Загальна характеристика роботи
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна
ДАНИЛОВИЧ ГАННА ВІКТОРІВНА
УДК 577.152.3
КІНЕТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ Mg2+-ЗАЛЕЖНОЇ АТРази ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ ГЛАДЕНЬКОМ’ЯЗОВИХ КЛІТИН
03.00.04 – біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2005
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у відділі біохімії м’язів
Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор,
член-кореспондент НАН України
КОСТЕРІН Сергій Олексійович,
завідувач відділу біохімії м’язів
Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
МАТИШЕВСЬКА Ольга Павлівна,
професор кафедри біохімії
Київського національного університету
імені Тараса Шевченка;
доктор біологічних наук,
старший науковий співробітник
ПАРХОМЕНКО Юлія Михайлівна,
провідний науковий співробітник
відділу біохімії коферментів
Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ.
Провідна установа – Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН
України, відділ хімії білка.
Захист відбудеться 6 лютого 2006 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ (01601 Київ, вул. Леонтовича, 9).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ (Київ, вул. Леонтовича, 9).
Автореферат розіслано 30 грудня 2005 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук О.В. Кірсенко
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Матка, скоротлива активність якої контролюється різноманітними факторами (статеві гормони, гормони гіпофіза, нейромедіатори, іони, механічне розтягнення тощо), виконує важливу функцію в організмі, що пов’язана з виношуванням плоду та пологами. Порушення ланцюга фізико-хімічних та біохімічних процесів, які у сукупності забезпечують унікальне явище електро- та фармакомеханічного спряження, є основою виникнення різноманітних патологій скоротливої функції матки: її гіпо- та гіпертонусу, слабкості пологової діяльності, спонтанних абортів, передчасних пологів, викиднів, атонії [Chini E.N. et al., 1997; Burghardt R.C. et al., 1999; Buxton I.L., 2004; Hertelendy F. et al., 2004; Woodcock N.A. et al., 2004].
У забезпеченні регуляції скорочення гладеньких м’язів, зокрема міометрію, фундаментальна роль належить Mg2+-залежним АТР-гідролазним ферментативним системам (КФ 3.6.3.), які локалізовані в плазматичній мембрані (ПМ) (Na+,K+-АТРаза, Са2+,Mg2+-АТРаза) та в мембрані саркоплазматичного ретикулума (СР) (Са2+,Mg2+-АТРаза) [Karaki H. et al., 1997; Крутецкая З.И. и др., 2003; Kosterin S.O., 2003; Isenovic E.R. et al., 2004]. У модельних дослідах, які були проведені із використанням фракції сарколеми гладеньких м’язів, у тому числі і міометрію, було ідентифіковано реакцію, так званого, “базального” Са2+-незалежного, Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР, якому властива висока ферментативна активність – 10-100 мкмоль Рі/мг білка за год залежно від складу середовища інкубації, умов проведення реакції, виду тварин, чистоти мембранної фракції та топології мембранних фрагментів [Костерин С.А., 1990; Cunningham H.B. et al., 1993; Kosterin S.A., 1994; Nedeljkovic N. et al., 1998]. “Базальний” Mg2+-залежний гідроліз АТР маскує активність транспортних АТРаз — Na+,K+-АТРази, яка забезпечує підтримку трансмембранних градієнтів іонів K та Na [Turi A. et al., 1985; Biser P.S., 2002; Isenovic E.R., 2004] та Са2+,Mg2+-АТРази – Mg2+,АТР-залежної кальцієвої помпи, що здійснює викид іонів Са з клітини [Carafoli E. et al., 2000; Luisi A. et al., 2003; Matthew A. et al., 2004]. Із використанням методів препаративної біохімії, зокрема афінної хроматографії, із сарколеми міометрія вдалося одержати високоочищений препарат транспортної Са2+,Mg2+-АТРази, у якому була відсутня активність “базальної” Mg2+-АТРази; азолектинові ліпосоми, що містили реконструйовану транспортну Са2+,Mg2+-АТРазу, були здатні накопичувати іони Са у Mg2+,АТР-залежному процесі [Курский М.Д. и др., 1990; Слинченко Н.Н. и др., 1990]. Білок, збагачений Mg2+-АТРазною активністю, було виділено з ПМ клітин скелетного, серцевого та гладенького м’язів, а також мозку [Tuana B.S. et al, 1988; Михайлова М.В. и др., 1992; Cunningham H.B. et al., 1993; Hohmann J. et al., 1993; Pacheco G. et al., 1996; Betto R. et al., 1999]. Ці та інші дані [Van Erum M. et al., 1995; Smith T.M. et al., 1997; Nedeljkovic N. et al., 1998] дають підставу стверджувати, що “базальна” Mg2+-АТРаза не є безпосередньо причетною до функціонування Mg2+,АТР-залежної кальцієвої помпи ПМ.
Слід зазначити, що в літературі існують різні точки зору щодо функціональної ролі “базальної” Mg2+-АТРази. Активність фермента пов’язують з регуляцією пуринергічного сигналу в м’язових клітинах та синаптичних щілинах нервових закінчень [Tuana B.S. et al., 1988; Cunningham H.B. et al., 1993; Delgado J. et al., 1997], а також з транспортом протонів у клітинах печінки, меланоми, трахеї [Luu-The V. et al., 1987; Pacheco G. et al., 1996; Bhatnagar V. et al., 1998]. Не виключають, що у гладеньком’язових клітинах (ГМК) матки Mg2+-АТРаза виконує роль своєрідного рН-чутливого ферментативного сенсора і є фактором контролю концентрації протонів Н+ у міоплазмі [Костерин С.А., 1998].
Mg2+-АТРазну активність було виявлено і у фракції клітинних мембран одноклітинних мікроорганізмів. З функціонуванням Mg2+-АТРази в мембрані прокаріотів пов’язують транспортування катіонів та інших речовин [Karamushka V.L. et al., 1991; Mukherjee T. et al., 2001; Marchesini N. et al., 2002; Elandalloussi L.M. et al., 2005].
