НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут молекулярної біології та генетики

____________________________________________________________________

ДЗЯДЕВИЧ Сергій Вікторович

УДК 577.15 + 543.6 + 543.9 + 543.55 + 621.314

Системний аналіз взаємозв’язків біоселективних елементів із мініатюрними електрохімічними перетворювачами в біосенсориці

03.00.20 - біотехнологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

К и ї в - 2005

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в лабораторії біомолекулярної електроніки відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (м. Київ).

Науковий консультант | доктор біологічних наук, професор, академік НАН України

Єльська Ганна Валентинівна,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

директор інституту, завідувач відділу механізмів трансляції генетичної інформації

Офіційні опоненти | доктор біологічних наук, професор

Говорун Дмитро Миколайович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

заступник директора з наукової роботи, завідувач відділу молекулярної біофізики

доктор біологічних наук, професор

Дмитренко Микола Петрович,

Інститут екогігієни та токсикології імені Л.І. Медведя МОЗ України, завідувач лабораторії біохімії

доктор хімічних наук, професор

Ульберг Зоя Рудольфівна,

Інститут біоколоїдної хімії імені Ф.Д. Овчаренка НАН України, директор інституту, завідувач відділу колоїдної технології природничих систем

Провідна установа | Національний університет харчових технологій МОН України, кафедра біотехнології мікробного синтезу, м. Київ

Захист дисертації відбудеться 22 листопада 2005 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (03143, Київ-143, вул. Заболотного, 150).

Автореферат розіслано _21 жовтня___ 2005 року

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради

к.б.н. О.В.Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біосенсорика – це новітня галузь аналітичної біотехнології, одним із основних напрямків якої є розробка електрохімічних біосенсорів. Найважливішими з характерних ознак біосенсорів є їхня висока чутливість та селективність, простота у використанні та швидкість аналізу, а також широкий діапазон речовин, що можуть бути детектовані. Це визначає можливість, а скоріше, необхідність, їхнього застосування практично в усіх галузях людської діяльності, включаючи медицину, фармацевтичне, харчове, біотехнологічне та хімічне виробництва, сільське господарство, охорону довкілля, тощо. Порівняно з існуючими аналітичними методами вони можуть забезпечити швидкий, надійний, чутливий та дешевий аналіз різноманітних сполук.

Біосенсор завжди складається з двох основних частин - біоселективного елемента, що відповідає за розпізнавання і трансляцію інформації із біологічного домену в хімічний чи фізичний вихідний сигнал з відповідною чутливістю, та перетворювача, який відповідає за трансляцію цього сигналу в електричний домен та його перетворення в аналітично доступну інформацію. Електрохімічні перетворювачі поділяють на потенціометричні, амперометричні та кондуктометричні. Останнім часом основну увагу приділяють перетворювачам, для виготовлення яких застосовують сучасні досягнення мікроелектронної технології. Інтерес до використання таких перетворювачів обумовлений високою чутливістю та селективністю, відсутністю необхідності у технологічно складному електроді порівняння, здатністю до мініатюризації та високого рівня інтеграції, можливості створення мультисенсорів та розміщення на одному кристалі перетворювача разом зі схемою обробки інформаціі; а головне - низькою собівартістю при масовому виробництві. Це робить економічно вигідним навіть одноразове використання таких датчиків та значно розширює сферу застосування біосенсорів, зокрема в польових умовах, і може дати значний економічний ефект при подальшому їхньому впровадженні в практику.

Незважаючи на швидке зростання протягом останніх 20 років кількості робіт у галузі створення біосенсорів, більшість із них є емпіричними і тому основні переваги біосенсорів не завжди використовуються з максимальною ефективністю. О.П.Солдаткін один із перших започаткував роботи з розробки загальних науково-технологічних засад створення біосенсорів. Ці дослідження запровадили більш системний підхід до розробки біосенсорів, але стосувалися переважно біологічної частини сенсорів.

На початку досліджень із розробки якогось конкретного біосенсора перед науковцями завжди постає питання про вибір найефективнішого типу перетворювача для забезпечення найкращих аналітичних характеристик отриманих датчиків та можливості подальшої роботи розроблених приладів у реальних умовах проведення аналізів. У більшості випадків цей вибір відбувається без ґрунтовного аналізу можливостей різних систем перетворення сигналу, специфічних особливостей перетворювачів та біоселективного матеріалу.

