МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

Київська медична академія післядипломної освіти

ім. П.Л. Шупика

ЦВЕЮК НАДІЯ ПЕТРІВНА

УДК 582.923.1: 615.451

ФАРМАКОГНОСТИЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ

ТИРЛИЧУ ВАТОЧНИКОВИДНОГО

15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Івано-Франківському державному медичному університеті Міністерства охорони здоров’я України.

Науковий керівник: кандидат фармацевтичних наук, доцент

Грицик Андрій Романович

Івано-Франківський державний медичний університет,

завідувач кафедри фармації

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, старший науковий співробітник

Маковецька Олена Юріівна

Медичний інститут Української асоціації народної медицини,

завідуюча кафедри фармацевтичної хімії та фармакогнозії

доктор фармацевтичних наук, професор

Мазулін Олександр Владиленович

Запорізький державний медичний університет,

професор кафедри фармакогнозії

Провідна установа: Національний фармацевтичний університет Міністерства охорони здоров’я України, кафедра фармакогнозії, м. Харків

Захист відбудеться “  28    жовтня  2005 р. о  00  годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.04 при Київській медичній академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика за адресою: 04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика (04112, м. Київ, вул. Дорогожицька,9).

Автореферат розісланий “  27     вересня   2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доцент Л.Б. Пилипчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пошуки та створення нових лікарських засобів рослинного походження, а також організація їх промислового виробництва – важливе завдання вітчизняної фармації. Особлива увага надається рослинам з багатовіковим досвідом використання в народній медицині, до яких належить тирлич жовтий (Gentiana lutea L.).

На українському фармацевтичному ринку зареєстровані і широко використовуються комплексні алопатичні і гомеопатичні препарати іноземних виробників, які вміщують сумарні екстракти коренів тирличу жовтого (Гербіон шлункові краплі, Трав’яний бальзам і Шведська гіркота Др. Тайса, Афлубін, Лімфоміозот). Застосовують їх при атонії і секреторній недостатності органів шлунково-кишкового тракту, анорексії, дискінезії жовчних шляхів, для загального зміцнення організму.

Вітчизняні виробники ліків не виготовляють препарати з тирличу жовтого, оскільки даний вид є рідкісним гірським європейським видом, який перебуває на межі зникнення. Сировина тирличу жовтого була включена до Державної Фармакопеї VIII видання, а в подальші видання не включена, тому що запаси її постійно скорочуються.

Актуальним є розробка впровадження в медичну практику нової лікарської рослинної сировини, яка може бути замінником офіцинальної сировини. Перпективним є дослідження тирличу ваточниковидного (Gentiana asclepiadea L.), який використовується в народній медицині нарівні з тирличем жовтим, широко розповсюджений на території Українських Карпат. Недостатнє хімічне та відсутні фармакологічні дослідження тирличу ваточниковидного, а також доступність сировини стали підставою для наших досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Івано-Франківського державного медичного університету і є складовою частиною науково-дослідної теми: “Дослідження деяких дикорослих і культивованих рослин західного регіону України і вивчення можливості створення на їх основі лікарських засобів” (номер державної реєстрації 0103 U 004377).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є фармакогностичне дослідження тирличу ваточниковидного, вивчення можливості комплексного застосування рослинної сировини для створення лікарських засобів, а також розробка методів стандартизації сировини і препаратів за вмістом діючих речовин.

Для досягнення цієї мети ставили такі завдання:

- провести попереднє фітохімічне дослідження сировини тирличу ваточниковидного;

- виділити та ідентифікувати біологічно активні речовини (БАР) з трави і коренів тирличу ваточниковидного;

- розробити спосіб одержання і стандартизацію екстрактів з тирличу ваточниковидного;

- вивчити фармакологічні властивості екстрактів з рослинної сировини;

- вивчити можливість створення лікарських засобів з коренів і трави тирличу ваточниковидного;

- вивчити сировинні ресурси тирличу ваточниковидного;

- розробити проекти аналітичної нормативної документації (АНД) на сировину, інструкцій із заготівлі, сушіння і зберігання коренів і трави тирличу ваточниковидного.

Об’єкти дослідження: підземні і надземні органи тирличу ваточниковидного, водні та водно-спиртові екстракти, індивідуальні біологічно активні речовини.

Предмет дослідження: виділення, ідентифікація біологічно активних речовин тирличу ваточниковидного, створення на їх основі і стандартизація нового фітозасобу.

Методи дослідження. Біологічно активні речовини вивчали методами тонкошарової і паперової хроматографії в різних системах розчинників. Для виділення БАР з рослинної сировини використовували рідинну екстракцію, колонкову хроматографію на поліаміді, а також препаративну хроматографію на папері і в тонкому шарі сорбенту. Хімічну будову виділених речовин встановлювали методом УФ-спектрального аналізу за допомогою спектрофотометрів типу СФ-56 та Specord М40. Ресурсознавчі дослідження проводили з використанням методу модельних екземплярів. Висоту над рівнем моря визначали приладом GARMIN GPS 12. Для анатомічного дослідження листків тирличу ваточниковидного використовували мікроскоп Rathenow 83241, цифровий фотоапарат Minolta DImage X20. Фармакологічні дослідження проводили in vivo.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено систематичні фітохімічні, фармакологічні і ресурсознавчі дослідження тирличу ваточниковидного. Ідентифіковано 8 речовин, серед яких флавоноїди, ксантон, фенолкарбонові кислоти. Проведено вивчення вмісту біологічно активних речовин коренів і трави тирличу ваточниковидного в залежності від фази вегетації і місця зростання рослини.

Опрацьовано оптимальні умови одержання сумарних екстрактів. Встановлено, що екстракти коренів і трави є нетоксичними і проявляють гепатозахисну і протизапальну активність.