Подальший розвиток уявлень щодо функціональної ролі “базальної” Mg2+-АТРази в міометрії, зокрема її причетності до створення транссарколемального градієнта протонів, потребує комплексних досліджень кінетичних та каталітичних характеристик реакції “базального” Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР. Селективний інгібітор “базальної” Mg2+-АТРази невідомий. Тому методологічною основою таких досліджень, які проводяться, як правило, на фракції ПМ, має бути, перш за все, коректне визначення питомої активності цієї АТРази, що ґрунтується на використанні в середовищі інкубації високоефективних селективних інгібіторів інших “супутніх” АТРаз – оуабаїну, тапсигаргіну, циклопіазонієвої кислоти, калоксину 1А1, які останнім часом знайшли широке поширення у біохімічній мембранології [Seidler N.W. et al., 1989; Wictome M. et al., 1992; Scheiner-Bobis G., 2002; Pande J. et al., 2005].
На сьогодні практично нічого не відомо про чутливість “базальної” Mg2+- АТРази у міометрії до дії різноманітних ефекторів та фізіологічно-активних речовин – модуляторів активності АТР-гідролаз та катіонного обміну. Це, зокрема, такі ефектори, як іони La, п-хлормеркурібензоат (п-ХМБ), о-ванадат, еозин Y (2’,4’,5’,7’-тетрабромфлуоресцеїн), а також аліфатичні поліаміни, які є важливим фактором контролю скоротливої функції матки [Maruta K. Et al., 1985; Houlihan D.D. et al., 2002]. Бракує інформації і щодо механізму реакції “базального” Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР.
Отже, однією з актуальних проблем сучасної біохімічної мембранології гладеньких м’язів є з’ясування ферментативних механізмів трансмембранного іонного обміну. Систематичне вивчення кінетичних та каталітичних властивостей “базальної” Mg2+-АТРазної реакції в ПМ гладеньком’язових клітин матки, ролі Mg2+-АТРазної активності у забезпеченні внутрішньоклітинного іонного гомеостазу, а також подальший розвиток уявлень щодо механізму Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР дозволило б наблизитись до глибшого розуміння фізико-хімічних та біохімічних основ електро- та фармако-механічного спряження в міометрії та значення сарколеми у контролі скоротливої функції матки.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу біохімії м’язів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (завідувач – чл.-кор. НАН України, професор Костерін С.О.), з проблеми “Біохімія тварин та людини”: - тема № 5, держ. регістр. № 0199И000270 “Вивчення біохімічних механізмів електро- та фармакомеханічного спряження у гладеньких м’язах та ролі систем енергозалежного транспорту Са2+ у забезпеченні цього процесу (І кв. 1999 — ІV кв. 2003); - тема № 5, держ. регістр. № 0104И003281 “Вивчення властивостей та регуляції АТФ-залежних кальцієвих помп мембранних структур гладеньких м’язів” (І кв. 2004 — ІV кв. 2008); - проект “Колоїдно-хімічні властивості біологічних наносистем” у рамках комплексної програми фундаментальних досліджень “Наносистеми, наноматеріали та нанотехнології, завдання “Колоїдні нанорозмірні системи”, тема “Колоїдно-хімічні властивості біологічних наносистем” 2003-2004 рр.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи було:
у дослідах, виконаних на фракції ПМ міоцитів матки свині, провести комплексне дослідження кінетичних властивостей та функціональної ролі реакції “базального” Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР.
Відповідно до мети були поставлені такі задачі:
1. Із використанням специфічних інгібіторів Mg2+-залежних АТР-гідролаз підібрати умови для визначення активності “базальної” Mg2+-АТРази та дослідити можливість створення нею транссарколемального градієнта протонів у міометрії.
2. Дослідити кінетичні закономірності реакції Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР , вивчити вплив інгібіторів АТРаз та поліамінів на неї.
3. На підставі одержаних експериментальних даних щодо властивостей реакції Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР запропонувати кінетичну модель її можливого механізму.
Об’єкт дослідження. “Базальний” Mg2+-залежний ферментативний гідроліз АТР в ПМ клітин міометрія.
Предмет дослідження. Кінетичні властивості реакції Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР у фракції ПМ клітин міометрія.
Методи дослідження. У роботі були застосовані методи препаративної біохімії, біохімічної мембранології, ензимології, спектрофотометрії, спектрофлуориметрії, хімічної та біохімічної кінетики, математичного моделювання, а також статистичного аналізу.
Наукова новизна одержаних результатів. У дослідах, виконаних із залученням апробованих інгібіторів АТР-гідролазних ферментативних систем (оуабаїн, тапсигаргін, азид натрію), підібрані оптимальні умови для визначення “базальної” Са2+-незалежної Mg2+-залежної АТРазної активності у фракції ПМ клітин міометрія свині. Із використанням флуоресцентного зонду 9-аміноакридину, протонофору карбонілціанід-m-хлорфенілгідразону (СССР) та детергенту дигітоніну продемонстровано здатність “базальної” Mg2+-АТРази міометрія створювати транссарколемальний протонний градієнт (рН).
Вперше систематично досліджені кінетичні та каталітичні властивості реакції “базального” Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР, її чутливість до дії модуляторів активності АТР-гідролаз. Показано, що “базальна” Mg2+-АТРаза інгібується еозином Y (Кі = 45,3 мкМ), досліджено кінетичні закономірності його дії на Mg2+-залежний ферментативний гідроліз АТР. У присутності поліамінів сперміну, спермідину та путресцину у фізіологічних концентраціях (до 1 мМ) і вище (до 10 мМ) спостерігалась тенденція до стимуляції (на 20-30 %) її активності.
На підставі результатів кінетичного аналізу, що був проведений у рівноважному режимі, запропоновано та експериментально обгрунтовано можливий механізм реакції “базального” Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР.
