КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Федотов Євген Рудольфович

УДК: 577.336: [616-008.853+616.155.3]

Вивчення функціонального стану лейкоцитів за допомогою кількісної люмінесценції із застосуванням акридинового оранжевого в комплексі імунологічних методів при різних патологіях

спеціальність 03.00.09 - імунологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі імунології та біохімії Запорізького національного університету Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: | доктор медичних наук, професор,

завідуючий кафедрою імунології та біохімії

Фролов Олександр Кирилович,

Запорізький національний університет

Міністерства освіти і науки України

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, професор, головний науковий співробітник

Стародуб Микола Федорович,

Інститут біохімії ім. В.О. Палладіна НАН України

доктор медичних наук, професор, член-кор. НАН України, зам. директора по науковій роботі

Гольцев Анатолій Миколайович,

Інститут проблем кріобіології та кріомедицини НАН України

Провідна установа: | Луганський державний медичний університет МОЗ України

Захист дисертації відбудеться “29” березня 2005 р., о 16.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського національного університету імені Тараса Шеченка за адресою: м. Київ, просп. Акад. Глушкова, 2/12; біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет; т. 252-16-48.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ім. М.Максимовича Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033, м. Київ,
вул. Володимирська, 58)

Автореферат розісланий 25 лютого 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Молчанець О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Відомо, що прогрес в області наукових досліджень тісно пов’язаний з розробкою і впровадженням нових методів дослідження. Особливо це стосується клінічної імунології, де набір широко доступних і використовуваних методичних прийомів не такий вже і великий та не завжди достатньо інформативний (Петров Р.В., 2003; Ярилин А.А., 2001; Фролов В.М., 2003). За допомогою переважної більшості застосовуваних в імунології методів можна визначати кількісні характеристики імунокомпетентних клітин або їхню потенційну функціональну активність у культурі на мітогени або антигени (Фролов О.К., 1993; Чумак, А.А., 1998; Чернушенко Е.Ф., 1998; Пинегин Б.В., 2001). Все ж таки ці методи не завжди адекватно віддзеркалюють характер і рівень реактивності даних клітин в організмі. У зв'язку з цим, пошук більш інформативних імунологічних тестів залишається актуальним (Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н., 1995; Хаитов Р.М., 2000; Лебедев К.А., Понякина И.Д., 2000; Тотолян А.А., 2001; Лебедев К.А., 2001; Фролов О.К., 2003).

Життєдіяльність клітин, їх будова, функція і патологія тісно поєднана зі станом та метаболізмом нуклеїнових кислот. На сьогодні можливість люмінесцентно-мікроскопічного аналізу стану нуклеїнових кислот в фіксованих клітинах, оброблених акридиновим оранжевим та деякими іншими діамінопохідними акридину, не викликає сумнівів. Такий підхід і дозволяє значно збагатити арсенал функціональних імунологічних тестів (Карнаухова Н.А., Сергиевич Л.А. та ін., 2001; Полетаев А.И., 2001). Так, акридиновий оранжевий за своїми фізико-хімічними властивостями відноситься до двохвильових люмінофорів, що дозволяє оцінювати метаболізм як одно- так і двохланцюгових молекул нуклеїнових кислот (Шурдов М.А., 1982; Карнаухова Н.А., 2001). Оскільки люмінесцентні барвники – мітки є дуже тонким і чутливим інструментом дослідження, тому їх широке застосування вимагає ретельного визначення конкретних умов. Лише при їх строгому визначенні та детальній характеристиці біологічного об'єкта можна одержати за допомогою люмінесцентного методу цінні і надійні результати (Завгородняя Е.Г., 1993; Карнаухова Н.А., 2001; Полетаев А.И., 2002).

З’вязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження початі в 1992 році. Дана робота проводилася в рамках держбюджетної теми №04/91 "Розробка критеріїв оцінки функціональної активності лімфоцитів в організмі людини і тварин і їх імунокорекція" (№ держреєстрації 01910054345). Надалі ці дослідження були продовжені при виконанні держбюджетної теми № 4/97 "Вивчення впливу конституціональних особливостей антиген-структурного поліморфізму на гомеостатичну функцію імунної системи на ранніх етапах онтогенезу в умовах забрудненого навколишнього середовища" (№ держреєстрації 0197U012790), та 4/00 "Розробка і впровадження патогенетичного підходу до аналізу стану імунної системи в організмі людини і тварин на різних етапах" (№ держреєстрації 0100U001725).

Мета дослідження. Вивчення можливості люмінесцентного методу визначення активності лейкоцитів крові в організмі людини з застосуванням акридинового оранжевого (АО) для розробки деяких підходів для патогенетичного аналізу стану імунної системи.

Задачі дослідження:

1. Порівняти інформативність показників люмінесценції лімфоцитів крові, пофарбованих АО: інтенсивність люмінесценції при довжині хвилі
530 нм (І530), 640 нм (І640), -параметр (І640/І530) та індекси люмінесценції
(ІЛ 640 = І640 клітини / І640 фону; ІЛ 530 = І530 клітини / І530 фону).

2. Підвищити об'єктивність люмінесцентної мікроскопії з застосуванням АО за рахунок зниження погрішностей, пов'язаних із люмінесценцією фону, при роботі в різних режимах фотоелектроного множувача (ФЕМ) люмінесцентних мікроскопів та при експрес-аналізі активності білок-синтетичної системи лейкоцитів крові для скринуючих клінічних досліджень.

