НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ
ДРОБОТ Людмила Борисівна
УДК 577.112.7:576.32/36
ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІЗАЦІЇ І ФУНКЦІОНУВАННЯ СИГНАЛЬНИХ МЕРЕЖ В НОРМАЛЬНИХ ТА ПУХЛИННИХ КЛІТИНАХ
03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Львів – 2005
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано у відділі сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН України (м. Львів).
Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор,
член-кореспондент НАН України
Сибірний Андрій Андрійович,
Інститут біології клітини НАН України,
директор Інституту
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,
академік НАН України
Комісаренко Сергій Васильович,
Інститут біохімії НАН України,
директор Інституту
доктор біологічних наук, професор,
член-кореспондент НАН України
Риндич Алла Володимирівна,
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,
завідувач відділу молекулярної онкогенетики
доктор біологічних наук,
Луцик Максим Дмитрович
Інститут біології клітини НАН України,
Провідний науковий співробітник відділу
регуляції проліферації клітин
Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є Кавецького НАН України, м. Київ
Захист відбудеться “ 23 грудня 2005 р. о 14 годині на засіданні cпеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 в Інституті біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова,14/16.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.
Автореферат розіслано “ листопада 2005 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук, ст. н. сп. Убийвовк В.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Однією із властивостей, спільних для всіх живих організмів, є їх динамічна здатність до постійної координації власної діяльності у відповідності зі змінами в оточуючому середовищі і свого внутрішнього стану, що забезпечується функціонуванням шляхів трансмембранного перетворення і внутрішньоклітинного проведення регуляторних сигналів (сигнальних шляхів) (Schlessinger, 1994; Pawson, 1995). До недавнього часу вважалось, що передача окремих сигналів від мембранних рецепторів вглиб клітини відбувається шляхом низки взаємодій між сигнальними білками та іншими молекулами сигнального шляху. Однак величезний об’єм інформації стосовно численних нових учасників сигнальних систем, що поставляється структурною геномікою, призвів до якісного перегляду звичних і дуже часто спрощених уявлень в галузі клітинної біології (Monk, 2003). Виявилось, що регуляторні білки сконструйовані, переважно, у вигляді касет доменів, що опосередковують білково-білкові (-ліпідні, -нуклеїнові) взаємодії або володіють ферментативною активністю (Pawson & Nash, 2000). Завдяки значним успіхам, які були досягнуті протягом останніх років у з’ясуванні модульної організації сигнальних білків та в розшифровці механізмів міжмолекулярних взаємодій, відповідальних за збирання сигнальних молекул в окремі біохімічні шляхи, стало зрозумілим, що здатність клітин регулювати просторово розділені функції обумовлена організацією сигнальних шляхів в мережі (Jordan et al., 2000). Встановлено, що провідну роль у просторовому розмежуванні сигналювання відіграють адаптерні та риштувальні (scaffold) білки, які забезпечують одночасно збирання надмолекулярних комплексів сигнальних білків і взаємодії з елементами клітинних структур, таких як цитоскелет і ін. (Pawson & Nash, 2003). Результати цих робіт однозначно показали, що порушення сигнальних механізмів клітини є однією з головних молекулярних подій в етіології і патогенезі багатьох захворювань людини і, зокрема, раку (McCormick, 1999; Hahn & Weinberg, 2002). По мірі поглиблення нашого розуміння деталей такої функціональної організації і переходу на наступний рівень аналізу взаємозв’язаних клітинних функцій, постає надзвичайно важлива проблема виявлення та вивчення властивостей сигнальних мереж в цілому, таких як здатність до інтеграції і консолідації величезної кількості регуляторних сигналів, специфічність, ефективність і інтенсивність сигналювання, кінетика і амплітуда проходження сигналу в мережі і ін. Від відповіді на ці і інші взаємопов’язані питання в значній мірі буде залежати, в якому напрямку буде розвиватись фундаментальна біологічна наука і які стратегічні підходи буде використовувати медицина в майбутньому. Важливим показником практичної значимості досліджень у вказаній галузі молекулярної клітинної біології є інтенсивний розвиток цілої галузі дизайну фармакологічних засобів, здатних ефективно пригнічувати у змінених клітинах конститутивно активовані сигнальні мережі шляхом блокування передачі сигналу в окремих її ланках, що дозволяє регулювати фізіологію клітин в обхід генетичних змін, які призвели до розвитку тих чи інших патологічних станів (Sawyer, 1998; Dalgarno et al., 1998; Vidal et al., 2001; Madhusadan & Ganesan, 2004: Noble et al., 2004).