Одержані результати розширюють сучасні уявлення щодо властивостей реакції “базального” Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР в ПМ ГМК і її можливої ролі у підтриманні внутрішньоклітинного іонного, зокрема протонного, гомеостазу. Експериментальні дані мають значення для подальшого вивчення мембранних механізмів електро- та фармакомеханічного спряження в міометрії.
Практичне значення одержаних результатів. Методологія тестування активності “базального” Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР у фракції ПМ міоцитів може бути корисною для подальших експериментальних досліджень у галузі біохімічної мембранології, спрямованих на вивчення властивостей, регуляції та функціональної ролі мембранозв’язаних Са2+-незалежних Mg2+-АТРаз.
Одержані результати можуть бути використані для скринінгу ефекторів, фармакологічних та фізіологічно активних сполук, здатних модифікувати ферментативну активність мембранозв’язаних Mg2+-залежних АТР-гідролаз.
Особистий внесок здобувача. Головна ідея та задачі досліджень були сформульовані науковим керівником – чл.-кор. НАН України, професором С.О. Костеріним. Підбір, систематизація, аналіз та узагальнення відповідних літературних даних було проведено дисертанткою. Нею особисто виконана вся експериментальна частина роботи та здійснено статистичний аналіз результатів. Аналіз експериментальних результатів, розроблення кінетичних моделей механізму реакції Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР було проведено спільно із науковим керівником.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що викладено в дисертації, були заслухані та обговорені на таких наукових конференціях: II Міжнародний симпозіум “Фізіологія та біофізика гладеньких м’язів”, 2003 р., Київ; VIII Український біохімічний з’їзд, 2002 р., Чернівці; ІІІ з’їзд Українського біофізичного товариства, 2002 р., Львів; ІІІ з’їзд біофізиків Росії, 2004 р., Воронеж; Установчий з’їзд Українського товариства клітинної біології, 2004 р., Львів; конференція молодих вчених Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна, 2003 р., Київ. Результати експериментів неодноразово доповідались та обговорювались на наукових семінарах відділу біохімії м’язів, загальноінститутському семінарі та засіданнях вченої ради Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (1999-2005 рр.).
Публікації. За результатами дисертації опубліковано 4 статті в “Українському біохімічному журналі” та 5 тез доповідей у матеріалах міжнародних та всеукраїнських наукових конференцій.
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 177 сторінках друкованого тексту і складається з таких розділів: “Вступ”, “Огляд літератури” (складається з 2 розділів, 7 підрозділів), “Експериментальна частина” (підрозділи — “Матеріали та методи дослідження”, “Результати та їх обговорення”), “Заключний розділ”, “Висновки”, “Додаток 1”, “Додаток 2”, “Список використаних джерел”, який містить 260 посилань. Робота містить 37 рисунків та 14 таблиць.
Огляд літератури
Огляд літератури складається із двох розділів. Перший розділ присвячено характеристиці Mg2+-залежних АТР-гідролаз клітини (Na+,K+-АТРаза, транспортні Са2+,Mg2+-АТРази ПМ та СР, “базальна” Mg2+-АТРаза та Са2+-АТРаза ПМ, АТРаза мітохондрій, АТРаза скоротливих білків). У другому розділі охарактеризовано “базальну” Mg2+-АТРазу ПМ клітин функціонально різних тканин, а саме: умовам тестування її активності у фракції ПМ, методам виділення, кінетичним та каталітичним властивостям цього ферменту, а також з’ясуванню функціональної ролі реакції Ca2+-незалежного Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР у клітині.
Методи дослідження
Фракцію ПМ ГМК виділяли з міометрія свині методом диференційного центрифугування у градієнті густини сахарози [Кондратюк Т.П. и др., 1986]. Кількість білка в мембранному препараті визначали за його реакцією з реактивом Кумасі G-250 [Bradford M.M., 1976].
“Базальну” Mg2+-залежну АТРазну активність у фракції сарколеми міоцитів визначали при 37 0С у стандартному середовищі інкубації (об’єм 0,4 мл) такого складу: 1 мМ АТР, 3 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl, 100 мМ KCl, 1 мМ ЕГТА, 20 мМ HEPES-Трис-буфер (рН 7,4), 1 мМ оуабаїн (для інгібування Na+,K+-АТРази ПМ), 1 мМ NaN3 (для інгібування мітохондріальної Н+-АТРази), 0,1 мкМ тапсигаргін (для інгібування транспортувальної Са2+,Mg2+-АТРази СР), 0,1 %-й дигітонін, 20-30 мкг білка суспензії фракції ПМ. Тривалість інкубації – 3 хв. У дослідах контролем на неферментативний гідроліз АТР було стандартне середовище інкубації, яке не містило білка суспензії фракції ПМ. Контролем на кількість ендогенного неорганічного фосфату Рі в мембранах була суспензія мембранного препарату у водному розчині.
Ферментативну реакцію ініціювали введенням у середовище інкубації 20 мкл суспензії ПМ, а зупиняли шляхом додаванням до інкубаційної суміші 1 мл охолодженого (8 0С) “стоп”-розчину наступного складу: 1,5 М натрій оцтовокислий, 3,7 %-й формальдегід, 14 %-й етанол, 5 %-а ТХО (рН 4,3). Вміст фосфату неорганічного Рі визначали за методом W. Rathbun, V. Betlach [Болдырев А.А., 1977].
Загальну ферментативну Na+,K+,Mg2+-залежну АТРазну активність визначали в середовищі інкубації (об’єм 0,4 мл) наступного складу: 1 мМ АТР, 3 мМ MgCl2, 125 мМ NaCl, 25 мМ KCl, 1 мМ ЕГТА, 20 мМ HEPES-Трис-буфер (рН 7,4), 1 мМ NaN3, 0,1 мкМ тапсигаргін, 0,1 %-й дигітонін, 25-30 мкг білка супензії фракції ПМ. Тривалість інкубації – 3 хв при 37 0С.
