і відстроченими судомами. При цьому, відстрочені каїнат-викликані судоми відрізнялися надзвичайною стійкістю до дії карбамазепіну і вальпроєвої кислоти.

Науково-практичне значення отриманих результатів. Отримані дані є патофізіологічним підґрунтям для розуміння формування феномену резистентності в ранньому постнатальному періоді. Вперше показано, що пошкоджувальні судомні впливи на недиференційований мозок щурів в ранньому постнатальному періоді сприяють прискореному розвитку повторного пікротоксинового (ПКТ) кіндлінгу в більш пізньому періоді порівняно з його формуванням у інтактних дорослих щурів.

Перебіг судомного синдрому у щурів в ранньому постнатальному періоді має більш виражений і стійкий характер, підтверджений в умовах генералізованих хронічних, а також посттравматичних судом. Вперше доведено, що в цих умовах відсутні протисудомні ефекти у карбамазепіну (КБЗ) та вальпроєвої кислоти (ВК), що дозволяє в комплексі говорити про те, що в основі стійкого характеру епілептогенезу і формування фармакологічної резистентності у щурів в ранньому періоді може лежати недостатність протиепілептичних механізмів - функціональної активності антиепілептичної системи мозку разом з активацією ендогенних проепілептогенних механізмів. Отримані результати є перспективними для розробки патогенетично обгрунтованих напрямків фармакотерапії резистентних форм епілепсії.

Теоретичні положення дисертації впроваджені в учбовий процес на кафедрах нормальної фізіології, загальної та клінічної патофізіології, гістології, цитології та ембріології, нейрохірургії і неврології Одеського державного медичного університету та нормальної фізіології Дніпропетровської державної медичної академії.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною науковою працею, внесок автора полягає у виборі напрямку, об'єму і методів дослідження, проведенні патентно-інформаційного пошуку з теми дослідження, формулюванні мети і задач дослідження, науковому аналізі та узагальненні одержаних результатів, формулюванні основних положень і висновків дисертації. Автор самостійно здійснила експериментальні дослідження, статистичну обробку одержаних результатів і публікацію основних положень роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися й отримали позитивну оцінку на ІІІ міжнародній конференції Української Протиепілептичної Ліги (Київ, 1999), IV Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2000), ІІІ Національному Конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Одеса, 2000), республіканській конференції молодих учених “Актуальные вопросы диагностики и лечения неотложных состояний” (Донецьк, 2000), ІІ конференції Українського товариства нейронаук, присвяченій 70 річчю кафедри фізіології ДонДМУ ім. М.Горького (Донецьк, 2001), науковій конференції, присвяченій 160 річчю Національного медичного університету “Історія та сучасні досягнення фізіології в Україні” (Київ, 2001), XLV Міжрегіональній науково-практичній конференції (Тернопіль, 2002), науково-практичній конференції з міжнародною участю “І.М.Сєченов та одеська школа фізіологів”, присвяченій 175 річчю з дня народження І.М.Сєченова (Одеса, 2004).

Публікації. Результати дисертації опубліковано у 13 наукових працях, з яких 4 статті у наукових журналах ВАК України (дві – особисті).

Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 172 сторінках машинопису; вона складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, трьох розділів результатів дослідження, аналізу й узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел. Роботу ілюстровано 8 таблицями і 35 рисунками. Список використаної літератури нараховує 328 джерел, з яких 63 – вітчизняні, 265 – іноземні.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Експериметальні дослідження проведені за умов гострого і хронічного експерименту на 200 дорослих (6 місячних) щурах лінії Віcтар і 250 20-денних щурах лінії Віcтар, яких утримували в звичайних умовах віварію.

Генералізовані cyдoми у інтактних щурів та щурів після нанесення черепно-мозкової травми (ЧМТ) викликали за допомогою агоністу рецепторів збуджуючих амінокислот каїнової кислоти (КК). Каїнову кислоту (”Sigma”, USA) розчиняли в 0,9 % фізіологічному розчині NаСl і вводили внутрішньоочеревинно в дозах 5, 8, 10 і 15 мг/кг: розчини готували безпосередньо перед введенням. Крім того, для індукції генералізованих судом у дорослих щурів використовували також ПТЗ (в дозах 5, 15, 30 і 45 мг/кг, в/очер) і ПКТ (”Sigma”, USA; 0,1; 0,5; 1,0; 1,5 і 2,0, в/очер), конвульсивні ефекти яких пов’язані з компрометацією ГАМК-ергічного гальмування (Woodburry D., 1980), а також пілокарпін в дозі 280 мг/кг (в/очер). Ефекти конвyльcантів реєстрували візуально протягом 30 хв після їх застосування й оцінювали за загальноприйнятою шкалою (Шандра О.А., 1986). Визначали латентний період перших судомних проявів, латентний період генералізованих клонікo-тонічних нападів, а також число тварин з генералізованими судомними нападами.