3. За допомогою люмінесцентного аналізу з застосуванням АО дослідити роль імунної та нейроендокринної систем в розвитку загального адаптаційного синдрому при операційному лікуванні у хірургічних хворих при різних патологіях, а також оцінити стан імунної системи в онкологічних хворих.

4. За допомогою кореляційного аналізу оцінити патогенетичний зв'язок показників інтенсивності люмінесценції лімфоцитів, пофарбованих АО, з частотою популяцій лімфоцитів, фенотипованих моноклональними антитілами, та оцінених іншими патогенетичними методами.

Об?єкт дослідження. Лейкоцити крові здорових і хворих осіб в динаміці хірургічного лікування, лімфоцити в стимульованій ФГА культурі.

Предмет дослідження. Визначення люмінесцентних ознак активації лейкоцитів, флуорохромованих АО, дослідження інформативності цих ознак в порівнянні з іншими імунологічними методами.

Методи дослідження. Гематологічні методи оцінки кількості лейкоцитів, визначення відносного та абсолютного складу окремих видів лейкоцитів, ФГА-стимульована культура лімфоцитів, виділення лімфоцитів на фікол-верографіновому градієнті, флуорохромування лейкоцитів АО, люмінесцентне мікроскопіювання, тест Е-РУК з обраховуванням авідності Т-лімфоцитів до ерітроцитів барана, цитогенетичний та цитоморфометричний тести, непрямий варіант визначення поверхневих антигенів лімфоцитів за допомогою МКАТ (CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD25), радіоімуний метод визначення концентрації кортизолу та гормонів тіреоїдного комплексу.

Наукова новизна отриманих результатів. Проведено люмінесцентний аналіз функціональної активності лейкоцитів крові людини з застосуванням АО. Доведено інформативну значимість I 640 нм і незастосовність для дослідження активності диференційованих лейкоцитів периферичної крові I  нм і -параметру.

Запропоновано застосування люмінесцентного методу з АО за різних клінічних умов для визначення імунного статусу людини: заміна аутоплазми на ембріональну телячу сироватку (ЕТС), що дозволяє контролювати світіння фону; введення індексів люмінесценції (ІЛ), що дозволяє порівнювати результати люмінесцентних досліджень, отриманих при різних рівнях напруги на ФЕМ і на різних мікроскопах; готування мазків-відбитків, що дозволяє сумарно оцінювати білок-синтетичну активність лімфоцитів.

Вперше в клінічній імунології визначена функціональна активність імунної системи під час операційної травми за допомогою патогенетичного підходу, що дозволяє враховувати основні стадії імуногенезу: активацію, проліферацію, диференціювання і міграцію лімфоцитів. Проведено оцінку імунного статусу при антистресорному анестезіологічному захисті в умовах хірургічного лікування при різної локалізації патологічного процесу.

Вперше проведено аналіз патогенетичного зв'язку показників інтенсивності люмінесценції лімфоцитів, пофарбованих АО, із частотою популяцій лімфоцитів, фенотипованих моноклональними антитілами, та оцінених іншими патогенетичними методами в періферійній крові та культурі лімфоцитів.

Наукова новизна підтверджена впровадженими авторськими посвідченнями (Деклараційний патент UA 25765 А G01N33/48, Деклараційний патент UA А G01N33/48, Деклараційний патент 48845 А G01N33/48).

Практичне значення отриманих результатів. В ході вивчення динаміки активності лімфоцитів, що циркулюють, виділено інформативні ознаки (I  нм, I 530 нм, -параметр, ІЛ 640 нм, ІЛ 530 нм), що відображають їхній попередній імуноцитопоез у центральних та імуногенез у периферійних органах імунної системи, та відповідність основним етапам (активація, проліферація, диференціювання), що може мати практичне застосування в експериментальній біології та клінічній імунології.

Виділено відносні до фону показники люмінесценції в противагу абсолютним в у.о. при 530 нм і 640 нм (ІЛ 640 = І640 клітини / І640 фону;
ІЛ 530 = І530 клітини / І530 фону), що дозволяє проводити порівняльну оцінку білок-синтетичній активності лейкоцитів крові на різних мікроспектрофлуориметрах, при різних показниках напруги на ФЕМ, в різних лабораторіях. Для скринуючих досліджень розроблено експрес-люмінесцентний метод визначення функціональної активності лейкоцитів по їх відбитках на поверхнях, покритих полілізином. Розроблено люмінесцентний критерій зрушення формули крові “вліво”. По динаміці активованих лімфоцитів у ході операційного лікування та у постопераційний період визначений напрямок міграції і депонування імунокомпетентних клітин в органах імунної системи слизистих і периферії (шкіра, скелетна мускулатура), що дозволяє оцінювати інтенсивність відновлювальних процесів і прогнозувати післяопераційні ускладнення. За рівнем І640 гранулярних і агранулярних лейкоцитів крові запропонована оцінка ступеня напруги імунітету онкологічних хворих, впливу на імунітет імунотропних препаратів, що дозволить вивчати стан імунної системи людини і тварин на різних етапах онтогенезу, при різних фізіологічних і патологічних станах організму, оцінювати вплив на імунну систему різних екологічних чинників.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача полягає у визначенні актуальності та ступеню вивчення проблеми, виконанні методик експериментальних досліджень. Особисто дисертантом проведений статистичний аналіз результатів досліджень, написані всі розділи дисертації, зроблені висновки. Робота виконувалася на кафедрі імунології і біохімії Запорізького державного університету в співдружності з кафедрою анестезіології і ІТ ЗІУЛ.