Однак, незважаючи на суттєві зусилля, переважна більшість сигнальних шляхів досліджені лише частково, дуже мало відомо про те, яким чином окремі сигнали надходять до специфічних компартментів клітини, просторово-часові принципи організації і функціонування сигнальних мереж клітин залишаються в значній мірі нез’ясованими, робота над створенням базових концепцій, які б дозволили безпосередньо перейти від аналізу окремих сигнальних компонентів до системного аналізу, розпочалась лише нещодавно. Деякі аспекти вказаної проблеми знайшли розвиток у даній дисертаційній роботі.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планами наукових досліджень відділу сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН України (раніше відділ біохімії клітинної диференціації Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України). У роботі використані результати досліджень, отримані в рамках наступних бюджетних тем: „Исследование биохимических механизмов действия инсулина на клетки животных в раннем эмбриогенезе”, № держреєстрації 01830064145, 1982-1985 рр.; „Изучение биохимических механизмов действия полипептидных факторов роста на клетки животных и человека”, № держреєстрації 01860011724, 1986-1990 рр.; „Изучение молекулярних механизмов действия трансформирующего фактора роста типа ? (ТФР- ?) на пролиферацию и дифференцировку клеток животных и человека”, № держреєстрації 0294900001, 1991-1993 рр.; „Дослідження каскадних процесів фосфорилювання білків при індукції диференціації клітин”, № держреєстрації 0297V000549, 1994-1996 рр.; „Дослідження молекулярних механізмів альтернативної диференціації клітин”, № держреєстрації 0197V004659, 1997-1999 рр.; „Дослідження ролі білок-білкових взаємодій, опосередкованих Src-гомологічними доменами сигнальних білків в регуляції проліферації, диференціації і апоптозу клітин людини і тварин”, № держреєстрації 0100V000081, 2000-2003 рр.; „Роль SH3-вмісних адаптерних білків Ruk/CIN85/SETA в регулюванні сигнальних мереж нормальних і трансформованих клітин”, № держреєстрації 0104V000724, 2004-2006 рр. Робота виконувалась також у рамках вітчизняних конкурсних програм: 5-ти проектів Державного фонду фундаментальних досліджень, зокрема, „Вивчення функціонального стану рецепторних тирозинових протеїнкіназ та білків, асоційованих з ними, в регуляції процесів проліферації і диференціації клітин в культурі”, № 5/17, 1992-1993 рр.; „Дослідження ролі GTP-зв’язуючих білків (G-білків) в регуляції активності фосфоінозитидкіназ при стимуляції клітинної проліферації і диференціації”, № 5.2/73, 1993-1994 рр.; „Дослідження ролі тирозинспецифічного фосфорилювання білків у регуляції процесів проліферації і диференціації клітин в культурі”, № 5.3/436, 1994-1996 рр.; “Регуляція функціональної активності низькомолекулярних GDP/GTP-зв`язуючих Ras-подібних білків в процесі індукції диференціації лейкемічних клітин в культурі”, № 5.4/38, 1997-1998 рр.; „З’ясування біологічної ролі адаптерного білка Ruk в регуляції процесів проліферації, диференціації та апоптозу клітин людини і тварин”, № 05.07/00283, 2001-2005 рр.
Мета та завдання досліджень. Метою дослідження було з’ясувати особливості функціонування сигнальних мереж в нормальних і пухлинних клітинах на моделях зародків тварин, що розвиваються, та клітин у культурі, експериментально обґрунтувати гіпотезу стосовно критичної ролі стехіометрії адаптерних/риштувальних білків в надмолекулярних сигнальних комплексах у забезпеченні специфічності та інтенсивності внутрішньоклітинного сигналювання, дослідити сигнальні мережі, опосередковані SH3-вмісним адаптерним/ риштувальним білком Ruk, та проаналізувати експресію ізоформ Ruk у пухлинах людини.
Для досягнення поставленої мети було сформульовано такі основні завдання:
1) з’ясувати роль інсуліну і епідермального фактора росту (EGF) у регуляції процесів, що відбуваються в клітинах ранніх зародків костистої риби в’юна та ідентифікувати і охарактеризувати основні сигнальні ланки, які модулюються вказаними факторами росту;
2) дослідити динаміку сигнальних процесів в клітинах зародків в’юна на стадії пізньої бластули-ранньої гаструли в контролі та при дії інсуліну і EGF;
3) встановити здатність інгібітора тирозинових протеїнкіназ, анзаміцинового антибіотика гербіміцину А, і форболового ефіру, форбол-міристат-ацетату (РМА), інгібувати клітинний ріст, індукувати диференціацію і апоптоз Ph+-позитивних клітин еритролейкемії людини лінії К562;
4) проаналізувати роль і динаміку р210Bcr-Abl-залежних внутрішньоклітинних сигнальних шляхів в клітинах еритролейкемії людини лінії К562 та вплив на ці процеси гербіміцину А і форбол-міристат-ацетату;
5) виявити зміни в складі надмолекулярних комлексів, опосередкованих адаптерними білками Grb2 та р85?, регуляторною субодиницею РІ-3-кінази, при дії гербіміцину А і РМА на клітини К562;
6) ідентифікувати білки-партнери, які взаємодіють із SH3-вмісним адаптерним білком Ruk in vivo і in vitro, та домени адаптерного білка, залучені до взаємодії, дослідити роль доменної організації білка Ruk в регуляції його біологічної активності;
7) дослідити експресію адаптерного білка Ruk/CIN85 в пухлинах нирки людини;
8) показати роль стехіометрії адаптерних білків в надмолекулярних сигнальних комплексах в регуляції біологічної активності їхніх ефекторних мішеней.
Об’єкт дocліджeння: сигнальні мережі нормальних і пухлинних клітин.
Пpeдмeт дocліджeння: динаміка сигнальних процесів, білок-білкові взаємодії, опосередковані адаптерними/риштувальними білками, в організації та регулюванні сигнальних мереж клітин.
Методи дослідження: біохімічні, молекулярно-біологічні, молекулярної клітинної біології, цитологічні, імунофлуоресцентна мікроскопія.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше виявлені рецептори інсуліну і EGF в клітинах зародків в’юна на стадії ранньої гаструли, вивчено кінетичні параметри ліганд-рецепторної взаємодії. Показано, що ідентифіковані рецептори інсуліну і EGF є функціональними і зазнають автофосфорилювання, що стимулюється лігандами. Визначено молекулярну масу субодиниць рецептора інсуліну та рецептора EGF. Охарактеризовано провідні рецептор-чутливі сигнальні ланки, залучені до реалізації ефектів зазначених факторів росту. До них належать GTP-зв’язувальні білки, система обміну поліфосфоінозитидів плазматичних мембран, тирозинспецифічне фосфорилювання білків ембріональних клітин, S6-кіназна активність.
Вперше показано, що основною закономірністю сигнальних процесів в ранньому ембріогенезі є їх системний коливний характер, в той час як скерованість регуляторного впливу екзогенних поліпептидних факторів росту (ПФР) залежить від рівня активності сигнальних ланок в інтактних зародках (від пригнічення їхньої активності при високому рівні в контролі і, навпаки, до стимуляції – при низькому рівні в контролі).