Таким чином проведення системного теоретичного та експериментального аналізу роботи різних електрохімічних мініатюрних перетворювачів та застосування їх у біосенсорах залежно від поставлених завдань та вибраного біологічно-чутливого елемента, а також різностороннє вивчення прикладних аспектів практичного застосування створених біоаналітичних приладів є актуальним.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт лабораторії біомолекулярної електроніки відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України і виконувалася під загальним керівництвом академіка НАН України Г.В.Єльської та д.б.н., професора О.П.Солдаткіна в рамках таких тем: „Розробка наукових засад створення біосенсорів на основі кондуктометричних перетворювачів” (НДР НАНУ, № держ. реєстрації 0195U005362, 1995-98 рр.); „Розробка нетрадиційних підходів до створення селективних елементів біоелектронних систем” (НДР НАНУ, № держ. реєстрації 0199U000660, 1999-2002 рр.); „Розробка монобіосенсорів та сенсорних масивів для аналізу забруднення навколишнього середовища та харчових продуктів” (НДР НАНУ, № держ. реєстрації 0101U008008, 2001-04 рр.)4 „Розробка нових підходів для створення амперометричних біосенсорів для потреб біотехнології” (НДР НАНУ, № держ. реєстрації 0103U000074, 2003-07 рр.); „Розробка біосенсорів нового покоління для аналізу та контролю біотехнологічних процесів” (НДР Міністерства України з питань науки та технологій № 2/1119-97, № держ. реєстрації 0197U005638, 1997-99 рр.); „Development of new enzymatic kits and microbiosensors for ecological monitoring of formaldehyde pollution” (INTAS Grant No 96-1971, 1996-98 рр.), „Development of enzyme multisensor arrays for ecological monitoring of toxic agents” (NATO Linkage Grant ENVIR.LG972305, 1998-2000 рр.); „Development of novel electrochemical biosensors for glycoalkaloids determination in foodstuffs and biological samples” (INTAS Grant No 00-0151, 2001-03 рр.); „Novel technology for fermentation process monitoring and quality control of alcoholic beverages based on enzyme electrodes and kits” (INTAS Grant No 00-0751, 2001-04 рр.); „Оцінка загальної токсичності основних класів екологічних забруднювачів та продуктів їхньої деградації у водних розчинах за допомогою класичних та новітніх аналітичних методів” (НДР Міністерства освіти і науки України № Ф7/291-2001, № держ. реєстрації 0103U008705, 2001-05 рр.); „Розробка монобіосенсорів та сенсорних масивів для біотехнології та харчової промисловості” (НДР Міністерства освіти і науки України № ДП/224-2003, № держ. реєстрації 0103U008703, 2003-05 рр.); „Оцінка токсичності поверхневих вод за допомогою біосенсорів на основі водоростів” (НДР Міністерства освіти і науки України № М/122-2003, № держ. реєстрації 0103U008707, 2002-04 рр.) та „Development of novel conductometric biosensors” (Collaborative NATO Linkage Grant 979775, 2003-05 рр.).

Метою роботи було проведення системного теоретичного та експериментального аналізу взаємозвязків біоселективних елементів з мініатюрними електрохімічними перетворювачами для їхнього ефективного застосування в біосенсориці та подальшого практичного використання.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі наукові завдання:

ь Вивчити особливості роботи різних типів перетворювачів та порівняти їхню ефективність для реєстрації фізико-хімічних сигналів, генерованих при взаємодії біоселективного елемента з аналізованою сполукою, залежно від матеріалу, форми і розмірів електродів та умов проведення експериментів.

ь Проаналізувати функціонування різноманітних біоселективних елементів біосенсорів з точки зору їхнього застосування з різними типами електрохімічних перетворювачів та здійснити пошук закономірностей в процесах формування біоселективних шарів і шляхів оптимального поєднання біологічного матеріалу з поверхнями електрохімічних перетворювачів.

ь Створити лабораторні прототипи деяких біосенсорних пристроїв і розробити оптимальні алгоритми проведення аналізу. Відібрати серед розроблених біосенсорних прототипів такі, що найповніше відповідають вимогам практичного застосування для їхнього технологічного опрацювання та подальшого впровадження.

ь Розробити фундаментальні та технологічні засади створення мультисенсорних і мультиферментних систем, вивчити шляхи математичної обробки масивів даних з метою розпізнавання образу складної біологічної або хімічної суміші.

Об’єкт дослідження: взаємозв’язки біологічних елементів з електрохімічними перетворювачами.

Предмет дослідження: мініатюрні електрохімічні перетворювачі як складова частина біосенсорів.

Методи дослідження: високоефективна рідинна хроматографія, імпедансна спектроскопія, вольтамперометрія, люмінесцентні та флуорометричні біометоди, біохімічні методи.

Комплексний характер досліджень із використанням сучасних експериментальних методів, проведення експериментів у автоматизованому режимі, комп’ютерна обробка результатів та їхній аналіз на базі розроблених теоретичних моделей, гарна відтворюваність експериментальних даних та їх узгодженість із теоретичними розрахунками забезпечували достовірність одержаних результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено всебічний теоретичний аналіз фізико-хімічних процесів, що мають місце на межі розподілу фаз у комірках із різними типами електрохімічних перетворювачів та біоселективних мембран, вибрано найкращий дизайн, оптимальні матеріали і геометрію для кожного типу перетворювачів, визначено умови подальшого їхнього використання в біосенсорах.

Вперше функціонування різноманітних біоселективних елементів біосенсорів проаналізовано з точки зору застосування кожного з них із різними типами електрохімічних перетворювачів. Зроблено висновок про вибір найкращого перетворювача для кожного з досліджених біоселективних елементів, визначено шляхи покращення їхніх аналітичних характеристик для подальшої роботи з реальними зразками.

Вперше проведено порівняння роботи низки ферментних електрохімічних біосенсорів на основі холінестераз різного походження з традиційними методами аналізу токсинів та показано високу кореляцію отриманих результатів, що дозволяє говорити про реальну можливість їхнього практичного застосування.

Вперше показано, що використовуючи ацетилхолінестеразний біосенсор для визначення загальної токсичності водних розчинів, можна проводити попередній скринінг не тільки токсинів, а й продуктів їхньої деградації, що часто неможливо зробити, використовуючи загальноприйняті методи.

Використовуючи сучасний математичний апарат для обробки масивів даних, а саме - дискримінантний функціональний аналіз, вперше створено концепцію мультибіосенсора для визначення різних токсичних речовин на основі інгібіторного ферментного аналізу.

Вперше для розробки лабораторного прототипу кондуктометричного біосенсора для визначення лужної фосфатазної активності використано природну мультиферментну систему зелених мікроводоростів Chlorella vulgaris. При цьому ферменти функціонують у своїх природних оптимальних умовах і можна оцінити вплив на їхні властивості різних токсинів.

Наукове значення роботи полягає в тому, що вперше розроблено загальну стратегію вибору мініатюрних електрохімічних перетворювачів у біосенсориці, яка враховує всі аспекти створення біосенсорів, починаючи з виробництва самих перетворювачів, іммобілізації біологічного матеріалу на їхню поверхню, розробки протоколів аналізу для роботи з модельними розчинами та в реальних умовах. З точки зору розвитку біомолекулярної електроніки ці результати дозволяють по-новому підходити до створення новітніх біосенсорів, суттєво зменшуючи час і витрати на виконання таких розробок.

