ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені Юрія ФЕДЬКОВИЧА

ГОСПОДАРЬОВ

Дмитро Валерійович

УДК 577.151.6+579.22+582.282.23

ОКИСНЕННЯ БІЛКІВ І ЛІПІДІВ

У ДРІЖДЖІВ SACCHAROMYCES CEREVISIAE

ТА МОЖЛИВА РОЛЬ КАТАЛАЗ У ЙОГО ЗАПОБІГАННІ

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Чернівці – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Прикарпатському національному університеті імені Василя Стефаника Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор,

ЛУЩАК Володимир Іванович,

Прикарпатський національний університет

імені Василя Стефаника,

завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

МЕЩИШЕН Іван Федорович,

Буковинський державний медичний університет,

завідувач кафедри медичної хімії

доктор біологічних наук, професор,

ГОНЧАР Михайло Васильович,

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляторних систем клітини

Провідна установа: Київський національний університет

імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії, м. Київ

Захист відбудеться “14” грудня 2005 року о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05 у Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича за адресою: 58012, м. Чернівці, вул. Лесі Українки, 25, ауд. 81.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича (58012, м. Чернівці, вул. Лесі Українки, 23).

Автореферат розісланий “_6_” _листопада_ 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Копильчук Г.П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Зараз багато уваги приділяють вивченню активова-них форм кисню (АФК), які утворюються в мітохондріях при диханні клітини, а також у деяких метаболічних шляхах (Vranova E.D. et al., 2002). До АФК від-носять супероксидний і гідроксильний радикали, пероксид водню, синглетний кисень, озон тощо. З одного боку, вони задіяні у фізіологічному контролі клі-тинних функцій та сигнальній трансдукції (Droge W., 2002; Thannickal V., Fanburg B.L., 2000), а з іншого, здатні пошкоджувати клітини через окисну мо-дифікацію білків, ліпідів та нук-леїнових кислот (Eaton J.W., Qian M., 2002). За знешкодження АФК та репара-цію модифікованих молекул відповідальна сис-тема антиоксидантного захисту. Її компонентом є низка ферментів, які безпо-середньо дезактивують АФК, зокрема каталаза [КФ1.11.1.6]. Як один з най-зручніших модельних об’єктів для вивчення метаболізму АФК використову-ють дріжджі Saccharomyces cerevisiae. На сьогодні добре вивчені структура та особливості функціонування каталази в клі-тині дріжджів. Проте поза увагою залишилась здатність каталази за певних умов запобігати окисній модифікації біомолекул через знешкодження пе-рок-сиду водню. Відомо, що окисна моди-фікація здебільшого ініціюється гідроксильним радикалом, який утворюється в реакції Фентона. При підсиленій генерації пероксиду водню ймовір-ність цієї реакції зростає. Зменшення концентрації пероксиду водню за рахунок його розкладання в каталазній або пероксидазній реакції є одним з вирішальних моментів у запобіганні реакції Фентона. Тому актуальною буде оцінка здатно-сті каталаз запобігати окисній модифікації білків і ліпідів в умовах, які сприя-ють розвитку оксидативного стресу у дріжджів.

Зв’язок даної роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась з 2001 по 2005 рік на кафедрі біохімії Прикарпатського націо-нального університету ім. В. Стефаника і є частиною наукової тематики кафе-дри “Еволюційні аспекти регуляції іонами заліза вільнорадикальних процесів у живих організмах”, номер держреєстрації – 0102U003439.

Мета та завдання дослідження. Мета роботи – оцінити здатність різних ізоферментів каталази запобігати окисній модифікації білків і ліпідів у S. cerevisiae in vivo. Для реалізації мети були поставлені наступні завдання:

1). Визначити та провести порівняльний аналіз вмісту продуктів окиснення біл-ків і ліпідів, а також активності антиоксидантних та пов’язаних з ними фер-ментів у дефектних за різними ізозимами каталази клітинах S. cerevisiae, виро-щених в середовищах:

а) з різною концентрацією іонів заліза;

б) зі зброджуваним і незброджуваним джерелом вуглецю.

2). Визначити і проаналізувати вміст продуктів окиснення білків і активність антиоксидантних і пов’язаних з ними ферментів у дріжджів S. cerevisiae після інкубації з інгібітором каталази 3-аміно-1,2,4-тріазолом.

3). Провести окисну модифікацію in vitro чутливого до окиснення ферменту S. cerevisiae (глюкозо-6-фосфатдегідрогенази) і порівняти кінетичні харак-те-ристики окисненого та нативного білків.

Об’єкт дослідження – окиснення білків і ліпідів у дріжджів S. cerevisiae.

Предмет дослідження – показники активності антиоксидантних ферментів та вміст продуктів вільнорадикального окиснення білків і ліпідів у дріжджів, дефектних за каталазами.