Отримано оригінальні дані про те, що незалежно від експресії в клітинах К562 химерної тирозинової кінази р210Bcr-Abl, рівень її активності, фосфорилювання білків по тирозину та рівень активності ефекторних білків р21Ras і фосфатидилінозит-3-кінази (РІ-3-кінази) не підтримуються на постійному конститутивному рівні, а володіють коливним характером залежно від фази росту клітинної культури. Показано, що зміни в активності досліджуваних сигнальних ланок, індуковані інгібітором тирозинових протеїнкіназ гербіміцином А і РМА, є різноспрямованими і носять системний фазовий характер залежно від показників в інтактних клітинах за відсутності згаданих чинників.
Встановлено, що осциляції сигнальних процесів в лейкемічних клітинах К562 корелюють із змінами у складі р210Bcr-Abl-залежних надмолекулярних комплексів, опосередкованих адаптерними білками Сbl, Grb2, Shc і р85?, регуляторною субодиницею РІ-3-кінази. З’ясовано, що ці ж зміни визначають і направленість дії позаклітинних регуляторних сполук на рівень р21Ras-залежного і РІ-3-кіназного сигналювання.
Вперше показано, що регуляторна субодиниця РІ-3-кінази, білок р85?, та ендонуклеаза(и) є зв’язувальними партнерами адаптерного білка Ruk, ідентифіковано домени і мотиви, залучені до міжмолекулярної взаємодії, проаналізовано роль внутрішньомолекулярних взаємодій в регулюванні біологічної активності Ruk. Встановлено зниження експресії ортолога Ruk у людини, білка CIN85, у зразках світлоклітинної карциноми нирки людини (у 12 випадках з 20 досліджених) порівняно з умовно нормальними зразками.
Обґрунтовано та експериментально доведено критичну роль стехіометрії адаптерних білків в надмолекулярних сигнальних комплексах в регуляції біологічної активності їхніх ефекторних мішеней, специфічності та інтенсивності сигналювання. Розроблено концепцію про системний характер осциляцій сигнальних процесів в нормальних і пухлинних клітинах вищих евкаріот, які визначають просторово-часову скерованість регуляторного впливу позаклітинних сигнальних сполук. Отримані результати є важливим вкладом у розвиток теорії мережевої організації сигнальних процесів і мають загальнобіологічне значення.
Практичне значення одержаних результатів. З’ясування природи та механізмів міжмолекулярної взаємодії, критичної ролі стехіометрії адаптерних/риштувальних білків в надмолекулярних сигнальних комплексах у забезпеченні інтенсивності і специфічності сигналювання, виявлення зниження експресії Ruk/CIN85 в світлоклітинних карциномах нирки людини закладає теоретичні основи створення фармакологічних препаратів нового покоління, мішенями для яких стануть ключові центри організації сигнальних мереж клітин, адаптерні і риштувальні білки. Зокрема, розробка препаратів, здатних інгібувати взаємодію Grb2-Shc в клітинах хронічної мієлоїдної лейкемії може стати одним із перспективних методів лікування даного захворювання.
Очищені препарати рекомбінантних форм адаптерного білка Ruk використано для отримання поліклональних та моноклональних антитіл, які можуть стати основою для розробки специфічних діагностикумів та подальшого дослідження біологічної ролі Ruk у контролі сигнальних мереж клітин. Результати дисертаційної роботи рекомендуються для використання в загальному курсі „Молекулярна біологія клітини” та спецкурсі „Клітинне сигналювання” для студентів університетів зі спеціальностей „біохімія” та „молекулярна біологія”.
Особистий внесок здобувача. Вcі результати отримані здобувачем особисто або за безпосередньої участі. Дисертаційна робота – завершене дослідження, виконане автором відповідно до програм експериментальних досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 1986-2005 рр. Дисертантом особисто обґрунтовано концепцію роботи, розроблено методологію експериментальних досліджень, зроблено пошук та аналіз даних літератури, запропоновано робочі гіпотези, підготовлено до друку публікації. Основні положення і висновки дисертаційної роботи, сформульовані автором, обговорено разом із науковим консультантом – чл.-кор. НАН України Сибірним А.А. Робота проводилась в рамках держбюджетних та конкурсних тематик, які виконувались у відділі сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН України. Окремі фрагменти дocліджeнь були виконані на базі Людвігівського інституту ракових досліджень (Лондон, Велика Британія), Единбурзького університету (Велика Британія), Онкологічного центру М. Склодовської-Кюрі (Глівіце, Польша) та Інституту експериментальної біології ім. Ненцького (Варшава, Польша) під час наукових стажувань. У виконанні експериментів, описаних в розділі 3.1, брали участь співробітники відділу сигнальних механізмів клітини Ю.Р. Кошельник та В.С. Юрженко; розділі 3.2 – О.М. Ільницька, З.М. Гусак та Н.І. Ігуменцева; розділі 3.3 – к.б.н. Ю.Я. Кіт, к.б.н. Бобак Я.П., к.б.н. Маєвська О.М., В.Р. Дрель та Г.Ю. Шуваєва. Ідентифікацію доменів і мотивів, залучених до взаємодії між адаптерним білком Ruk і р85? регуляторною субодиницею РІ-3-кінази, здійснено у співробітництві з І.Т. Гутом та В.Л. Бухманом (Велика Британія). Співучасть співробітників відділу сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН України у виконанні роботи відмічена у спільних публікаціях.
