КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ГРЕБІНИК ДМИТРО МИКОЛАЙОВИЧ

УДК 577.24/.352.4:57.044:54-39

КАЛЬЦІЄВИЙ ГОМЕОСТАЗ НА РАННІХ ЕТАПАХ АПОПТОЗУ ТИМОЦИТІВ ЩУРА

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у лабораторії фізико-хімічної біології кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Матишевська Ольга Павлівна,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, член-кореспондент

НАН України, професор

Костерін Сергій Олексійович

Інститут біохімії імені О. В. Палладіна НАН України,

завідувач відділу біохімії м’язів

доктор біологічних наук

Дружина Микола Олександрович

Інститут експериментальної патології, онкології та радібіології імені Р. Є. Кавецького НАН України

завідувач відділу радіобіології

Провідна установа: Національний медичний університет

імені О.О. Богомольця МОН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться „ 30” січня 2006 року о 12.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр-т Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, біологічний

факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:

м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий „ 29 ” грудня 2005 року

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останнім часом все більшу увагу дослідників привертають механізми підтримання та регуляції внутрішньоклітинного Са2+-гомеостазу за умов як фізіологічного, так і патологічного станів клітин. Йони Са виконують роль універсальних внутрішньоклітинних месенджерів, внаслідок короткочасних змін концентрації йонів Са у цитозолі ([Ca2+]і) здійснюється регуляція таких важливих процесів, як експресія генів, диференціація, активація клітин, їх проліферація та виживання (Carafoli, 2002; Eisner, et al, 2004). Припускають, що Са2+ відіграє важливу роль у механізмах апоптозу. Однак точні механізми генерації Са2+-залежних сигналів за апоптозу залишаються до кінця не з’ясованими.

Пероксид водню та іонізуюче випромінювання – індуктори так званого безрецепторного (стресорного) типу апоптозу. Дія Н2О2 реалізується через індукцію окисного стресу внаслідок посилення продукції АФК. Основною мішенню дії іонізуючої радіації є ядерна ДНК клітин, хоча ефект опромінення також виявляється у збільшенні вмісту активних форм кисню. Зручною експериментальною моделлю для дослідження механізмів апоптозу є суспензія ізольованих тимоцитів щура – неповністю диференційованих клітин з нестабільним геномом, які гинуть через апоптоз під час дозрівання, диференціації та за патологій імунної системи. Апоптогенний ефект іонізуючого випромінювання у дозі 4,5 Гр та Н2О2 у концентрації 0,1 мМ на ізольовані тимоцити щура був доведений у експериментальних роботах (Гринюк, 2004; Коваль, 2004; Матишевська, 2005) - упродовж 5-годинної інкубації тимоцитів після дії чинників виявлено зниження життєздатності клітин, морфологічні ознаки апоптозу, накопичення продуктів міжнуклеосомного розщеплення ДНК.

Дані щодо ролі Са2+ у активації апоптозу тимоцитів суперечливі. Одні автори вважають, що підвищення [Ca2+]і є важливим для ініціації апоптозу лімфоїдних клітин (Orrenius, et al, 2003; Eisner, et al, 2004), а в інших роботах показано, що програма апоптозу може активуватись і за відсутності внутрішньоклітинного Са2+-сигналу (Scoltock, et al, 2000; Zhu, et al, 2000).

Припускають, що важливою передумовою апоптичної загибелі є не стільки підвищення загального рівня Са2+ у цитозолі, скільки порушення перерозподілу катіона серед внутрішньоклітинних депо (Carafoli, 2002; Brookes, et al, 2004). У зв’язку з цим, актуальним є дослідження Са2+-гомеостазу та ролі внутрішньоклітинних Са2+-депо у його підтриманні на ранніх етапах апоптозу тимоцитів, викликаного іонізуючим випромінюванням або пероксидом водню.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано згідно плану науково-дослідної роботи кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках теми № 01 БФ 036-04 “Розробка наукових основ пошуку біологічно-активних сполук радіозахисної дії” (№ державної реєстрації 0101U002291).

Мета та завдання дослідження. Мета роботи – визначити концентрацію вільного цитозольного Са2+ та активність систем акумуляції Са2+ у мітохондріях та ЕПР ізольованих тимоцитів щура на ранньому етапі після дії іонізуючої радіації та пероксиду водню.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

? із застосуванням зондів індо-1 та фура-2 визначити концентрацію вільного цитозольного Са2+ у тимоцитах упродовж інкубації після дії іонізуючої радіації у дозі 4,5 Гр або за присутності 0,1 мМ Н2О2 у середовищі інкубації;

? дослідити залежність фрагментації ДНК у підданих дії досліджуваних чинників тимоцитах від концентрації вільного цитозольного Са2+;

? оцінити пасивний вхід Са2+ у опромінені та оброблені пероксидом водню тимоцити;

? дослідити вплив блокаторів кальцієвих каналів верапамілу та ніфедіпіну, а також заміни натрію на холін у середовищі інкубації на концентрацію вільного цитозольного Са2+ у клітинах після дії пероксиду водню;

? оцінити вплив тапсигаргіну, рутенієвого червоного та циклоспорину А на концентрацію вільного цитозольного Са2+ у тимоцитах, підданих дії Н2О2;

? визначити активність Са2+-транспортних систем мітохондрій та ЕПР у пермеабілізованих дигітоніном тимоцитах у контролі та на ранньому етапі після дії досліджуваних чинників.

Об’єкт дослідження – Са2+-гомеостаз на ранніх етапах апоптозу тимоцитів, викликаного дією іонізуючої радіації та пероксиду водню.