Практичне значення одержаних результатів полягає в розробці наукових та технологічних засад застосування різних мініатюрних електрохімічних перетворювачів у біосенсориці та оптимізації аналітичних характеристик отриманих біосенсорів для їхнього практичного використання.

Проведено детальне дослідження ефективності роботи різних типів електрохімічних перетворювачів та порівняння їхніх характеристик при реєстрації фізико-хімічних сигналів. Для кожного з перетворювачів розроблено практичні рекомендації щодо найкращого дизайну, оптимальних матеріалів та схем вимірювань, які було використано при їхньому виробництві як в Україні, так і за кордоном.

Створено діючі лабораторні прототипи ферментних електрохімічних біосенсорів та розроблено протоколи експериментального визначення концентрацій цілої низки метаболітів та токсинів. Роботу частини цих датчиків було перевірено з реальними зразками, вперше вироблено практичні рекомендації щодо вибору кращих перетворювачів, що враховують саме прикладні аспекти використання біосенсорів у повсякденній практиці. Отримані результати дозволяють реально застосовувати розроблені біосенсори в медицині, екології, біотехнології та харчовій промисловості.

Вперше показано принципову можливість створення мультибіосенсора для визначення різних токсичних речовин на основі ферментного інгібіторного аналізу. Застосовуючи розроблений протокол вимірювань та запропоновану математичну обробку даних, можна проводити якісний і напівкількісний аналіз одразу кількох токсичних речовин у розчині.

Вперше розроблено лабораторний прототип кондуктометричного біосенсора на основі зелених мікроводоростів Chlorella vulgaris.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок дисертанта є визначальним на всіх етапах дослідження. Дисертаційну роботу сплановано і виконано здобувачем, в основному, самостійно. Всі експериментальні дослідження проводились здобувачем особисто або за його безпосереднього керівництва та участі в проведенні експериментів. Основні положення і висновки сформульовано разом із науковим консультантом, академіком НАН України Г.В. Єльською. Теоретичні загальні огляди написані автором особисто, а в узагальнювальних роботах, де підсумовано та проаналізовано власні експериментальні дослідження, автору належать: ідея публікації, обговорення отриманих результатів, основне навантаження у написанні робіт. Основні результати експериментальних досліджень із розробки біосенсорів на основі глюкозооксидази, уреази, алкогольоксидази, холінестераз, тирозинази та мікроводоростів отримані особисто автором. Частина експериментальних робіт із розробки мультисенсорів, біосенсорів для визначення іонів важких металів, пеніциліну, пестицидів, формальдегіду, глікоалкалоїдів та етанолу виконані в тісному співробітництві з д.б.н., проф. О.П. Солдаткіним, к.б.н., с.н.с. В.М. Архиповою, к.б.н., с.н.с. Я.І. Корпаном, к.б.н., с.н.с. О.А. Білоіван, к.ф.-м.н. О.А. Шульгою, м.н.с. Л.В. Шкотовою, м.н.с. О.А. Назаренко, м.н.с. О.М. Щувайло, professor J.-M. Chovelon, professor N. Jaffrezic-Renault, professor C. Martelet, doctor T. Mai Anh, doctor C. Chouteau, результати досліджень опубліковано в спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідалися і обговорювалися на таких конференціях: 7 Європейський конгрес з біотехнології (Ніца, Франція, 1995), Світові конгреси „Biosensors’96” (Бангкок, Таїланд, 1996), „Biosensors’2000” (Сан-Діего, США, 2000) та „Biosensors’04” (Гранада, Іспанія, 2004); NATO Workshop з біосенсорів для прямого моніторингу забруднювачів довкілля (Смоленіца, Словаччина, 1997) та з новітніх напрямків у розробці біосенсорів (Київ, Україна, 1998); Міжнародні конференції „Eurosensors ХIII” (Хагує, Нідерланди, 1999), „Eurosensors ХIV” (Копенгаген, Данія, 2000), „Eurosensors ХVI” (Прага, Чехія, 2002), „Eurosensors ХVII” (Гімарез, Португалія, 2003) та „Eurosensors ХVIII” (Рим, Італія, 2004); 8 Міжнародна конференція з хімічних сенсорів (Базель, Швейцарія, 2000); 51 Міжнародна конференція з іоно-селективних електродів (Варшава, Польща, 2000); 31 Конгрес французського товариства з пестицидів (Ліон, Франція, 2001); 16 Міжнародний симпозіум з біоелектрохімії та біоенергетиці (Братислава, Словаччина, 2001); 1 та 2 Чорноморські конференції з аналітичної хімії (Одеса, Україна, 2001 та Станбул, Туреччина, 2003); Міжнародні конференції “MADICA-2001” (Хамамет, Туніс, 2001) та “MADICA-2004” (Туніс, Туніс, 2004); SENSPOL Workshop (Лондон, Англія, 2002); Міжнародна конференція „Функціональні матеріали: синтез, властивості та застосування” (Київ, Україна, 2002); Міжнародна конференція з аналітичної хімії (Поліхнітос, Греція, 2002); Український біохімічний з’їзд (Чернівці, Україна, 2002); 69 Конференція молодих вчених, аспірантів і студентів “Розроблення, дослідження і створення продуктів функціонального харчування, обладнання та нових технологій для харчової та переробної промисловості” (Київ, Україна, 2003); 5 Міжнародна конференція з фізики та високих технологій (Хамамет, Туніс, 2003); 7 Міжнародна конференція з стану водних екосистем (Ліон, Франція, 2003); 3 Міжнародна конференція з інструментальних методів аналізу (Цесалонікі, Греція, 2003); Конференція молодих вчених, аспірантів та студентів з молекулярної біології (Київ, Україна, 2003); Міжнародний симпозіум з біосенсорів для контролю харчових продуктів та моніторингу довкілля (Маракеш, Мароко, 2003); Наукові дні французських інженерів (Дурдан, Франція, 2003); 7 Європейська конференція з оптичних хімічних сенсорів та біосенсорів (Мадрид, Іспанія, 2004); Міжнародна конференція з сенсорів, електроніки та мікросистемних технологій (Одеса, Україна, 2004); 9 Міжнародний колоквіум французського товариства з біоелектрохімії (Серет, Франція, 2004); 8 Міжнародна конференція з холінестераз (Перуджія, Італія, 2004), 2 Міжнародний симпозіум по розумним артефактам та біосистемам (Ліон, Франція, 2005).