Для відтворення фармакологічного кіндлінгу тваринам протягом 24 діб щоденно одноразово в/очер вводили ПКТ в підпорогових дозах (0,8-0,9 мг/кг – 20 денним щурятам і 0,9-1,1 мг/кг - дорослим щурам) (О.А.Шандра та співавт., 1999). Подальші дослідження проводили тільки на тих тваринах, у яких спостерігали судоми 3-4 стадії.

ЕС у щурів відтворювали внутрішньошлуночковим введенням КК (0,75 мкг) в об'ємі 1,0 мкл, розчиненої у фізіологічному розчині. У тварин оцінювали негайні та відстрочені судомні реакції.

В окремих серіях досліджень щурам з кіндлінг-викликаною хронічною ЕпА (за 30 хв перед тестуючим введенням ПКТ) і ЕС (за 30 хв до введення КК) вводили КБЗ (10, 15 і 20 мг/кг, в/очер) і ВК (100 і 150 мг/кг).

Імплантацію електродів і канюль робили за Вoлoшиним М.Я. (1987), у відповідно до атласу Paxinos, Watson (1982), до таких утворень: фронтальна, тім'яна та потилична ділянки кори великих півкуль, чорна речовина, вентральний гіпокамп, мигдалик та хвостате ядро. Реєстрацію електричної активності здійснювали через 7-10 днів після стереотаксичних втручань. Локалізацію електродів та місця деструкції верифікували на серійних зрізах замороженого мозку.

Для оцінки ЕЕГ використовувалася частота відповіді 256 імп/с за допомогою АЦП (National Instruments, USA). Частотний діапазон сигналів склав 0,5-40 Гц. 16 секундні епохи запису ЕЕГ піддавали аналізу Фур'є (“Labview-5,0”, США). При цьому, на основі візуального аналізу виключали ділянки ЕЕГ, що містили артефакти і визначали показники загальної і спектральної потужності ЕЕГ (мкВ2), досліджувані показники представляли у вигляді відносних величин (контроль – 100 %). Частотні диапазони класифікували так: 0,5-4, 4-8, 8-12, 12-25, 25-40 Гц.

Підготовку переживаючих зрізів гіпокампа та дослідження популяційної активності пірамідних нейронів провадили за методикою Митюшова М.И. (1985). Колатералі Шаффера стимулювали парними прямокутними електричними імпульсами (тривалість 50 мкс, інтервали між імпульсами 10 мс) за допомогою біполярних електродів, виготовлених з ніхромового дроту. Перша серія експериментів проводилася за умов інкубації зрізів гіпокампа без застосування конвульсантів. У другій серії експериментів реєстрували відповідні зміни популяційної активності після проведених стимуляцій протягом 20 хв на фоні дії конвульсантів. Для кількісної оцінки ефекту введення конвульсантів визначали відносну зміну амплітуди 10 послідовних середніх популяційних спайків.

ЧМТ викликали за методом Шандри О.А. і співавт. (1993). Для цього щурам, що були зафіксовані в стереотаксичному апараті, ЧМТ наносили механічно вантажем масою 5 г і 10 г. Черепно-мозкову травму наносили на тім'яно-потиличну ділянку пластмасовим циліндром, заповненим дробом, що опускався з висоти 50 см. Площа ударної частини, при цьому, складала 3,5 см2. За тваринами спостерігали протягом 24 годин з моменту нанесення ЧМТ, після чого тестували їх судомну готовність.

Для проведення морфологічних досліджень тварин декапітували через 60 хв після нанесення ЧМТ, головний мозок промивали фізіологічним розчином і занурювали в 5 % розчин формаліну. Виготовлені за допомогою мікротома фронтальні зрізи головного мозку, узяті на рівні брегми, оцінювали морфологічно під світловим мікроскопом (збільшення – 100).

Всі отримані результати обробляли за допомогою параметричних і непараметричних методів статистичного аналізу. Статистичну обробку здійснювали на персональному комп'ютері за допомогою програми статистичного аналізу “SigmaStat” (“Jandel Scientific”, 1994).