Предмет дослідження – концентрація вільного цитозольного Са2+, фрагментація ДНК, вхід Са2+ у клітини, активність та кінетичні параметри функціонування енергозалежних систем акумуляції Са2+ мітохондріями та ЕПР тимоцитів.

Методи дослідження – світлова мікроскопія, спектрофлуориметрія з використанням зондів індо-1AM та фура-2AM, пермеабілізація клітин дигітоніном, радіоізотопний метод із застосуванням 45Са2+, спектрофотометричні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено порівняльну оцінку впливу апоптогенних чинників - іонізуючого випромінювання у дозі 4,5 Гр та 0,1 мМ пероксиду водню на кальцієвий гомеостаз тимоцитів щура. Встановлено, що у підданих дії пероксиду водню тимоцитах відбувається тривале підвищення концентрації вільного цитозольного Са2+, яке передує міжнуклеосомному розщепленню ДНК, тоді як у опромінених тимоцитах [Ca2+]i не змінюється порівняно з контролем. Спричинена дією Н2О2 деградація ДНК запобігається у випадку зниження концентрації вільного Са2+ у цитозолі тимоцитів. Вперше оцінено активність та кінетичні параметри Са2+-транспортних систем мітохондрій та ЕПР у тимоцитах у контролі та за дії досліджуваних апоптогенних чинників. Показано, що на ранньому етапі після дії Н2О2 провідна роль Са2+-транспортної системи мітохондрій у забезпеченні поглинання Са2+ із цитозолю втрачається, пригнічується також активність Са2+-акумулюючої системи ЕПР. В опромінених тимоцитах накопичення катіону мітохондріями пригнічується меншою мірою і у більш пізній термін, ніж після дії Н2О2.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані розширюють уявлення про механізми регуляції Са2+-гомеостазу у клітинах після дії пероксиду водню та іонізуючого випромінювання. Експериментальна модель з використанням пермебілізованих дигітоніном тимоцитів може бути застосована для дослідження параметрів функціонування внутрішньоклітинних Са2+-транспортних систем за апоптозу. Результати роботи можуть бути використані для пошуку шляхів контролювання Са2+-гомеостазу у лімфоїдних клітинах за умов окисного стресу.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто здійснено інформаційний пошук, експериментальні дослідження, інтерпретацію, теоретичне обгрунтування і оформлення результатів. Дані з розділу 3.1. отримано за участі м. н. с. кафедри біофізики біологічного факультету Київського університету імені Тараса Шевченка Семенова Ю. В. і опубліковано в спільній статті. Основні теоретичні та експериментальні ідеї було розроблено за участі наукового керівника дисертанта д.б.н., проф. О.П. Матишевської.

Апробація результатів роботи. Основні результати дисертаційної роботи були представлені на Міжнародній практичній конференції “EMBO Workshop on Signal Transduction-Mediated Regulation of Nuclear Transport” (Страсбург, 2001), 1-ій Міжнародній конференції “Conference for students, PhD-students and young scientists on molecular biology and genetics” (Київ, 2001), II Всеукраїнській конференції студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, 2002 ), VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), 2-ій Міжнародній конференції “Conference for students, PhD-students and young scientists on molecular biology and genetics” (Київ, 2003), Міжнародному Конгресі “29th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies (FEBS)” (Варшава, 2004), Міжнародному Форумі для молодих вчених FEBS (Варшава, 2004), 5-ій Україно-Польській Парнасівській конференції “Molecular mechanisms of cellular signalling” (Київ, 2005).

Публікація матеріалів. Основні положення дисертаційної роботи викладено у 12 наукових публікаціях - 5 статей у фахових виданнях, які затверджені переліком ВАК України, та 7 тез конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 126 сторінках друкованого тексту, містить 18 рисунків, 6 таблиць. Робота складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, заключення, висновків, списку використаних джерел (253 посилання).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Тимоцити одержували з тимусу щурів лінії Вістар обох статей вагою 120–150 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію. Тимус (200 мг) протирали через нейлонову сітку у буфер А (мМ): Na2HPO4 - 3, KCl - 5, NaCl - 120, CaCl2 - 1, глюкоза - 10, Mg Cl2 - 1, NaHCO3 - 4, HEPES - 10, рН 7,4. Оцінку життєздатності та підрахунок кількості тимоцитів проводили у камері Горяєва після профарбовування 0,2 % розчином трипанового синього.

Інкубацію тимоцитів (2–4·106/мл) проводили у термостаті при 37оС у середовищі RPMI-1640, що містило 5% ембріональну телячу сироватку. Експерименти проводили за таких умов: контрольну суспензію тимоцитів інкубували протягом певного часу; у середовище інкубації клітин додавали пероксид водню до кінцевої концентрації 0,1 мМ; перед інкубацією клітинну суспензію піддавали однократному рентгенівському опроміненню у дозі 4,5 Гр (експозиційна доза - 11,61·10-2 Кл/кг) на установці РУМ-17 (потужність дози - 0,24 Гр/хв, фільтри 0,5 мм (Сu + Аl), напруга 200 кВ, сила струму 10 мА, фокусна відстань - 50 см).

Кількість високомолекулярної та фрагментованої ДНК визначали за методом Бартона (Burton, 1956). Вміст полідезоксирибонуклеотидів (ПДН) визначали після лізису клітин у буфері, що містив (мМ): ЕДТА - 10, трис-HCl – 10, рН 7,4, 0,5 % тритон Х-100.