Публікації. Основні результати дисертації опубліковані в 40 наукових статтях (4 статті – одноосібні), 1 патенті та 7 розширених працях міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, експериментальної частини, що складається із 4 розділів, аналізу і узагальнення результатів та висновків. Її обсяг складає 340 сторінок друкованого тексту, враховуючи 135 рисунків та 20 таблиць. Перелік цитованої літератури містить 509 найменувань.

Основний зміст

Матеріали і методи дослідження. В роботі використoвували такі препарати: глюкозооксидаза з Penicillium vitale з активністю 130 од.акт./мг виробництва фірми “Діагностикум” (Львів, Україна); ацетилхолінестераза з електричного вугря з активністю 292 од.акт./мг та бутирилхолінестераза з сироватки крові коня з активністю 13 од.акт./мг виробництва фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim, Germany); уреаза із бобів сої з активністю 31 од.акт./мг виробництва фірми „Fluka” (Germany); алкогольоксидаза з Hansenula pоlymorpha з специфічною активністю 6 од.акт/мг білка, люб’язно надана д-ром Т. Гібсоном (Університет м.Лідс, Англія); тирозиназа з грибів з активністю 6680 од. акт./мг виробництва фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim, Germany). Також в роботі використовували сироватковий альбумін бика (БСА) та 25 % розчин глутарового альдегіду фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim, Germany).

Субстрати глюкоза, сечовина, ацетилхолін хлорид, бутирилхолін хлорид, параформальдегід, 4-хлорофенол, фенол, катехол були виробництва фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim, Germany).

Як токсичні речовини, що використовували для аналізу через інактивацію ферментів, були фосфорорганічні пестициди: трихлорфон [(dimethyl–2,2,2-trichlor–1–hydroxyethyl)-phosphonat], діізопропіл-фторфосфат, параоксон-етил [diethyl-p-nitrophenyl phosphate], параоксон-метил [O,O-dimethyl-O-(4-nitrophenyl)-phosphate], паратіон-метил [(O,O-dimethyl-O-(4-nitrophenyl)-phosphorothiate] фірми „Riedel-de-Haen (Швейцарія)”; карбаматний пестицид карбофуран [2,3–dihydro–2,2–dimethylbenzofuran–7–yl N-methylcarbamate] фірми „Riedel-de-Haen” (Швейцарія), глікоалкалоїди -чаконін, -соланін з паростків картоплі, томатін, демісидін, езерін та аглікони соланідин з паростків картоплі, томатідін (3-Hydroxy-5-tomatidane), соласодін (Solasod-5-en-3-ol), атразин (2-хлор-4-етиламін-6-ізопропіламін-1,3,5-триазин), діурон (3-(3,4-дихлорофеніл)-1,1-диметилуреа), бромоксиніл (3,5-дибром -4-гідроксибензонітрил), дезетилатразин (2-амін-4-хлор-6-ізопропіламін-1,3,5-триазин) і дезізопропілатразин (6-хлор-N-етил-1,3,5-триазин-2,4-діамін) фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim, Germany). Для інактивації уреази іонами важких металів використовували водні розчини таких солей: Hg(NO3)2, Cu(NO3)2, Pb(NO3)2, Co(NO3)2, Cd(NO3)2, AgNO3, Sr(NO3)2.

Матеріали для створення біоселективних та додаткових мембран: нафіон - катіонообмінний полімер (5 % в суміші низько-молекулярних аліфатичних спиртів та 10 % води, продукт № 27.470-4) та полі(4-вінілпіридин-ко-стирен) полімер (ПВП), продукт № 19,207-4) були поставлені фірмою „Aldrich Chem. Co.” (США).

Як робочий буфер використовували калій-фосфатний розчин (КН2РО4-NaOH) вітчизнянного виробництва. Всі інші реактиви були вітчизняного та імпортного виробництва і мали кваліфікацію “ос.ч.” чи “х.ч.”.

Результати досліджень та обговорення.

Технологічні та методологічні основи розробки електрохімічних перетворювачів. Дуже важливим питанням розробки біосенсорів після вибору необхідного типу перетворювача є, перш за все, вибір найбільш ефективного для нього дизайну, розмірів і матеріалу. Було досліджено аналітичні характеристики та ефективність роботи різних електрохімічних перетворювачів. Ці дослідження були спрямовані як на розробку найбільш чутливих перетворювачів, так і на пошук можливості зниження їхньої собівартості.

Найефективнішим перетворювачем для створення кондуктометричних біосенсорів є гребінчастий тонкоплівчастий електрод - мініатюрний датчик на основі двох гребінчастих металевих електродів для вимірювань провідності шару розчину, який знаходиться безпосередньо біля поверхні електродів та визначається їхніми характеристичними розмірами. В роботі було розроблено та досліджено цілу низку кондуктометричних перетворювачів (рис. 1).

