НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ПІВДЕННИХ МОРІВ ім. О.О. КОВАЛЕВСЬКОГО

ДРОБЕЦЬКА

Ірина Вікторівна

УДК 582.232:[581.143+581.19]:581.13

ВПЛИВ УМОВ МІНЕРАЛЬНОГО ЖИВЛЕННЯ НА РІСТ І

ХІМІЧНИЙ СКЛАД SPIRULINA PLATENSIS (NORDST.) GEITLER

03.00.17 — гідробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Севастополь - 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті біології південних морів

ім. О.О. Ковалевського НАН України, м. Севастополь

Науковий керівник: кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

Тренкеншу Рудольф Павлович,

Інститут біології південних морів НАН України,

завідувач відділу

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Самишев Ернест Зайнуллінович,

Інститут біології південних морів НАН України,

завідувач відділу функціонування морських екосистем

доктор біологічних наук, доцент

Паршикова Тетяна Вікторівна,

Київський національний університет ім. Т. Шевченка,

завідувач кафедри фізіології та екології рослин

Провідна установа: Інститут гідробіології НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “ 23 ”_листопада_ 2005 р. о _10__ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 50.214.01 при Інституті біології південних морів НАН України за адресою: 99011, м. Севастополь, пр. Нахімова, 2, конференц-зал.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології південних морів НАН України за адресою: 99011, м. Севастополь, пр. Нахімова, 2.

Автореферат розісланий “ 19 ” _жовтня_ 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої ради Д 50.214.01

доктор біологічних наук, професор Гаєвська А.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Spirulina platensis (Cyanophyta/Cyanobacteria) синтезує широкий спектр біологічно активних речовин, через що є одним з провідних об'єктів сучасної фітобіотехнології. Переважна більшість робіт, виконаних за більш ніж тридцятирічний період інтенсивних досліджень спіруліни, сфокусовано, в основному, на біотехнологічних напрямах (Richmond, 1986; Vonshak, 1997; Borowitzka, 1999). У той же час багато еколого-фізіологічних аспектів росту і мінерального живлення цього виду при різних умовах вирощування дотепер залишаються не цілком виразними. Конкретне сполучення параметрів культивування (швидкості протоки середовища, щільності біомаси, освітленості, температури, конструкції культиваторів тощо) визначає продуктивність культур, швидкість і вибірність асиміляції живильних речовин, величини їхніх оптимальних і лімітуючих концентрацій, а також спрямованість конструктивних і енергетичних процесів у клітинах. Квазібезперервний і непропорційно проточний режими культивування у відкритих басейнах спільно з природними коливаннями освітленості і температури створюють особливі умови, які істотно відрізняються від умов в описаних раніше лабораторних і промислових системах вирощування спіруліни. Дослідження особливостей росту і метаболізму S. platensis у таких культурах може стати науковою основою для удосконалення методів її масового культивування з метою підвищення продуктивності виду і біологічної цінності одержуваної біомаси. Крім того, відомості такого роду сприятимуть з'ясуванню фізіолого-біохімічних механізмів, що регулюють розвиток Cyanophyta у водоймах з високим рівнем евтрофікації, підданих впливу промислових і побутових стоків.

Є особливо актуальною проблема розробки фізіолого-біохімічних критеріїв стану мікроводоростей в умовах щільної культури. Для спіруліни такими критеріями можуть бути вміст білка (основного компонента сухої речовини) і фотосинтетичних пігментів, що визначають енергетичний статус клітин. Біосинтез амінокислот, тетрапірольних пігментів і каротиноїдів зв'язаний у рамках центральних метаболічних шляхів мевалонової і ?-амінолевулінової кислот з біосинтезом ключових антиоксидантів і вітамінів (токоферолів, супероксиддисмутази, вітамінів В12 і К1). Отже, по вмісту білка і пігментів можна з достатньою мірою точності міркувати про біологічну цінність біомаси в цілому. Серед основних елементів живлення, що впливають на біосинтез цих компонентів, варто виділити азот. Питанням азотного живлення спіруліни в роботі приділена основна увага.

Дослідження характеру впливу селену на продуктивність S. platensis і на її здатність накопичувати цей елемент має особливе значення в зв'язку з техногенним зростанням вмісту сполук селену в атмосфері й океані та посиленням його ролі у формуванні структури і продуктивності морських і прісноводних угруповань (Vandermeulen, Foda, 1988; Wong, Oliveira, 1991). Подібна інформація важлива і для оцінки можливості збагачення спіруліни есенціальним мікроелементом, що суттєво підвищує антиоксидантні властивості біомаси.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі фізіології тварин і біохімії Інституту біології південних морів НАН України в рамках досліджень за темами: “Розробка наукових основ біотехнологій відтворення і використання морських ресурсів” (№ держ. реєстр. 0101U001448, 2001-2005 р.), “Розробка технологій культивування і підвищення адаптаційної здатності морських і прісноводних мікроводоростей з метою заощадження існуючого генетичного фонду рослин і раціонального використання фіторесурсного потенціалу України” (№ держ. реєстр. 0102U004004, 2003-2005 р.), госпдоговорів “Наукове обґрунтування і практичні рекомендації з вирощування спіруліни в культиваторах відкритого типу в умовах прибережної зони Криму” (1999 р.), “Оцінка можливості управління синтезом і накопиченням біологічно активних речовин у спіруліні” (2000 р.), “Наукове обґрунтування і розробка технології виробництва препарату зі збалансованим набором мікроелементів у спіруліні” (2001-2002 рр). Автор брала участь в темах як виконавець розділів.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було встановити вплив умов мінерального живлення на ріст і хімічний склад Spirulina platensis при різних методах вирощування. Відповідно до поставленої мети виконувались такі завдання:

- дослідити ростові характеристики і динаміку вмісту білка, хлорофілу а, фікобіліпротеїнів і каротиноїдів у спіруліни при вирощуванні в періодичній культурі на повному і редукованому середовищі Заррука;

- оцінити швидкість росту і хімічний склад спіруліни в квазібезперервній культурі при різних концентраціях нітратів у середовищі;

- визначити потреби спіруліни в нітратному азоті при різних режимах культивування;

- дослідити динаміку росту і хімічного складу спіруліни в періодичній і непропорційно проточній культурах при вирощуванні на карбаміді і карбамід-нітратних сумішах;

- встановити вплив різних концентрацій селеніту натрію в середовищі на ріст і накопичення селену в спіруліні в періодичній і квазібезперервній культурах.

Об'єкт дослідження. Альгологічно чиста культура Spirulina platensis (Nordst.) Geitler з колекції відділу біотехнологій і фіторесурсів ІнБПМ НАН України.

Предмет дослідження. Ростові і біохімічні показники S. platensis у залежності від умов вирощування.

Методи дослідження. У роботі використовували фотоколориметричні і спектрофотометричні методи визначення оптичної щільності культур, вмісту білка, хлорофілу а, С-фікоціаніну, алофікоціаніну і сумарних каротиноїдів у біомасі; флуориметричний метод визначення вмісту селену; потенціометричний метод визначення концентрації нітратів у середовищі; загальноприйняті розрахункові методи визначення швидкостей росту культур.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше встановлені закономірності росту і метаболізму Spirulina platensis у періодичній, квазібезперервній і непропорційно проточній культурах при вирощуванні на модифікованому середовищі Заррука у відкритих культиваторах в умовах субтропічного клімату причорноморської зони.

Розроблено експрес-метод визначення щільності біомаси (г абсолютно сухої речовини (АСР)/дм3) по оптичній щільності культури в області 750 нм. Визначено швидкість росту і динаміку вмісту білка, хлорофілу а, фікобіліпротеїнів, каротиноїдів у біомасі спіруліни в залежності від концентрації і хімічної форми азоту в середовищі (нітрати, карбамід, карбамід-нітратні суміші), а також при одночасному зменшенні концентрацій усіх компонентів середовища в 2 і 4 рази.

Уперше показана можливість використання даних щодо вмісту білка і пігментів у біомасі для розрахунку системних характеристик (надійність, складність, організація, стабільність) S. platensis в умовах інтенсивної культури.

Уперше для квазібезперервної культури отримані дані, що характеризують ріст S. platensis і накопичення селену у біомасі при різних концентраціях селеніту натрію в середовищі Заррука. Запропоновано моделі (біохімічна, фізіологічна і загальна), що описують вплив співвідношення концентрацій селену і сірки в середовищі на ріст спіруліни і накопичення сполук селену клітинами.

Практичне значення отриманих результатів. Результати, які характеризують закономірності росту і метаболізму S. рlatensis у квазібезперервній культурі при різній забезпеченості елементами живлення, важливі для розробки методів керованого культивування спіруліни з метою збільшення продуктивності культур та одержання біомаси з підвищеним вмістом білка й антиоксидантів.

Додання в мікроелементний склад спіруліни селену у концентраціях, зіставлених з добовою потребою людини, дозволить істотно підсилити антиоксидантні й імунотропні властивості харчових добавок.

Запропоновано комплекс фізіолого-біохімічних індикаторів (вміст білка, хлорофілу а, С-фікоціаніну і каротиноїдів), які інтегрально відбивають стан S. рlatensis за різних умов існування. Отримані результати можуть бути покладені в основу технологічного регламенту з вирощування S. platensis у південних областях України, а також для характеристики якості біологічно активних добавок із спіруліни.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним науковим дослідженням. Розробка завдань і вибір методик досліджень, основний комплекс експериментальних робіт, аналіз та узагальнення отриманих результатів виконані автором самостійно. У роботах, що опубліковані у співавторстві, здобувачем здійснювалась постановка наукових завдань, проведення експериментів, визначення ростових та біохімічних характеристик культур, динаміки рН, концентрації нітратів у середовищі, статистична обробка даних та їх інтерпретація.