Апробація результатів досліджень. Основні положення роботи доповідались і були представлені на вітчизняних та міжнародних конференціях і симпозіумах, зокрема: VП Всесоюзній нараді по ембріології (Ленінград, 1986), V Українському біохімічному з’їзді (Івано-Франківськ, 1987), ІV Всесоюзному з’їзді ендокринологів (Львів, 1987), Всесоюзній конференції „Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторные клетки” (Суздаль, 1988), Міжнародному симпозіумі по молекулярній і клітинній онкобіології (Таллін, 1988), Всесоюзній нараді „Актуальные вопросы клеточной биологии: факторы роста, дифференцировки, злокачественной трансформации” (Ленінград, 1989), Міжнародному симпозіумі по молекулярній і клітинній онкобіології (Львів, 1990), Радянсько-Фінському симпозіумі “Signal molecules and cell differentiation” (Суздаль, 1991), VІ Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1992), 12-му Міжнародному конгресі „International Society of Developmental Biologists” (Відень, 1993), 6-ій Весняній конфренції IMP “Interfaces between Cancer and Development” (Відень, Австрія, 1995), Конгресі Європейської організації з біології розвитку (Тулуза, Франція, 1995), VП Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997), ХХХV з’їзді Польського біохімічного товариства (Олштин, Польша, 1999), 3-ій, 4-ій і 5-ій Парнасівських конференціях (Львів, 2000; Вроцлав, Польша, 2002; Київ, 2005), VШ Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), Міжнародній конференції “Interactions in macromolecular assemblies” (Друскіненкай, Литва 1993), Всеукраїнській науково-практичній конференції „Біохімія” (Дніпропетровськ, 2003), Наукових конференціях в Глівіце “Gliwickie Spotkania Naukowe” (Глівіце, Польша, 2002, 2003), 29-ому Конгресі FEBS (Варшава, Польша, 2004), Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2005), 30-ому Конгресі FEBS (Будапешт, Угорщина, 2005).
Публікації. Зa тeмoю диcepтaції oпyблікoвaнo 57 poбіт, з яких 27 cтaтей y провідних фахових виданнях, 30 - тeзи дoпoвідeй у матеріалах міжнapoдниx та вітчизняних нayкoвиx конференцій, з’їздів, конгресів.
Cтруктура та обсяг дисертації. Дисертація містить тaкі poзділи: вcтyп, аналітичний oгляд літepaтypи, мaтepіaли тa мeтoди дocліджeнь, peзyльтaти власних дocліджeнь, аналіз та узагальнення peзyльтaтів дocліджeнь, виcнoвки тa cпиcoк викopиcтaниx джepeл. Диcepтaцію виклaдeнo нa 357 cтopінках мaшинoпиcнoгo тeкcтy і пpoілюcтpoвaнo 110 pиcyнками тa 4 тaблицями. Спиcoк використаних джерел oxoплює 465 нaймeнyвaнь.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. В огляді літератури детально висвітлено сучасний стан проблеми організації і функціонування сигнальних мереж клітини. Приведено дані стосовно доменної організації сигнальних білків та проаналізовано роль міжмолекулярних взаємодій у перетворенні та внутрішньоклітинному проведенні регуляторних сигналів. Особливу увагу приділено аналізу сигнальних мереж, опосередкованих онкобілком Bcr-Abl та SH3-вмісним адаптерним білком Ruk.
Матеріали та методи досліджень. У дисертаційній роботі викopиcтано такі ізотопи: H332PO4 (4625 Kі/мoль), мeтил-[3H]-тимідин (4250 Kі/мoль), Na125І без носія (15,7 Kі/мг), [?-32P]ATP (1000 Kі/мoль), [?-32P]GTP (15 Ki/ммоль), ("Iзoтoп", Pocія); [?-32P]GTP (20 Кi/ммоль), [32P]NAD+ (10 Кі/ммоль), (“Amersham”, Англія), [?-32P]ATP (4500 Кi/моль), (“NEN”, Бельгія).
Використано такі плазмідні вектори, сконструйовані для експресії в клітинах бактерій і ссавців: pGEX-2T/Grb2(full), pGEX-2T/Grb2-N-SH3, pGEX-2T/Grb2-C-SH3, pGEX-2T/p85?(full), pGEX-2T/p85б-SH3, pGEX-2T/Ruk-SH3A, pGEX-2T/Ruk-SH3B, pGEX-2T/Ruk-SH3C, pGEX-2T/Ruk-3SH3 (?казані вектори були надані проф. І. Гутом (UCL, Велика Британія); pGEX-4T/Ruks, pRc/CMV2, pRc/CMV2/Rukl, pRc/CMV2/Rukm, pRc/CMV2/Rukh, pCMV5/Rukl-Flag-tag, pCMV5/Rukm-Flag-tag, pCMV5/Rukh-Flag-tag, pCMV5/?Pro-Ruk-Flag-tag, pCMV5/?SH3-Ruk-Flag-tag (вказані вектори були надані проф. В. Бухманом (Кардіфський університет, Велика Британія); pBlueBac4 (”Invitrogen”, США). Рекомбінантні бакуловіруси, що експресували р85? та р110? субодиниці РІ-3-кінази були надані для роботи проф. М. Вотерфілдом (Людвігівський інститут ракових досліджень, Лондонське відділення, Велика Британія).
Інсулін горбуші був наданий к.б.н. Ю.І. Русаковим (Інститут еволюційної фізіології і біохімії ім. І.М. Сєченова РАН), EGF із слинних залоз мишей – к.б.н. Ю.Д. Іващенко (Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України), аглютинін з пpopocтків пшeниці (WGA), N-aцeтил-глюкoзaмін і гемоціанін мечехвоста – д.б.н. Лyцикoм M.Д. (Інститут біології клітини НАН України), холерний, кашлючний і ботулінічний токсини – к.б.н. М. Панченко (Російський кардіологічний науковий центр, Москва). Праймери для субклонування Glu-tag ізоформ кДНК Ruk були надані І. Гутом. [32Р]-мічені 32-mer та 24-mer олігодезоксинуклеотиди (ОДН) та 150-mer ОДН гену 5S рРНК Litechinus variagatus були надані д-ром Й. Ржешовська-Вольни (Онкологічний центр ім. М. Склодовської-Кюрі, Глівіце, Польща). Поліклональні анти-p21Ras антитіла були надані к.б.н. Н. Мазуренко (Російський онкологічний науковий центр, Москва), анти-Glu-tag антитіла – д-ром Л. Стефенсом (AFRC Інститут Бабрагама, Кембрідж, Велика Британія), а моноклональні анти-Ras антитіла клону Y13-259, моноклональні анти-р85б та поліклональні анти-Ruk антитіла проти 17-членного С-кінцевого пептиду Ruk – проф. І. Гутом .