Концентрацію вільного цитозольного Са2+ вимірювали за допомогою зондів індо-1АМ та фура-2АМ (Sigma, США). Клітини ( 3Ч107/мл) навантажували зондом (5 мкМ) протягом 40 хв при 250 С, відмивали від надлишку зонду трьохкратним центрифугуванням (600 g, 10 хв) та ресуспендували у буфері А до концентрації 1Ч107 /мл. Спектр флюоресценції індо-1 визначали на спектрофлюориметрі СДЛ-2 (ЛОМО, Росія), лзбудж. - 350 нм, лвипр. – 410 та 495 нм; спектр флюоресценції фура-2 - на спектрофлюориметрі Shimadzu RF-510 (Японія), лзбудж. = 330 та 375 нм, лвипр. = 505 нм. Концентрацію Са2+ розраховували за двохвильовим параметром R (Grynkiewicz, 1985).

Для оцінки входу кальцію тимоцити (5Ч 106 ) інкубували при 370 С в середовищі об’ємом 0,5 мл, що містило буфер А та 1 мкКі 45СаСl2 (Amersham, Великобританія). Реакцію зупиняли швидкою фільтрацією проб через фільтри (0,45 мкм) Millipore (США),

Активність внутрішньоклітинних енергозалежних Са2+-транспортних систем визначали, інкубуючи тимоцити при 370 С у середовищі об’ємом 0,5 мл, що містило 15 мкМ дигітонін для пермеабілізації плазматичної мембрани. Загальне накопичення Са2+ ініціювали внесенням клітин ( 1Ч 107 ) у стандартне середовище інкубації (20 мM HEPES, 125 мM KCl, 3 мМ MgCl2, 3 мМ АТФ, 2 мМ К+-фосфатний буфер (pH = 7,4), 3 мМ сукцинат натрію, 15 мкМ дигітонін, 10 мкМ 40CaCl2 + 1 мкКі 45СаСl2). Накопичення Са2+ мітохондріями оцінювали, інкубуючи клітини у стандартному середовищі з додаванням 100 нМ тапсигаргіну. Накопичення Са2+ в ЕПР оцінювали у стандартному середовищі такого складу: 20 мM HEPES, 125 мM KCl, 3 мМ MgCl2, 3 мМ АТФ, 15 мкМ дигітонін, 10 мМ оксалат калію, 10 мкМ рутенієвий червоний, 10 мкМ 40CaCl2 + 1 мкКі 45СаСl2 (Борисова, 2000). Реакцію зупиняли швидкою фільтрацією проб через фільтри (0,45 мкм) Millipore, які тричі промивали 3 мл охолодженого стоп-розчину, що містив 150 мM KСl, 5 мМ СоСl2 Ч 6Н2О, 10 мМ НЕРЕS, рН 7,4. Радіоактивність проб вимірювали на рідинно-сцинтиляційному лічильнику Delta (США).

Кінетичні параметри накопичення Са2+ клітинами та внутрішньоклітинними компартментами (початкова швидкість V0 та максимальне накопичення Pmax) визначали, як описано в роботі (Костерин, 1987).

Статистичну обробку результатів дослідження проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики (Плохинский, 1981). Розрахунки та побудову графіків виконували на комп’ютері з використанням прикладних програм “Origin 7.0” та “Microsoft Excel 98”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Визначення концентрації вільного цитозольного Са2+ у тимоцитах після дії іонізуючої радіації або H2O2. Для оцінки [Ca2+]i у тимоцитах у контролі та після дії досліджуваних чинників нами було використано ацетоксиметиловий ефір Са2+-чутливого флуоресцентного зонду індо-1. Концентрація вільного Са2+ у цитозолі контрольних тимоцитів становила 104 ± 9 нМ і не змінювалась упродовж інкубації клітин.

Як видно з даних, представлених на рис. 3.1., концентрація вільного цитозольного Са2+ у тимоцитах упродовж 5 год після опромінення у дозі 4,5 Гр не змінювалась. За інкубації тимоцитів у присутності 0,1 мМ Н2О2 спостерігалось швидке підвищення рівня цитозольного Са2+ - показник зростав в 2,7 рази порівняно з контролем вже через 30 хв (рис. 1., крива 2). Максимальний рівень [Ca2+]i, що перевищував контрольний в 5,5 разів, спостерігався через 2-3 год після додавання Н2О2 до суспензії тимоцитів. У подальшому відбувалося зниження показника, який на п’яту годину інкубації залишався у 2,5 рази вищим від контрольного

Рис. 1. Концентрація вільного цитозольного Са2+ у тимоцитах за їх інкубації після рентгенівського опромінення (1) або внесення 0,1 мМ H2O2 (2) у середовище інкубації

Такі результати узгоджуються з літературними даними. Так, пероксид водню у концентраціях 0,2 - 1 мМ викликав підвищення [Ca2+]i в епітеліоцитах (Сastro, 2004), клітинах HeLa (Jornot, 1998), клітинах гепатоми HepG2 (Kim, 2000), T-лімфоцитах (Madesh, 2001).

Питання про те, чи є підвищення [Ca2+]i обв’язковою умовою індукції апоптозу тимоцитів залишається відкритим. Тому наступною нашею задачею було оцінити показник структурного стану ДНК – вміст низькомолекулярних продуктів міжнуклеосомного розщеплення ДНК у підданих дії досліджуваних апоптогенних чинників тимоцитах та залежність цього показника від концентрації Са2+ у цитозолі клітин.

Залежність фрагментації ДНК у тимоцитах від концентрації Са2+ у цитозолі опромінених або оброблених Н2О2 клітин. Для дослідження зв’язка між фрагментацією ДНК та рівнем вільного цитозольного Са2+ нами було проведено експерименти, у яких вміст ПДН у контрольних та підданих дії радіації або Н2О2 тимоцитах оцінювали за інкубації клітин у стандартному середовищі, що містило 1 мМ СаСl2, тобто за умов підтримання направленого всередину клітин градієнта Са2+, або у номінально безкальцієвому середовищі – за умов, коли концентрація йонів Са у цитозолі падає.