Результати досліджень та їх обговорення. Особливості генералізованих судом у щурів в ранньому постнатальному періоді. Введення ПКТ (0,1 мг/кг) 20 денним щурятам зумовлювало виникнення перших судомних реакцій через (19,0±3,0) хв - латентний період перших судом був в 2 рази коротшим за відповідний показник у 6 місячних щурів (P<0,01). У 1 з 10 тварин цієї групи розвинувся генералізований клоніко-тонічний судомний напад, у 3 щурів судоми виявлялися у вигляді клонічних скорочень тулуба і кінцівок. Інтенсивність ПКТ-викликаних судом в цій групі складала (1,1±0,5) балів. В умовах застосування ПКТ (0,1 мг/кг) дорослим щурам, тільки у 1 тварини з 10 відмічалися клонічні скорочення м'язів морди і передніх кінцівок, у решти протягом 45 хв спостереження, судомних реакцій не відмічалося. Інтенсивність судом склала (0,20±0,20) бала, латентний період перших судомних реакцій становив 40-45 хв.

Введення ПКТ (0,5 мг/кг) 20 денним щурятам сприяло виникненню перших судомних реакцій через (14,4±2,1) хв. Інтенсивність ПКТ-викликаних судом в цій групі складала (2,3±0,6) бала. Після введення конвульсанту в дозі 0,5 мг/кг дорослим щурам, тяжкість судом у тварин цієї групи склала (1,1±0,5) бала, латентний період перших судомних реакцій складав (34,5±4,0) хв.

Після подальшого введення ПКТ в дозах 1,0, 1,5 та 2,0 мг/кг ми визначили середньоефективні дози епілептогену відносно індукції клонічних і клоніко-тонічних судом у тварин різного віку. ЕД50 ПКТ, необхідного для індукції клонічних судом у щурят, складала (0,23±0,13) мг/кг, що було в 2,5 рази менше відповідного показника в групі дорослих щурів (P<0,01). ЕД50 ПКТ для індукції клоніко-тонічних судом у щурят дорівнювала (0,92±0,17) мг/кг, що було в 2,3 рази менше відповідного показника в групі дорослих щурів (P<0,01).

Введення пентилентетразолу (ПТЗ) для індукції генералізованих судом показало, що ЕД50 ПТЗ для індукції клонічних судом у молодих щурів, складала (6,9±4,5) мг/кг і була в 3 рази меншою відповідного показника в групі дорослих щурів (P<0,05). ЕД50 ПТЗ для індукції клоніко-тонічних судом у молодих щурів дорівнює (13,3±3,0) мг/кг, що в 2,8 рази менше відповідного показника в групі дорослих щурів (P<0,001).

Середньоефективні дози КК для індукції клонічних і клоніко-тонічних судом у тварин обох груп істотно не відрізнялися. Так, ЕД50 КК для індукції клонічних судом у щурят складала (1,9±0,7) мг/кг, що було на 25 % менше відповідного показника в групі дорослих щурів (P>0,05). ЕД50 КК, яка викликала клоніко-тонічні судоми у щурят, дорівнює (7,6±1,2) мг/кг, що також не відрізнялася від аналогічного показника в групі дорослих щурів (P>0,05).

В цілому, отримані дані дозволяють зробити висновок про недосконалість системи ГАМК-ергічного гальмівного контролю в ранньому постнатальному періоді. В цей же часовий період система збуджуючих амінокислот вже сформована, а її гіперактивація сприяє формуванню виражених судомних реакцій.

Особливості розвитку хронічної ЕпА у щурів в ранньому постнатальному періоді. Починаючи з 4 введення ПКТ (0,8 мг/кг) 20 денним щурятам у 11 з 12 тварин реєструвалися міоклонічні скорочення м’язів морди, які впродовж наступних 6-8 хв трансформувалися у 8 щурів у міоклонічні скорочення передніх кінцівок. Середня інтенсивність судомних реакцій становила (1,00,2) бала. Починаючи з 9 ін’єкції конвульсанту, у 100 % тварин відзначалися численні міоклонічні скорочення м’язів тулуба і кінцівок. Середня інтенсивність судомних реакцій дорівнювала (2,80,5) бала і в 2 рази перевищувало аналогічні показники, які були отримані на 9 добу при відтворенні кіндлінгу у дорослих щурів (P<0,05). Після 12 введення епілептогену середня інтенсивність судом становила (3,10,4) бала і була в 1,7 рази більшою, у порівнянні з аналогічними показниками у дорослих щурів (P<0,05). У відповідь на 15 ін’єкцію конвульсанту в 11 з 12 тварин реєструвалися генералізовані клоніко-тонічні напади з падінням на бік, втратою рівноваги, вегетативними розладами та депресією після нападів (P<0,01). Середня інтенсивність судом у 20 денних щурят при цьому становила (4,10,4) бала (рис.).