Апробація результатів досліджень. Матеріали дисертації доповідались на семінарах відділу фізіології тварин і біохімії і відділу біотехнологій і фіторесурсів ІнБПМ НАНУ (2000 - 2004 рр.), X Міжнародному симпозіумі “Нетрадиционное растениеводство. Эниология. Экология и здоровье” (Алушта, 2001), VI Міжнародній конференції “Экология и здоровье человека. Экологическое образование. Математические модели и информационные технологии” (Криница, 2001), X Міжнародній конференції “Новые информационные технологии в медицине и экологии” (Ялта – Гурзуф, 2002), VI Міжнародній конференції “Биоантиоксидант” (Москва, 2002), Міжнародній науково-практичній конференції “Новые технологии получения и применения биологически активных веществ” (Алушта, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових праць (п’ять без співавторів), із них 8 – статті в спеціалізованих наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, 6 – тези доповідей у матеріалах міжнародних конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 188 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, семи розділів, висновків, списку літератури (що включає 245 джерел), п'яти додатків, ілюстрована 15 таблицями та 28 рисунками.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

У розділі розглянуті сучасні уявлення про систематичне положення і біологію Spirulina (Arthrospira) platensis, дається характеристика особливостей мінерального живлення Cyanophyta у зв'язку зі специфікою їхнього метаболізму (у порівнянні з різними групами мікроводоростей), наведені відомості про метаболічну роль білків і пігментів, лабільність їхнього вмісту і складу в залежності від умов вирощування. Проаналізовано дані, що підтверджують можливість використання цих показників для оцінки фізіологічного стану культур Cyanophyta і інтегральної оцінки біологічної цінності біомаси.

МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Основну частину експериментальних робіт виконано на базі науково-виробничого підприємства “Агро-Вікторія” (м. Адлер, Росія) у весняно-літній період 2000-2001 рр. Культиваторами були прямокутні басейни (площею 1,3-1,7 м2), розташовані в типовій скляній теплиці. Об?єм середовища становив 100-120 дм3, висота шару розчину – 7,2-7,7 см. Освітленість на поверхні культур у денний час варіювала в травні від 5до 50 кЛк, у червні-липні – від 4 до 60 кЛк. Температурні коливання у травні знаходились в діапазоні 18-30?С; у червні-липні –18-32?С. Культури протягом дня багаторазово перемішували за допомогою ручних мішалок.

Різні умови мінерального живлення в дослідах створювали шляхом змінення складу середовищ і застосуванням різних методів культивування. Квазібезперервну культуру зі швидкістю протоки 0,1 доба-1 одержували періодичною (з інтервалом 24 г) заміною 1/10 частини суспензії спіруліни рівноцінним об?ємом свіжоприготовленого середовища. Під час непропорційно проточного вирощування перед виконанням “10%-вого обміну” з метою підтримки щільності культур на рівні 0,5-0,6 г АСР/дм3 частину біомаси, зосередженої в поверхневому шарі, вилучали за допомогою рейки.

Експерименти з вивчення впливу концентрації селену на ріст S. platensis і накопичення елемента в біомасі здійснювались в лабораторних умовах. Накопичувальні культури утримували в літрових скляних колбах (об?єм суспензії 500 см3) на люміностаті при цілодобовому освітленні знизу (лампи ЛДС-20) і безупинному барботажі повітрям зі швидкістю 0,2 дм3/хв. Освітленість дорівнювала 5,3 кЛк, температура середовища – 25,5-26,0°С. Квазібезперервним методом спіруліну вирощували в прямокутних басейнах місткістю 100 дм3 (висота шару культури 10 см) при безперервному освітленні зверху лампами ДЛР-750 і перемішуванні за допомогою електричних насосів. Освітленість на поверхні культур досягала 4,4 кЛк, температура розчину – 20-22°С.

Основою живильних середовищ було модифіковане середовище Заррука (Zarrouk, 1966). У різних експериментах, у залежності від поставлених цілей, до складу середовища вносили відповідні зміни. У контролі вміст нітратів становив 500 мг N/дм3.

Інтенсивність освітлення на поверхні культур реєстрували за допомогою люксметра Ю-116, рН середовища контролювали іономіром ЕВ-74. Ріст культур реєстрували з використанням фотометричного методу по оптичній щільності суспензії спіруліни в області 750 нм (D750). Вміст АСР у культурах визначали розрахунковим методом за попередньо одержаним рівнянням регресії, що відбиває залежність між D750 і щільністю культури (г АСР/дм3). Максимальну продуктивність (абсолютну швидкість росту) періодичної культури розраховували за рівнянням лінійної регресії як тангенс кута нахилу лінійної ділянки кривої росту: В = Р*t + Вo, де В и Вo – поточна і початкова величини біомаси (г АСР/дм3); Р – продуктивність (г АСР/(дм3·доб)); t – час, доба. Продуктивність квазібезперервної культури оцінювали щодня за різницею між величинами біомаси до і після обміну. Середні питомі швидкості росту ? (доб-1) розраховували за рівнянням ?= (lnХ- lnХo) /(t-to), де Х и Хo – величини біомаси в момент часу t і to (Vonshak, 1986).

Масову частку білка визначали за допомогою методу Лоурі (Lowry, 1951), вміст пігментів – спектрофотометричними методами (Rowan, 1989). Хлорофіл екстрагували 100% ацетоном, для розрахунку його концентрації використовували специфічний коефіцієнт екстинкції 88,15 дм3? г-1см-1 (при = 663 нм) (Jeffrey, Humphrey, 1975). Каротиноїди екстрагували етанолом, омиляли 30 хв при 60?С (0,1 см3 50% КОН на 1 см3 спиртового екстракту) і переводили в гексан. Концентрацію пігментів у гексановій фракції визначали по поглинанню в області 450 нм при =2500 (Liaaen-Jensen, Andrewes, 1985). Для виділення фікобіліпротеїнів – С-фікоціаніну (С-ФЦ) і алофікоціаніну (АФЦ) – використовували фосфатний буфер (0,1М; рН=7). Реєстрували оптичну щільність отриманих супернатантів в області характеристичних максимумів поглинання С-ФЦ (620 нм) і АФЦ (650 нм). Вміст С-ФЦ і АФЦ у біомасі розраховували за рівняннями (MacColl, Guard-Friar, 1987).