Значення [Ca2+]i у контрольних тимоцитах, інкубованих упродовж 3 год у стандартному середовищі, становило 110 ± 9 нМ, тоді як за інкубації у номінально безкальцієвому середовищі показник знижувався до рівня 68 ± 5 нМ (табл. 1).

Дія іонізуючої радіації у дозі 4,5 Гр призвела до посилення фрагментації ДНК у тимоцитах, яке виявлялося незалежно від того, у якому середовищі здійснювали інкубацію опромінених клітин (табл. 1.).

Таблиця 1.

Вміст ПДН (у % від загальної ДНК) та концентрація вільного цитозольного Са2+ (нМ) у тимоцитах у контролі та за інкубації клітин у стандартному та номінально-безкальцієвому середовищі після дії іонізуючої радіації або пероксиду водню (M ± m; n = 4)

Умови досліду | Стандартне

середовище | Номінально безкальцієве середовище | [Ca2+]iПДН | [Ca2+]iПДН | Контроль | 110 ± 9 | 9,1 ± 1,4 | 68 ± 5** | 7,3 ± 1,3 | 4,5 Гр | 105 ± 8 | 34,8 ± 3,6* | 65 ± 5** | 28,8 ± 3,8 | 0,1 мМ Н2О2671 ± 63* | 29,3 ± 2,8* | 86 ± 8** | 11,3± 2,3* | *- p ? 0,05 порівняно з контролем.

**- p ? 0,05 порівняно з інкубацією у стандартному середовищі.

У тимоцитах, підданих дії Н2О2, також спостерігалося посилення фрагментації ДНК. Однак, цей ефект виявлявся лише за умов інкубації клітин у стандартному середовищі – вміст ПДН через 3 год зростав до 29,3 ± 2,8 % від загального вмісту ДНК у тимоцитах, а концентрація цитозольного Са2+ у цей період підвищувалась порівняно з контролем у 6,2 рази (табл. 3.1.). Якщо інкубацію тимоцитів за присутності Н2О2 здійснювали у номінально безкальцієвому середовищі, концентрація Са2+ у цитозолі встановлювалась на рівні 86 ± 8 нМ, посилення фрагментації ДНК не відбувалося – вміст ПДН у клітинах залишався на контрольному рівні. Отримані дані вказують, що оптимальними умовами для активації ендонуклеолізу ДНК у тимоцитах під дією Н2О2 є підвищення [Ca2+]i та її утримання на підвищеному рівні у ранній період, який передує накопиченню фрагментів ДНК у клітинах

Існує декілька можливих причин раннього підвищення [Ca2+]i у тимоцитах за дії Н2О2 - посилений вхід з навколишнього простору через канали плазматичної мембрани або вивільнення Са2+ у цитозоль з внутрішньоклітинних Са2+-депо (Hajnoczky G., 2003; Orrenius S., 2003). Тому нашим наступним завданням було дослідити вхід Са2+ через плазматичну мембрану у контрольних та підданих дії радіації або Н2О2 тимоцитах.

Вхід Са2+ у опромінені та оброблені пероксидом водню тимоцити. З метою оцінки інтенсивності входу позаклітинного Са2+ в тимоцити, як інтегрального показника пасивного накопичення катіона клітинами за дії досліджуваних чинників, було використано радіоізотопний метод із застосуванням 45Са2+.

Вхід Са2+ у тимоцити є досить швидким процесом – стаціонарний рівень накопиченого катіону (7,85 пмоль/106 клітин) встановлюється вже через 1 хв після внесення суспензії клітин у середовище інкубації, що містило 45Са2+ (рис. 2.)

Рис. 2. Вхід Са2+ у тимоцити у контролі (1), через 15 (2) та 30 хв (3) після опромінення клітин у дозі 4,5 Гр (А) або обробки 0,1 мМ H2O2 (Б).

Криві входу катіону у тимоцити у контролі та через 15 та 30 хв після рентгенівського опромінення клітин мали однаковий характер (рис. 2,А), а кінетичні параметри входу Са2+ у опромінені тимоцити достовірно не відрізнялись від контрольних значень (V0 = 138 ± 9,6 пмоль 45Са2+/106 кл Ч хв, Рmax = 8,22 ± 1,12 пмоль 45Са2+/106 кл ). Отже, дія іонізуючої радіації у дозі 4,5 Гр не супроводжується зміною проникності плазматичної мембрани тимоцитів до Са2+.

Крива входу Са2+ у тимоцити, упродовж 15 хв оброблені H2O2, не відрізнялась від контрольної (рис. 2, Б). Однак, через 30 хв після дії H2O2 спостерігається пригнічення входу 45Са2+ у клітини, значення V0 падає у 2,9 разів, а Рmax – у 2 рази порівняно з контролем.

Причиною зниження входу Са2+ у тимоцити на ранньому етапі після дії Н2О2 може бути активація систем, які виводять катіон з клітини у позаклітинне середовище у випадку підвищення його концентрації у цитозолі. Отримані нами дані узгоджуються з літературними щодо особливостей порушень Са2+-гомеостазу. Показано, що посилення входу позаклітинного Са2+ через плазматичну мембрану незбудливих клітин є більш пізнім наслідком порушення регуляції Са2+- транспортних процесів у внутрішньоклітинних компартментах (Hajnoczky, 2003; Orrenius, 2003) .