Починаючи з 4 введення епілептогену (1,0 мг/кг) дорослим щурам, у всіх тварин (n=10) відзначались епізоди завмирання і слабкого тремору голови, виражених міоклонічних здригань м’язів морди. Через (6,30,6) хв у 6 щурів виникали міоклонічні скорочення м’язів передніх кінцівок. Середня інтенсивність судомних реакцій при цьому становила (0,50,1) бала.

Починаючи з 9 ін’єкції ПКТ, у щурів спостерігалися міоклонічні скорочення м’язів тулуба та передніх кінцівок. Інтенсивність судомних реакцій у цих умовах становила (1,50,3) бала. Після 18 введення конвульсанту у 8 з 10 щурів виникали клонічні скорочення м’язів тулуба, передніх і задніх кінцівок, підіймання на задні лапи (т.з. “поза кенгуру”). Інтенсивність судом становила (3,20,4) бала. Після 24 ін’єкції конвульсанту генералізовані напади реєструвались у всіх тварин. Середня інтенсивність судом у щурів цієї групи наприкінці відтворення ПКТ-кіндлінгу становила (4,20,4) бала.

Починаючи з 4 введення епілептогену дорослим щурам, у яких в ранньому постнатальному періоді був сформований ПКТ-кіндлінг, реєструвалися міоклонічні скорочення м’язів морди, які впродовж наступних 6-8 хв у 7 з 10 трансформува-

лися в міоклонічні скорочення передніх кінцівок. Середня інтенсивність судомних

реакцій, при цьому, дорівнювала (1,10,3) бала. Починаючи з 9 ін’єкції ПКТ, у 100 % тварин відзначалися численні міоклонічні скорочення м’язів тулуба та

Рис. Розвиток пікротоксинового кіндлінгу у щурів різного віку.

*- P<0,05 і ** - P<0,01 – вірогідні розбіжності досліджуваних показників у порівнянні з такими в інтактних дорослих щурів.

кінцівок, середня інтенсивність судом становила (2,00,4) бала. Після 12 введення епілептогену середня інтенсивність судом у 2 місячних щурів, у яких в ранньому постнатальному періоді був сформований кіндлінг, становила (2,80,4) бала, що істотно не відрізнялося від аналогічних показників у інтактних дорослих щурів (P>0,05). У відповідь на 18 ін’єкцію ПКТ у 9 з 10 тварин реєструвалися генералізовані клоніко-тонічні напади з падінням на бік, втратою рівноваги, вегетативними розладами та депресією після нападів (P<0,05). Середня інтенсивність судом у щурів досліджуваної групи становила (4,10,3) бала.

Дослідження ЕЕГ в умовах кіндлінгу показало, що підсилення процесів біоелектрогенезу, більшою мірою, спостерігається у вентральному гіпокампі, а також у ділянках лобової і тім'яної кори великих півкуль, що свідчить про їхню важливу роль в епілептогенезі. В наших дослідженнях одержано електрофізіологічне пояснення і доказ більш раннього формування ПКТ кіндлінгу у щурят, що проявлялося посиленням потужності і вираженості епілептиформних потенціалів у ділянках вентрального гіпокампа, а також лобової і тім'яної кори великих півкуль.

Отже, проведені дослідження показали, що повторні введення ПКТ в підпороговій дозі щурятам сприяють швидшому виникненню і прогресивному зростанню інтенсивності судомних проявів від окремих міоклонічних здригань до генералізованих клоніко-тонічних судомних нападів. У 20 денних щурят повторні введення конвульсанту в підпороговій дозі сприяють формуванню фармакологічного кіндлінгу вже після 15 застосування епілептогену. У дорослих щурів ПКТ-індукований кіндлінг формується протягом 24 тестуючих уведень конвульсанту. ПКТ-провоковані судоми у кіндлінгових щурів (у ранньому постнатальному періоді й у дорослих щурів, у яких кіндлінг формували в ранньому постнатальному періоді) характеризуються коротким латентним періодом виникнення та максимальною інтенсивністю. За даних умов у щурів зазначених груп переважають генералізовані судомні напади, в тому числі й повторні.