Масову частку вологи в повітряно-сухій біомасі спіруліни визначали шляхом висушування наважок біомаси при 105°С протягом 24 годин (Методи …, 1975).

Вміст нітратного азоту в середовищі визначали потенціометричним методом за допомогою іономера І-130 (нітратселективний електрод “Элит-021” (НПО “Нико”, Росія)) (Уильямс, 1982). Економічний коефіцієнт по нітратах (Y) розраховували як відношення кількості споживаного субстрату до відповідного приросту біомаси (Перт, 1978).

Концентрацію селену у сухій біомасі спіруліни визначали флуорометричним методом (Голубкина, 1995).

Розраховували середні арифметичні (М), стандартні відхилення (s), помилки середньої (m), вірогідність розходжень вибіркових середніх за допомогою парного t-критерію (?), коефіцієнти кореляції (R).

ЗАГАЛЬНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ РОСТУ І МЕТАБОЛІЗМУ

S. platensis в УМОВАХ ПЕРІОДИЧНОЇ КУЛЬТУРИ

Ростові і біохімічні показники спіруліни при вирощуванні в накопичувальній культурі на повному і редукованому середовищі Заррука. При вирощуванні спіруліни у відкритих культиваторах в умовах природної освітленості на повному середовищі накопичувальна культура I (контроль) досягла стаціонарної фази росту на 10-у добу (рис. 1А), коли в середовищі ще залишалося близько 50% початкового рівня нітратів (рис. 1 Б). Середня продуктивність (Р) за цей період становила 0,104 г АСР/(дм3?доб), а максимум біомаси – 1,17 г АСР/дм3.

Розведення середовища в два рази в початковий період ніяк не позначалося на рості культури II. Відставання намітилося, починаючи з 5-ї доби, і за 10 діб по середній величині продуктивності цей варіант поступився першістю контролю лише на 18%. Максимум біомаси був відзначений на 11-у добу, причому його величина наближалась до контролю і складала 1,09 г АСР/дм3. У варіанті III при скороченні концентрації живильних елементів у 4 рази зниження темпів росту було зареєстровано вже на другу добу, однак, середня за 10 діб Р і величина максимальної біомаси знизилися непропорційно розведенню середовища – у 1,5 рази. Стаціонарна фаза росту була досягнена на 12-у добу за повною відсутністю нітратів у середовищі.

Вплив розведення середовища на вміст білка, хлорофілу (ХЛ) а і фікобіліпротеїнів (ФБП) у S. platensis був особливо різко виражений на стаціонарній стадії росту, у період глибокого дефіциту азоту, хоча перші ознаки зміни хімічного складу виявилися вже на 4-у добу (табл. 1). При цьому найбільшою мірою виснажувалися запаси С-ФЦ і АФЦ (у варіанті III – на 68 і 73% порівняно з контролем), що обумовило падіння відносної частки С-ФЦ у загальному білку і величини співвідношення ФЦ/ХЛ. Слід зазначити, що навіть на повному середовищі вміст білка і пігментів у спіруліні, вирощеної в накопичувальній культурі, не досяг рівня інокуляту, отриманого методом непропорційно проточної культури з щоденним 10%-вим обміном живильного середовища і щільністю 0,5-0,6 г АСР/дм3. Причому, у всіх варіантах за період стаціонарної фази росту зареєстровано різке зниження величин усіх досліджених показників, за винятком вмісту каротиноїдів (КР). Чіткої залежності концентрації цих пігментів від складу живильного середовища виявити не удалося. Наприкінці експерименту їхній рівень у всіх трьох культурах наближався і практично не відрізнявся від початкового. Можливо, при зниженні концентрації ХЛ а і ФБП роль КР у поглинанні сонячної енергії істотно зростає, і стабілізація біосинтезу КР є одним з механізмів адаптації клітин до дефіциту біогенів. Величина співвідношення ФЦ/АФЦ у всіх варіантах підтримувалася в діапазоні 2,5 – 3,0, при якому, очевидно, процеси переносу енергії від фікобілісом на ХЛ найбільш збалансовані.

Потреби спіруліни в нітратах. Економічний коефіцієнт по нітратах (Y) визначали по співвідношенню швидкості споживання нітратів (VN) і продуктивності

Таблиця 1

Вміст білка і пігментів у сухій біомасі S. platensis у залежності

від ступеня розведення живильного середовища

Час, доба | Варіанти експерименту | Показники інокуляту | I – середовище без розведення | II – розведення середовища 1:1 (v/v) | III – розведення середовища 1:3 (v/v) | Вміст білка, % АСР (M ± m) | 4 | 51,13 ± 0,25 | 49,45 ± 0,51 | 43,45 ± 0,75 |