Вхід Са2+ з позаклітинного простору у цитозоль незбудливих клітин забезпечується, в основному, через активацію потенціал-залежних дигідропіридин-чутливих Са2+-каналів L-типу (Hoffmann F., 1999), які були знайдені також і у Т-лімфоцитах (Kotturi M.F., 2003). Для з’ясування можливого надходження катіону з позаклітинного середовища через Са2+-канали на ранньому етапі після дії пероксиду водню нами було використано два селективних блокатори L-каналів - верапаміл та ніфедіпін у кінцевій концентрації 7,5 мкМ у пробі.

Внесення у середовище інкубації тимоцитів верапамілу або ніфедіпіну не впливає на спричинене дією Н2О2 підвищення [Ca2+]i через 0,5 та 1 год інкубації. Ефект блокаторів виявляється через 2 год після обробки тимоцитів пероксидом - спостерігається зниження рівня вільного Са2+ у цитозолі у 1,4 рази порівняно з контролем. Отже, у період до 1 год після дії Н2О2 посилення входу катіону через L-канали плазматичної мембрани не відбувається.

Для перевірки можливої ролі Na2+/Ca2+-обмінника у підвищенні [Ca2+]i у тимоцитах за дії H2O2, ми проводили інкубацію клітин у безнатрієвому середовищі, яке замість NaCl містило еквімолярну кількість холінхлориду, тобто, за умов пригнічення функціонування обмінника. Значення [Ca2+]i у контрольних клітинах за їх інкубації у безнатрієвому середовищі суттєво не відрізнялося від отриманого у стандартному середовищі і складало 123 ± 8 та 110 ± 7 нМ відповідно. Додавання Н2О2 до безнатрієвого середовища інкубації призводило до такого ж підвищення [Ca2+]i у тимоцитах через 0,5 та 2 год, яке спостерігалось за інкубації тимоцитів з пероксидом водню у стандартному середовищі. Проте, через 1 год інкубації клітин за присутності Н2О2 у безнатрієвому середовищі значення [Ca2+]i було вищим, ніж за інкубації у стандартному. Не виключено, що через 1 год після дії Н2О2 концентрація цитозольного Са2+ у тимоцитах досягає рівня, оптимального для активації уніпортера, тому за умов його пригнічення спостерігається ще більше зростання [Ca2+]i.

Отримані результати вказують, що можливою причиною підвищення [Ca2+]i у тимоцитах на ранніх етапах після дії пероксиду водню є не посилення входу катіону через плазматичну мембрану, а вивільнення його з внутрішньоклітинних кальцієвих депо - ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій (Orrenius, 2003; Brookes, 2004). Тому наступною задачею було оцінити можливу роль внутрішньоклітинних депо у підвищенні [Ca2+]i після дії Н2О2.

Вплив тапсигаргіну, рутенієвого червоного та циклоспорину А на рівень [Ca2+]i у тимоцитах за дії H2O2. Для оцінки [Ca2+]i у тимоцитах за дії тапсигаргіну та пероксиду водню нами було використано ацетоксиметиловий ефір Са2+-чутливого флуоресцентного зонду фура-2 (фура-2AM), який зберігає усі переваги двохвильового зонду, однак є більш чутливим до Са2+ порівняно з Indo-1АМ, що робить його дуже зручним для виявлення швидких змін [Ca2+]i (Grynkiewicz G., 1985). Тому інкубацію тимоцитів проводили безпосередньо у кюветі з одночасним моніторингом рівня [Ca2+]i.

Рис. 3. Динаміка підвищення [Ca2+]i у тимоцитах після внесення клітин у стандартне (А) або номінально-безкальцієве (Б)середовище тапсигаргіну (300 нМ) та 0,1 мМ H2O2.

Для з’ясування можливої ролі ЕПР підвищенні [Ca2+]i ми вивчали вплив Н2О2 на рівень [Ca2+]i за умов попереднього спустошення Са2+-депо ЕПР тапсигаргіном. У пробу, що містила завантажені Fura-2AM тимоцити, вносили тапсигаргін, а після виходу значення [Ca2+]i на “плато” у кювету додавали Н2О2. Внесення 300 нМ тапсигаргіну до стандартного середовища інкубації призводило до швидкого зростання [Ca2+]i більш ніж у 4 рази порівняно з контролем, яке утримувалось на підвищеному рівні упродовж 40 хв (рис. 3.,А). Внесення Н2О2 у пробу після встановлення стаціонарного рівня [Ca2+]i призводило до подальшого поступового підвищення [Ca2+]i яке досягало значення 1,1 мкМ на 40-ій хвилині інкубації. Таким чином, в умовах спустошення Са2+-депо ЕПР тапсигаргіном пероксид водню здатен викликати додаткове вивільнення катіону у цитозоль тимоцитів.

Інтерпретація результатів, отриманих за інкубації клітин у стандартному середовищі ускладнена через те, що спустошення ЕПР могло індукувати вхід катіона з позаклітинного середовища для поповнення запасів Са2+ у ретикулумі за “ємністним” механізмом (Parekh A. B., 2003). З метою запобігання такої можливості інкубацію тимоцитів проводили у номінально безкальцієвому середовищі. У ході попередньої 10-хвилинної інкубації клітин у номінально безкальцієвому середовищі у цитозолі тимоцитів встановлювалася рівноважна концентрація 62 7 нМ. Додавання тапсигаргіну до середовища інкубації викликало спустошення ЕПР та підвищення [Ca2+]i до 96 8 нМ, яке утримувалось упродовж 5 хв, після чого рівень катіону поступово знижувався (рис. 3.,Б). Додавання Н2О2 до оброблених тапсигаргіном тимоцитів викликало подальше підвищення [Ca2+]i в клітинах до рівня 136 11 нМ з виходом на “плато” через 20 хв інкубації і його утриманням до кінця інкубаційного періоду. Отримані дані свідчать про те, що джерелом надходження Са2+ у цитозоль може бути не лише ЕПР, але й інші внутрішньоклітинні Са2+-депо, наприклад, мітохондрії. Якщо саме мітохондрії залучені до індукованого Н2О2 підвищення [Ca2+]i за відсутності позаклітинного Са2+, то вивільнення катіону з них може відбуватись і без кальцієвого перевантаження цих органел, оскільки [Ca2+]i після обробки клітин тапсигаргіном є невисоким (96 8 нМ).