Розроблений спосіб одержання екстракту з коренів тирличу ваточниковидного з гепатозахисною активністю, який захищено патентом на винахід № 70451А. На спосіб одержання екстракту з трави тирличу ваточниковидного, який проявляє гепатозахисну активність, отримано позитивне рішення про видачу деклараційного патенту на корисну модель (№ заявки u 2005 00556 від 21 січня 2005 р.)

Виявлені місця зростання рослини і встановлені запаси надземних і підземних органів.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані фітохімічні та фармакологічні дані вказують на можливість використання коренів і трави тирличу ваточниковидного як лікарської рослинної сировини.

Розроблено проекти АНД “Тирличу ваточниковидного корені” і “Тирличу ваточниковидного трава”. Розроблено проекти інструкцій із заготівлі, сушіння і зберігання коренів і трави тирличу ваточниковидного.

Розроблено і затверджено Технічні умови України на корені тирличу (ТУ У 15.8-02010758-002-2003) і траву тирличу ваточниковидного (ТУ У 15.8-02010758-003-2003), згідно яких контролюється якість вихідної сировини при виробництві рослинних настоянок на Івано-Франківському обласному державному об’єднанні спиртової та лікеро-горілчаної промисловості.

За матеріалами роботи видані методичні рекомендації “Поширення і перспективи застосування тирличу ваточниковидного в медицині”, які впроваджені в навчальний процес і практичну роботу кафедри фармакології та фармації Буковинської державної медичної академії, кафедр фармації, фармакології з курсом клінічної фармакології ІФДМА, кафедр ботаніки, фармакогнозії Національного фармацевтичного університету, кафедри фармацевтичної хімії і фармакогнозії Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика, кафедри фармакогнозії і ботаніки Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, контрольно-виробничої лабораторії Івано-Франківського обласного державного об’єднання спиртової та лікеро-горілчаної промисловості (акти впровадження від 23.01.2004, 2.02.2004, 20.03.2004, 30.01.2004, 12.02.2004, 26.10.2004, 18.03.2004, 5.02.2004 відповідно).

Особистий внесок здобувача. Автором проведений аналіз літературних даних ботанічної характеристики, поширення тирличу ваточниковидного, хімічного складу і використання рослин роду тирлич;

– встановлені основні групи БАР, проведений їх кількісний аналіз в сировині по фазах вегетації і з різних місць зростання;

– виділено та ідентифіковано 8 речовин фенольної природи з трави тирличу ваточниковидного;

– розроблені способи одержання сумарних екстрактів та досліджена їх фармакологічна активність;

– проведена ресурсна характеристика тирличу ваточниковидного в Українських Карпатах;

– вивчено анатомічні діагностичні ознаки трави тирличу ваточниковидного.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладено на 7-му Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих учених (Тернопіль, 2003), Міжнародній науковій конференції, присвяченій 100-річчю створення фармацевтичного факультету Запорізького державного медичного університету “Історія та перспективи розвитку фармацевтичної науки і освіти” (Запоріжжя, 2004), Х-му Конгресі СФУЛТ (Чернівці, 2004), І-й Міжнародній науково-практичній конференції “Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів і біологічно активних добавок” (Тернопіль, 2004), Науково-практичній конференції “Фармацевтичне право: організаційно-правові проблеми рецептурного та безрецептурного відпуску лікарських засобів в сучасних умовах” (Харків, 2004), Всеукраїнському науково-практичному семінарі “Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії” (Харків, 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 17 наукових праць, у тому числі 10 статей (з них 6 у наукових фахових виданнях), 1 методичні рекомендації, 1 патент на винахід, 5 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, трьох розділів з результатами експериментальних досліджень, списку літературних джерел і додатків. Загальний обсяг дисертації складає 137 сторінок. Робота містить 21 рисунок, 47 таблиць, 19 додатків. Список використаних джерел літератури складає 120 найменувань, з них 35 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Ботанічна характеристика, хімічний склад та

застосування тирличу ваточниковидного в медицині

В огляді літератури описано біологічні особливості тирличу ваточниковидного, умови проростання і культивування, хімічний склад, застосування в народній медицині. Рослина широко розповсюджена на території Українських Карпат, корені і трава тирличу ваточниковидного містять комплекс цінних біологічно активних речовин, здавна використовуються в народній медицині, і є перспективною сировиною для фітохімічного і фармакологічного дослідження з метою створення нових препаратів, враховуючи терапевтичну дію і забезпеченість сировинною базою.

Виявлення основних груп біологічно активних речовин

надземних і підземних органів тирличу ваточниковидного

За допомогою реакцій ідентифікації та паперової хроматографії в траві, листках, квітах, коренях і кореневищах тирличу ваточниковидного виявлені вільні цукри, водорозчинні поліцукри, аскорбінова кислота, фенолкарбонові кислоти, іридоїди, алкалоїди, флавоноїди, ксантони, 6 органічних кислот, від 6 до 11 амінокислот в залежності від виду сировини. Основними біологічно активними речовинами надземних і підземних органів є фенольні сполуки і поліцукри.

Для виділення, розділення і одержання індивідуальних речовин з сировини тирличу ваточниковидного використовували методи рідинної екстракції, адсорбційної хроматографії на поліаміді, кристалізації, препаративної хроматографії на папері. При встановленні структури виділених речовин використовували УФ-спектроскопію та хімічні методи: лужний гідроліз, лужну та йодистоводневу деструкцію, лактонізацію. В результаті проведеного дослідження з трави тирличу ваточниковидного виділено 8 сполук. Основні фізико-хімічні властивості речовин, виділених з трави тирличу ваточниковидного, наведені в табл. 1. Стандартні зразки було надано проф. Ковальовим В.М., завідувачем кафедри фармакогнозії Національного фармацевтичного університету.