Дослідження вираженості протисудомних ефектів КБЗ та ВК за умов кіндлінг-викликаної ЕпА показало, що КБЗ виявився ефективним лише у разі його введення у максимальній дозі: саме тоді він викликав зниження інтенсивності судомних реакцій і збільшення тривалості латентного періоду їхнього розвитку (табл. 1). Важливим є збільшення латентного періоду виникнення перших судом у дорослих кіндлінгових щурів під впливом КБЗ в дозі 15 мг/кг, але зазначена доза препарату не була ефективною щодо ПКТ-спричинених судом у молодих щурів.

Подібні дані ми отримали в разі введення щурам ВК (табл. 2). При цьому ПКТ судоми в усіх групах кіндлінгових щурів характеризувалися малою чутливістю до дії даного протисудомного препарату. Лише після введення максимальної (близької до токсичної) дози ВК реєструвалося збільшення латентного періоду виникнення перших судом у тварин усіх досліджуваних груп, проте інтенсивність судомних реакцій не відрізнялася істотно від таких даних у відповідних контрольних групах. Отже, проведені дослідження показали, що ЕпА, сформована впродовж розвитку ПКТ кіндлінгу у молодих щурів, є стійкою до дії протисудомних препаратів.

Можливо, фармакологічна резистентність до протисудомних засобів розвивається в ранньому постнатальному періоді. Відмічається більш швидкий розвиток ПКТ кіндлінгу у молодих щурів, а також тяжчі прояви ПКТ- і ПТЗ-провокованих генералізованих судом, що свідчить про відсутність сформованих антиепілептичних механізмів в недиференційованому мозку.

Важливими, з точки зору побудови подальших схем експериментальних досліджень, є дані про тестування ПКТ-спричиненої судомної активності у дорослих щурів, яким у 20 денному періоді відтворювали кіндлінг. Ці дані також свідчать про те, що епілептогенні впливи в разі їхнього нанесення в ранньому постнатальному періоді сприяють формуванню та тривалому збереженню підвищеної готовності до дії просудомних факторів, так і формуванню резистентності до протисудомних засобів.

Таблиця 1

Вплив КБЗ на кіндлінг-викликану ЕпА у щурів різного віку

Умови досліду, доза препарату | Вік тварин | Латентний період перших судом, хв. | Кількість тварин
із судомами, бали

0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5

1. Контроль:

Кіндлінг + ПТК, n=8 | 6 місяців | 15,21,8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6 | 2

20 діб | 14,01,2 | 0 | 0 | 0 | 1 | 6 | 1

6 місяців** | 11,11,7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 | 4

2. Кіндлінг + КБЗ (10 мг/кг) + ПТК, n=10 | 6 місяців | 16,62,1 | 0 | 0 | 0 | 2 | 7 | 1

20 діб | 18,12,9 | 0 | 0 | 0 | 1 | 6 | 3

6 місяців** | 14,82,0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7 | 3

3. Кіндлінг + КБЗ (15 мг/кг) + ПТК, n=10 | 6 місяців | 21,42,1 # | 0 | 0 | 0 | 4 | 4 | 2

20 діб | 16,12,4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 | 2

6 місяців** | 17,02,6 | 0 | 0 | 0 | 1 | 5 | 4

4. Кіндлінг + КБЗ (20 мг/кг) + ПТК, n=10 | 6 місяців | 25,12,9 # | 0 | 5 | 4 | 1 | 0 | 0*

20 діб | 22,02,9 # | 0 | 4 | 5 | 1 | 0 | 0*

6 місяців** | 18,62,1 # | 0 | 3 | 5 | 2 | 0 | 0*

Примітки (тут і в табл. 2):

1. ** - зазначена група 6 місячних щурів, у яких в ранньому постнатальному періоді (20 діб) відтворювали кіндлінг.

2. # - P<0,05 – суттєві розбіжності латентного періоду судом відносно таких показників у відповідних контрольних групах щурів (АНОВА критерій).

3. * - P<0,05 – суттєві розбіжності тяжкості судом відносно таких показників у відповідних контрольних групах щурів (критерій Крушкал-Валліс).