Для перевірки участі мітохондрій у викликаному Н2О2 порушенні внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу у тимоцитах було використано селективний інгібітор мітохондріального Са2+-уніпортера рутенієвий червоний та блокатор неселективної мітохондріальної пори циклоспорин А. Інгібітори вносили у пробу, що містила навантажені фура-2 тимоцити, одночасно з H2O2. За присутності 10 мкМ рутенієвого червоного у середовищі інкубації спостерігалось уповільнення спричиненого пероксидом водню підвищення концентрації Са2+ у цитозолі тимоцитів та зниження її стаціонарного рівня у в 1,2 рази (рис. 4, крива 2). Можна припустити, що блокатор пригнічує вхід Са2+ у мітохондрії та попереджує їх перевантаження катіоном, або ж пригнічує вихід кальцію з мітохондрій, зумовлений оберненням Са2+-уніпортера у випадку деполяризації внутрішньої мембрани мітохондрій під дією H2O2.

Рис. 4. Динаміка підвищення [Ca2+]i за інкубації оброблених 0,1 мМ Н2О2 тимоцитів за відсутності інгібіторів (1), у присутності 10 мкМ рутенієвого червоного (2) або 5 мкМ циклоспорину А (3)

Циклоспорин А блокує неселективну мітохондріальну пору внаслідок приєднання до одного з компонентів пори зі сторони матриксу – циклофіліну D та пригнічення пептидил-проліл-цис,транс-ізомеразної активності цього білка (Bernardi, 1999). Як видно з даних, представлених на рис. 4, за присутності 5 мкМ циклоспорину А підвищення [Ca2+]і, спричинене дією H2O2, у період до 15 хв інкубації тимоцитів повністю запобігалось (крива 3), а у подальшому Са2+-мобілізуючий ефект пероксиду водню знижувався у 2 рази. Виявлений ефект циклоспоріну А підтверджує появу неспецифічної проникності внутрішньої мітохондріальної мембрани під дією H2O2. Той факт, що екзогенний пероксид водню або його аналог tBOOH здатні індукувати відкриття неселективної пори, підтверджено на пермеабілізованих клітинах і ізольованих мітохондріях (Черняк, 1999). Неспецифічна проникність мітохондріальної мембрани за дії H2O2, очевидно, обумовлена як надходженням Са2+ з цитозолю у мітохондріальний матрикс, так і спричиненим окисним стресом, що узгоджується з так званою гіпотезою “подвійного удару”, за якою відкриття неселективної пори є найбільш вірогідним лише при поєднанні двох факторів – підвищення [Ca2+]m та посилення продукції АФК (Brookes, 2004). Оскільки циклоспорин А не попереджає повністю підвищення [Ca2+]i у підданих дії Н2О2 тимоцитах, ще одним джерелом надходження Са2+ у цитозоль може бути ендоплазматичний ретикулум.

Враховуючи важливу роль внутрішньоклітинних Са2+-депо у підтриманні Са2+-гомеостазу у тимоцитах, було оцінено активність Са2+-транспортуючих систем ЕПР та мітохондрій тимоцитів на ранньому етапі дії апоптогенних чинників.

Оцінка активності енергозалежних Са2+-транспортних систем ЕПР та мітохондрій у тимоцитах у контролі і за дії пероксиду водню або радіаційного опромінення. Особливості та механізми функціонування систем акумуляції Са2+ в мітохондріях та ЕПР тимоцитів, а також внесок цих систем у підтримання кальцієвого гомеостазу вивчені недостатньо, оскільки дослідження АТФ-залежного транспорту Са2+ у внутрішньоклітинні структури інтактних тимоцитів ускладнені. Цих ускладнень можна уникнути, використовуючи пермеабілізовані дигітоніном клітини, що дозволяє забезпечити доступ АТФ та Са2+ всередину клітин та зберегти природне співвідношення об’ємів внутрішньоклітинних Са2+-депо.

Виявилось, що оброблені дигітоніном (2-30 мкМ) тимоцити здатні накопичувати Са2+ із стандартного середовища інкубації, максимальний рівень накопиченого за 5 хв катіону був виявлений за присутності 15 мкМ дигітоніну і становив 405 21 пмоль/106 клітин. Цей показник було прийнято за 100 % для того, щоб порівняти відносний внесок у загальну акумуляцію катіону Са2+-транспортуючих систем ЕПР та мітохондрій, активність яких було визначено за умов, описаних у розділі “Матеріали і методи”. Стаціонарний рівень накопичення Са2+ мітохондріями пермеабілізованих тимоцитів становив 316 19 пмоль/106 клітин, а ЕПР - 67 ± 17 пмоль/106 клітин, тобто 76% та 19% від загального накопичення Са2+ тимоцитами відповідно. Залишкове накопичення (5%), очевидно, обумовлене акумуляцією катіона у інші внутрішньоклітинні структури тимоцитів, зокрема, у ядра, які здатні накопичувати Са2+ та виявляти Са2+-АТФазну активність (Борисов, 2001).