Дуже важливим моментом при виробництві перетворювачів є підбір оптимального матеріалу самих гребінок. З одного боку, він повинен бути дешевим, а з іншого - мати необхідну чутливість до зміни провідності розчину. Використовуючи метод імпедансної спектроскопії, проведено серію експериментів, в яких порівнювали датчики, гребінки яких були виготовлені з різних металів.

Рис. 1. Зовнішній вигляд кондуктометричних перетворювачів, виготовлениих в Інституті мікроелектроніки м.Ньюшатель, Швейцарія (1), Київському радіозаводі, Україна (2, 8), Інституті хемо- та біосенсорики м.Мюнстер, Німеччина (3, 4), Науково-дослідному Інституті “Мікроприлад”, м.Київ, Україна (5, 6, 7)

Отримано ряд пріоритетності різних матеріалів для створення кондукто-метричних біосенсорів: платина > золото > нікель > мідь > хром > титан > алюміній.

Проведено також експерименти для дослідження структур, виготовлених на різних підкладинках. Показано, що матеріал підкладинки не впливає на чутливість датчика до зміни провідності середовища. Основна вимога, що повинна до нього висуватися, – це його електронепровідність. З технологічної точки зору найзручніше використовувати скло, тому що це, з одного боку, найдешевший матеріал, а з іншого - найменш крихкий.

Наступна важливе завдання - визначення характеристичних розмірів електродів. Для цього проведено експерименти з дослідження впливу розмірів „пальців” гребінок та відстані між ними на чутливість датчиків. Зроблено висновок, що мініатюризація не потребує технологічно складного збільшення кількості „пальців” на електроді за рахунок зменшення їхніх розмірів. Мініатюризацію доцільно проводити шляхом рівномірного зменшення як робочої поверхні електроду, так і характеристичних розмірів електродів. Основну роль при виборі розмірів сенсора відіграє співвідношення між товщиною мембрани, характеристичними розмірами електродів та їхньою активною площею.

Результати досліджень використано при виробництві кондуктометричних перетворювачів у різних установах. Кращі характеристики продемонстрували перетворювачі, які виготовлені на Київському радіозаводі та в Інституті хемо- і біосенсорики (м.Мюнстер, Німеччина). Саме перетворювачі такого дизайну запропоновано для створення серійних кондуктометричних біосенсорів.

Наступна частина роботи присвячена дослідженню різних перетворювачів для створення амперометричних біосенсорів, а саме - різноманітних вуглецевих та металевих електродів, виготовлених за сучасними технологіями, а також їхньому порівняльному аналізу. В основі роботи амперометричного біосенсора лежить вимірювання сили струму через електрохімічну комірку при постійному потенціалі за наявності в зразку електрохімічно активних речовин.

Перший крок при здійсненні пошуку оптимальних матеріалів і оцінки технології виготовлення електродів - вивчення серійної стабільності різних типів амперометричних перетворювачів. Адже погана відтворюванність електрохімічних властивостей від електроду до електроду може зробити малоперспективною подальшу розробку біосенсора на його основі, навіть при непоганих характеристиках окремих представників серії. Було досліджено та використано перетворювачі, які наведено на рис. 2.

Рис. 2. Зовнішній вигляд електродів, що використовували як амперометричні перетворювачі: графітовий стрижень в оболонці (1), графітовий стрижень без оболонки (2), амперометричний електрод „Ива” на твердій основі (3), амперометричний електрод „Ива” на гнучкій основ (4) та платиновий дисковий електрод (5)

Показано, що майже всі розглянуті графітові перетворювачі мають досить великий розкид значень та невелике співвідношення “відгук/фон”. Найкращі співвідношення “відгук/фон” отримано для платинових дискових електродів. Зроблено висновок про небажаність використання більшості розглянутих перетворювачів для створення амперометричних ферментних біосенсорів через низьке співвідношення “відгук/фон”. Особливо це стосується графітових електродів, які, до того ж, мають погану серійну стабільність. В той же час наведені результати не нівелюють переваг графіту як електродного матеріалу, бо графітові перетворювачі досить часто потребують попередньої хімічної та/або електрохімічної обробки. Така процедура покращує їхні електрохімічні характеристики, але деяким чином ускладнює роботу з ними. Іншим можливим рішенням є використання диференційного режиму вимірювань, що дозволяє значно підвищити відношення “відгук/фон”. Встановлено, що платина є більш придатним електродним матеріалом, ніж графіт. Але необхідно було знайти на її основі більш ефективніший перетворювач сигналу, бажано виготовлений за допомогою високотехнологічного промислового виробництва, оскільки в більшості випадків саме лабораторне ручне виготовлення електродів є причиною низьких електрохімічних якостей розглянутих перетворювачів.

Ми зосередили увагу на металевих гребінчастих планарних електродах, виготовлених методом вакуумного напилення. Було визначено, що оптимальним матеріалом для виробництва таких електродів є платина, для підкладинки - кремній, а найоптимальніша ширина „пальців” та відстань між ними - 10 мкм.

Для створення ультрамікробіосенсорів для визначення in vivo одними із найперспективніших є амперометричні мікроелектроди на основі вуглецевого волокна. Показано, що для таких електродів необхідна обов’язкова електрохімічна передобробка, після якої чутливість і стабільність таких перетворювачів різко збільшується.

Окрім того, досліджено перетворювачі на основі рН-чутливих польових транзисторів. Для цього необхідно було дослідити роботу напівпровідникових структур при розміщенні їх у водних розчинах, вибрати кращий матеріал, з огляду на його рН-чутливість і стабільність, а після отримання рН-чутливих польових транзисторів, - вивчити їхні аналітичні характеристики та вибрати кращі варіанти для подальшої розробки потенціометричних біосенсорів на їхній основі.