Ферментативну активність Na+,K+-АТРази обчислювали як різницю між загальною Na+,K+,Mg2+-залежною АТРазною активністю та Na+,K+,Mg2+-залежною АТРазною активністю у присутності 1 мМ оуабаїну (Mg2+-залежною АТРазною активністю).
Ферментативну активність ацетилхолінестерази визначали в середовищі інкубації (об’єм - 1,5 мл) такого складу: 50 мМ Трис-HCl (рН 7,6), 0,5 мМ 5,5-дитіо-біс-2-нітробензойна кислота, 2,5 мМ ацетилтіохолінбромід, 50 мкг білка суспензії фракції ПМ. Реакцію ініціювали внесенням 50 мкл суспензії ПМ, а зупиняли додаванням 0,5 мл 1%-ого DS-Na. Час інкубації 10 хв при 37 0С. Неферментативне утворення тіохоліну оцінювали у середовищі інкубації, яке містило інактивований мембранний препарат (1 %-й DS-Na додавали до початку інкубації). Оптичну густину розчину вимірювали за допомогою спектрофотометра SPECORD UV VIS (Німеччина) при довжині хвилі 412 нм.
Формування градієнта протонів на ПМ в ході реакції Mg2+-залежного гідролізу АТР вивчали за допомогою класичного рН-індикатора — флуоресцентного зонду 9-аміноакридину. У цих дослідах фракцію ПМ суспендували в 3 мл середовища такого складу: 10 мМ Hepes-Tris (рН 7,4, 8 0С), 150 мМ KCl. Реакцію Mg2+-залежного гідролізу АТР проводили при 37 0С в середовищі інкубації (об’єм 2 мл) такого складу: 1 мМ АТР, 3 мМ MgCl2, 150 мМ KCl, 1 мМ ЕГТА, 10 мМ Hepes-Tris -буфер (рН 7,4), 1 мМ оуабаїн, 1 мМ NaN3, 0,1 мкМ тапсигаргін, 10 мкМ 9-аміноакридин-гідрохлорид моногідрат. Реакцію ініціювали внесенням 100 мкл розчину реагентів реакції - іонів Мg та АТР. Кінцева кількість білка в реакційній суміші становила 50-60 мкг/мл. Утворення протонного градієнта оцінювали за зміною флуоресценції 9-аміноакридину при 429 нм, збуджуючи зразок світлом з довжиною хвилі 400 нм. Інтенсивність флуоресценції 9-аміноакридину вимірювали на спектрофлуориметрі HITACHI MPF-4 (Японія).
Дослідження кінетичних та каталітичних властивостей ферментативної реакції Mg2+-залежного гідролізу АТР проводили в стандартному середовищі інкубації, що було модифіковане за фізико-хімічними характеристиками чи складом відповідних компонентів (час інкубації, кількість білка мембранної фракції, концентрації Mg2+ або АТР, субстратна, катіонна та аніонна специфічність, рН, інгібітори, поліаміни).
Всі експерименти з вивчення властивостей "базальної" Mg2+-АТРазної ферментативної реакції проводили в режимі початкової швидкості Vo (лінійність накопичення продукту Рі у часі до 10 хв).
Експериментальну апробацію рівноважних моделей перебігу ферментативної реакції Mg2+-залежного гідролізу АТР в ПМ ГМК проводили за стандартних умов інкубації. Загальні концентрації АТР ([АТР]0) та MgCl2 ([Mg2+]0) змінювали в межах 0,02 - 1 мМ; ці реагенти вносили до середовища інкубації в еквімолярному співвідношенні 1:1. Концентрацію вільних іонів Mg [Mg2+] та АТР [ATP4-] у середовищі інкубації у присутності 1 мМ ЕГТА розраховували за допомогою програми “MAXCHEL”. При цьому співвідношення р = [ATP4-] / [Mg2+] підтримувалось постійним - 1,25.
Уявні кінетичні параметри, які характеризують Mg2+-залежну АТР-гідролазну реакцію — константу активації іонами Mg (КMg), константу Міхаеліса (Кm) та початкову максимальну швидкість реакції гідролізу АТР за Mg2+ (VMg) і за АТР (VATP) визначали за методом Хейнса [Келети Т., 1990]. Одержані концентраційні залежності швидкості ферментативної реакції від досліджуваних реагентів реакції гідролізу (АТР та Mg2+) перебудовували в координатах: S/V від S, де S – задана концентрація реагенту (АТР чи Mg2+), а V – швидкість ферментативного гідролізу АТР при заданій концентрації АТР чи Mg2+ відповідно.
Величини уявних констант інгібування Кі та коефіцієнтів Хілла (nН) щодо реакції Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР обчислювали з використанням лінеаризованих концентраційних кривих, побудованих за рівнянням Хілла [Курганов В.И., 1978] у координатах {lg[(V0-V0*)/ V0*]; lg[i]}, де V0 та V0* — початкові швидкості АТР-гідролазної реакції за відсутності та наявності інгібітора в середовищі інкубації відповідно, [i] – концентрація інгібітора.
Для лінеаризованих графіків абсолютне значення коефіцієнта кореляції r становило 0,90-0,99.
Результати та їх обговорення
Задача 1. Із використанням специфічних інгібіторів Mg2+-залежних АТР-гідролаз підібрати умови для визначення активності “базальної” Mg2+-АТРази та дослідити можливість створення нею транссарколемального градієнта протонів у міометрії.
Вирішенню цієї задачі був присвячений перший етап наших досліджень.