Динаміку накопичення Са2+ в ЕПР та мітохондріях контрольних клітин представлено на рис.5 ( крива 1 на А та Б, відповідно). Крива акумуляції катіону мітохондріями тимоцитів мала тенденцію до встановлення рівноважного стаціонарного рівня акумульованого Са2+ на 5-ій хвилині інкубації (рис. 5., А,крива 1). Згідно результатів кінетичного аналізу кривої, максимальний рівень накопичення Са2+ в мітохондріями (Pmax) складав 345 ± 17 пмоль Са2+/106 клітин, а значення початкової швидкості накопичення Са2+ (V0) - 106 9 пмоль Ca2+ /106 клітин за 1 хв.

Залежність накопичення Са2+ в ЕПР від часу інкубації клітин мала лінійний характер без тенденції до насичення (рис. 5.,Б, крива 1). Рівень акумуляції катіону в ЕПР на 5-ій хвилині інкубації становив 65 5 пмоль Ca2+ /106 клітин, а початкова швидкість накопичення V0 складала 14 2 пмоль Ca2+ /106 клітин за 1 хв.

Розраховані параметри функціонування Са2+-акумулюючої системи мітохондрій, зокрема, початкова швидкість акумуляції катіона, яка кількісно характеризує її транспортну активність, перевищують за величиною відповідні параметри системи АТФ-залежного накопичення Са2+ в ЕПР пермеабілізованих тимоцитів. Отже, потужність мітохондріальної Са2+-транспортуючої системи є достатньою для того, щоб за умов надходження у цитозоль надлишкової кількості Са2+, зумовленого вільним входом катіону з позаклітинного середовища та його виходом з ЕПР під дією тапсигаргіну, забезпечити високий рівень внутрішньомітохондріального накопичення йонів Са. Це дозволяє зробити висновок про основну роль мітохондрій у акумуляції Са2+ з цитозолю тимоцитів.

Активність систем внутрішньоклітинної акумуляції Са2+ на ранньому етапі після дії пероксиду водню досліджували, інкубуючи клітини у присутності Н2О2 упродовж 5 та 15 хв, після чого їх переносили у середовище, що містило дигітонін та 45Са2+.

Рис. 5. Акумуляція Са2+ мітохондріями (А) та ендоплазматичним ретикулумом (Б) пермеабілізованих тимоцитів у контролі (1) та через 5 (2) і 15 хв (3) після дії Н2О2

Вже через 5 хв після дії Н2О2 спостерігається зниження активності Са2+-акумулюючої системи мітохондрій (рис.5.,А). Стаціонарний рівень накопичення катіону, який встановлюється на 5-ій хвилині інкубації, знижувався в 1,5 рази порівняно з контролем (крива 2). Через 15 хв після дії Н2О2 спостерігається ще більш значне пригнічення накопичення Са2+ мітохондріями тимоцитів - стаціонарний рівень акумуляції на 5-ій хвилині інкубації падає в 3,5 рази у порівнянні з контролем (крива 3).

Результати дослідження впливу пероксиду водню на динаміку накопичення Са2+ ендоплазматичним ретикулумом тимоцитів представлено на рис. 5.,Б. У клітинах, оброблених Н2О2 упродовж 5 хв виявлялось незначне зниження рівня катіона, накопиченого в ЕПР за 10 хв (крива 2). Через 15 хв після обробки клітин Н2О2 кількість Са2+, акумульованого ендоплазматичним ретикулумом знижувалась у 1,7 рази порівняно з контролем (крива 3).

Таким чином, виявлене на ранніх етапах дії Н2О2 зниження активності систем акумуляції Са2+ у внутрішньоклітинних структурах тимоцитів може бути причиною підвищення концентрації вільного катіона у цитозолі. Довготривале підвищення [Ca2+]i у тимоцитах за дії H2O2 (рис. 1.), очевидно, пов’язано з порушенням Са2+-транспортуючої функції не лише мітохондрій, а й ЕПР і плазматичної мембрани.

Вплив іонізуючої радіації на активність внутрішньоклітинних енергозалежних систем транспорту Са2+ досліджували, ініціюючи акумуляцію Са2+ внесенням клітин у дигітонін-вмісне середовище через 15 та 30 хв після опромінення тимоцитів. Через 15 хв після опромінення швидкість та максимальний рівень накопичення катіону не змінювався порівняно з контролем (рис. 6, крива 2). Через 30 хв після опромінення тимоцитів спостерігалось зниження накопичення катіону мітохондріями, яке виявлялось вже через 2,5 хв після початку інкубації, а через 10 хв показник був нижчим від контрольного у 1,6 рази (крива 3).

Динаміка та інтенсивність акумуляції Са2+ в ЕПР опромінених тимоцитів у досліджуваний термін не змінювались у порівнянні з контролем. Отже, у ранній період після дії іонізуючого опромінення Са2+-акумулююча здатність ЕПР тимоцитів не знижується, що свідчить про збереження функціональної активності Са2+-АТФази.

Рис. 6. Акумуляція Са2+ мітохондріями тимоцитів у контролі (1), через 15 (2) і 30 хв (3) після радіаційного опромінення у дозі 4,5 Гр

Таким чином, міжнуклеосомна фрагментація ДНК у тимоцитах, підданих дії іонізуючої радіації у дозі 4,5 Гр, не супроводжується підвищенням [Ca2+]і, функціональна активність системи акумуляції Са2+ у ЕПР у ранній період після опромінення зберігається, однак накопичення катіона мітохондріями пригнічується. Малоймовірно, що виявлені порушення виникають у значній частині мітохондрій внаслідок первинного акту іонізації, проте внаслідок посилення реакцій вільнорадикального окиснення з окремих мітохондрій може локально вивільнюватися Са2+, який захоплюється сусідніми мітохондріями. У такий спосіб Са2+-сигнал може передаватися до найближчих мітохондрій і, можливо, посилюватися.