Таблиця 1

Фізико-хімічні властивості речовин, виділених

з трави тирличу ваточниковидного

Шифр речо-вини | Речовина, її структурна характеристика | Загальна формула | Ттопл,

є? | УФ-спектр, ?,нм | Значення Rf в системі розчинників | Флавоноїди | Ф1 | Апігенін (5,7,3'-триоксифлавон) | С15Н10О5 | 345-347 | 275, 321, 401 | 0,82 (А); 0,03 (В); 0,16 (Г); 0,49 (Д) | Ф2 | Лютеолін (5,7,3',4'-тетраоксифлавон) | С15Н10О6 | 327-329 | 300, 318, 350, 410 | 0,86 (А); 0,02 (В); 0,03 (Г); 0,20 (Д) | Ф3 | Ізовітексин (апігенін-6-С-?-глюкозид) | С21Н20О10 | 230-232 | 280, 300, 405 | 0,20 (А); 0,66 (В); 0,56 (Г); 0,61 (Д) | Ф4 | Ізоорієнтин (лютеолін-6-С-?-глюкозид) | С21Н20О11 | 245-247 |

284, 307, 322, 350 | 0,46 (А); 0,13 (В); 0,27 (Г); 0,52 (Д) | Ксантони | К1 | Мангіферин (1,3,6,7-тетрагідроксиксантон-2-С-глюкозид) | С19Н18О11 | 264-266

з розкл. | 290, 315, 388, 430 | 0,47 (А); 0,23 (В); 0,46 (Г); 0,60 (Д) | Фенолкарбонові кислоти | ФК1 | Хлорогенова кислота (5-О-кофеїл-D-хінна кислота) | С16Н18О9 | 203-205 | 240, 298, 325 |

0,30 (А); 0,57 (Б); 0,77 (Г); 0,84 (Д) |

ФК2 | Неохлорогенова кислота (3-О-кофеїл-D-хінна кислота) | С16Н18О9 | аморф. | 235, 299, 325 |

0,34 (А); 0,60 (Б); 0,88 (Г); 0,88 (Д) | ФК3 | Ферулова кислота(3-метокси-4-оксикорична кислота) | С10Н10О4 | 167-169 | 230, 291, 323 | 0,46 (А); 0,49 (Б); 0,55 (Г); 0,90 (Д) |

Примітки: 1. А – н-бутанол-оцтова кислота-вода (4:1:2);

2. Б – 2,5% оцтова кислота;

3. В – 6% оцтова кислота;

4. Г – 15% оцтова кислота;

5. Д – 30% оцтова кислота.

Речовини Ф1 і Ф2 за результатами якісних реакцій, хроматографічною рухливостю в різних системах розчинників, а також одержаних максимумів поглинання в УФ-області спектру нами віднесено до агліконів флавоноїдів. На основі вивчених фізико-хімічних властивостей досліджуваних речовин, а також порівняння з достовірними зразками виділена речовина Ф1 ідентифікована як апігенін, а Ф2 – як лютеолін.

Речовини Ф3 і Ф4 за результатами реакцій ідентифікації, хроматографічною рухливістю, флуоресценцією плям на хроматограмах в УФ-світлі до і після проявлення хромогенними реактивами віднесено до флавоноїдних глікозидів. Дані речовини стійкі до кислотного гідролізу, тому віднесені нами до С-глікозидів. При проведенні деструкції йодистоводневою кислотою в середовищі рідкого фенолу і оцтового ангідриду досліджувані сполуки розщеплювалися на дві речовини. В продуктах гідролізу речовини Ф3 виявлено апігенін і D-глюкозу, в продуктах гідролізу речовини Ф4 – лютеолін і D-глюкозу. Речовина Ф3 за фізико-хімічними властивостями і продуктами гідролізу ідентифікована як апігенін-6-С-в-глюкозид (ізовітексин). Змішана проба речовини Ф4 з достовірним зразком ізоорієнтину не викликала депресії температури топлення і на хроматограмах давала по одній нероздільній плямі. Речовина Ф4 була ідентифікована як лютеолін-6-С-в-глюкозид (ізоорієнтин).

Речовина К1 глікозидної природи віднесена до ксантонів. В УФ-світлі на хроматограмах проявляється у вигляді оранжевої плями, яка після обробки парами аміаку набуває лимонно-жовтого забарвлення. Дана речовина стійка до кислотного гідролізу, тому віднесена нами до С-глікозидів. Змішана проба виділеної речовини і достовірного зразка мангіферину не викликала депресії температури топлення і на хроматограмах давала одну нероздільну пляму. Виділену речовину ідентифіковано як 1,3,6,7-тетрагідроксиксантон-2-С-глюкозид (мангіферин).

Речовини ФК1, ФК2 і ФК3 за флуоресценцією плям на хроматограмах у фільтрованому УФ-світлі та встановленими максимумами поглинання УФ-спектрів віднесені нами до фенолкарбонових кислот. В продуктах лужної деструкції речовин ФК1 і ФК2 виявлено протокатехову кислоту, речовини ФК3 – ванілінову кислоту. Лужний гідроліз речовин ФК1 і ФК2 приводить до утворення кофейної та D-хінної кислот. Місце приєднання кофейної кислоти до D-хінної встановлено за результатами лактонізації виділених речовин під впливом льодяної оцтової кислоти. Утворення лактону хінідину відбувалося тільки з речовини ФК2, що вказує на наявність вільної гідроксигрупи у С-5 положенні D-хінної кислоти. Отже, в молекулі речовини ФК1 залишок кофейної кислоти приєднаний в положенні С-5 до D-хінної кислоти, а в речовини ФК2 – в положенні С-3. На основі проведених досліджень і результатів порівняння з достовірними зразками речовина ФК1 ідентифікована як хлорогенова кислота, ФК2 – неохлорогенова кислота, ФК3 – ферулова кислота.