У роботі також використано моноклональні анти-Erk антитіла (“Zymed Laboratories, Inc.”), поліклональні анти-с-Cbl, -Shc, -Abl антитіла (“Santa Cruz Biotechnology”, США); моноклональні анти-pTyr антитіла клону 4G10, кон’юговані з пероксидазою хрону (“Upstate Biotechnology Inc.”, США), клону RC20 (Transduction Laboratories”, США) та клону pY20 (“Santa Cruz Biotechnology”); анти-Flag антитіла (“Sigma”, США), кролячі антитіла проти IgG щура, анти-мишачі та анти-кролячі IgG, кон’юговані з пероксидазою хрону (“Promega”, США), анти-кролячі IgG, кон’юговані з FITC (“Pierce”, США); розчини для ЕCL детекції (“Amersham”, Велика Британія) та набори реактивів для виділення плазмідної ДНК “NucleoSpin System” (“NT”, Велика Британія) і “Qiagen plasmid Kit” (“Qiagen”, Німеччина); набір реактивів для ПЛР (“Fermentas”, Литва); набір реактивів для елюції фрагментів ДНК з агарозного гелю “QIAquick gel extraction kit” (“Qiagen”); набір реактивів для лігазної реакції “Takara ligase kit” (“Takara”, Японія); набори реактивів для рестриктазних реакцій (“Fermentas”); набір для отримання рекомбінантних бакуловірусів “Bac-N-BlueTM” (“Invitrogen”, США); реагент для трансфекції клітин комах “InsectinPlusTM” (“Invitrogen”); ДНК із сім’яників сперми лосося та ДНК Е. coli (“Sigma”).
Поліклональні анти-фосфотирозинові антитіла та антитіла до найменшої ізоформи Ruk, білка Ruks, що включає спільну для всіх ізоформ С-кінцеву суперспіралізовану ділянку, отримували шляхом імунізації кролів антигенами KLH-фосфотирозин і GST-Ruks, відповідно, з наступним афінним очищенням. Гібридому, що продукує моноклональні антитіла до SH3A домену Ruk, отримано в результаті соматичної гібридизації спленоцитів мишей, імунізованих GST-3SH3 фрагментом Ruk, з клітинами мієломи миші SP1.
В експериментах було використано зародки в'юна, які отримували з заплідненої ікри за методикою Коcтомарової (1964), та постійні лінії клітин К562 (хронічного мієлолейкозу людини), НЕК293 (ембріональної нирки людини), U937 (гістоцитарної лімфоми людини), NIH3T3 (фібробласти миші), Cos1 (фібробласти нирки зеленої африканської мавпи), L1210 (лейкемії миші), Ramоs (В-лімфоми людини), HELA S3 (аденокарциноми матки людини), MDCK (епітеліальні клітини Мадін-Дарбі нирки собаки), C6 (гліоми щура), A549 (аденокарциноми легень людини), С2С12 (міобласти миші) і SF9 (комах Spodoptera frugiperda). Клітини постійних ліній вирощували в середовищах DMEM або RPMI 1640 (“Sigma”, США) за присутності 10% ембріональної сироватки теляти (FBS) (“GibcoBRL”, Велика Британія), 2 мМ L-глутаміну, 50 МО/мл пеніциліну, 50 мкг/мл стрептоміцину (“GibcoBRL”) в зволоженій атмосфері з 5% СО2 при 370, а клітини SF9 – в середовищі IPL-41 (“GibcoBRL”) з додаванням 10% FBS, їстолату, концентрату ліпідів та гентаміцину (“GibcoBRL”) при 270С. Трансформовані бактерії E. coli штаму XL-1 Blue (“Stratagene”, США) вирощували в середовищі Luria – Bertani (LB) з ампіциліном (0,05 мг/мл), а бактерії штаму BL-21 (“Stratagene”, США) з екстраплазмідою резистентності до хлорамфеніколу – в середовищі LB з додаванням хлорамфеніколу та ампіциліну (0,02 і 0,05 мг/мл, відповідно) на шейкері при 370С. В дослідженнях використано клінічний матеріал після хірургічного видалення нирки з пухлинним ростом, який отримували в рамках співпраці з кафедрою урології Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького. Проаналізовано післяопераційний матеріал 20 хворих на рак нирки. За клінічними та гістологчними ознаками пухлини були верифіковані як світлоклітинний рак ІІ-ої та ІІІ-ої стадій. Визначення стадій проводили за класифікацією TNM (1997).
Блаcтодерми, ізольовані клітини та фракції плазматичних мембран виділяли згідно методик Луцика та cпівр. (1983, 1986). Концентрацію білка визначали за методом Петерсона (Peterson, 1977). Аналіз включення міченого [3Н]-тимідину в ДНК клітин бластодерм проводили, як описано в роботі (Юрженко і ін., 1993). Зв'язування [125І]-інcуліну та [125І]-EGF клітинами бластодерм в’юна аналізували згідно рекомендацій (Jackobs, 1979). Ковалентне зв'язування [125I]-інcуліну та [125І]-EGF білками плазматичних мембран зародкових клітин при допомозі диcукцинімідилcуберату здійснювали за модифікованою методикою Пілча та cпівр. (Pilch et al., 1979). Чаcткову очиcтку рецепторів інcуліну та EGF проводили афінною хроматографією на WGA-cефарозі за умов, які були запропоновані Вертбладом та cпівр. (Vertblad et al., 1977). Вивчення автофоcфорилювання рецепторів інcуліну і EGF проводили з використанням препарату глікопротеїнів, отриманого афінною хроматографією на WGA-cефарозі (Drobot et al., 1994). Включення 32P в поліфосфоінозитиди плазматичних мембран та їх аналіз здійснювали, як описано в роботі (Дробот і ін., 1991). GTP-зв'язувальні білки на нітроцелюлозних блотах ідентифікували за допомогою [?-32P]GTP, ADP-рибозилтранcферазну реакцію проводили за присутності кашлючного, холерного та ботулінового токсинів (Drobot et al., 1995). Часткову очистку S6 кінази з бластодерм в’юна здійснювали ступінчатою хроматографією на DEAE-целюлозі та гель-проникаючою хроматографією на сефадексі G-150. S6-кіназну реакцію проводили, використовуючи як субстрат 40S субодиниці рибосом із печінки щура. Рибосомні білки розділяли двовимірним електрофорезом в ПААГ згідно з протоколом (Kalshmidt & Wittman, 1970). Клітинні білки розділяли електрофорезом у градієнтному (5-17%) ПААГ за присутності SDS в буферній системі Леммлі (Laemmli, 1970). Імуноблотинг білків здійснювали після їх електропереносу з ПААГ на нітроцелюлозну або полівінілдифторидну мембрани згідно з рекомендаціями (Towbin, 1979). Імунорективні смуги білків на блотах виявляли за допомогою набору для підсиленої хемілюмінесценції (ECL).