59,97 ± 0,24 | 10 | 53,39 ± 0,32 | 48,14 ± 0,29 | 45,23 ± 1,03 | 14 | 42,00 ± 1,81 | 45,23 ± 1,85 | 29,60 ± 0,65 | Вміст хлорофілу а, % АСР (M ± m) | 4 | 0,73 ± 0,01 | 0,70 ± 0,01 | 0,62 ± 0,02 |

1,09 ± 0,01 | 10 | 0,74 ± 0,02 | 0,66 ± 0,02 | 0,64 ± 0,01 | 14 | 0,67 ± 0,02 | 0,62 ± 0,01 | 0,51 ± 0,01 | Вміст С-фікоціаніну, % АСР (M ± m) | 4 | 3,48 ± 0,09 | 3,57 ± 0,04 | 3,10 ± 0,12 |

8,20 ± 0,03 | 10 | 3,49 ± 0,11 | 3,95 ± 0,06 | 3,29 ± 0,06 | 14 | 3,00 ± 0,04 | 2,34 ± 0,05 | 0,95 ± 0,03 | Вміст алофікоціаніну, % АСР (M ± m) | 4 | 1,01 ± 0,04 | 1,15 ± 0,07 | 0,94 ± 0,05 |

2,33 ± 0,02 | 10 | 1,04 ± 0,06 | 1,22 ± 0,04 | 1,05 ± 0,06 | 14 | 1,19 ± 0,08 | 0,83 ± 0,02 | 0,32 ± 0,03 | Вміст каротиноїдів, мкг/г АСР (M ± m) | 4 | 482 ± 21 | 784 ± 19 | 416 ± 26 |

1600 ± 5 | 10 | 670 ± 15 | 769 ± 17 | 577 ± 14 | 14 | 598 ± 11 | 580 ± 10 | 536 ± 9 |

(Р), відбитих на рис. 1 (А, Б). Середні величини Y для варіантів I, II і III становили 217,9 мг N/г АСР, 215,8 мг N/г АСР і 180,9 мг N/г АСР. На основі власних даних щодо вмісту білка наприкінці лінійної фази росту культур і літературних відомостей про вміст нуклеїнових кислот у S. platensis, був розрахований показник YAS – концентрація загального азоту в біомасі (мг N/г АСР). Співвідношення YAS/Y (%) представлено нами як коефіцієнт ефективності асиміляції нітратів KAS. Розрахункові величини показали, що до моменту виходу періодичних культур на стаціонарну фазу асимільований у складі біомаси азот у всіх варіантах дорівнював лише 42 – 47% від загального зниження вмісту нітратного азоту в середовищі за зазначений період. Такі результати можуть бути обумовлені значною часткою екскретованих N-метаболітів (нітритів, амонію, вільних амінокислот, амінів, розчинних пептидів, вітамінів) (Herrman, 1977; Shah, 1977; Collos, 1992), а також поглинанням NO3- супутньою бактеріальною флорою і частковим відмиранням клітин спіруліни.

ЗАКОНОМІРНОСТІ РОСТУ І МЕТАБОЛІЗМУ S. platensis в УМОВАХ квазібезперервної КУЛЬТУРИ

Ростові і біохімічні характеристики спіруліни в залежності від концентрації нітратів у середовищі Заррука. Дослідження впливу концентрації нітратного азоту в середовищі на ріст і метаболізм спіруліни в квазібезперервній культурі показало, що при вмісті нітратів у живильному середовищі у діапазоні 500–60 мг N/дм3, незважаючи на істотні розходження в забезпеченості культур азотом, швидкості їхнього росту на експонентній стадії розвитку і середні значення продуктивності за цей період практично не відрізнялись, а максимальна щільність біомаси була близькою до 1 г АСР/дм3 (рис. 2 і 3А).

У варіантах з початковою концентрацією азоту 30 і 10 мг /дм3 активний ріст спіруліни спостерігався до 7 і 3-ї доби, відповідно. При цьому у варіантах 500 і 200 мг N/дм3 наприкінці експерименту ще залишалося близько 50 і 20% початкового рівня нітратів. У варіанті 100 мг N/дм3 вміст нітратів знизився до нижньої границі чутливості іоноселективного електрода (близько 1 мг N/ дм3) на 11-у добу досліду, а при вихідних концентраціях 60, 30 і 10 мг N /дм3, починаючи з 7, 6 і 5-ї доби, відповідно, азот у середовищі вже не реєструвався (рис. 4).

Продовження активного росту культур в умовах азотного дефіциту відбувалося на тлі істотної зміни хімічного складу біомаси (рис. 5).

Насамперед слід зазначити різке зменшення вмісту білка і пігментів в спіруліні у всіх варіантах (у порівнянні з інокулятом) у початковий період культивування (див. рис. 5), що, мабуть, є відповідною реакцією організму на стрибкоподібну зміну відразу декількох чинників середовища: освітленості, рН, солоності, концентрації біогенів тощо. У варіантах 500 і 200 мг N/дм3 рівні білка, ХЛ а і С-ФЦ швидко відновлювалися і не знижувалися до кінця досліду. Аналогічна тенденція спостерігалася спочатку і при концентраціях 100 і 60 мг N/дм3, однак, відновний період тривав лише 9 і 6 діб, відповідно (тобто до вичерпання нітратів у середовищі), після чого концентрація азотвмісних речовин у клітинах почала швидко знижуватися. Ще більш глибокі порушення метаболізму відзначені у варіантах 30 і 10 мг N/дм3. Зміни у вмісті загального білка, ХЛ а і С-ФЦ у всіх варіантах носили односпрямований характер, коефіцієнти кореляції між ними становили близько 0,9. При цьому частка С-ФЦ у білку при високому рівні азоту в середовищі в ході експерименту зростала, а в умовах середнього і гострого дефіциту біогену скорочувалась (табл. 2). Подібний характер змін відзначений і в співвідношенні ФЦ/ХЛ, що вказує на N-резервну роль фікоціаніну.