Таблиця 2

Вплив ВК на кіндлінг-викликану ЕпА у щурів різного віку

Умови досліду, доза препарату | Вік тварин | Латентний період перших судом, хв. | Кількість тварин
із судомами, бали

0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5

1. Контроль: Кіндлінг + ПТК, n=8 | 6 місяців | 15,21,8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6 | 2

20 діб | 14,01,2 | 0 | 0 | 0 | 1 | 6 | 1

6 місяців** | 11,11,7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 | 4

2. Кіндлінг + ВК (100 мг/кг) + ПТК, n=10 | 6 місяців | 16,52,3 | 0 | 0 | 0 | 1 | 6 | 3

20 діб | 15,21,7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7 | 3

6 місяців** | 14,82,2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6 | 4

3. Кіндлінг + ВК (150 мг/кг) + ПТК, n=10 | 6 місяців | 21,42,1 # | 0 | 0 | 3 | 4 | 2 | 1*

20 діб | 19,61,9 # | 0 | 0 | 0 | 1 | 8 | 1

6 місяців** | 17,72,2 # | 0 | 0 | 0 | 1 | 7 | 2

Завданням наступної серії досліджень було вивчення особливостей формування ще однієї моделі судомної активності – ЕС - у незрілих тварин, а також тестування ефектів КБЗ та ВК в умовах каїнат-викликаного ЕС. У середньому, через 45-55 с з моменту внутрішньошлуночкового введення КК дорослим тваринам, у них реєструвалися різкі судомні здригання голови, клонічні скорочення м'язів передніх кінцівок. Протягом подальших 60 с у всіх щурів розвивалися генералізовані клоніко-тонічні судомні напади з падінням на бік і втратою рівноваги. У всіх тварин цієї групи переважав тонічний компонент судомного нападу, у 75 % щурів генералізовані судомні напади відбувалися повторно. Надалі у щурів відмічалися незначні міоклонічні здригання, які через (5,20±0,50) год змінилися постійними міоклонічними здриганнями та скороченнями м'язів передніх кінцівок (табл. 3).

Таблиця 3

Формування каїнат-викликаної ЕС у щурів різного віку

Умови
досліду | Кількість щурів | Латентний період перших судомних
реакцій, M±m, хв | Латентний період відстрочених судомних
реакцій, M±m, год

1.6 місячні щури | 12 | 0,88±0,07 | 5,20±0,50

2. 20 денні щури | 16 | 1,12±0,08* | 3,85±0,45#

Примітки:

1. * - P<0,05 - суттєві розбіжності відносно таких показників в групі дорослих щурів (АНОВА критерій).

2. # - P<0,05 - суттєві розбіжності відносно таких показників в групі дорослих щурів (критерій Крушкал-Валіс).

Після в/шл ін'єкції КК (0,75 мкг) 20 денним щурятам, перші судомні реакції у них реєструвалися, в середньому, через (1,12±0,08) хв, що на 21 % перевищувало відповідний показник в контрольній групі тварин (P<0,05). При цьому, протягом подальших 25-50 с судомні прояви швидко трансформувалися в генералізовані клоніко-тонічні напади з втратою рівноваги і падінням на бік. У всіх молодих щурів також переважав тонічний компонент судомного нападу, у 81 % щурів генералізовані судомні напади відбувалися повторно. При цьому летальність щурят становила 56 %. Надалі у щурят, що пережили ЕС, відмічалися незначні міоклонічні здригання, які через (3,85±0,45) год змінилися постійними міоклонічними здриганнями і скороченнями м'язів передніх кінцівок. Латентний період відстрочених судом був на 26 % меншим за аналогічний показник у дорослих тварин (P<0,05). Досліди показали, що відстрочені каїнат-викликані судоми відрізнялися надзвичайною стійкістю до дії КБЗ і ВК.

В подальшому ми провели серію спостережень з метою дослідження електричної активності зрізів гіпокампа у щурів різного віку, результати яких дають підстави вважати, що основою розвитку феномену резистентності в мозку незрілих щурів в ранньому постнатальному періоді можуть бути синаптичні зміни соми пірамідних нейронів гіпокампа, що проявляються у порушенні балансу ГАМК-зумовленого гальмування і функціонального стану системи збуджуючих амінокислот, які забезпечують високу фармакологічну резистентність.

Недиференційований мозок щурів в ранньому постнатальному періоді характеризується підвищеною збудливістю пірамідних нейронів, що виявляється при ЕС колатералей Шаффера, і підвищеною чутливістю до дії ПКТ і КК, що підтверджує наше припущення про недосконалість загальних регуляторних механізмів. Ймовірно, ця закономірність носить загальний характер і виявляється в гіпокампі, в сомі пірамідних нейронів. Швидше за все, відмічені зміни в недиференційованому мозку є основними причинами формування “резистентності” до проводжуваного лікування.