Кількісне визначення різних груп біологічно активних речовин

тирличу ваточниковидного

При дослідженні полісахаридів осадження фракцій водорозчинних полісахаридів (ВРПС) з водних витяжок, пектинових речовин (ПР) з кислих витяжок і геміцелюлоз (ГЦ) з лужних витяжок проводили за допомогою ацетону. Вихід вуглеводних фракцій з коренів, кореневищ, трави, листків і квітів тирличу ваточниковидного наведено на рис. 1.

Рис. 1. Вміст виділених фракцій полісахаридів в надземних і підземних органах тирличу ваточниковидного.

Максимальна кількість водорозчинних полісахаридів міститься в листках (1,85%), геміцелюлози найбільше в траві (6,97%), пектинових речовин – в кореневищах (2,78%). Після гідролізу у фракціях ВРПС за допомогою паперової хроматографії виявлено глюкозу, фруктозу, генціанозу, в ПР – фруктозу, глюкозу і глюкуронову кислоту.

В підземних і надземних органах тирличу ваточниковидного, заготовлених в різні пори року, методом атомно-абсорбційної спектроскопії досліджували вміст 9 елементів: заліза, магнію, цинку, марганцю, кобальту, міді, літію, хрому, кадмію. Встановлено, що в коренях максимальний вміст практично всіх досліджуваних елементів накопичується під час масової вегетації. У траві кількісний вміст більшості елементів не змінювався протягом досліджуваних періодів вегетації.

При вивченні впливу умов зростання на елементний склад тирличу ваточниковидного встановлено, що із збільшенням висоти над рівнем моря в коренях менше накопичується магнію, хрому і марганцю, у траві знижується вміст практично всіх досліджуваних елементів.

З метою встановлення термінів заготівлі рослинної сировини тирличу ваточниковидного, раціонального використання, а також розробки можливих методів її стандартизації нами проведено визначення показника гіркоти і кількісного вмісту суми поліфенольних сполук, суми г-піронів, аскорбінової та органічних кислот в надземних і підземних органах рослини, заготовлених у різні фази вегетації.

Методику кількісного визначення суми ?-піронів модифіковано. За стандартний зразок було вибрано ксантоновий глікозид мангіферин. Встановлено, що максимуми поглинання комплексних сполук мангіферину-стандарту і водно-спиртової витяжки трави тирличу ваточниковидного з алюмінію (ІІІ) хлоридом співпадають при 410 нм (рис.2).

Рис. 2. УФ-спектри комплексів мангіферину (1) і водно-спиртової витяжки трави тирличу ваточниковидного (2) з алюмінію (ІІІ) хлоридом.

При виборі умов проведення реакції комплексоутворення з алюмінію (ІІІ) хлоридом, встановлено, що оптимальним об’ємом для нанесення на колонку є 1 мл екстракту, співвідношення елюату з колонки і розчину комплексоутворювача 1:1, стійкість комплексу зберігається 20-30 хв. Відносна похибка методу не перевищує ±3,58 %.

Визначення вмісту аскорбінової та органічних кислот в сировині тирличу ваточниковидного проводили згідно з методиками ДФ ХІ. Вміст суми поліфенольних сполук в сировині тирличу ваточниковидного в перерахунку на хлорогенову кислоту визначали фотоколориметричним методом.

Результати досліджень вмісту БАР в коренях і траві тирличу ваточниковидного, заготовлених у різні фази вегетації, наведені на рис. 3.

Вміст суми г-піронів у траві тирличу ваточниковидного становить 0,20-0,59% в залежності від фази вегетації. Найбільше аскорбінової кислоти та органічних кислот нагромаджується в траві під час масової вегетації (0,19% і 0,65%), в коренях – на початку вегетації (0,10% і 0,42%). Максимальний вміст поліфенольних сполук в траві накопичується в період масового цвітіння (10,79%), в коренях – в період відмирання надземної частини (3,60%). Одержані дані використані при встановленні оптимальних термінів заготівлі рослинної сировини тирличу ваточниковидного: для коренів – фаза відмирання надземної частини, для трави – фаза цвітіння.

Рис. 3. Вміст БАР в коренях (А) і траві (Б) тирличу ваточниковидного в залежності від фази вегетації:

1 – початок вегетації;

2 – масова вегетація;

3 – початок бутонізації;

4 – початок масового цвітіння;

5 – масове цвітіння;

6 – плодоношення;

7 – відмирання надземної частини.

Показник гіркоти для сировини тирличу ваточниковидного визначали за методикою Европейської Фармакопеї: для коренів тирличу ваточниковидного становить 20833±938, для кореневищ – 625±28.

З метою виявлення впливу умов зростання тирличу ваточниковидного на вміст БАР проведено їх кількісне визначення в надземній і підземній частинах, зібраних під час цвітіння і відмирання надземної частини відповідно. Сировину заготовляли в Рахівському районі Закарпатської області (Чорногірський хребет, г. Менчул), Надвірнянському і Верховинському районах Івано-Франківської області (окол. с.Яблуниця, окол. оз. Несамовите), Вижницькому районі Чернівецької області (окол. с. Буковець, окол. м. Берегомет) протягом 2002-2003 р.р. Результати дослідження наведено на рис. 4.

Рис. 4. Вміст БАР в надземних і підземних органах тирличу ваточниковидного в залежності від місця зростання:

1 - Чорногірський хребет, 1900 м н.р.м.;

2 - г. Менчул, 1227 м н.р.м.;

3 - окол. оз. Несамовите, 1750 м н.р.м.;

4 - окол. с.Яблуниця, 979 м н.р.м.;

5 - окол. с. Буковець, 920 м н.р.м.;

6 - окол. м. Берегомет, 773 м н.р.м.

Встановлено, що вміст досліджуваних БАР в сировині, заготовленій з різних місць зростання, суттєво не відрізняється.