Таблиця 2

Відносний вміст С-фікоціаніну в загальному білку (%) і співвідношення ФЦ/ХЛ у S. platensis в квазібезперервній культурі

Час, доба | Концентрація нітратів у вихідному живильному середовищі, мг N/дм3 | 500 | 200 | 100 | 60 | 30 | 10

Вміст С-ФЦ у білку (%) | 1 | 9,84 | 10,21 | 10,15 | 9,49 | 9,90 | 10,09 | 5 | 9,61 | 10,47 | 10,96 | 9,86 | 8,51 | 4,28 | 11 | 10,24 | 10,16 | 8,15 | 3,73 | 3,02 | 1,45 | 17 | 12,83 | 12,60 | 7,02 | 5,28 | 2,24 | 0,85 | ФЦ/ХЛ | 1 | 6,11 | 6,17 | 6,13 | 5,94 | 6,17 | 6,48 | 7 | 6,22 | 6,31 | 5,82 | 5,64 | 3,59 | 1,91 | 15 | 7,50 | 7,33 | 3,61 | 2,05 | 1,63 | 1,60 | 17 | 7,78 | 8,30 | 5,19 | 3,30 | 2,21 | 0,79 |

Менш вираженим був вплив забезпеченості культур азотом на динаміку вмісту КР (див. рис. 5), для синтезу яких не потрібний азотвмісний попередник. Однак, при гострому дефіциті азоту у варіантах 30 і 10 мг N/дм3 інгібування білкового синтезу не могло не позначитися на активності ферментних систем, що відповідають за утворення і трансформацію ізопреноїдів.

Таким чином, при концентраціях нітратів у середовищі 200 і 500 мг N/дм3 показники росту і хімічного складу спіруліни в квазібезперервній культурі практично не відрізняються.

Зіставлення характеристик спіруліни, вирощеної в квазібезперервній і накопичувальній культурах за однакових умов зовнішнього середовища, показало, що щоденний 10 % обмін забезпечує більш високу продуктивність S. platensis (на 15%) і вміст білка, ХЛ а, ФБП і КР у біомасі (на 9-11%, 27-32%, 42-55% і 49-52%, відповідно).

Системні характеристики спіруліни в залежності від умов азотного живлення. Будь-яка біологічна самовідтворююча система різного рівня організації має структуру елементів, поєднаних між собою функціональними зв'язками. Системні характеристики (надійність, організація, стабільність, складність) дають можливість кількісно оцінити рівень відхилення функціонування системи від норми, тобто можуть бути узагальненим критерієм для оцінки її стану. Для визначення системних характеристик спіруліни використовували загальноприйняту методику розрахунків (Михайловский, 1978; Михайловский, Федоров, 1982). Для розрахунку надійності системи нами було побудовано кореляційну матрицю на основі восьми параметрів, одночасно контрольованих у кожен момент часу, – величин біомаси, продуктивності, рН, концентрацій білка, ХЛ а, С-ФЦ, КР у біомасі і рівня нітратів у середовищі. Для варіантів 10, 30 і 60 мг N/дм3 коефіцієнт кореляції біомаси з усіма досліджуваними біохімічними параметрами (вміст білка і пігментів у біомасі) був нижче нуля, що свідчить про відказ системи в умовах N-голодування. В інших випадках відзначено, що при збільшенні концентрації азоту в середовищі до 200 мг N/дм3, значення системних характеристик (рис. 6) й кількість вірогідних зв'язків також збільшуються.

Економічний коефіцієнт по нітратах і ефективність їхньої асиміляції. Величини економічних коефіцієнтів по нітратах (Y) позитивно корелювали з рівнем азотного забезпечення (R = 0.93, ? < 0,01) (рис. 7). Для YAS кореляція з рівнем нітратів у середовищі також була позитивною (R = 0,76), а для KAS – негативною (R = –0,97, ? < 0,01).Таким чином, найбільш ефективно поглинені нітрати засвоюються при гострому N-дефіциті (до 88% у варіанті 10 мг N/дм3).

СЕЧОВИНА ЯК КОМПОНЕНТ АЗОТНОГО ЖИВЛЕННЯ S. platensis

В експериментах сечовину (карбамід (NH2)2CO) використовували як єдине джерело азоту, а також в складі сумішей з нітратами (табл. 3).