Особливості розвитку посттравматичної судомної активності у молодих щурів. При огляді мозку інтактних щурят у місці нанесення ЧМТ вантажем масою 5 г виявлялися гематоми різної величини. Тверда мозкова оболонка мала перламутровий блиск, який місцями був відсутній. М'які мозкові оболонки набряклі. В речовині мозку, подалі від епіцентру ЧМТ, судини часто застійно повнокровні, частково спазмовані. В корі і підкіркових структурах відмічається розширення периваскулярних просторів, зрідка навкруги артеріальних судин зустрічаються диапедезні виходи еритроцитів.

У корі головного мозку щурят після нанесення ЧМТ вантажем масою 5 г ламінарність виражена так, як і у щурят в контрольної групи без нанесення травми. Відмічається гостре набухання нейроцитів, але без грубих порушень в структурі клітин. Вираженість стовпчатих ансамблів нечітка, у порівнянні з аналогічною морфологічною картиною в контрольних спостереженнях. Відзначаються грубі явища сателітозу. У вентральному і дорзальному гіпокампі виявлено переважання світлозабарвлених клітин зі збільшеним ядром. В нейронній популяції кори істотно зменшилася кількість нейронів з ознаками підвищеної функціональної активності та функціонального виснаження, порівняно з аналогічними контрольними показниками.

В цілому, зміна функціональних систем при ЧМТ має невиражений характер, що свідчить про легку ступінь пошкодження головного мозку. Отримані дані довели, що вираженість посттравматичних ПКТ-, пілокарпін- та каїнат-викликаних генералізованих судом була більшою у разі їхньої індукції за допомогою КК кислоти, механізм судомної дії якої реалізується шляхом активації системи збуджуючих амінокислот. Можливо, що травматичне ураження мозку, в цей період, також надає небажаного (просудомного) впливу на недиференційований мозок, який характеризується недосконалістю гальмівних регуляторних процесів. Крім цього, після ЧМТ виникає низка інших патологічних процесів, одним з яких є звільнення ацетилхоліну (Chen Yu. et al., 1998), внаслідок чого формується підгрунтя для майбутніх зрушень поведінки, а також значно зростає судомна чутливість до дії холінергічних речовин. За даними (Tanaka K. et al., 1995; Chen Yu. et al., 1998), внаслідок ЧМТ та пов’язаною з нею ішемією нейронів кори головного мозку відмічається значна загибель нейронів кори та гіпокампа, що також сприяє розвитку фармакологічної резистентності (Шандра А.А. и соавт., 2002).

ВИСНОВКИ

В дисертації наведені узагальнення і нове вирішення проблеми дослідження особливостей патофізіологічних механізмів епілептогенезу в ранньому постнатальному періоді. Отримані результати свідчать про недосконалість системи ГАМК-ергічного гальмівного контролю в мозку молодих щурів. У той же період онтогенетичного розвитку активність системи збуджуючих амінокислот перебуває на оптимальному рівні, та її активація сприяє формуванню судомних реакцій. Це є важливим у дослідженні патогенетичних механізмів збереження підвищеної судомної готовності в наступних вікових проміжках часу і, можливо, сприяє формуванню фармакологічної резистентності до дії протисудомних препаратів.

1. Генералізовані пентилентетразол-, пікротоксин- і каїнат-викликані судоми у незрілих щурів сутєво відрізняються в порівнянні з судомами у дорослих щурів. При цьому інтенсивність пентилентетразол-, і пікротоксин-викликаних судомних реакцій переважає у щурів 20 денного віку, а інтенсивність каїнат-викликаних генералізованих судом однакова у щурів різного віку, що свідчить про недосконалість системи ГАМК-ергічного гальмівного контролю в ранньому постнатальному періоді. Показники ЕД50 пентилентетразолу та пікротоксину відносно індукції клонічних судом у молодих щурів були в 3 рази та в 2,5 рази меншими за відповідні показники у дорослих щурів. Показники ЕД50 пентилентетразолу та пікротоксину відносно індукції клоніко-тонічних судом у молодих щурів були в 2,8 рази та в 2,3 рази меншими за відповідні показники у дорослих щурів.