Найкращі результати отримано для діелектрика, що складається з термічної плівки SiO2 товщиною біля 40 нм і плівки Si3N4 товщиною близько 100 нм. Необхідно також підкреслити, що деякі інші недоліки діелектрика впливають на стабільність системи, збільшуючи дрейф і унеможливлюючи проведення тривалих досліджень. Але найкращі результати також були отримані для діелектрика, що складається з термічної плівки SiO2 і плівки Si3N4.

З урахуванням отриманих нами даних, в НДІ "Мікроприлад" (м. Київ, Україна) було розроблено та виготовлено сенсорний чіп на основі рН-чутливих польових транзисторів (рН-ПТ). Крім того, в роботі були досліджені рН-ПТ інших виробників, деякі з них розроблені згідно наших рекомендацій (рис. 3).

Рис. 3. Загальний вигляд рН-ПТ, виготовлених в НДІ “Мікроприлад”, м.Київ, Україна (1), лабораторією LAAS CNRS, м.Тулуза, Франція (2), підприємством ESIEE, м.Париж, Франція (3) та в Інституті матеріалознавства, м.Ханой, В’єтнам (4)

Було показано, що найкращу рН-чутливість мають перетворювачі, які виготовлені в НДІ “Мікроприлад” (рН-чутливість близько 50 мВ/рН). Крім того, вони також мали кращу стабільність при роботі та невеликий дрейф вихідного сигналу з часом. Саме ці датчики і були, в основному, використані для створення потенціометричних біосенсорів на основі рН-чутливих польових транзисторів.

Таким чином, з точки зору технології виробництва найпростішими є кондуктометричні і амперометричні перетворювачі. Технологія виробництва рН-чутливих польових транзисторів є більш складною та специфічною. Але амперометричні перетворювачі потребують використання електроду порівняння, а це ускладнює систему аналізу. А якщо мати на увазі інтегральний електрод порівняння, то це значно ускладнює технологію виробництва перетворювачів. Тому з точки зору тільки технології виробництва та складності системи вимірювань кращими є кондуктометричні перетворювачі. Основні наукові результати опубліковано в працях [12, 17, 35, 39].

Біоселективні елементи електрохімічних сенсорів: принципи роботи, вибір перетворювача, іммобілізація та оптимізація аналітичних характеристик. Друга важлива і невід’ємна частина кожного біосенсора – це біоселективний елемент. Основну увагу, перш за все, було зосереджено на вивченні роботи низки ферментів (глюкозооксидоза, ацетилхолінестераза, бутирилхолінестераза, уреаза, -лактамаза, алкогольоксидаза, тирозиназа, трипсин, тощо) з метою отримання загальних закономірностей та обмежень використання різних типів електрохімічних перетворювачів при розробці відповідних біосенсорів. Крім того, пильну увагу приділяли пошуку закономірностей в процесах формування біоселективних шарів і шляхів оптимального поєднання біологічного матеріалу з поверхнями електрохімічних перетворювачів з точки зору простоти та технологічності виконання самої процедури, максимального збереження активності біомолекул, забезпечення високої щільності та просторової орієнтації їх на поверхні.

Можливості використання різних перетворювачів при створенні біосенсорів можна продемонструвати на прикладі реакції ферментативного перетворення глюкози, яка лежить в основі роботи біосенсорів для визначення глюкози (рис. 4).

Рис. 4. Загальна схема ферментативної реакції гідролізу глюкози та варіанти використання для створення глюкозного біосенсора різних типів перетворювачів

Із наведеної схеми можна бачити, що використовуючи різні етапи та складові однієї і тієї ж ферментативної реакції гідролізу глюкози, ми можемо застосовувати амперометричні датчики на основі як визначення кисню, так і перекису водню, чи кондуктометричні датчики для визначення зміни провідності, а також потенціометричні біосенсори на основі рН-чутливих польових транзисторів.

Розроблені біосенсори на основі глюкозооксидази і різних перетворювачів продемонстрували подібні аналітичні характеристики. Динамічний діапазон роботи кондуктометричного та потенціометричного біосенсорів був дещо вужчим за діапазон роботи амперометричного біосенсора. До того ж, на відміну від амперометричного біосенсора, їхні відгуки більше залежать від умов вимірювання.

Вузький діапазон роботи глюкозних біосенсорів на основі всіх типів електрохімічних перетворювачів пояснюється лімітуванням ферментативної реакції киснем - косубстратом цієї реакції. Було запропоновано та перевірено цілий ряд можливих шляхів розширення динамічного діапазону роботи глюкозного біосенсора. Наприклад, використання фериціаніду калію як окислювального реагенту в біокаталітичному окисленні глюкози забеспечує збільшення відгуку біосенсора в 10 - 100 разів та значне розширення його динамічного діапазону.

При використанні додаткових мембран різної природи, які наносяться зверху ферментативної мембрани для модифікації сенсора, кондуктометричний та потенціометричний глюкозні біосенсори розширюють динамічний діапазон роботи датчика до 10 мМ з незначним зменшенням чутливості до субстрату та стають менш чутливими до зміни буферної ємності та іонної сили середовища. Використання додаткової нафіонової мембрани у випадку амперометричного глюкозного біосенсора значно зменшує чутливість біосенсора до аскорбінової кислоти, яка присутня в багатьох біологічних рідинах і спричиняє неспецифічний відгук сенсора. Це є великою перевагою, бо дозволяє проводити аналіз глюкози в реальних зразках in vitro та in vivo.

Стабільність глюкозного сенсора не залежить від перетворювача, а визначається, в першу чергу, стабільністю ферментної мембрани. Біосенсори продемонстрували хорошу операційну стабільність протягом кількох днів, що дозволяло провести 200-300 вимірів глюкози на одному датчику. Зниження величини відгуку з часом складало близько 4 % за добу. При зберіганні біосенсора у сухому вигляді при температурі 4 С, він демонстрував стабільність протягом більше, ніж 3 місяців.