1.1. Визначення Ca2+-незалежної Mg2+-залежної АТРазної активності у мембранній фракції. Раніше було показано, що більшість мембранних фрагментів фракції ПМ міометрія, одержаної методом диференційного центрифугування у градієнті густини сахарози, мають переважно плазмалемальнє походження [Kosterin S.A., 1994]. Фракція сарколеми міометрія є гетерогенною як за своєю топологією – містить “незамкнені” та “замкнені” цитоплазматичним боком назовні та (або) всередину фрагменти [Grover A. K., 1980], так і за спектром активностей АТР-гідролаз, що локалізовані в ній – Na+,K+-АТРазної [Turi A., 1985; Векліч Т.О., 2005], Са2+,Mg2+-АТРазної [Слинченко Н.Н., 1990; Karaki H., 1997], Mg2+-незалежної Са2+-АТРазної [Enyedi A., 1988], Са2+-незалежної Mg2+-АТРазної [Missiaen L., 1988; Костерин С.А., 1995]. Зазвичай фракція сарколеми містить домішки мембранних фрагментів інших субклітинних структур — мембран мітохондрій та СР, які також здатні забезпечувати гідроліз АТР за наявності іонів Mg (мітохондріальна Н+-АТРаза та Са2+,Mg2+-АТРаза СР).
Як видно з рис. 1 (стовпчик 1) у присутності 1 мМ ЕГТА та за відсутності іонів Mg тестується незначний рівень АТР-гідролазної активності в ПМ міоцитів – (0,7±0,5 мкмоль Рі/мг білка за год). Внесення в середовище інкубації Mg2+ призводить до істотного (майже в 16 разів) зростання АТР-гідролазної активності (рис. 1, стовпчик 2).
Як зазначалось вище, фракція сарколеми міометрія містить, переважно, везикульовані структури. За даними літератури дигітонін у концентрації до 0,2% порушує бар’єрну функцію ПМ, не впливаючи на інтактність внутрішньоклітинних мембранних структур [Wibo M. Et al., 1981; Fiskum G., 1985; Bian J. et al., 1991]. Внесення в середовище інкубації 0,1%-ого дигітоніну не впливає суттєво на значення Mg2+-залежної АТР-гідролазної активності — спостерігається тенденція до підвищення в середньому на 10% (рис. 1, стовпчики 3 та 2).
Для фракції ПМ також характерним є широкий спектр АТР-гідролазної активності. Тому далі ми намагались з’ясувати внесок зазначених АТР-гідролаз в загальний Mg2+-залежний гідроліз АТР у фракції ПМ.
Наявність у середовищі інкубації, яке не містить екзогенного Са2+, 1 мМ ЕГТА унеможливлює роботу Са2+-АТРаз, що локалізовані у ПМ. Як виявилось, поступове внесення до середовища інкубації, яке містить дигітонін, оуабаїну (специфічного інгібітора Na+,К+-АТРази [Lingrel J.B. et al., 1994; Scheiner-Bobis G., 2002]), NaN3 (інгібітора мітохондріальної АТРази [Сыроешкин А.В. и др., 1999]), тапсигаргіну (високоефективного інгібітора транспортувальної Са2+,Mg2+-АТРази СР [Thastrup O. et al., 1990; Sagara Y. et al., 1991; Lytton J. et al., 1991]) спричинює вірогідне сукупне зниження на 35 % Mg2+-залежної АТРазної активності порівняно з величиною ферментативної активності, що була визначена за наявності в середовищі інкубації лише детергенту (рис.1, стовпчики 4, 5, 6 та 3 відповідно).
Аналіз наведених вище експериментальних даних дає підставу трактувати “базальну” Са2+-незалежну, Mg2+-залежну АТР-гідролазну активність у фракції сарколеми міоцитів як таку, що тестується за наявності в середовищі інкубації ЕГТА і дигітоніну та є резистентною до дії оуабаїну, NaN3 і тапсигаргіну (рис.1, стовпчик 6).
1.2. Mg2+-АТРаза та можливість створення нею транссарколемального градієнта протонів. Вважають, що “базальна” Mg2+-АТРаза є ферментативним маркером сарколеми гладеньких м’язів [Grover A.K. et al., 1985; Raeymaekers L. et al., 1985, Костерин С.А., 1992].
Враховуючи значну питому ферментативну активність “базальної” Mg2+-АТРази (10-12 мкмоль Рі/мг білка за год) можна припустити, що вона є потужним фактором накопичення протонів Н+ в гладенькому м’язі. Визначаючи збільшення активності маркерних ферментів ПМ ацетилхолінестерази (активний центр локалізований на зовнішній поверхні ПМ) та оуабаїнчутливої Na+,К+-АТРази (активний центр локалізований на внутрішній поверхні ПМ) після оброблення мембранної фракції розчином дигітоніну (0,001 – 0,2 %) ми кількісно (за вмістом білка) охарактеризували топологію мембранних фрагментів. Виявилось, що фракція ПМ містить переважно везикульовані фрагменти: 50 – 60% складали везикули, замкнені цитоплазматичним боком в середину, 20 – 30% - везикули, замкнені цитоплазматичним боком назовні; 10 – 30 % становили невезикульовані фрагменти. Практично такі самі кількісні результати ми одержали, тестуючи топологію мембранних фрагментів за підвищенням активності оуабаїнчутливої Na+,К+-АТРази, ацетилхолінестерази та “базальної” Mg2+-АТРази, виходячи з уявлень, що остання має саме цитоплазматичну локалізацію активного центру.
Отже, враховуючи одержану інформацію щодо топології мембранних везикул та локалізації активного центру Mg2+-АТРази, ми намагалися з’ясувати питання — чи може “базальна” Mg2+-АТРаза сарколеми міометрія створювати трансмембранний градієнт протонів?
Внесення до стандартної інкубаційної суміші, що містила суспензію ПМ, але в якій був відсутній дигітонін, АТР та Mg2+, приводило до зниженням флуоресценції 9-аміноакридину протягом 1 – 3 хв, що свідчить про рН-індуковану акумуляцію 9-аміноакридину у внутрішньовезикулярному просторі, що спряжена з Mg2+-залежним гідролізом АТР у мембранній фракції (рис.2).