Інтенсивність росту культури клітин К562 оцінювали, підраховуючи кількість клітин в камері Горяєва. Кількість мертвих клітин визначали після їх зафарбовування трипановим синім. Ступінь еритроїдної диференціації клітин К562, індукованих гербіміцином А (4·10-8 M) (“Sigma”) визначали за накопиченням гемоглобіну, підраховуючи % бензидин-позитивних клітин (Rowley et al., 1981). Мегакаріоцитну диференціацію індукували РМА (1,6·10-8 М). Апоптоз клітин лінії U937 індукували TNF-? (“Sigma”) в концентрації 10 нг/мл. Ступінь еритроїдної та мегакаріоцитної диференціації, наявність цитоархітектурних характеристик апоптозу оцінювали також за цитоморфологією клітин К562 і U937 після зафарбовування за методом Романовського-Гімзи (Лилли, 1969). Виділення та електрофоретичний аналіз клітинної ДНК проводили за методом (Herrmann, 1994). Співвідношення GTP/GDP в анти-Ras імунопреципітатах аналізували згідно з методиками, описаними в роботах (Karnitz et al., 1995; Satoh et al., 1990), з нашими модифікаціями (Drobot et al., 2005). Лізис клітин проводили як описано в роботі (Domin et al., 1996). Для імунопреципітації лізати клітин, стандартизовані за вмістом білка (1.3-1.5 мг), інкубували при постійному перемішуванні протягом 2 год при 40С з відповідними антитілами. Імунні комплекси осаджували за допомогою білок G-сефарози (“Pharmacia”, Швеція)/білок А-сефарози (“Pharmacia”) протягом 1 год при 40С з наступним імуноблотингом. Детекцію сигнальних білків на блотах здійснювали, використовуючи специфічні антитіла. Реакцію фосфорилювання Bcr-Abl in vitro проводили в анти-с-Abl імунопреципітатах лізатів клітин за присутності [?-32P]ATP. Мічені білки розділяли в SDS-ПААГ з наступною авторадіографією електрофореграм. Ступінь фосфорилювання Bcr-Abl in vivo оцінювали як описано в роботі (Ільницька і ін., 2003). Ліпідкіназну активність РІ-3-кінази аналізували в анти-р85? імунопреципітатах лізатів клітин К562 (Kilgour et al., 1996).
Білково-білкові взаємодії аналізували in vitro з використанням афінно очищених рекомбінантних GST-кон’югованих форм адаптерних білків: Grb2 (повнорозмірної форми та фрагментів, що відповідають N- та С-кінцевим SH3 доменам), регуляторної р85? субодиниці РІ-3-кінази (повнорозмірної форми та фрагменту, що відповідає SH3 домену), Ruk (А-, В-, С-SH3 доменів та фрагменту, що відповідає 3SH3 доменам). Білки клітинних лізатів, преципітовані за допомогою глутатіон-сефарози, розділяли в SDS-ПААГ з наступним імуноблотингом. Денситометричний аналіз результатів імуноблотингу здійснювали з використанням пакетів програм “Image Tool” та “GelPro”.
кДНК Rukl, що містила на С-кінці епітоп Glu-tag, отримували полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР). Отриману кДНК субклонували в pBlueBac4 “transfer” вектор за центрами пізнавання ендонуклеазами рестрикції BamH1 і EcoR1. Ізолювання рекомбінантних бакуловірусів і інфікування клітин комах Spodoptera frugiperda лінії SF9 здійснювали згідно з рекомендаціями фірми-виробника (“Invitrogen”, США). Для субклонування Glu-tagged l, m, і h ізоформ адаптерного білка Ruk у вектори для експресії в клітинах ссавців як матриці були використані вектори pRc/Rukl, pRc/Rukm та pRc/Rukh. Нуклеотидну послідовність, яка кодувала С-кінцевий фрагмент білків, модифікували за допомогою ПЛР. Сенсовий праймер для l і m ізоформ включав послідовність навколо ApaI центру, а для H форми – центр пізнавання для ендонуклеази рестрикції BamH1 і 5’-кінцеву послідовність. Антисенсовий праймер для всіх трьох ізоформ включав послідовності для ендонуклеаз рестрикції EcoRI і ApaI, стоп-кодону, Glu-tag епітопу та 3’-кінцевого фрагменту відповідних кДНК. Продукт ПЛР для h ізоформи білка Ruk субклонували у вектор pcDNA3.1 за центрами пізнавання ендонуклеазами рестрикції BamH1 і EcoR1. Плазмідну ДНК ізолювали з трансформованих клітин E. coli штаму XL1 Blue. Тимчасову трансфекцію клітин НЕК293 здійснювали за допомогою фосфату кальцію (Webster, 1999).
Glu-tagged форми білка Ruk, експресовані в бакуловірусній системі та в клітинах ссавців, очищали афінною хроматографією на білок G-сефарозі, ковалентно кон’югованій з моноклональними анти-Glu-tag антитілами за допомогою диметилпімелімідату (“Sigma”).