2. В основі розвитку генералізованих судомних реакцій в ранньому постнатальному періоді і формування підвищеної судомної чутливості до дії епілептогених чинників, збереження підвищеної судомної готовності у наступних вікових проміжках часу і розвитку резистентності до антиепілептичних засобів є гіперактивація системи збуджуючих амінокислот.

3. Пікротоксин-індукований кіндлінг у щурят формується швидше порівняно з дорослими щурами. Пошкоджуючі судомні дії на недиференційований мозок щурів в ранньому постнатальному періоді сприяють, незважаючи на триваючі процеси диференціювання мозку і механізми пластичності, формуванню епілептичних систем в структурах мозку, що зумовлюють прискорене формування пікротоксинового кіндлінгу в більш пізньому періоді порівняно з його формуванням у інтактних дорослих щурів.

4. Сформована в процесі становлення пікротоксинового кіндлінгу епілептична активність у молодих щурів є стійкою у відношенні до дії карбамазепіну і вальпроєвої кислоти, що є важливим доказом формування резистентності до протисудомної терапії.

5. Епілептичний статус у незрілих щурів характеризується більш коротким (на 26%) інтеріктальним періодом між першими судомними проявами і відстроченими судомами, ніж дорослих тварин. Відстрочені каїнат-викликані судоми надзвичайно стійкі до дії карбамазепіна та вальпроєвої кислоти.

6. Посттравматична епілептична активність у щурят характеризується зростанням активності нейронів кори головного мозку. Вираженість пікротоксин-, пілокарпін- та каїнат-викликаних генералізованих судом у тварин з ЧМТ була більшою, вiдповiдно, на 25%, 27% та 31% у порівнянні з такою у інтактних тварин, що свідчить про підвищену активність системи збуджуючих амінокислот в мозку молодих щурів.

7. Формування судомного синдрому у щурів в ранньому постнатальному періоді характеризується більш вираженим і стійким характером, що підтвердженим в умовах генералізованих, хронічних і посттравматичних судом. Відсутність протисудомних ефектів вальпроєвої кислоти і у меншій мірі карбамазепіна свідчить, що в основі стійкого характеру епілептогенезу і формування фармакологічної резистентності у щурів в ранньому постнатальному періоді може бути недостатність функціональної активності антиепілептичної системи мозку разом з активацією ендогених проепілептогених механізмів.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА МАТЕРІАЛАМИ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Черненко Н.А. Особливості формування хронічної епілептичної активності у щурів раннього та пізнього постнатального віку // Одеський медичний журнал. –2002. -№6. – С.32-35.

2. Особливості посттравматичної судомної активності у молодих щурів / Волохова Г.О., Насібулін Б.А., Черненко Н.А., Кащенко О.А., Вастьянов Р.С., Шандра О.А. // Одеський медичний журнал. –2003. -№1. –С.7-12 (Внесок автора: здійснено пошук літератури, проведення досліджень по вивченню судомної активності у молодих щурів. Реєстрація електричної активності мозку у молодих щурів.).

3. Протисудомні ефекти карбамазепіну, але вальпроєвої кислоти в умовах пікротоксин- та пілокарпінспричинених моделей хронічної епілептичної активності у щурів різного віку / Вастьянов Р.С., Черненко Н.А., Кащенко О.А., Олійник А.А., Волохова Г.О. // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. –2003. -№1 (21). –С.29-38 (Внесок автора: здійснено пошук літератури, проведення досліджень по вивченню судомної активності у молодих щурів. Реєстрація електричної активності мозку у молодих щурів).

4. Черненко Н.А. Особливості гострих генералізованих судом у щурів різного віку // Вісник наукових досліджень. –2003. -№2. –С.98-101.

5. Черненко Н.А. Изменение судорожной готовности крыс в раннем и позднем постнатальном периоде // Тези ІІІ міжнародній конференції Української Протиепілептичної Ліги. –Київ, 1999. –С.63.

6. Черненко Н.А., Віхрестюк С.Л. Різний профіль протисудомних препаратів у щурів 1-2 місяців життя за умов гострих коразол- та пікротоксин-викликаних судом // Тези IV Міжнародного медичного конгресу студентів і молодих вчених. –Тернопіль, 2000. –С.335 (Внесок автора: здійснено пошук літератури, проведення досліджень по вивченню судомної активності у молодих щурів, виступ з доповіддю на конференції).

7. Черненко Н.А. Изменение чувствительности крыс разного возраста к судорожному действию пикротоксина и каиновой