Дійсно, у присутності в середовищі інкубації 0,1 % дигітоніну чи 10 мкМ протонофору СССР при внесенні субстратів реакції гідролізу ми не фіксували гасіння флуоресценції 9-аміноакридину, що вказує на неможливість створення протонного градієнта в умовах збільшення Н+-провідності ПМ та у разі порушення бар’єрної функції мембранних везикул. Подібні результати були одержані при дослідженні Mg2+-АТРази ПМ гепатоцитів [Luu-The V. еt al., 1987].
Таким чином, результати модельних дослідів свідчать, що “базальна” Mg2+-АТРаза сарколеми міометрія, яка є резистентною до дії оуабаїну, азиду натрію та тапсигаргіну, здатна забезпечувати утворенням рН на ПМ.
Задача 2. Дослідити кінетичні закономірності реакції Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР, вивчити вплив інгібіторів АТРаз та поліамінів на неї.
2.1. Кінетичні та каталітичні характеристики “базального” Mg2+-залежного гідролізу АТР в плазматичній мембрані. На другому етапі досліджень у комплексних експериментах охарактеризовано основні кінетичні та каталітичні властивості “базального” Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР у фракції ПМ міоцитів.
Було показано, що динаміка накопичення неорганічного фосфату Рі у діапазоні часу до 10 хв відповідає кінетичним закономірностям реакції нульового порядку. Значення початкової швидкості реакції “базального” Mg2+-залежного гідролізу АТР у фракції сарколеми дорівнює 250 ± 40 нмоль Рі/мг білка за хв (M±m, n=5).
Залежність АТР-гідролазної активності у фракції ПМ від концентрації іонів Mg (концентрація АТР – 1 мМ) та АТР (концентрація MgCl2 – 3 мМ) відповідає класичному рівнянню Міхаеліса–Ментен. Значення константи активації іонами Mg (КMg) дорівнює 286,7±27,6 мкМ, максимальної початкової швидкості за Mg (VMg) — 34,6±4,3 мкмоль Рі/мг білка за год. Відповідно для АТР значення константи Міхаеліса (Km) складає 48,5±8,0 мкМ, максимальної початкової швидкості за АТР (VАТР) — 33,1±4,8 мкмоль Рі/мг білка за год.
Було показано, що “базальна” Mg2+-АТРаза ПМ не є специфічною до ATP (гідролізує також UTP, CTP, GTP). Катіони двовалентних металів здатні забезпечувати гідроліз АТР у фракції ПМ в такій послідовності: Ca2+ > Mg2+ > Co2+ > Cd2+ > Mn2+ Zn2+ Ni2+ > Sr2+, за наявності катіонів Cu та Ba ферментативний гідроліз АТР не відбувався. Також Mg2+-АТРазна активність не змінювалась у разі ізотонічної заміни в середовищі інкубації Na+ (150 мМ) на K+, Li+, Rb+, холін (у разі використання хлоридів) чи на сахарозу (300 мМ), або Cl- (150 мМ) на Br-, I- (у разі використання калієвих солей). Активація “базальної“ АТРази іонами Mg також не залежала від хімічної природи аніона у складі магнієвої солі (Cl- чи SO42-).
Ми показали (рис. 2), що внаслідок реакції “базального” Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР на ПМ створюється трансмембранний градієнт протонів. Було одержано лінійну залежність між активністю Mg2+-АТРази та значенням рН в діапазоні величин водневого показника 6,0-8,0 (рис.3.). Це свідчить на користь того, що дійсно Mg2+-АТРаза ПМ клітин міометрія може виступати своєрідним ферментативним рН-сенсором в ГМК: адже зменшення концентрації протонів Н+ (перш за все у примембранних шарах) буде активувати каталітичну активність “базальної” Mg2+-АТРази, що сприятиме підвищенню швидкості Mg2+-залежного гідролізу АТР та активнішого продукування протонів (зниженню рН) та виведення їх із ГМК. Такий своєрідний обернений зв’язок може бути важливим для контролю протонного та катіонного гомеостазу в ГМК (через Na+-Н+ та Са2+-Н+ трансмембранний обмін ) [Тугай В.А., 1993; Taggart M.I. et al., 1995; Orlov S.N. et al., 1998; Pei J.M. et al., 1999; Schewiening C.J. et al., 2002; Garnovskaya M.N. et al., 2003.].
2.2. Вплив неспецифічних інгібіторів АТРаз на “базальну” Mg2+-АТРазну активність. При дослідженні кінетичних та каталітичних властивостей транспортувальних АТРаз широке застосування знайшли різноманітні неспецифічні та специфічні інгібітори — катіони лантану, п-ХМБ, о-ванадат та еозин Y [Skou J.C. et al., 1981; Левицкий Д.О., 1990; Gatto C. et al., 1995; Костерин С.А., 1996; Павлов К.В. и др., 1999]. Тому подальші дослідження ми спрямували на з’ясування чутливості “базальної” Mg2+-АТРазної активності до дії цих інгібіторів (рис. 4, а).
Іони лантану (0,1 мМ), які є антагоністами іонів Са, практично не впливали на “базальний” Mg2+-залежний гідроліз АТР — активність Mg2+-АТРази знижувалась в середньому на 6 %. Ці дані вказують, зокрема, на те, що La3+ не конкурує з Mg2+ за утворення хелатного комплексу з нуклеотидтрифосфатом, а сам La3+ не “атакує” “базальну” Mg2+-АТРазу.
Відомий реагент на SH-групи – п-ХМБ – є ефективним інгібітором Са2+-транспортувальних Mg2+,АТР-залежних насосів Р-типу, що локалізовані в ПМ, СР та мітохондріях. Максимальний ефект його дії (зниження активності практично на 100 %) на ці транспортувальні системи спостерігається при концентрації до 100 мкМ [Костерин С.А. и др., 1996]. п-ХМБ в концентрації 1 мМ інгібував Mg2+-АТРазну активність сарколеми міоцитів в середньому на 25%. Таким чином, можна припустити, що в активному центрі “базальної”Mg2+-АТРази ПМ присутні SH-групи, але, скоріше за все, даний фермент не можна віднести до АТРаз Р-типу.