Виділення біологічно активних речовин з тирличу ваточниковидного та дослідження їх фармакологічної активності

З метою створення нових лікарських засобів з забезпеченою сировинною базою нами опрацьовано способи одержання екстрактів з коренів і трави тирличу ваточниковидного. При розробці умов одержання суми БАР з коренів і трави тирличу ваточниковидного враховували ступінь подрібнення сировини, природу екстрагента, співвідношення сировина і екстрагента, час і кратність екстракції. Критеріями, за якими оцінювали оптимальні параметри екстрагування були кількісний вміст суми поліфенольних сполук, суми ?-піронів та екстрактивних речовин.

Згідно розроблених параметрів екстракції одержано ліофілізовані екстракти з коренів (КТ) і трави (ТТ, ТТ4, ТТ7) та рідкий водно-спиртовий екстракт з коренів тирличу ваточниковидного (ЕТв). Ліофілізовані сухі екстракти – це пухкі аморфні маси від світло-жовтого до темно-коричневого кольору, гіркого смаку, без запаху. Вихід екстрактів і вміст суми поліфенольних сполук і суми ?-піронів в них наведений в табл. 2.

Таблиця 2

Характеристика екстрактів тирличу ваточниковидного

Сировина | Екстрагент | Умовне позна-чення | Вихід, % | Сума

г-піронів,

% | Сума поліфенольних сполук, % | Корені | Вода | КТ | 43,12– | 8,27±0,06 | 40% етанол | ЕТв–– | 3,12±0,15 | Трава | Вода | ТТ | 30,63 | 1,33±0,04 | 33,55±0,73 | 40% етанол | ТТ4 | 29,50 | 1,40±0,02 | 35,37±0,55 | 70% етанол | ТТ7 | 29,00 | 1,45±0,04 | 37,14±0,74 |

Вихід сухих екстрактів з трави в залежності від виду екстрагента суттєво не відрізняється і становить 29,00–30,63%; вміст суми поліфенольних сполук і ?-піронів знаходиться в межах 33,55 – 37,14% і 1,33 – 1,45% відповідно.

Вивчення гострої токсичності, протизапальної і гепатозахисної активності одержаних екстрактів тирличу ваточниковидного проводили на базі кафедри біологічної хімії Івано-Франківського державного медичного університету при консультативній допомозі проф. Клименка А.О.

При дослідженні гострої токсичності встановлено, що ліофілізовані екстракти і водно-спиртовий екстракт з коренів є практично нетоксичними речовинами при внутрішньошлунковому введенні. Всі досліджувані речовини можна віднести до IV класу токсичності.

При вивченні протизапальної активності екстрактів тирличу ваточниковидного нами використовувалась модель набряку лапи щура, викликаного субплантарним введенням флогогенного агенту. Результати проведених досліджень свідчать, що найвищу протизапальну активність проявляють ліофілізований екстракт з трави ТТ7 і рідкий екстракт з коренів ЕТв.

Вивчення гепатозахисної активності екстрактів тирличу ваточниковидного проведено на скринінговій моделі ушкодження печінки, яка виникає при введенні тетрахлорметану. Екстракт з коренів тирличу ваточниковидного на рівні препарату порівняння “Силібор” знижував активність АлАТ в 1,6 рази і рівень МДА в сироватці крові в 1,4 рази. На спосіб одержання водно-спиртового екстракту з коренів тирличу ваточниковидного ЕТв, який проявляє гепатозахисну активність одержано патент України на винахід № 70451 А.

Серед екстрактів з трави тирличу ваточниковидного найбільш виражену гепатозахисну активність проявив екстракт ТТ7, який знижував в умовах гострого токсичного гепатиту активність ферменту АлАТ в 2 рази. Рівень продукту перекисного окислення ліпідів МДА в сироватці крові тварин, які отримували лікування ТТ7, знижувався в порівнянні до контрольної групи в 1,5 рази. На спосіб одержання екстракту з трави тирличу ваточниковидного, який проявляє гепатозахисну активність нами отримано позитивне рішення про видачу деклараційного патенту на корисну модель (№ заявки u 2005 00556 від 21 січня 2005р.) Технологія одержання сухого екстракту з трави тирличу ваточниковидного, який проявляє гепатозахисні і протизапальні властивості апробована в умовах контрольно-виробничої лабораторії Івано-Франківського обласного державного об’єднання спиртової та лікеро-горілчаної промисловості (акт впровадження № 1/Ф від 15.11.2004р.).

Ресурсні дослідження і розробка аналітичної нормативної документації

на сировину тирличу ваточниковидного

З метою вивчення забезпеченості сировинною базою нового лікарського засобу досліджено ресурси тирличу ваточниковидного в Українських Карпатах. На території Івано-Франківської, Закарпатської та Чернівецької областей нами встановлено місця його зростання. Популяції тирличу ваточниковидного з’являються переважно у складі вторинних угрупувань на місцях вирубок смерекових лісів. Встановлено, що середня урожайність підземних органів тирличу ваточниковидного становить 4,87–70,0 г/м2 повітряно-сухої сировини, а надземної частини – 2,7–29,2 г/м2 в залежності від фітоценотичних умов зростання.

Результати визначення біологічного, експлуатаційного запасів та обсягу можливої щорічної заготівлі коренів і трави тирличу ваточниковидного наведені в табл. 3, і вказують, що запаси сировини тирличу ваточниковидного достатні для промислової заготівлі як можливої лікарської рослинної сировини.

Таблиця 3

Запаси коренів і трави тирличу ваточниковидного

Область | Біологічний запас, кг | Експлуатаційний запас сировини, кг | Обсяг можливої щорічної заготівлі, кг

корені | трава | корені | трава | корені | трава | Івано-Франківська | 2749,6 | 868,4 | 2333,3 | 1008,65 | 233,4 | 252,2 | Закарпатська | 5020,0 | 2923,5 | 4364,8 | 2493,3 | 436,5 | 601,2 | Чернівецька | 3207,0 | 1715,0 | 2954,6 | 1504,5 | 295,5 | 376,1 | Всього: | 10976,6 | 5506,9 | 9652,7 | 5006,4 | 965,4 | 1229,5 |

З метою визначення тотожності трави тирличу ваточниковидного вивчали її зовнішні і мікроскопічні ознаки. Встановлено, що клітини внутрішнього епідермісу пелюстки паренхімні, мають характерні сосочкоподібні вирости на поверхні; клітини верхнього епідермісу листка звивистостінні, нижнього – сильнозвивисті; клітини нижнього епідермісу над жилкою листка видовжені, прямостінні; продихи зустрічаються лише на нижньому епідермісі; замикаючі клітини продиху великі; навколопродиховий комплекс аномоцитного типу; по краю листкової пластинки є зубчасті вирости епідермісу з складчастою кутикулою.