Механізми взаємодії між білком Ruk та регуляторною р85? субодиницею РІ-3-кінази вивчали in vivo в бакуловірусній системі експресії. Вплив адаптерного білка Ruk на РІ-3-кіназну активність вивчали in vitro з використанням очищених препаратів рекомбінантних білків. Для аналізу субклітинної локалізації білка Ruk клітини імунофлуоресцентно забарвлювали згідно рекомендацій (Pyrzynska et al., 2002) з використанням перших поліклональних анти-Ruks антитіл та других FITC-кон’югованих анти-кролячих антитіл. Актиновий цитоскелет специфічно забарвлювали TRITC фаллоїдином або Alexa Fluor 546 фаллоїдином (Sabala et al., 2002). Контрастування ядерного хроматину клітин здійснювали шляхом забарвлення DAPI (Li and Benezra, 1996). Конфокальну мікроскопію отриманих препаратів проводили за допомогою конфокального мікроскопа TCS SP2 під управлінням програмного забезпечення Leica Confocal Software 2.0. Сканування здійснювали при довжинах хвилі збудження 494 нм для FITC (аргон-іонний лазер), 543 нм для TRITC фаллоїдину (гелій-неон-іонний лазер) та 368 нм для DAPI (аргон-іонний лазер).
ДНК-зв’язувальні білки в афінно очищених препаратах Glu-tagged ізоформ білка Ruk детектували методом затримки в гелі [Protic et al., 1993]. Для дослідження ДНК-гідролізуючої активності препаратів рекомбінантних білків як субстрати використовували 32Р-мічені олігодезоксирибонуклеотиди та плазмідну ДНК. Для передбачення можливих партнерів, залучених до білково-білкової взаємодії з Ruk, специфічних послідовностей та характеристик досліджуваного білка, його субклітинної локалізації були використані програми: GenRaner 3.00; PredictProtein (); PSORT II ( seqanal/interfaces/psort2.html).
Тотальну РНК із зразків умовно нормальних і пухлинних тканин нирки людини виділяли гуанідинтіоціанатним методом (Маниатис и др., 1984). Для Нозерн-гібридизації використовували 32Р-мічений зонд клону 3Е7 кДНК гену ruk (Gout et al., 2000). Рівень експресії ізоформ Ruk/CIN85 на рівні білка вивчали в Тритон Х-100-розчинних екстрактах відповідних зразків методом імуноблотингу. Імуногістохімічні дослідження зразків нирки проводили на парафінових зрізах за схемою непрямого методу виявлення антигенів із застосуванням авідин-біотинової системи та пероксидази як ферментної мітки згідно зі стандартними протоколами. Отримані препарати аналізували під мікроскопом Axioplan (Zeiss, Німеччина) із застосуванням імерсійного об’єктиву (х100).
Всі експерименти проводили 3-5 разів. В роботі наведено середні значення величин і стандартні похибки (М±m). Статистичний аналіз проводили, користуючись критерієм Ст’юдента (t); вірогідними вважали дані у разі р<0,05. Побудову графіків та статистичну обробку даних здійснювали за допомогою програм Origin 4.0 та Excel 97.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Закономірності функціонування сигнальних мереж, залучених до регуляції проліферації і диференціації клітин зародків в’юна (Misgurnus fossilis L.). Однією з експериментальних моделей для вивчення сигнальних мереж, залучених до регуляції проліферації клітин і координованих змін активності генів протягом диференціації, є ембріони тварин, що розвиваються. Зародкові клітини, особливо на ранніх стадіях розвитку володіють мультипотентними властивостями і здатні як диференціюватися в певному напрямку залежно від індуктивного оточення, так і давати початок ембріональним карциномам (Piersma et al., 1989; Smith, 1987; Mummery et al., 1991). Наявні дані дозволяють вважати, що поліпептидні фактори росту (ПФР), які синтезуються ембріональними клітинами, та зміна чутливості до сигнальних сполук у процесі розвитку відіграють провідну роль у підтриманні тонкого балансу між інтенсивністю проліферації, скерованістю клітинної диференціації та програмованою клітинною смертю. Ключовим моментом на шляхах реалізації регуляторних ефектів ПФР в клітинах-мішенях є їхня взаємодія зі специфічними рецепторами клітинної поверхні. Хоча до початку наших робіт в зародках різних видів тварин на ранніх етапах розвитку були виявлені інсулін і IGF типів І і ІІ, речовини з активністю TGF?- і ?-типів, FGF (Heath & Smith, 1989; Кусень і ін., 1983), дані про кінетичні параметри ліганд-рецепторної взаємодії та молекулярну природу рецепторів ПФР, які експресуються в клітинах зародків на стадії пізньої бластули-ранньої гаструли, в літературі були відсутні. Не були також вивчені і охарактеризовані сигнальні процеси, які опосередковують ефекти ПФР на проліферацію і диференціацію та їхня динаміка.
Роботу здійснювали на ізольованих клітинах зародків костистої риби в’юна, отриманих на стадії ранньої гаструли (10-12 год розвитку) (Костомарова, 1975). Нами виявлено, що ембріональні клітини специфічно та оборотно зв’язують [125I]інсулін та [125I]ЕGF. При 19С рівновага між вільними та зв’язаними з клітинами радіолігандами досягалась до 2-ої год інкубації. При цьому рівень зв’язування прямо пропорційно залежав від кількості клітин в інкубаційному середовищі в діапазоні від 2 до 20 х 106 клітин/мл. Як видно з рис. 1, а, б, насичення центрів зв’язування інсуліну та ЕGF на поверхні клітин зародків в’юна спостерігається при концентрації лігандів в інкубаційному середовищі вище 40 та 12 нМ, відповідно. Під час оцінки параметрів інсулін-рецепторної взаємодії ми виходили з моделі, яка передбачає наявність двох класів рецепторів (Гребенщиков и Мошковский, 1986): І – з високою спорідненістю і низькою зв’язувальною ємністю; ІІ – з низькою спорідненістю і високою зв’язувальною ємністю. При цьому константи дисоціації (Kd) для двох класів існулінзв’язувальних центрів становлять 7,3 х 10-11 та 9,9 х 10-9 М з кількістю рецепторів на клітину 115 12 та 4640 370 (рис. 1, а). За даними аналізу Скетчарда рецептори ЕGF представлені одним класом з Kd 0,72 х 10-9 М та кількістю 5460 105 рецепторів на клітину (рис. 1, б).