Впровадження результатів дисертації. Результати дисертації підтверджені актом про впровадження на кафедрі госпітальної педіатрії Запорізького державного медичного університету при Запорізькій обласній дитячій лікарні.

Основні положення дисертаційної роботи включені в програму лекцій і практичних занять спецкурсів кафедри імунології і біохімії ЗДУ, відображені у відповідних методичних рекомендаціях.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на щорічних підсумкових конференціях викладачів і студентів ЗДУ, на конференції фізіологів України (м. Донецьк 1997), на 4 Українській науково-практичній конференції по актуальних питаннях алергології та клінічної імунології в м. Київ (1999), на 4 Міжнародному симпозіумі "Біологічні механізми старіння" у м. Харків (2000), на 3 з'їзді імунологів і алергологів СНД у м. Сочі (2000), на науково-практичних конференціях імунологів у м. Київ (2000, 2002).

Публікації по темі дисертації. За матеріалами дисертації опубліковано 25 робіт, серед яких 8 статей у спеціалізованих виданнях, затверджених ВАК України, 14 тез, 3 патенти.

Об'єм і структура дисертації. Дисертація викладена на 143 сторінках друкарського тексту; дисертація складається з вступу, 8 глав, висновків, списку використуваних джерел і доповнень. Список літератури містить 215 джерел, серед яких 31 іноземна праця. Робота проілюстрована 42 таблицями, 2 малюнками, у додатку розміщено 10 фотографій.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи дослідження. Для дослідження брали венозну кров, стабілізовану гепарином у наступних групах обстежених:

1. Група хірургічних хворих на різних етапах оперативного лікування (34 людини) з наступними діагнозами: пухлини центральної і периферійної нервової системи (19 осіб); вертеброгенні та краніальні поразки (8 осіб); вісцеропатії (гострі і хронічні) (7 осіб). Імунологічні показники в даній групі обстежених реєстрували на етапах загальної анестезії і хірургічного лікування: 1-й етап - контроль (вихідний стан), 2-й – 30-40 хвилин після премедикації;
3-й - через 30-40 хвилин після інтубації трахеї і індукції; 4-й - через 30-40 хвилин після початку операції; 5-й етап – після закінчення операції; 6-й етап – на наступний день після операції; 7-й етап – через тиждень після операції. В усіх хворих на основних етапах знеболювання, хірургічного лікування та у найближчому післяопераційному періоді визначали концентрацію кортизолу і гормонів тиреоїдного комплексу. Підбір хворих проводився за принципом важкості захворювання та різної локалізації паталогії.

2. Група онкологічних хворих із різною локалізацією первинних пухлин 4 стадії (метастазування), які отримували сеанси радіо- та хіміотерапії (20 осіб);

3. Група здорових донорів (22 людини) у комплексі з дослідженнями з МКАТ (10 осіб) та з постановою культури лімфоцитів (3 донора).

Відповідно до мети роботи, патогенетичну значимість люмінесцентного методу з застосуванням акридинового оранжевого досліджували з використанням комплексу патогенетичних методів, що оцінюють стан імунної системи людини за рівнем новоутворення і міграції лімфоцитів у внутрішньому середовищі організму і характеризують основні етапи гісто- і імуногенезу лімфоцитів: активацію, проліферацію, диференціювання і міграцію лімфоцитів в організмі на момент обстеження: 1) цитогенетичного - по аналізу кількості лімфоцитів, які складають клас (КЛ) без асоціацій акроцентричних хромосом (КЛ О ААХ) і з двома акроцентриками в асоціаціях (КЛ 2 ААХ), у сумі (КЛ О+2 ААХ); 2) цитоморфометричного - по аналізу кількості лімфоцитів, які складають КЛ із діаметром клітин до 6,0 мкм (КЛ 6,0 мкм); 3) авідного розеткового - по аналізу кількості лімфоцитів, що приєднали більш 8 еритроцитів барана (КЛ 8 ЕБ).

До цитогенетичного класу КЛ 0+2 ААХ відносяться усі постпроліферативні активовані лімфоцити (Фролов О.К., 1993). У периферичній рециркуляції вони мають морфологію малих (КЛ 6,0 мкм) і великих лімфоцитів (КЛ ? 10 мкм) (Фролов О.К., Федотов Є.Р. та ін., 1999). Цитоморфометричний клас КЛ ? 6,0 мкм складають постпроліферативні малі лімфоцити, що пройшли всі стадії диференціювання, з високою міграційною активністю. Частину КЛ ? 10 мкм, складають великі лімфоцити, що зберігають ознаки бластності, а їхнє збільшення в периферійній крові - ступінь напруги імунітету. Кількість високоавідних лімфоцитів (КЛ ? 8 ЕБ) характеризує рівень активації лімфоцитів до їхнього вступу в проліферацію (Фролов О.К., Федотов Є.Р., Копійка В.В., 2001).

Патогенетична значимість люмінесцентного методу з використанням АО була також підтверджена дослідженнями в культурі лімфоцитів (in vitro) і в крові обстежених (in vivo) із використанням моноклональних антитіл проти панспецифичних СD3, СD4, СD8 , СD16, СD20, і стадіоспецифичної СD25 структури.