Наступним предметом дослідження були біосенсори на основі холінестераз. В основі їхньої роботи лежать такі ферментативні реакції:

Під час цих двох реакцій генеруються протони, що призводить до зміни рН чи провідності мембрани. Це дає змогу використовувати кондуктометричні датчики для визначення зміни провідності, чи потенціометричні біосенсори на основі рН-чутливих польових транзисторів. Стосовно амперометричних біосенсорів, то під час цих реакцій не продукуються електроактивні сполуки. Це унеможливлює використання амперометричних перетворювачів для створення сенсорів.

Перш за все було показано, що за допомогою холінестеразних біосенсорів можна визначати концентрацію ацетилхоліну і бутирилхоліну як субстратів та цілої низки інгібіторів – таких, як фосфорорганічні пестициди та стероїдні глікоалкалоїди. Залежності ступеня інгібування іммобілізованих бутирилхолінестерази (БуХЕ) та ацетилхолінестерази (АцХЕ) від концентрацій -чаконіну та параоксон-метилу наведено на рис. 5. Видно, що біосенсор на основі БуХЕ значно чутливіший до -чаконіну, ніж біосенсор на основі АцХЕ. Для інших типів стероїдних алкалоїдів, таких як -соланін, соланідін та томатін були отримані подібні результати. На противагу цьому (рис. 5б), потенціометричний біосенсор на основі АцХЕ більш чутливий до фосфорорганічних пестицидів, ніж сенсор на основі БуХЕ. Аналогічні результати були отримані і для кондуктометричних біосенсорів.

Проведено оптимізацію роботи кондуктометричного і потенціометричного біосенсорів на основі холінестераз для визначення концентрацій токсичних речовин на основі зворотнього і незворотнього механізмів інгібування. Обидва типи розроблених біосенсорів демонстрували аналітичні характеристики, придатні для практичного застосування при кількісному визначенні фосфорорганічних і карбаматних пестицидів (табл.1) та глікоалкалоїдів.

а б

Рис. 5. Залежність рівня інгібування іммобілізованих БуХЕ (1) та АцХЕ (2) від концентрацій -чаконіну (а) та параоксон-метилу (б). Відгуки на додавання 1 мМ (а) та 2 мМ (б) концентрацій субстрату виміряні в 5 мМ фосфатному буфері, рН 7,4

Таблиця 1

Динамічний діапазон розроблених біосенсорів для визначення пестицидів |

Динамічний діапазон, M

Кондуктометричний біосенсор | Потенціометричний біосенсор

АцХЕ | БуХЕ | АцХЕ | БуХЕ

Діізопропилфтор-фосфат | 5,010-11 –1,010-7 | 5,010-11 –5,010-7 | 3,010-11 –5,010-7 | 5,010-11 –1,010-7

Параоксон-етил | 1,010-8 –5,010-5 | 5,010-7 –5,010-5 | 1,010-6 –5,010-5 | 5,010-7 –5,010-5

Параоксон-метил | 5,010-7 –5,010-5 | 5,010-6 –5,010-5 | 1,010-6 –5,010-5 | 5,010-6 –5,010-5

Трихлорфон | 3,010-7 –1,010-5 | 5,010-7 –1,010-5 | 2,010-7 –1,010-5 | 1,010-6 –1,010-5

Паратіон-метил | 5,010-6 –1,010-4 | 1,010-5 –1,010-4 | 1,010-5 –1,010-4 | 2,010-5 –1,010-4

Карбофуран | 2,010-6 –1,010-4 | 1,010-6 –1,010-4 | 2,010-6 –1,010-4 | 1,010-6 –1,010-4

Рис. 6. Відтворюваність та стабільність БуХЕ біосенсора на основі ІСПТ. Вимірювання були проведені в 5 мМ фосфатному буфері, рН 7,2, концентрація БуХ - 1 мМ

Досліджені пестициди можна розмістити за силою їхнього інгібування у такий ряд: діізопропілфторфосфат > параоксон-етил > трихлорфон > параоксон-метил > карбофуран > паратіон-метил.

Також було показано, що БуХЕ інгібується різними стероїдними глікоалкалоїдами в діапазоні концентрацій від 1 мкМ до 100 мкМ з мінімальною границею їхнього визначення, що складала 0,2 мкМ.

Всебічно досліджено відтворю-ваність біосенсорів на основі холінестераз, операційну стабільність та стабільність при зберіганні (рис. 6). Відгуки біосенсора добре відтворювані, відносне стандартне відхилення складає 3 %. Дослідження операційної стабільності показало, що біосенсор залишається стабільним протягом доби з відносним зменшенням сигналу близько 1 % за день. При зберіганні сенсора в 5 мМ фосфатному буфері, рН 7,5 при температурі 4 C, біосенсор залишається стабільним більше, ніж 5 місяців.

Наступним етапом дослідження було продовження робіт з розробки біосенсорів на основі уреази. В основі їхньої роботи лежить така ферментативна реакція:

Під час цієї реакції йде поглинання протонів, що призводить до зміни рН, а також генерації додаткових іонів (амоній та HCO3-), що разом із поглинанням протонів призводить до зміни провідності мембрани. Це дозволяє використовувати кондуктометричні перетворювачі для визначення зміни провідності чи потенціометричні біосенсори на основі рН-чутливих польових транзисторів. Стосовно амперометричних біосенсорів, то під час цієї реакції не продукуються електроактивні речовини. Це унеможливлює використання амперометричних перетворювачів для визначення сечовини.

Динамічні діапазони роботи потенціометричних і кондуктометричного уреазних сенсорів для визначення сечовини майже збігаються і їхня верхня межа не перевищує 3 мМ. Показано, що величина відгуку сенсорів залежить від умов середовища, а саме - буферної ємності, рН, іонної сили. Це є певним недоліком, бо потребує врахування цих критеріїв при розробці протоколів аналізу.