Афінне мічення білків плазматичних мембран клітин зародків в’юна [125I]міченими лігандами показало, що інсулін зв’язується з білками з молекулярною масою 125 та 115 кДа, які відповідають -субодиниці рецептора інсуліну, а ЕGF – з білком з молекулярною масою 180 кДа. Ця взаємодія є специфічною, оскільки усувається за присутності надлишку немічених лігандів (рис. 1, в, г). Цікаво, що в плазматичних мембранах печінки в’юна інсулін зв’язується переважно з білком з молекулярною масою 130 кДа.
в-?убодиниця рецептора інсуліну та рецептор ЕGF є тирозинспецифічними протеїнкіназами, здатними до ліганд-стимульованого автофосфорилювання. У свою чергу, фосфорилювання внутрішньоклітинного каталітичного домену рецепторів по специфічних залишках тирозину супроводжується зростанням ферментативної активності по відношенню до екзогенних субстратів (Yarden & Ullrich, 1988). Цю властивість ми використали для виявлення функціональної активності досліджуваних алостеричних ферментів, тобто їх здатності до трансмембранного перетворення регуляторного сигналу. З рис. 1, д, е видно, що в препараті мембранних глікопротеїнів, очищених хроматографією на WGA-сефарозі, інсулін у залежний від дози спосіб стимулює фосфорилювання білка з молекулярною масою 97 кДа, що відповідає -субодиниці інсулінового рецептору, а ЕGF – білка з молекулярною масою 180 кДа. Слід відзначити також інсулінозалежне посилення фосфорилювання білків з молекулярною масою 60, 64 та 110 кДа, які очевидно є потенційними субстратами кінази рецептора інсуліну.
Специфічні рецептори багатьох сигнальних сполук, зокрема ПФР, спряжені в мембрані з надзвичайно гетерогенною групою GTP-зв’язувальних білків (G-білків), що належать до надродини високоафінних GTPаз (Birnbaumer et al., 1990; Satoh et al., 1992) і виконують роль молекулярних „перемикачів” в процесі
Рис. 1. Клітини ранніх зародків в’юна експресують функ-ціональні рецептори інсуліну і EGF: кінетика специфічного зв’язування [125I]-інсуліну (а) та [125I]-EGF (б) в коорди-натах Скетчарда; (в) кова-лентне мічення білків плазма-тичних мембран клітин зародків і печінки дорослих особин в’юна [125I]-інсуліном (1-4) та [125I]-EGF (5-6) за допомогою дисукцинімідилсуберату:1,2,5,6-плазматичні мембрани клітин зародків в’юна; 3,4-плазматичні мембрани печінки в’юна; 2,4,6- афінне мічення за присутності надлишку відповідних немічених лігандів; (г) вплив інсуліну і EGF на фосфорилювання білків плазматичних мембран клітин зародків в’юна, очищеному афінною хрома-тографією на WGA-сефарозі. К - контроль
трансмембранного перетворення регуляторних сигналів (Bourne et al., 1991). Згідно з отриманими даними (Drobot et al., 1995), уявне значення Km для GTP плазматичних мембран зародкових клітин складає 6,7.10-7 М, що відповідає Km відомих спрягаючих білків. Ідентифіковано субстрат ADP-рибозилтрансферазної активності кашлючного токсина, білок з молекулярною масою 39 кДа, який відповідає Gб0-субодиниці (Birnbaumer et al., 1990), та субстрати ботулінового екзоферменту С3, білки з молекулярною місою 26 і 28 кДа, які відносяться до підродини Rho/Rac SMG білків (Hall, 1990; Braun et al., 1989). Експресію вказаних SMG білків в ранньому ембріогенезі в’юна підтверджено методом GTP-блотингу, в той час як гомолог білка Ras був ідентифікований методом імуноблотингу (Drobot et al., 1995). Дані про високий рівень експресії ряду специфічних G- і SMG-білків в ранньому ембріогенезі в’юна узгоджуються з їхньою функціональною значимістю.
Для з’ясування особливостей функціонування сигнальних мереж, з точки зору ефективності внутрішньоклітинного перетворення регуляторного сигналу, можна використати тестування ряду внутрішньоклітинних параметрів після взаємодії ПФР з клітиною-мішенню. За умов in vivo до цих параметрів відноситься в першу чергу індекс мічення клітин [3H]-тимідином. Включення [3H]-тимідину в ДНК зародкових клітин вивчали протягом 9-15 год розвитку.
З графіка, представленого на рис. 2, а, видно, що рівень включення [3H]-тимідину в ДНК значно в ідрізняється на досліджуваних етапах ембріогенезу, а
Рис. 2. Включення 3H-тимідину в ДНК зародків в’юна протягом 9-15 год розвитку: контрольні бластодерми (а); при дії інсуліну та EGF (б); залежність включення [3H]–тимідину в ДНК зародків в’юна від концентрації інсуліну на 10 год (в) та на 12 год (г) розвитку.
динаміка цього процесу володіє коливальним характером. Найбільш високий рівень включення [3H]-тимідину спостерігається на 12 год розвитку, в той час як значне зниження індексу мічення – на 10 год розвитку. Виявлені зміни свідчать про стадієспецифічну регуляцію синтезу ДНК, а, отже, і мітотичну активність клітин в ранньому ембріогенезі. Зниження синтезу ДНК співпадає з двома основними морфогенетичними подіями, які відбуваються протягом гаструляції і на початку нейруляції – індукцією мезодерми (10 год розвитку) і нейроектодерми (13 год розвитку). Встановлено (рис. 2, б), що інсулін (10-6М) і EGF (10-9М) пригнічують включення міченого тимідину в ДНК на стадіях, що характеризуються відносно високою мітотичною активністю клітин зародків в’юна (85 і 70% від контролю, відповідно, на 12 год розвитку). В періоди з відносно низьким мітотичним індексом інсулін і EGF, навпаки, посилюють цей процес: 136%, 185% (при дії інсуліну) та 110%, 118% (при дії EGF) порівняно з контролем на 11 і 13 год розвитку, відповідно). Необхідно