Результати досліджень. Для відпрацьовування оптимальних параметрів приготування, фіксації та аналізу препаратів лейкоцитів периферійної крові люмінесцентним методом із застосуванням АО була проведена серія дослідів на однотипних мазках у результаті чого був відпрацьован наступний режим: фіксація мазків крові сумішшю абсолютний етиловий спирт:ацетон - 20 хвилин із наступною проводкою через батарею етилових спиртів концентрації, що знижується (960-15 хвилин; 600-10 хвилин; 300-5 хвилин; дист. вода-ополіскування); інкубування 5 хвилин у цитрато-фосфатному буфері (ЦФБ) із рн = 6; фарбування препарату розчином АО на ЦФБ (рн = 6) із концентрацією 1:20 000 - 10 хвилин із наступним ополіскуванням у 2-ух порціях свіжого ЦФБ; препарат охороняється від висихання вологим покривним склом із наступною окантовкою 30 % полістеролом на ксилолі; на мазку аналізується люмінесценція 100 лімфоцитів, 50 сегментоядерцевих лейкоцитів і 10 значень світіння фону на різних ділянках препарату.

Запропоновано наступні модифікації люмінесцентного методу з АО по тестуванню білок-синтетичної активності лейкоцитів периферійної крові:

Заміна аутоплазми в зразку крові на ембріональну телячу сироватку (ЕТС), що має низький рівень світіння та приготування мазка з лейкоцитарного осаду істотно знижує помилку середнього арифметичного і коефіцієнту варіації всіх показників люмінесценції клітин крові більш, ніж у 2 рази.

2.Заміна абсолютних показників люмінесценції (I 530 нм, у.о.; І 640 нм, у.о.) на індекси люмінесценції, що відбивають рівень світіння клітини відносно фону: I відн. 530 нм = I уо 530 нм клітини / I уо 530 нм фону;

I відн. 640 нм = Iуо 640 нм клітини / Iуо 640 нм фону.

Дані показники дозволяють порівнювати результати, отримані при різних рівнях напруги на ФЕМ, на різних люмінесцентних мікроскопах без втрати інформативності та об'єктивності.

Для тих випадків, коли необхідно оцінювати лише сумарну білок-синтетичну активність популяції клітин, розроблено експрес-аналіз люмінесценції лімфоцитів із застосуванням АО. Принцип даного методу полягає в приготуванні відбитків на поверхнях, покритих полілізином, із лімфоцитарної суспензії в лунках із стрічки Parafilm M (США). Інтенсивність люмінесценції оцінюється з об'єктивом х 40 без зонду в 10 полях зору в двох повторах, що в сумі дозволяє аналізувати біля 20 000 клітин.

В другій групі досліджень показана інформативність люмінесцентного методу з застосуванням АО в адаптованому виді при динамічних дослідженнях імунного статусу в клінічних дослідженнях.

Рис.1. Динаміка люмінесцентних показників лімфоцитів крові хірургічних хворих (34 людини) по етапам обстеження.

Аналіз показників люмінесценції в динаміці хірургічного лікування дозволяє оцінити їх інформативність і застосовність у дослідженнях периферійної крові (рис.1). І530 - показник, що оцінює рівень дволанцюгових нуклеїнових кислот, переважно ДНК. І530 на всіх етапах обстеження статистично була стабільною не лише в нейтрофілах, але й у лімфоцитах. Це дозволяє зробити висновок, що ядра циркулюючих лімфоцитів, як і нейтрофілів метаболічно неактивні. Однак ця метаболічна інертність не остаточна, як у нейтрофілів. Для більшості лімфоцитів вона тимчасова. Після одержання мітогеного і (або) антигеного сигналу лімфоцити в центральних і периферійних лімфоїдних органах активуються; у них підсилюється білоксинтетична активність; лімфоцити проходять визначені етапи імуногенезу, створюючи клони ефекторних лімфоцитів і клітин пам'яті. Вони виходять у загальну рециркуляцію. У цих активованих циркулюючих лімфоцитів метаболічна активність ядра припиняється, але залишається її слід - накопичені і -РНК,
т -РНК, р-РНК. Накопичені РНК в ціх лімфоцитах, як залишкову ознаку їх імуногенезу в лімфоїдних органах, ми реєструємо по інтенсивності люмінесценції при довжині хвилі 640 нм (І640). Тому саме в цьому спектрі інтенсивність люмінесценції варіює в залежності від операційного періоду в хірургічних хворих, тоді як І530 залишається статистично стабільною.

б-?араметр не дає однозначної характеристики функціональної активності конкретної клітини крові. Він є відношенням інтенсивності люмінесценції при максимумі 640 нм до інтенсивності люмінесценції при максимумі 530 нм, а в диференційованих клітинах периферичної крові його рівень визначається, в основному, рівнем І640. Нейтрофіли є клітинами на кінцевому етапі диференціювання, тому І640 нейтрофілів була значно нижче лімфоцитарної і варіювала в значно меншому ступені.

Як кількісні, так і функціональні сумарні по всім 34 хворим показникии імунітету в динаміці лікування характеризували розвиток загального адаптаційного синдрому (ЗАС) по Сельє у відповідь на емоційний, медикаментозний, інтубаційний і операційний стрес і післяопераційні регенераційні процеси.