Таблиця 3

Вміст різних хімічних форм азоту в середовищі Заррука

Хімічна форма азоту | Концентрація азоту, мг N/дм3

Варіанти експериментів | К | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | Нітратний азот (N+5) | 500 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 490 | 470 | 440 | 400 | 200 | 100 | Амідний азот (N-3) | 0 | 10 | 30 | 60 | 100 | 300 | 500 | 10 | 30 | 60 | 100 | 300 | 400 |

Залежність ростових і біохімічних показників спіруліни в періодичній культурі від концентрації карбаміду в середовищі і складу карбамід-нітратних сумішей. Встановлено, що при вирощуванні спіруліни в накопичувальній культурі (у літрових колбах) сечовина в концентраціях 300-500 мг N-3/дм3 (незалежно від наявності нітратів) породжує різке пригнічення життєдіяльності клітин аж до їхньої загибелі (рис. 8). Найбільш ймовірною причиною цього може бути накопичення в середовищі NH4+ і NH3 унаслідок посилення гідролізу сечовини при високих температурах і рН.

Рівні карбаміду 100 мг N-3/дм3 (і нижчі за них) не забезпечували високих величин біомаси (див. рис. 8) і вмісту в ній білка і пігментів (табл. 4). У той же час часткова заміна нітратів на сечовину (до 20% по азоту) справляла стимулюючий ефект як на темпи росту культур, так і на активність анаболічних процесів у клітинах. При цьому зростання вмісту С-ФЦ у білку і співвідношення ФЦ/ХЛ вказувало на більш інтенсивне утворення N-резервів.

Використання карбаміду при культивуванні S. platensis непропорційно проточним методом. Було встановлено, що при непропорційно проточному культивуванні спіруліни концентрації сечовини, нижчі 60 мг N-3/дм3, (як єдиного

Таблиця 4

Біохімічні показники S. platensis, вирощеної накопичувальним способом

при різних умовах азотного живлення

Концентрація джерел азоту в середовищі, мг N /дм3 | Вміст белка, % АСР | Вміст ХЛ а, % АСР | Вміст С-ФЦ, % АСР | Вміст КР, мкг/г АСР | Частка С-ФЦ у білку, % | ФЦ/ХЛ

10 (N-3) | 19,00 ± 0,26 | 0,239 ± 0,004 | 0,23 ± 0,01 | 546,8 ± 0,2 | 1,21 | 0,96

30 (N-3) | 21,90 ± 0,21 | 0,245 ± 0,008 | 0,27 ± 0,01 | 720,7 ± 0,2 | 1,23 | 1,10

60 (N-3) | 26,15 ± 0,18 | 0,320 ± 0,007 | 0,52 ± 0,02 | 764,6 ± 0,3 | 1,99 | 1,63

100 (N-3) | 35,02 ± 0,41 | 0,534 ± 0,007 | 1,34 ± 0,04 | 1178,2 ± 0,5 | 3,83 | 2,51

10 (N-3) + 490 (N+5) | 69,38 ± 0,35 | 1,390 ± 0,006 | 8,56 ± 0,05 | 2715,0 ± 0,6 | 12,34 | 6,16

30 (N-3) + 470 (N+5) | 69,83 ± 0,52 | 1,409 ± 0,009 | 9,08 ± 0,04 | 2685,9 ± 0,4 | 13,00 | 6,44

60 (N-3) + 440 (N+5) | 71,05 ± 0,29 | 1,481 ± 0,010 | 9,42 ± 0,08 | 2646,8 ± 0,7 | 13,26 | 6,36

100 (N-3) + 400 (N+5) | 72,49 ± 0,42 | 1,510 ± 0,012 | 9,71 ± 0,06 | 2859,9 ± 0,6 | 13,39 | 6,43

500 (N+5) | 69,44 ± 0,31 | 1,387 ± 0,009 | 8,52 ± 0,03 | 2646,3 ± 0,3 | 12,27 | 6,14

джерела азоту) не забезпечували високих швидкостей росту протягом всього експерименту (рис. 9). Погіршення ростових показників (відносно контролю) відзначили на 5 – 6-у добу у випадках 10N-3 і 30N-3 і на 13-у добу у варіанті 60N-3. Останній, проте, був порівняний з контролем по середній за весь період продуктивності (рис. 10). Концентрація карбаміду в середовищі 100 мг N-3/дм3 забезпечувала високі темпи росту спіруліни протягом усього часу культивування. Однак, у цьому випадку вміст білка, ХЛ а, С-ФЦ і КР у біомасі до кінця експерименту знижувався і становив, відповідно, 45,2 %, 0,8%, 3,8% і 209 мг% (проти 65,9%, 1,3%, 8,1% і 278 мг% у контролі). Можливо, активний ріст відбувався за рахунок мобілізації внутрішньоклітинних резервів, накопичених раніше при адекватних умовах азотного живлення.

Концентрації сечовини 300 і 400 мг N-3/дм3 (незалежно від наявності нітратів у середовищі) спричинювали різке інгібування росту спіруліни, звязане з адаптаційними метаболічними перебудовами – підвищенням рівня білка (71 – 72% АСР) і С-ФЦ (>10% АСР) на тлі зниження рівня ХЛ а. При цьому значення індексу ФЦ/ХЛ зростало до 9 –10 (у контролі воно дорівнювало 6 – 7). На відміну від накопичувальної культури цей ефект протягом 8-10 днів нівелювався, і до кінця експерименту швидкості росту у варіантах 300 і 400 N-3 більш ніж на 40 % перевищували рівень контролю (див. рис. 9), що обумовило відсутність вірогідних розходжень між цими варіантами по середній за весь період продуктивності (див. рис. 10).