Встановлено числові показники доброякісності сировини: у траві вміст суми г-піронів складає не менше 0,40% екстрактивних речовин не менше 15%, вологість не більше 13%, золи загальної не більше 10%, золи, нерозчинної в 10% розчині НСІ не більше 2%, пожовтілих і почорнілих частин трави не більше 1%, стебел не більше 50%, органічних домішок не більше 1%, мінеральних домішок не більше 1%; у коренях показник гіркоти повинен становити не менше 20800, екстрактивних речовин не менше 20%, вологість не більше 10%, золи загальної не більше 10%, золи, нерозчинної в 10% розчині НСІ не більше 2%, органічних домішок не більше 1%, мінеральних домішок не більше 1%.

Дослідження числових показників доброякісності і кількісного вмісту суми поліфенольних речовин і суми ?-піронів в процесі зберігання дозволило встановити термін придатності коренів і трави до 2-х років.

Одержані результати товарознавчого аналізу використані при розробці тех-нічних умов України (ТУ У 15.8-02010758-002-2003 “Корені тирличу” і ТУ У 15.8-02010758-003-2003 “Трава тирличу ваточниковидного”) і проектів аналітичної нормативної документації на сировину тирличу ваточниковидного.

Опрацьовані нами прийоми заготівлі, первинної обробки і сушіння сировини включені до технологічних інструкцій на корені (ТІ 15.8.02010758.002-2003) і траву (ТІ 15.8.02010758.003-2003) тирличу ваточниковидного.

ВИСНОВКИ

1. Вперше теоретично обгрунтована і доведена практична значимість тирличу ваточниковидного як лікарської рослини, встановлено його запаси на виявлених місцях зростання і показники доброякісності трави і коренів; визначено якісний склад та кількісний вміст основних діючих речовин, розроблено спосіб одержання стандартизованих екстрактів з коренів і трави, які проявляють протизапальну і гепатозахисну активність.

2. В підземних і надземних органах тирличу ваточниковидного виявлені флавоноїди, ксантони, іридоїди, фенолкарбонові кислоти, алкалоїди, аскорбінова кислота, вільні цукри і полісахариди.

3. З надземних органів тирличу ваточниковидного виділено та ідентифіковано 8 речовин: 4 флавоноїди (апігенін, лютеолін, ізовітексин, ізоорієнтин), 1 ксантон (??????????), 3 ?????????????? ??????? (???????????, ??????????????, ????????).

4. Одержано фракції водорозчинних полісахаридів, пектинових речовин, геміцелюлози з надземних і підземних органів тирличу ваточниковидного, в яких методом хроматографії на папері виявлено глюкозу, фруктозу, генціанозу, глюкуронову кислоту. За допомогою хроматографічного аналізу виявлено від 6 до 11 амінокислот у надземних і підземних органах тирличу ваточниковидного.

5. Визначено кількісний вміст макро- і мікроелементів (Fe, Mg, Zn, Mn, Co, Cu, Li, Cr, Cd) в коренях і траві тирличу ваточниковидного. Вивчено динаміку нагромадження елементів у сировині протягом вегетаційного періоду, а також вплив висоти над рівнем моря на елементний склад тирличу ваточниковидного.

6. Визначено кількісний вміст суми поліфенольних речовин, суми г-піронів, аскорбінової кислоти та вільних органічних кислот в надземних і підземних органах тирличу ваточниковидного в різні фази вегетації і з різних місць зростання. Заготовляти траву доцільно під час бутонізації і масового цвітіння, корені – на початку вегетації, або після відмирання надземної частини рослини.

7. Розроблені проекти інструкцій із заготівлі, сушіння і зберігання трави і коренів тирличу ваточниковидного, технічні умови та проекти аналітичної нормативної документації на сировину, у специфікації яких включено показник кількісного вмісту суми г-піронів і показник гіркоти.

8. Розроблені способи екстракції біологічно активних речовин з коренів і трави тирличу ваточниковидного водою, водно-спиртовими сумішами. За вмістом суми поліфенольних і суми г-піронових сполук найкращими екстрагентами для коренів є вода і 40% етанол, для трави – вода, 40% і 70% етанол.

9. Водні і водно-спиртові екстракти надземних і підземних органів тирличу ваточниковидного, які вміщують флавоноїди, ксантони, іридоїди, фенолкарбонові кислоти, органічні кислоти, не токсичні, проявляють протизапальну і гепатозахисну активність. Спосіб одержання водно-спиртового екстракту з коренів тирличу ваточниковидного, який проявляє виражену гепатозахисну дію, захищений патентом України № 70451 А. На спосіб одержання екстракту з трави тирличу ваточниковидного, який проявляє гепатозахисну активність нами подано заявку на корисну модель в Укрпатент (№ заявки u 2005 00556 від 21.01.2005 р.).

10. Встановлені місця зростання тирличу ваточниковидного на територіях Івано-Франківської, Закарпатської і Чернівецької областей площею 39,6 га. Обсяг можливих щорічних заготівель на виявлених заростях становить для коренів 965,4 кг, для трави – 1229,5 кг.