Відомий інгібітор транспортних АТРаз – о-ванадат [Missiaen L. et al., 1991; Bian J. et al., 1991; Павлов К.В. и др., 1999], що був використаний у концентрації 1 мМ, інгібував Mg2+-АТРазну активність в середньому на 50 %. Цікаво проаналізувати у порівняльному аспекті його вплив на системи енергозалежного транспорту Са2+ міоцитів матки. В концентрації 1 мМ о-ванадат інгібує Са2+-акумулювальну систему мітохондрій на 70 % та на 80-100 % пригнічує активність Mg2+,АТР-залежних помп ПМ та СР [Костерин С.А. и др., 1996]. Отже, чутливість “базальної” АТРази до дії цього інгібітора менша, ніж чутливість Mg2+,АТР-залежних Са2+-транспортувальних систем субклітинних мембранних структур.
Еозин Y (2',4',5',7'-тетрабромфлуоресцеїн) [Majima E. et al., 1998] пригнічував Mg2+-АТРазну активність найефективніше — на 84 %. Відповідно до даних літератури, еозин Y є ефективним конкурентним оборотним інгібітором Na+,K+-АТРази, К+,Н+-АТРази, Mg2+,АТР-залежної Са2+-помпи ПМ кардіоміоцитів, міоцитів матки, а також Mg2+,АТР-залежних Са2+-транспортувальних систем мітохондрій та СР клітин міометрія [Skou J.C. et al., 1981; Helmich-de Jong M.L. et al., 1986;Gatto C et al., 1995; Костерин С.А. и др., 1996].
Враховуючи ефективну інгібіторну дію о-ванадату та еозину на “базальну” Mg2+-АТРазну активність сарколеми міоцитів, ми дослідили концентраційну залежність впливу цих інгібіторів на ферментативний процес (рис.4, б).
Інгібувальний ефект о-ванадату спостерігається при його концентраціях 100 мкМ - 1 мМ, еозин Y пригнічує АТРазну активність в усьому діапазоні концентрацій: від 0,1 мкМ до 1 мМ. Значення уявної константи інгібування Кі для о-ванадату становить 1,35±0,28 мМ, для еозину Y – 45,30±14,50 мкМ. Отже, у випадку еозину Y спорідненість цього інгібітора до Mg2+-АТРази у 30 разів більша, ніж у випадку о-ванадату. Але порівняно з Mg2+,АТР-залежними Са2+-транспортувальними системами ПМ, СР та мітохондрій міоцитів матки спорідненість о-ванадату та еозину Y до “базальної” Mg2+-АТРази значно менша (для вищезазначених систем значення Кі для о-ванадату складали 5 мкМ, 45 мкМ та 0,6 мМ відповідно, для еозину Y – 0,8 мкМ, 0,8 мкМ та 2,1 мкМ відповідно) [Костерин С.А. и др., 1996].
У зв’язку із досить ефективною інгібувальною дією еозину Y на Mg2+-АТРазну активність ПМ мета наших подальших досліджень полягала в розширенні існуючих уявлень щодо закономірностей інгібувальної дії еозину Y на “базальний” Mg2+-залежний гідроліз АТР в ПМ, а саме: вивченні впливу цієї речовини на найважливіші кінетичні параметри даної ферментативної реакції (рис.5).
Результати кінетичного аналізу інгібувального ефекту еозину Y вказують на змішаний тип дії цього ефектора. Дійсно, еозин у концентраціях до 100 мкМ зменшує максимальну початкову швидкість реакції ферментативного гідролізу АТР, визначену як за Mg2+ (VMg), так і за АТР (VATP), а також спорідненість Mg2+-АТРази до Mg2+ і АТР (тестується за константами KMg та Km відповідно).
Виявилось, що каталітична ефективність ферменту, яка характеризується відношенням початкової максимальної швидкості до константи його спорідненості до субстрату реакції (VATP/Km), за умов насичення ферменту іонами Mg, дуже чутлива до гальмівної дії еозину Y, на відміну від каталітичної ефективності ферменту (VMg/KMg) за умов його насичення АТР. Відповідно до цього можна вважати, що “атака” еозину Y на “базальну” Mg2+-АТРазу відбувається переважно на рівні АТР-зв’язувального центру. Ці дані дають підставу припустити, що, у випадку “базальної” Mg2+-АТРази, існують два окремі центри зв’язування – для АТР4- та Mg2+.
2.3. Вивчення впливу поліамінів на “базальну” Mg2+-АТРазну активність. Аліфатичні поліаміни — спермін, спермідин та путресцин — є природними компонентами всіх типів клітин [Thomas T. et al., 2003; Janne J. et al., 2004]. Для ГМК матки показано, що поліаміни, зокрема спермін, інгібують (у концентрації 1-10 мМ) АТРазу актоміозинового комплексу та транспортувальну Са2+,Mg2+-АТРазу сарколеми, знижують накопичення іонів Са в СР, а також в низьких концентраціях (до 1 мМ) стимулюють накопичення Са2+ у мітохондріях; збільшення концентрації поліамінів до 10 мМ призводить до зниження акумуляції Са2+ в цих структурах [Векліч Т.О., 2001; Лабинцева Р.Д. та ін., 2003, Слінченко Н.М. та ін., 2003; Бабич Л.Г. и др., 2004].
У зв’язку із широкими фізіологічними властивостями поліамінів нами було досліджено їх вплив на Mg2+-залежну АТРазну активність сарколеми міометрія.
Було виявлено тенденцію до стимуляції Mg2+-АТРазної активності сарколеми поліамінами в концентрації 0,05-10 мМ в середньому на 10-27 % для сперміну і путресцину та на 20-37 % для спермідину (рис.6).