Найбільшу інформативність з усіх показників люмінесценції представляє І640 лімфоцитів, що характеризує популяційне варіювання в циркулюючих клітинах кількісті РНК. Так, І640 через 30-40 хвилин після премедикації (перед індукцією) вірогідно знизилася в порівнянні з її вихідним рівнем. Ймовірною причиною даного зниження, є гальмування міграції активованих лімфоцитів у лімфоїдних органах під впливом глюкокортикоїдних гормонів, що викидаються в кров наднирниками в перші хвилини реакції організму на стрес (початок доопераційного періоду). У підтвердженні цього нами зареєстрований максимальний рівень кортизолу в крові в цей період. Однак вже через 30-40 хв. після індукції і інтубації І640 (перед операцією) він повернувся до вихідного значення, що можна розцінити як збільшення кількості активованих лімфоцитів у загальній рециркуляції в результаті позитивної дії анальгезії. Операція є сильним стресовим впливом на організм, крім того, в організмі з'являється велика кількість антигенів і аутоантигенів з ушкоджених тканин. Організм відповідає мобілізацією імунної системи, у результаті чого через 30-40 хвилин після початку операції І640 збільшується на 47,78 % у порівнянні з початковим рівнем. До кінця операції даний показник продовжує підвищуватися до максимальних значень і зростає на 72,2 % у порівнянні з початковим рівнем, віддзеркалюючи максимальну напругу імунної системи. Вірогідно збільшення люмінесценції в 1,72 рази відбулося за рахунок перерозподілу активованих імунокомпетентних клітин у загальну рециркуляцію з депо (селезінка, кістковий мозок, лімфовузли, печінка). Наступного дня після операції і через 7 днів після неї I640 лімфоцитів залишається високою і вже більше характеризує мобілізацію імунної системи на відновлювальні процеси. По строкам обстеження динаміка показника I640 нм для нейтрофілів повторювала динаміку показника I640 для лімфоцитів (r=0,83, p < 0,001), але була значно меншою по амплітуді.

Аналізуючи динаміку кількості високоавідних лімфоцитів (КЛ 8 ЕБ) у ході хірургічного лікування, можна помітити збільшення даного показника лише після початку операції (139 %), коли в організм потрапляють анти- і аутоантигени при операційній травмі. Підвищений рівень КЛ 8 ЕБ зберігався і до кінця операції. Максимальне збільшення частки активованих лімфоцитів (КЛ 8 ЕБ) на 7-ому етапі (158 %), імовірно, свідчить про активацію відновлювальних процесів у період реконвалесценції і про напругу імунітету на даному етапі обстеження.

Аналізуючи динаміку цитоморфометричних показників, можна відзначити вірогідні зміни лише на 6-7 етапах обстеження. Так, кількість малих лімфоцитів (КЛ 6,0 мкм) збільшилась на 6-ому етапі (130 %), досягаючі свого максимуму на 7-ому етапі (177 %). Майже двократне збільшення кількості активованих лімфоцитів у післяопераційний період можна пояснити посиленою проліферацією клітин, яка спрямована на відновлення антиген–структурного гомеостазу (АСГ), а також виходом цієї популяції в загальну рециркуляцію з осередку ушкодження. Динаміка кількості великих лімфоцитів (КЛ 10 мкм) носила подібний характер (збільшення КЛ 10 мкм в 1,5 раза на 6-7 етапах обстеження в порівнянні з доопераційним періодом). Дане збільшення, імовірно, обумовлене включенням у циркуляцію незрілих бластних форм лімфоцитів, що говорить про напругу імунітету в післяопераційний період.

Вихідна відносна й абсолютна кількість активованих лімфоцитів, виражена через КЛ 0+2 ААХ в обстежених нами хворих (19 осіб із пухлинами центральної і периферійної нервової системи) була вище фізіологічної норми для даного віку, що складає 22-28 % (Фролов О.К., 1993). Даний факт можна пояснити напругою імунітету в наслідок онкологічного процесу в обстежених хворих. Динаміка частоти КЛ 0+2 ААХ, як і інші показники віддзеркалює стресові і відновлювальні реакції імунної системи в ході операційного лікування. Так, на 2 етапі, на якому домінували емоційний і медикаментозний стреси, спостерігалося різке зниження КЛ 0+2 ААХ. Основною причиною даної реакції, мабуть, було гальмування міграції активованих лімфоцитів. У ході індукції і застосування наркозу (3 етап), а також на початку операції (4 етап) спостерігалося плавне підвищення даного показника внаслідок блокади ноцицептивної інформації і початку перерозподілу активованих лімфоцитів. Наприкінці операції спостерігалося різке збільшення кількості лімфоцитів, які складають КЛ 0+2 ААХ як результат міграції і депонування активованих лімфоцитів у місцях хірургічного ушкодження. У постхірургічні етапи (6 і 7 етапи) відносна кількість КЛ 0+2 ААХ мала тенденцію зниження до вихідних значень, однак абсолютна кількість залишалася високою і віддзеркалювала напругу імунітету. Таким чином, загалом зміни кількості лімфоцитів
КЛ 0+2 ААХ збігалися з іншими кількісними і функціональними показниками: інтенсивністю люмінесценції лімфоцитів при довжині хвилі 640 нм в умовних одиницях (I 640 нм, у.о.) і в перерахунку на індекс люмінесценції при тій же самій довжині хвилі (ІЛ 640). Так, I 640 нм (у.о.), як абсолютний показник люмінесценції корелював із відносною частотою (%) КЛ 0+2 ААХ на рівні вірогідності r = 0,63, а з абсолютною частотою (Г/л) КЛ 0+2 ААХ зв'язок був вище: r = 0,77. Запропонований нами індекс люмінесценції ІЛ 640 нм (відносний показник люмінесценції) показав більш тісний зв'язок із зазначеними цитогенетичними показниками: із відносною частотою
КЛ 0+2 ААХ у % - r = 0,73, а з абсолютною частотою КЛ 0+2 ААХ у Г/л зв'язок наближався до функционального: r = 0,88. Підвищення рівня зв'язку від абсолютних до відносних показників люмінесценції свідчить про більшу інформативність запропонованого нами показника люмінесценції для оцінки функціонального стану клітини (ІЛ 640 нм).