У тимоцитах, підданих дії 0,1 мМ Н2О2 спостерігається раннє підвищення [Ca2+]і, яке передує міжнуклеосомній фрагментації ДНК і спричинене значним порушенням процесів трансмембранного обміну катіону у мітохондріях та ЕПР. Са2+-акумулююча система мітохондрій тимоцитів виявилася чутливішою до дії пероксиду водню у порівнянні з такою в ЕПР. Зниження Са2+-акумулюючої здатності мітохондрій за умов викликаного пероксидом окисного стресу може відбуватись одночасно з посиленням неселективної проникності мітохондріальної мембрани, внаслідок чого з міжмембранного простору та матриксу мітохондрій у цитозоль вивільняються апоптогенні фактори (AIF, цитохром с, ендонуклеаза G). Підвищення [Ca2+]і сприяє також активації Са2+-залежних ферментів та факторів (Са2+,Mg2+-залежна ендонуклеаза, каспаза 3, кальпаїн, білки Bax/Bad), які залучені до сигнальних каскадів апоптозу.

ВИСНОВКИ

На ізольованих тимоцитах щура проведено порівняльне дослідження концентрації Са2+ та параметрів Са2+-транспортних систем мітохондрій та ЕПР у контролі та за дії апоптогенних чинників - іонізуючої радіації (4,5 Гр) та Н2О2 (0,1 мМ). Виявлено відмінності у функціонуванні систем підтримання кальцієвого гомеостазу та встановлено можливі причини його порушення на ранньому етапі апоптозу тимоцитів.

Концентрація вільного Са2+ у цитозолі тимоцитів не змінюється упродовж 5-годинної інкубації клітин у контролі та після рентгенівського опромінення. За інкубації тимоцитів у присутності 0,1 мМ Н2О2 відбувається значне підвищення [Ca2+]i, яке виявляється через 15 хв після дії чинника, перевищує контрольний рівень у 6 разів через 3 год інкубації і залишається у 3,5 рази вищим порівняно з контролем через 5 год.

Через 3 год після дії досліджуваних чинників виявлено зростання вмісту продуктів міжнуклеосомного розщеплення ДНК у тимоцитах. У випадку зниження концентрації Са2+ у цитозолі клітин (інкубація у номінально безкальцієвому середовищі) фрагментація ДНК, спричинена дією Н2О2, запобігається, а у опромінених тимоцитах - послаблюється

Вхід Са2+ через плазматичну мембрану тимоцитів не є причиною підвищення [Ca2+]i на ранньому етапі дії Н2О2 (до 1 год), оскільки пасивний вхід катіона у клітини не посилюється, а внесення у середовище інкубації блокаторів Са2+-каналів плазматичної мембрани верапамілу та ніфедіпіну, так само як і заміна Na+ на холін для пригнічення Na+/ Са2+-обмінника не впливають на спричинене дією Н2О2 підвищення [Ca2+]i.

Виявлено, що внесення Н2О2 у суспензію тимоцитів, попередньо інкубованих у номінально-безкальцієвому середовищі та оброблених тапсигаргіном з метою спустошення Са2+-депо ЕПР, викликає додаткове підвищення [Ca2+]i.

За інкубації тимоцитів у присутності 5 мкМ циклоспорину А спричинене дією H2O2 підвищення [Ca2+]і у період до 15 хв інкубації повністю попереджається, а у подальшому рівень [Ca2+]i виявляється зниженим у 2 рази, що вказує на внесок Са2+-пулу мітохондрій у дисбаланс кальцієвого гомеостазу.

Пермеабілізовані дигітоніном тимоцити здатні накопичувати Са2+ з середовища інкубації. Визначено активність Са2+-транспортних систем мітохондрій і ЕПР та встановлено, що початкова швидкість акумуляції Са2+ (V0 ) є значно вищою у мітохондріях, ніж у ЕПР ( 106 9 та 14 2 пмоль Ca2+/хв на 106 клітин відповідно).

Активність Са2+-акумулюючої системи мітохондрій тимоцитів значно пригнічується через 15 хв після дії Н2О2, акумуляція катіону в ЕПР знижується меншою мірою, таким чином, домінуюча роль мітохондрій у накопиченні Са2+ з цитозолю втрачається.

Після опромінення тимоцитів функціональна активність Са2+-транспортної системи ЕПР зберігається, однак акумуляція катіону мітохондріями пригнічується. Таке пригнічення є менш значним і виявляється пізніше, ніж після дії Н2О2.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Борисов С. І., Гребіник Д. М., Матишевська О. П. Са2+-АТФазна активність та АТФ-залежне накопичення Са2+ у ядрах лімфоцитів селезінки Х-опромінених тварин // Вісник Київського університету. Серія Біологія. – 2001. – № 33. – С. 21-23. (Особистий внесок здобувача – опрацювання літератури за темою досліджень, виділення лімфоїдних клітин з селезінки щурів)

Матишевська О. П., Борисов С. І., Гребіник Д. М. Особливості регуляції концентрації Са2+ у ядрі // Український біохімічний журнал. – 2002. – Т. 74, №5. – С. 5-11. (Особистий внесок здобувача – участь у опрацюванні, аналізі та інтерпретації літературних даних, написання окремих частин огляду).

Гребіник Д.М., Артеменко O.Ю., Семенов Ю.В., Зима В.Л., Матишевська О.П. Вплив рентгенівського