Отже, є підстава припустити, що поліаміни можуть виконувати певну роль у контролі ферментативної активності “базальної” Mg2+-АТРази сарколеми матки.
Слід зазначити, що згідно з даними літератури Са2+-незалежний, Mg2+-залежний гідроліз АТР в ПМ властивий не лише еукаріотичним клітинам, але й одноклітинним організмам [Mukherjee T. et al., 2001; Marchesini N. et al., 2002; Elandalloussi L.M. et al., 2005]. Відомі дані, що від функціонування мембранної Mg2+-залежної АТР-гідролази залежить концентрування металів, зокрема золота, в мікроорганізмах Chlorella, Е. coli 1257, Bacillus cereus та Bacillus subtilis [Karamushka V.L. et al., 1991; Карамушка В.И. и др., 1991; Грузина Т.Г. и др., 2003]. Отже, є вагомі підстави вважати, що Mg2+-АТРаза мембран бактерій може мати важливе значення у забезпеченні процесу накопичення металів мікроорганізмами, який супроводжується трансмембранним переносом протонів і виникненням електричного потенціалу на мембрані [Карамушка В.И. и др., 1991; Грузина Т.Г. и др., 2003].
У незалежних експериментах було досліджено кінетичні властивості Mg2+-залежного гідролізу АТР в ПМ мікроорганізмів Bacillus sp. В4253, що здатні до накопичення золота. Препарат суспензії мембран Bacillus sp. В4253 було люб’язно надано к.б.н. Т.Г. Грузіною (Інститут біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України). Виявилось, що для ПМ Bacillus також є характерною “базальна” Mg2+-залежна АТРазна активність, що тестується за наявності в середовищі інкубації АТР (5 мМ), MgCl2 (5 мМ), ЕГТА (1 мМ), дигітоніну (0,01 %) та є резистентною до дії NaN3 (1 мМ). За деякими властивостями Mg2+-АТРаза ПМ ГМК та мембрани бактерій є подібними (зазначена АТРаза каталізує гідроліз АТР в режимі реакції нульового порядку і є чутливою до інгібувальної дії еозину Y). Утім, за деякими характеристиками обидві АТРази є відмінними: Mg2+-залежний гідроліз АТР в мембрані мікроорганізмів характеризується меншими значеннями питомої ферментативної активності та початкової швидкості V0 реакції гідролізу, більшими значеннями оптимальних концентрацій АТР та іонів Mg, меншими значеннями максимальної швидкості ферментативного гідролізу VMg та VATP, а також меншою спорідненістю до АТР і Mg2+, залежність активності Mg2+-АТРази від рН в діапазоні 6,0-8,0 має сигмоїдальний, а не лінійний, вигляд.
Отже, на другому етапі роботи проведено систематичні дослідження із вивчення кінетичних та каталітичних характеристик Mg2+,АТР-залежної ферментативної реакції, визначено її чутливість до дії відомих інгібіторів АТРаз Р-типу, а також поліамінів. Виявлено обернений зв’язок між активністю Mg2+-АТРази та значенням рН в діапазоні 6,0-8,0, що свідчить на користь того, що Mg2+-АТРаза ПМ може виступати як рН-чутливий внутрішньоклітинний ферментативний сенсор. Проведено порівняльний аналіз характеристик “базальної” Mg2+-АТРази ПМ ГМК та мембрани мікроорганізмів. Утім, характеристика Mg2+-АТРазної активності в ПМ не є повною без розуміння механізму ферментативної реакції Mg2+-залежного гідролізу АТР.
Задача 3. На підставі одержаних експериментальних даних щодо властивостей реакції Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР запропонувати кінетичну модель її можливого механізму.
На третьому етапі наших досліджень ми намагались наблизитись до з’ясування можливого механізму реакції “базального” ферментативного Mg2+-залежного гідролізу АТР в ПМ клітин міометрія. Нами було запропоновано дві можливі кінетичні моделі механізму АТР-гідролазної реакції.
Відповідно до першої моделі (“біцентрова”) припускається наявність двох окремих центрів зв’язування для іонів Mg та АТР4- на ферменті (див. розділ 2.2.). Тобто постулюється, що реальним субстратом АТР-гідролазної реакції є вільний нуклеозидтрифосфат, а Mg2+ є активатором ферментативного перетворення.
Друга модель (“моноцентрова”) постулює існування одного центру для зв’язування хелатного комплексу MgАТР2-, який і є субстратом реакції гідролізу.
При цьому було взято до уваги, що за фізіологічних значень рН Mg2+-залежна АТР-гідролазна реакція протікає незалежно від рівноважної неферментативної реакції хелатування нуклеозидтрифосфатом іонів Mg (Mg2++ATP4- = MgATP2-).
Результати проведеного нами кінетичного аналізу цих альтернативних моделей вказують на те, що у випадку “біцентрової” моделі графік у координатах [Mg2+]/V0; [Mg2+] має характеризуватися точкою мінімуму, а графічним критерієм ідентифікації “моноцентрової” моделі у координатах 1/V0; 1/[Mg2+]2 має бути пряма лінія.
З метою ідентифікації двох вищезазначених механізмів було досліджено ферментативну активність “базальної” Mg2+-АТРази ПМ при зміні загальних концентрацій АТР та Mg2+ в режимі еквімолярного співвідношення їх у середовищі інкубації (за присутності 1 мМ ЕГТА відношення концентрації вільного АТР (АТР4-) до концентрації вільного Mg (Mg2+) дорівнювало сталій величині – 1,25) (рис.7).
Перебудова одержаної концентраційної залежності (рис.7) у координатах [Mg2+]/V0;[Mg2+] показує чітко виражений мінімум (рис.8, а), який задовольняє графічному критерію кінетичної інтерпретації саме “біцентрової” моделі.
Навпаки, перебудова одержаної концентраційної залежності (рис.7) у координатах 1/V0;1/[Mg2+]2 не демострує суто лінійної залежності, яка є графічним критерієм