Вірогідне збільшення концентрації кортизолу у хірургічних хворих виявлено лише на 2-ому етапі обстеження (140 % доопераційного рівня), що пояснюється психоемоціональною напругою пацієнтів у чеканні оперативного втручання. Безпосередньо після інтубації вміст кортизолу знижувався до 110 %, що не виходить за межі стрес-норми і на даному етапі вказує на достатню профілактику інтубаційного стресу та ефективний анестезіологичний захист на етапах застосування наркозу – перехід на ІВЛ. Концентрація кортизолу і надалі залишалася на цьому рівні, можливо, як наслідок адекватного анестезіологічного захисту.

Аналізуючи динаміку концентрації тиреоїдних гормонів, слід зазначити зниження концентрації Т4 на другому етапі обстеження до 77 %, і незначне зменшення Т3 до 90 %, як результат супресивної дії кортизолу на гормони тиреоїдного комплексу. Наступні зміни спостерігалися на 7 етапі, вже як збільшення концентрації Т4 і Т3 (120 % і 125 % відповідно), що свідчить про адекватну активацію секреції гормонів, що має анаболічну дію при розвитку анаболічної фази стрес-реакції у відповідь на операційну травму.

Аналізуючи кількісні і якісні показники лейкоцитарної активності в крові хірургічних хворих в динаміці операційного лікування, можна відзначити наступну особливість: високий рівень варіювання показників і середнєквадратичного відхилення, максимальні значення яких спостерігалися на травматичних етапах операції (4-5) і в післяопераційний період (6-7). Даний факт можна пояснити тим, що, хоча імунна система реагує на операційний стрес стереотипно, але характер і напрямок міграції лімфоцитів залежать в

Рис. 2. Динаміка І 640 нм лімфоцитів в ході хірургічного лікування по нозологічним групам.

Рис.3. Динаміка кількості лімфоцитів, що складають КЛ ? 8 ЕБ в ході хірургічного лікування по нозологічним групам.

Рис. 4. Динаміка кількості лімфоцитів, що складають КЛ ? 6,0 мкм в ході хірургічного лікування по нозологічним групам.

основному від локалізації патології та операційного процесу. Сучасні літературні дані свідчать про дихотомію переважної міграції лімфоцитів, завдяки відповідним адгезивним молекулам, до локальної імунної системи слизових (респіраторний, травневий і сечостатевий тракти) та у локальну периферічну систему шкіри та скелетної мускулатури (Hayday Adrian, Viney Joanne L., 2000). Для вивчення міграційних особливостей лімфоцитів ми розділили досліджуваний контингент хворих (34 людини) на нозологічні групи: пухлини центральної і периферичної нервової системи (19 осіб); вертеброгенні та краніальні поразки (8 осіб); вісцеропатії (гострі і хронічні) (7 осіб).

Аналіз люмінесцентних показників лімфоцитів крові хворих, оперованих з приводу пухлин центральної і периферійної нервової системи показує, що інтенсивність люмінесценції при довжині хвилі 640 нм (I 640) наростала в ході хірургічного лікування, однак це наростання було не рівномірним, що віддзеркалює стресорний стан організму. Так, на 2 етапі інтенсивність люмінесценції навіть падала (86,67% від доопераційного рівня) унаслідок негативної регуляції гормонів кортикостероїдів на імуногенез і міграцію лімфоцитів, тому що в цей період розвивався емоційний стрес. Після інтубації та введення в наркоз показник вирівнювався, як наслідок дії анестезії. Однак на початок операції (4 етап), I 640 нм різко зростала до 164% від доопераційного рівня. Це зростання можна пояснити перерозподілом активованих лімфоцитів у зону альтерації. Наприкінці операції показник ще більше збільшився і залишався на тому ж високому рівні і через добу. На 7 день після операції під час загоєння рани показник досягав максимуму мабуть внаслідок вихіду у периферійну кров активованих лімфоцитів із рани.

Абсолютні показники люмінесценції, як-то індекс люмінесценції (ІЛ) при 640 нм на всіх етапах були вище в 3-5 разів, ніж I 640 в у.о. В сукупності це свідчить про те, що ІЛ більш інформативний, а також статистично зручний для порівняльного аналізу. Динаміка ІЛ 640 нм цілком збігалася з динамікою I 640 в у.о., про що говорить позитивний високий кореляційний зв'язок до 0,8 і вище на всіх етапах обстеження.

Незначне підвищення КЛ ? ЕБ на другому етапі (125 %) пов'язано з виходом високоавідних лімфоцитів із депо в момент емоційного стресу, у той час як антигена стимуляція, що утворюється в результаті хірургічної травми, викликала більш виражене і пролонговане збільшення авідності лімфоцитів крові.