Очевидно, динаміка вмісту амідного азоту у відкритих культиваторах визначалася не тільки швидкістю асиміляції субстрату клітинами спіруліни, але і швидкістю випару NH3, що утворюється під час гідролізу сечовини (Laliberte et al., 1997). Причому, внесок абіотичної складової при температурі середовища 30?С міг бути дуже вагомим – до 60% від загального зниження концентрації азоту (Proulx, et al., 1994).

При відносному вмісті N-3 у сумішах, який дорівнював 20, 60 і 80%, µ у всіх випадках практично збігалися з µ на середовищах, де джерелом азоту була одна сечовина, взята в таких самих концентраціях. Але такий збіг не означає, що потреби в азоті в обох паралелях забезпечувалися лише за рахунок аміду, тобто відбувалося блокування асиміляції нітратів, аналогічне процесу, описаному для сумішей NH4+ і NO3– (Syrett, 1981; Flores, Herrero, 1994). Більш високі рівні білка і пігментів у спіруліні, вирощеної у варіантах 100N-3+400N+5 і 300N-3+200N+5 (порівняно з варіантами 100N-3 і 300N-3) дозволяють припустити спільну утилізацію обох форм азоту.

Заміна 12 – 20% нітратного азоту середовища Заррука на амідний є оптимальнішим варіантом використання карбаміду при непропорційно проточному способі вирощування, бо забезпечує найбільш високі темпи росту і показники біологічної цінності біомаси (рівень білка 62 – 68% АСР, ХЛ а – 1,1 – 1,3% АСР, С-ФЦ – 7 – 9% АСР, КР – 2,8 – 3,6 мг/г АСР).

.

СЕЛЕН ЯК КОМПОНЕНТ СЕРЕДОВИЩА ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ S. platensis

Залежність темпів росту спіруліни і рівня накопичення селену в біомасі від концентрації селеніту натрію в середовищі. При вирощуванні спіруліни в накопичувальній культурі було показано, що в діапазоні концентрацій селену в середовищі 1 – 20 мг Se/дм3 (у формі селеніту натрію) не відбувається пригнічення росту культури (рис. 11).

Середня продуктивність при 5 мг Se/дм3 була на 50% вища, ніж у контролі (? < 0,05). У механізмі промоторної дії селену основну роль віддають підвищенню активності глутатіонпероксидази як компонента клітинної системи антиоксидантного захисту.

У S. platensis в умовах квазібезперервної культури оцінювали рівень накопичення Se у біомасі в залежності від концентрації елемента в середовищі. Початкова концентрація Se у середовищі експериментальних басейнів I і II досягала 0,5 і 2,0 мг Se/дм3, відповідно, при щільності культур ? 0,6 г АСР/дм3. У біомасі, відібраної на третю добу, вміст Se збільшився в 25,2 і 82,3 рази, у порівнянні з контролем (табл. 5).

Таблиця 5

Вміст селену в S. platensis в умовах квазібезперервної

культури при різних концентраціях Na2Se3 у середовищі

Концентрація селену (IV) у середовищі, мг/дм3Концентрація селену у сухій біомасі, мкг/г АСР | Тривалість експерименту, доба | 3 | 5 | 6 | 7 | 0 (контроль) | 0,13 0,03 | - | - | - | 0,5 | 3,28 0,24 | - | - | - | 2,0 | 10,70 0,55 | - | - | - | 10,0 | - | 24,6 1,3 | 14,6 0,6 | 14,3 0,6 | 15,0 | - | 23,9 1,2 | 19,9 1,2 | 21,8 0,9 |

Невелика кількість селену у контролі з`ясовується присутністю елемента як домішки в солях, використаних для готування живильного розчину.

На четверту добу концентрацію селену у дослідних басейнах збільшили до 10 і 15 мг/дм3, що призвело спочатку до значного (але непропорційного) підвищення рівня селену у водоростях (у 7,5 і 2,3 рази, відповідно), а потім – до його зниження. Середня продуктивність спіруліни в контролі і при 10 і 15 мг Se/дм3 варіювала в діапазоні 0,05 – 0,06 г АСР/(дм3?доб). За приблизною оцінкою, спіруліна в умовах квазібезперервної культури за 48 годин асимілювала із середовища близько 0,4% від кількості селену, що міститься в середовищі.

Антагоністичні моделі впливу селену на ріст і біохімічні показники спіруліни. На основі відомих уявлень про антагонізм сірки і селену були побудовані моделі, які характеризують залежність ростових і біохімічних показників спіруліни від співвідношення концентрацій селену і сірки в середовищі.

Відповідно до біохімічної і фізіологічної моделей, співвідношення швидкостей синтезу селен- і сірковмісних продуктів, а також їхніх клітинних концентрацій, лінійно пов'язане зі співвідношенням концентрацій субстратів (селену і сірки) у середовищі.

Загальна модель описує залежність питомої швидкості росту водоростей від співвідношення конкуруючих елементів у середовищі:

де – співвідношення кількостей селену і сірки в середовищі.

і – максимальні і мінімальні співвідношення цих елементів у середовищі, нижче чи вище яких ріст клітин не відбувається.

Оптимум співвідношення, при якому спостерігається максимум швидкості:

Експериментальні дані дозволяють зробити приблизну оцінку коефіцієнтів моделі. На рис. 12 показані одержані значення питомої