Список опублікованих праць за темою дисертації:

1. ?????? ?.?., ????? ?.?. ?????????????? ? ?????? ??????? ???????????????? // ??. ???? ??. ????? ??. ?.?.??????. – ????, 2003. – ???.12. – ?. 821-826. (???????? ???????? ??????? ?????? ? ???????????? ????? ?????????, ????????

?????????? ??????? ????????? ? ????????? ??????? ??????? ????????? ???????????).

2. ???????? ?., ?????? ?., ????? ?. ???????? ?????????????? ???????????? ?????? ?????? ???? ?????? // ???? ???????. – 2003. – ? 5. – ?. 19-20. (???????? ???????? ??????? ?????? ? ?????????? ???????????, ?????????????, ???????????? ??????? ????????? ?????, ????????? ???????? ??????).

3. ?????? ?.?., ??????? ?.?., ????? ?.?. ???????????? ?????? ???? ?????? (Gentiana L.) ? ???????? // ??????. ??????. – 2003. – ? 2. – ?. 91-97. (???????? ???????? ??????? ?????? ? ???????????? ????? ?? ????????? ???????? ??????).

4. ?????? ?.?., ????? ?.?., ?????? ?.?. ??????????? ?????????????? ?????????? ??????? ???????????????? // ??????? ???????? ?????? “????????? ??????? ?????????????? ?? ???????? ????? ?? ????????”. – ?????????:???-?? ????, 2004. – ???. ??? – ??? ?? – ?. 137-141. (???????? ???????? ??????? ?????? ? ?????????? ??????????? ?? ????????? ???????? ??????, ???????? ? ????????? ?? ???????????).

5. ?????? ?.?., ????? ?.?., ???????? ?.?., ??????? ?.?. ???????????? ??????? ???????????? ??????? ? ??????????????????? ?? ???????????? ????????????? // ??????????? ???????? ??????. – 2004. – ??? 2. – ? 1. – ?. 99-100. (???????? ???????? ??????? ?????? ? ??????? ?????????? ?? ?????? ??? ??’??? ???????????).

6. ?????? ?.?., ????? ?.?. ????????? ? ??????????? ????? ?????????? ????? ??????? ???????????????? // ???? ???????. – 2004. – ? 9 (86). – ?. 152. (???????? ???????? ??????? ?????? ? ???????????? ? ??????????? ??????????, ?????????????, ???????????? ??????? ????????? ?????, ????????? ???????? ??????).

7. ???. 70451 ?, ???????, ??? ?61?35/78. ?????? ????????? ????????? ? ??????? ??????? ????????????????, ???? ???????? ????????????? ?????????? / ????? ?.?., ?????? ?.?., ???????? ?.?. (???????). – 3 ?. (???????? ???????? ??????? ?????? ? ?????????? ???????????, ???????????? ??????? ????????? ?????, ?????????? ?????????? ?????????????? ??????? ???????).

8. ?????? ?.?., ????? ?.?. ?????? ??????????????? – ???????????? ????????? ??????? // ????????? ???????? ???????. – 2003. – ??? 3, ? 3-4. – ?. 144-146. (???????? ???????? ???????? ???? ?????????, ???? ??????, ??????? ?????? ? ????????? ??????).

9. ????? ?., ?????? ?., ????????? ?., ?????????? ?. ??????????? ?????? ??????? ??????????? ?????????? ??????? ???????????????? // ????????? ???????? ?????????????? ????????. ??. ????. ????? ??????????? ??????????? ????????????.– ????????:????, 2004. – ???.6. – ?. 61-63. (???????? ???????? ??????? ?????? ? ?????????? ???????????, ????????????? ????????? ?????, ????????? ???????? ??????).

10. ????? ?.?. ??????????? ??????? ???????????????? // 7-? ??????????? ???????? ??????? ????????? ?? ??????? ?????? 21-23 ??????. – ?????????: ???-????????, 2003. – ?. 263.

11. Цвеюк Н.П., Грицик А.Р., Клименко А.О. Гепатозахисні властивості екстракту

??????? ??????? ???????????????? // ??? ?????????? ???????-????????? ??????????? “????? ? ????????? ???????? ???????????: ????????, ????????, ?????????????” 21-23 ??????. – ??????:???-?? ????, 2003. – ?. 1.– ?. 311-312. (???????? ???????? ??????? ?????? ? ?????????? ???????????, ?????????????, ???????????? ??????? ????????? ?????, ????????? ???).

12. ????? ?.?. ??????????? ????????? ??????? ???????????????? // ????????? ???????? ??????????? ????????? ?? ??????? ?????? ? ??????????? ??????. – ???????, 2004. – ?. 333.

13. ????? ?.?., ?????? ?.?. ??????????? ????????? ??????? ???????????????? // ? ??????? ?????, 26-28 ??????. – ????????, 2004. – ?. 95. (???????? ???????? ??????? ?????? ? ?????????? ???????????, ????????? ???).

14. ????? ?.?., ?????? ?.?. ?????? ??????????????? – ???????????? ??????? ? ??????????-??????????????? ????????????? // ????????? ??????????? ???????-?????????? ??????????? “?????????, ???????????, ??????????????, ???????????????? ?????????? ??????? ?? ?????????? ???????? ???????” 14-15 ???????. – ?????????:???????????, 2004. – ?. 134-136. (???????? ???????? ??????? ?????? ? ???????????? ????? ?? ????????? ???????? ??????).

15. ????? ?.?., ?????? ?.?., ??????? ?.?. ???????? ?????????? ? ????????? ????? ?????????? ? ????? ??????? ???????????????? // ?????. ????.-?????. ????????. ??????????? ????????? ? ??????? ?????????? ?????????? ?????? ????????????? ???. – ??????:???-?? ????, 2004. – ?. 212-219. (???????? ???????? ??????? ?????? ? ?????????? ???????????, ?????????????, ???????????? ??????? ????????? ?????, ????????? ???????? ??????, ???????? ? ????????? ?? ???????????).