Найменший показник КЛ ? 6,0 мкм в абсолютних значеннях був у травматичний період (4 етап і 5 етапи), як результат перерозподілу їх в місцє ушкодження. Значний підйом КЛ ? 6,0 мкм наступного дня після операції і через 7 днів є результатом посилення імуногенезу і виходом з депо лімфоцитів. Крім того, 6-7 етапи також характеризуються максимальним рівнем великих (КЛ ?10 мкм) лімфоцитів (175 % у порівнянні з доопераційним рівнем), мабуть за рахунок бластних форм, що свідчить про посилення проліферативних процесів, спрямованих на регенерацію.

Аналізуючи динаміку I 640 у хворих з вертеброгеними і краніальними поразками, можна відзначити статистично вірогідне підвищення тільки на 5 етапі спостережень, причому цей підйом значно нижче в порівнянні з 1-ою групою хворих. Показник продовжував збільшуватися до 0,87 у.о. через добу після операції, а на 7 день обстеження його значення статистично не відрізнялося від доопераційного рівня, що є істотною відмінністю від першої групи хворих в якої цей показник був високим і на 7 добу. ІЛ 640 нм повторив динаміку I 640 на всіх етапах (r = 0,7 – 0,97). Таким чином, результати люмінесцентних досліджень демонструють короткочасне підвищення I 640 на 5-6 етапах досліджень і невисокі значення в порівнянні з першою групою хворих. Тобто активність білок-синтетичній системи в лімфоцитах, як відбиток інтенсивності імуногенезу, в хворих з вертеброгеними ушкодженнями була значно нижче. Але динаміка цих змін по етапах обстеження збігалася, що свідчить про подібність міграційних процесів лімфоцитів при патологіях у осіб першої і другої груп.

Максимальний підйом абсолютної кількості Е-РУК зареєстровано лише на 5 етапі досліджень. У цей же період відзначається найбільша кількість лімфоцитів, що відносяться до КЛ ? 8 ЕБ. У післяопераційний період дані показники знижувалися, проте залишаючись на високому рівні. Кореляційний аналіз показників люмінесценції з КЛ ? 8 ЕБ виявився значним у 1-ий та останній період, що вказує на адекватність люмінесцентних показників лімфоцитів крові даним авідного розеточного методу.

Морфометричні показники, як і дані розеткоутворення, підтверджують вище зроблені висновки. Динаміка кількості високомігруючих малих лімфоцитів збігалася по етапах обстеження з першою групою хворих. Причому максимум зниження приходився на кінець операції. Даний період також характеризувався максимальною кількістю великих лімфоцитів – КЛ ?10 мкм.

Вісцеропатії по локалізації патології відрізняються від перших двох груп обстежених хворих, що приводить до істотних відмінностей, у першу чергу по характеру міграції активованих лімфоцитів переважно в слизові тканини (ШКТ, сечостатевий тракт). Тоді як у 1 і 2 групи хворих міграція активованих лімфоцитів переважно мала місце в кісткову мускулатуру і шкірні покриви. Тому динаміка активованих лімфоцитів по всіх досліджуваних ознаках у хворих з вісцеропатіями відрізняється від перших двох груп.

Динаміка I 640 лімфоцитів повторювала динаміку відносної й абсолютної кількості лімфоцитів. Так, люмінесцентні показники, що характеризують білок-синтетичну активність лейкоцитів крові (I 640, ІЛ 640 нм та ?-параметр) вірогідно зменшуються на 2 етапі, а саме в період емоційного стресу. Це падіння значно нижче в порівнянні з першими двома групами. Подальша динаміка I 640 відрізняється різким підйомом вже на 4 етапі (початок операції), як результат перерозподілу активованих лімфоцитів із периферії в місце операції органів черевної порожнини. Але вже наприкінці операції I 640 значно знизилася, як результат міграції активованих лімфоцитів у місця альтерації, а через добу після операції на пикі відновлювальних процесів I 640 ще більш знизилася до 82 % від предопераційного рівня.

Через 7 днів після операції спостерігається підвищення I 640 лімфоцитів до доопераційного рівня. Однак з врахуванням підвищеної кількості лімфоцитів у цей період і попереднього оперативного лікування рівень I 640 не можна інтепретувати як нормалізацію показника. Його величину можна пояснити тільки з позиції початку зворотної міграції активованих лімфоцитів із місць депонування в загальну рециркуляцію. На момент спостереження (через 7 днів після операції) значна частина активованих лімфоцитів ще продовжує депонуватися в місцях хірургічної альтерації. Слід зазначити, що об'єм оперативного втручання у хворих даної групи (резекція шлунка, экстирпація матки і придатків та ін.) значно перевершував об'єм такого втручання у перших двох груп хворих.

Різниця в динаміці показників активності лімфоцитів крові між першими двома групами хворих і групою хворих з вісцеропатіями підтверджує дані літератури про різноспрямовану міграцію активованих лімфоцитів в залежності від локалізації патології. Так, у хворих 3 групи міграція імунокомпетентних клітин йде з периферії до внутрішніх органів, тоді як у хворих 1 та 2 груп перерозподіл активованих лімфоцитів був зворотній, кров же в обох випадках забиралася для обстеження з вени – периферичних відділів серцево-судинної системи.