В табл. 2 наведено динамічні діапазони біосенсорів на основі уреази для аналізу важких металів. Визначення більш низьких концентрацій іонів важких металів можливе при збільшенні часу преінкубації біосенсора з інгібітором.

Таблиця 2

Динамічний діапазон розроблених уреазних біосенсорів для аналізу важких металів |

Динамічний діапазон, M

Кондуктометричний біосенсор | Потенціометричний біосенсор

Hg2+ | 1,010-6 – 5,010-5 | 1,010-6 – 5,010-5

Ag+ | 2,010-6 – 7,010-5 | 2,010-6 – 7,010-5

Cu2+ | 2,010-6 – 1,010-4 | 2,010-6 – 1,010-4

Cd2+ | 5,010-6 – 2,010-4 | 5,010-6 – 2,010-4

Co2+ | 1,010-5 – 5,010-4 | 1,010-5 – 5,010-4

Pb2+ | 2,010-5 – 5,010-3 | 2,010-5 – 5,010-3

Sr2+ | 1,010-4 – 5,010-3 | 1,010-4 – 5,010-3

Аналітичні характеристики біосенсорів на основі двох перетворювачів практично однакові як з точки зору мінімальної границі визначення, так і динамічного діапазону роботи. Досліджені іони важких металів можна розмістити за силою їхнього інгібування уреази у ряд: Hg2+ > Ag+ > Cu2+ > Pb2+ > Cd2+ > Co2+ > Sr2+.

Розглянуто кілька підходів для розширення динамічного діапазону роботи кондуктометричних та потенціометричних уреазних біосенсорів та поліпшення їхніх аналітичних характеристик, а саме - використання напівпроникних додаткових мембран різної природи, застосування специфічного реагенту тетраборату натрію, який є конкурентним інгібітором уреази, використання препарату уреази з генетично модифікованим активним сайтом.

Рис. 7. Калібрувальні криві уреазного біосенсора на основі ІСПТ для визначення сечовини в 10 мМ фосфатному буфері, рН 7,4 без додавання у розчин (1) та з додаванням 0,125 мМ (2), 0,25 мМ (3) та 0,5 мМ (4) тетраборату натрію

З рис. 7 видно, що при збільшенні концентрації тетраборату натрію в розчині, зменшується величина відгуку біосенсора для низьких концентрацій субстрату та збільшується його динамічний діапазон роботи до 25 мМ сечовини. Мінімальна границя визначення в цьому випадку зсувалася з 0,05 мМ до 1 мМ сечовини. Ефект інгібування зворотній і біосенсор повністю відновлює свої характеристики після відмивання його фосфатним буфером.

Дуже цікавим завданням було спробувати використати у біосенсорі новий фермент – рекомбінантну уреазу з E.coli з генетично модифікованим активним сайтом.

Біосенсор функціонував в широкому діапазоні визначення сечовини з 1 мМ до 80 мМ в розчині. Це цілком покриває рівень сечовини в крові як при нормальному стані людини, так і при дисфункції нирок. Крім того, біосенсор демонструє дуже високу відтворюванність результатів і високу стабільність. Аналітичні характеристики біосенсора дозволяли зробити висновок про можливість його застосування в медицині для прямого безперервного визначення сечовини в плазмі крові чи діалізному розчині.

Наступна завдання - створення біосенсора на основі іммобілізованої алкогольоксидази (АОХ). У присутності кисню (косубстрату ферментативної реакції) відбувається окислення етанолу з утворенням продуктів реакції ацетальдегіду та перекису водню, який можна визначати за допомогою амперометричного перетворювача.

Для створення біосенсора для визначення формальдегіду можна також використати алкогольоксидазу. В цьому випадку має місце така ферментативна реакція:

Під час реакції генеруються протони, що призводить до зміни рН чи провідності мембрани, тому можна використовувати кондуктометричні датчики для визначення зміни провідності чи біосенсори на основі рН-чутливих польових транзисторів. Також генерується перекис водню, що дозволяє використовувати амперометричні електроди.

Калібрувальні криві для визначення формальдегіду лінійні в діапазоні концентрацій 5 - 300 мМ для всіх типів перетворювачів. Але абсолютні значення величин відгуків у випадку потенціометричного сенсора дуже низькі, близькі до межі визначення таким перетворювачем. Це може ускладнити роботу біосенсорів. Також показано, що тільки потенціометричний і кондуктометричний біосенсори мають високу селективність до формальдегіду і не відповідають на додавання метанолу, етанолу, глюкози та гліцеролу.

Подальші дослідження були спрямовані на оптимізацію аналітичних характеристик кондуктометричного формальдегідного біосенсора як найбільш перспективного в плані прикладного використання.

Показано, що основні робочі характеристики формальдегідного кондуктометричного біосенсора на основі алкогольоксидази можна змінювати завдяки використанню різних буферних розчинів та різного часу іммобілізації алкогольоксидази в парах глутарового альдегіду (рис. 8). Калібрувальні криві для формальдегідного біосенсора, отримані в буферних розчинах з різною буферною ємністю, демонструють однакову верхню, але різну нижню межу визначення формальдегіду. Нижня межа визначення в 1 мМ фосфатному буфері складає 0,05 мМ (0,15 ppm) формальдегіду, що є достатнім для використання в екологічному моніторингу.

Для різного часу іммобілізації алкогольоксидази (рис. 9) спостерігали зсув калібрувальних кривих біосенсора як для низьких, так і високих концентрацій формальдегіду. У випадку тривалого часу іммобілізації зменшення величини відгуку та розширення діапазону роботи сенсора для високих концентрацій субстрату може бути пов’язане з формуванням великої кількості ковалентних зв’язків між глутаровим