16. ?????? ?.?., ????? ?.?., ???????? ?.?. ??????????? ??????????? ?????? ??????? ???????????????? // ????????? ?????????????? ???????-?????????? ??????????? ? ??????????? ?????? „???? – ??????”, 3 ?????? 2005 ?. – ??????:???-?? ????, 2005. – ?. 196-200. (???????? ???????? ??????? ?????? ? ?????????? ???????????, ???????????? ??????? ????????? ?????, ????????? ???????? ??????).

17. ????? ?.?., ?????? ?.?. ????????? ?? ??????????? ???????????? ??????? ???????????????? ? ????????: ????????? ????????????. – ?????:?? “???????? ?????????????? ??????? ????? ? ????????? ???????”, 2003. – 20 ?. (???????? ???????? ???????? ???????? ???? ?????????, ???? ??????, ??????? ?????? ? ?????????? ???????????, ?????????????, ???????????? ??????? ????????? ?????, ??????? ?????? ? ?????????? ?????????? ???????????? ?? ?????).

????? ?.?. ???????????????? ??????????? ??????? ????????????????. – ???????.

?????????? ?? ???????? ????????? ??????? ????????? ?????????????? ???? ?? ????????????? 15.00.02 – ????????????? ????? ?? ?????????????. – ???????? медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України. – Київ, 2005.

? ?????????? ???????????? ?????????? ?????????????????? ??????????? ??????? ????????????????. ????????? ???????????? ???????????, ?????????????? ? ????????????? ??????????? ??????? ????????????????. ?????????????? 4 ??????????, ???????, 3 ?????????????? ???????. ????????? ???????? ?????? ?????????? ???????? ??????? ? ??????? ? ????? ??????? ???????????????? ? ?????????? ??? ???? ????????? ? ????? ????????? ???????. ?????-????????? ???????? ??????? ? ???? ????????? ??????? ? ????? ? ???????????? ? ?????????? ????????????? ? ????????????? ??????????. ???????? ????? ????????? ??????? ?? ????????? ??????????? ??????, ??????????? ?????? ????????? ? ????????? ???????.

?? ?????? ???????????? ????????? ?????? ?? ???????? ??????????????? ???????????? ????????????? ??????????????? ?????? ? ????? ??????? ???????????????? ?? ????????? ???????? ???????? ? ??????????????? ? ??????????????????? ?????????????, ?? ??? ?????????? ??????? ???.

??????? ?????: ?????? ???????????????, ???? ?-???????, ???????? ???????, ?????????, ????????????? ? ????????????? ??????????, ??????.

????? ?.?. ??????????????????? ???????????? ????????? ???????????. – ????????.

??????????? ?? ????????? ?????? ??????? ????????? ???????????????? ???? ?? ????????????? 15.00.02 – ???????????????? ????? ? ?????????????. – ???????? ??????????? ???????? ??????????????? ??????????? ??. ?.?. ?????? ?? ???????. – ????, 2005.

??????????????? ?????? ????????? ?????????? ? ????????? ? ??????????? ???????? ?????? ?????????????? ????????????? ????? – ?????? ? ????? ????????? ???????????. ?????????????????? ? ??????? ?????????, ?????????? ????????? ????????? ????????? ??????, ???????? ????????????? ???????????? ????????????. ?????? ????????? ?????? ?? ?????????? ????? ?????? ?????????????, ??? ?????? ???????????? ????????? ???????????. ????????????? ??? ???????????? ???????? ????????? ???????????, ?????? ???????????????? ?? ?????????? ?????????? ?????? ? ??????? ???????????? ? ???????? ???????? ??????? ? ?????????? ??????. ? ??????????? ???????????? ?????????? ??????????? ??????????????, ????????????????? ? ???????????????? ???????????? ????????? ???????????.

? ????????? ? ????????? ??????? ???????? ? ??????? ???????????? ???????, ???????? ? ???????????? ????????????? ?????????? ??????????, ????????, ????????, ??????????????? ???????, ?????????, ???????????? ???????, ????????????, ????????? ?????? ? ????????????. ?? ????????? ? ????????? ??????? ???????? ??????? ??????????????? ?????????????, ?????????? ???????, ????????????, ? ??????? ??????? ????????????? ?? ?????? ?????????? ???????, ????????, ??????????, ???????????? ???????. ?? ????? ????????? ??????????? ???????? ? ?????????????? ????????? ? идентифицировано с достоверными образцами, 2 агликона флавоноидов (апигенин, лютеолин), 2 гликозида флавоноидов (изовитексин, изоориентин), 1 ксантоновый гликозид (мангиферин) и 3 фенолкарбоновые кислоты (хлорогеновая, неохлорогеновая, феруловая).

С помощью метода атомно-абсорбционной спектроскопии установлено количественное содержание макро- и микроелементов (Fe, Mg, Zn, Mn, Co, Cu, Li, Cr, Cd) в корнях и траве горечавки ластовневой, заготовленных в разные фазы вегетации и с разных мест произрастания.

С целью рационального использования растительного сырья горечавки ластовневой, а также разработки возможных методов её стандартизации установлено содержание биологически активных веществ в надземных и подземных органах растения.

Сумму г-?иронов в траве установлено модифицированным хроматоспектроскопическим методом в пересчете на мангиферин. Сумму полифенольных соединений в корнях и траве установлено фотоелектроколориметричесим методом в пересчете на хлорогеновую кислоту. Содержание аскорбиновой и органических кислот в сырье установлено по методикам ГФ ХІ. Показатель горечи для корней горечавки ластовневой установлен по методике Европейской Фармакопеи.

Исследование количественного содержания биологически активных веществ проведено в разные фазы вегетации, результаты которого были использованы при установлении оптимальных сроков заготовки сырья.

Разработаны способы получения суммарных экстрактов из травы и корней горечавки ластовневой, учитывая степень измельчения сырья, природу экстрагента, соотношение сырья и экстрагента, время и кратность