Наведені вище особливості міграції активованих лімфоцитів підтверджуються даними авідного розеткового і морфометричного методів. Незначне зменшення абсолютної кількості КЛ ? 8 ЕБ на 2-ому етапі з максимальним збільшенням на 4-ому етапі і мінімальному значенні на 6-ому етапі відповідає динаміці люмінесцентних показників (І 640 і ІЛ 640). Абсолютна кількість малих лімфоцитів (КЛ ? 6,0 мкм) досягала мінімальних значень на 2-ому етапі (64,15 % від доопераційного рівня); на 5-ому (66,04 %) і на 6-ому (71,7 %) . Падіння КЛ ? 6,0 мкм на 2-ому етапі пояснюється реакцією імунокомпетентних клітин на емоційний стрес, а на 5-6 етапах – депонуванням ранніх постпроліферативних лімфоцитів в місцях хірургічної рани. Кінець операції (5 етап) супроводжувався максимальним підйомом кількості великих (КЛ ? 10 мкм) лімфоцитів (806,25 % від початкового рівня), що свідчить про високу напругу імунної системи і зрушенням лімфоцитарної формули крові “вліво”, виходом у загальну циркуляцію лімфобластів - клітин з структурно-функціональними ознаками незрілості.

Для демонстрації інформативності люмінесцентного методу при аналізі крові онкологічних хворих була обстежена група з 20 осіб з 4 стадією онкогенезу, які отримували сеанси радіо- та хіміотерапії. Інтенсивність люмінесценції лімфоцитів крові цих онкохворих вірогідно значно перевершує таку для контрольної групи (I 530 нм складає 203,42 % від контролю, а I 640 нм – 255,56 %). Дане явище обумовлене підвищеною активацією імунної системи антигенами клітин пухлин. Високий рівень I 640 та I 530, імовірно, свідчить про інтенсивно протікаючі реплікативні, транскрипційні та трансляційні процеси в клітинах, в результаті антигеної стимуляції і виходу в загальну рециркуляцію лімфоцитів з ознаками бластності. В більшості таких лімфоцитів I 640 лімфоцитів була вище, ніж I 530 нм, тому рівень ?-параметру перевищував одиницю).

Інтенсивність люмінесценції сегментоядерцевих лейкоцитів крові онкологічних хворих також значно перевершувала таку у контрольній групі
(I 530 нм – 169,72 %, I 640 нм – 309,09 %). Причому найбільше відхилення від рівня контролю по всіх показниках люмінесценції спостерігалося саме для I 640 сегментоядерцевих лейкоцитів. Сегментоядерцеві лейкоцити периферійної крові (в основному нейтрофіли) у нормі – це клітини на кінцевому етапі диференціювання з конденсованим хроматином і зі слідовою кількістю РНК у цитоплазмі, тому ядро такої клітини люмінесцує яскраво-зеленим світлом із високим рівнем світіння при I 530 нм, а цитоплазма має низький рівень світіння при 640 нм (світло-сірого кольору подібного до фону). Велика частина сегментоядерцевих лейкоцитів у крові онкохворих мала червоне світіння цитоплазми, що свідчить про вихід в периферійну кров незрілих форм нейтрофілів з залишками РНК-ових структур в цитоплазмі. Тому збільшення люмінесценції нейтрофілів при 640 нм більш, ніж у три раза можна трактувати як зрушення формули крові “вліво” в результаті тривалої напруги усіх ланок імунної відповіді.

Таким чином, люмінесцентні дослідження, в основному за рівнем люмінесценції лейкоцитів при 640 нм, в комплексі з іншими методами можуть бути застосовані для індивідуального аналізу стану імунної системи в нормі та патології, що допоможе оцінювати ступінь її напруги, наприклад, у хірургічних та онкологічних хворих, разробляти профілактичні та лікувальні заходи і контролювати їх успішність.

Вивчено патогенетичну значимість на групі здорових донорів трьох ознак активації лімфоцитів: розмір клітин, авідність Т-лімфоцитів до еритроцитів барана, інтенсивність люмінесценції лімфоцитів, флуорохромованих АО у порівнянні з частотами популяцій і субпопуляцій лімфоцитів, тестуємих МКАТ до CD-антигенів. Лімфоцити фенотипувались за допомогою моноклональних антитіл до CD-структур: CD-3, CD-4, CD-8, CD-16, CD-20, CD-25. З усіх популяцій лімфоцитів донорів, фенотипованих МКАТ, лише кількість СD-25+ - лімфоцитів позитивно корелювало з ІЛ 640 нм лімфоцитів, тоді як з іншими класами активованих лімфоцитів кореляція не досягала рівня значимості.

Досліджена активність лімфоцитів вищепереліченими методами з фенотипованими МКАТ у культурі, яку стимульовали фітогемаглютиніном (ФГА) протягом 72-х годин. Приріст частоти лімфоцитів з панспецифичними СD-структурами після культивування не досягав статистично значимої різниці. Кількість СD-25+ лімфоцитів збільшилася в 27 разів у порівнянні з вихідним рівнем, що свідчить про перехід більшості Т-лімфоцитів до стадії активації і мітотичного циклу – G1-М стадію. Внаслідок активації метаболізму нуклеїнових кислот вірогідно зростали всі показники люмінесценції (збільшення І640 – в 5,4 рази, І530 – в 2,5 рази), що вказує на розгортання білок- синтетичної системи. Співпадаюча динаміка активованих лімфоцитів, маркірованих різними методами (МКАТ до СD-25 і за рівнем I 640 та 530 нм) у мітогенстимульованій культурі лімфоцитів, підтверджує імуногенетичну значимість розробленого нами методу