Методи дослідження – мікробіологічні методи (побудова кривих росту культур мікроорганізмів, оцінка числа живих клітин в культурі), біохімічні ме-тоди (визначення активності ферментів, вмісту карбонільних груп білків і тіо-барбітурат-активних продуктів, часткове очищення ферментів, розрахунок кі-нетичних характеристик ферменту), методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. В дослідженні вперше вияв-лено, що при використанні етанолу як джерела вуглецю дефектні за каталазою штами дріжджів мають вищий вміст продуктів окиснення білків, ніж батьків-ський штам. Встановлено, що у дріжджів цитозольна каталаза може запобігати утворенню продуктів окисної модифікації білків і ліпідів за умов вирощування на середовищах з етанолом і 0,5 мМ сульфату заліза відповідно. Вперше про-ведено інактивацію in vitro глюкозо-6-фосфатдегідрогенази S. cerevisiae в сис-темі Fe2+/Н2О2 та порівняння кінетичних характеристик нативного та окисне-ного ферменту. З’ясовано вплив ряду хімічних сполук різної природи на окис-ну інактивацію глюкозо-6-фосфатдегідрогенази.

Практичне значення одержаних результатів. Представлені в роботі ре-зультати поглиблюють знання про роль каталази в еукаріотичних організмів, зокрема у дріжджів. Отримані дані можна застосувати при розробці технологій промислового культивування дріжджів. Результати роботи викорис-товуються при читанні лекцій та проведенні практичних занять з біо-хімії, мі-кр-о-біо-ло-гії та молекулярної біології на кафедрі біохімії Прикарпат-ського національного уні-верситету імені Василя Стефаника.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведений аналіз на-у-ко-вої літератури, виконана експериментальна частина роботи, статистична об-робка даних і приготування рукописів статей. Планування роботи, аналіз та обговорення отриманого в дослідженнях матеріалу проводились з науковим керівником. Технічну допомогу при виконанні експериментів здійснювали студенти природничого факультету Прикарпатського національного універси-тету – С. Я. Мандрик, Л. Д. Паньків, У. Я. Русин та аспірант М. М. Байляк.

Апробація результатів дисертації. Висновки дисертаційної роботи допо-відалися на Установчому З’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004 р.); X з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004 р.); VII Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і освіта ‘2004” (Дніпропетровськ, 2004), звітно-наукових конференціях Прикарпатського національного університету (Івано-Франківськ, 2002–2005) та засіданнях ка-федри біохімії Прикарпатського національного університету.

Публікації. Результати роботи опубліковані у п’ятьох статтях та чотирьох тезах доповідей наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, п’яти розділів результатів досліджень та їх обговорення, аналізу та узагальнення результатів дослід-жен-ня, списку використаних джерел. Робота викладена на 126 сторінках ма-шино-писного тексту і містить 19 рисунків та 15 таблиць. Список літератури склада-ється зі 152 джерел і розміщений на 15 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

У першому розділі роботи представлено огляд літератури, в якому подано узагальнену інформацію про оксидативний стрес та регуляцію системи анти-оксидантного захисту і обміну заліза у дріжджів Saccharomyces cerevisiae. Роз-глядаються механізми генерації АФК в клітині та їх роль в метаболізмі, наво-дяться загальні відомості щодо антиоксидантної системи дріжджів Saccharomyces cerevisiae.

Матеріали і методи досліджень

В роботі використовували наступні штами дріжджів Saccharomyces cere: YPH250 (MATa trp1-Д1 his3-Д200 lys2-801 leu2-Д1 ade2-101 ura3-52), дикий, або батьківський; YTT7 (MATa trp1-Д1 his3-Д200 lys2-801 leu2-Д1 ade2-101 ctt1::URA3), дефектний за цитозольною каталазою; YIT2 (MATa his3-Д200 lys2-801 leu2-Д1 ade2-101 ura3-52 cta1::TRP1), дефектний за пероксисом-ною каталазою; YWT1 (MATa his3-Д200 lys2-801 leu2-Д1 ade2-101 ctt1::URA3 cta1::TRP1), дефектний за цитозольною та пероксисомною каталазами. Штами люб’язно надані доктором Й. Інуї (Кіотський університет, Японія).

Дріжджі вирощували при 30 °С в середовищі, яке містило в 1 л: 20 г глю-кози, 20 г пеп-тону та 10 г дріжджового екстракту. В дослідах, де дріжджі не-обхідно було вирощувати на незброджува-них джерелах вуглецю, замість глю-кози в середовище додавали етанол (20 мл/л). Аерацію забезпечували шляхом барботажування. Концентрацію клітин в суспензії визначали шляхом підрахун-ку їх у лічильній камері Горяєва. При визначенні кривих виживання, суспензію клітин (106 кл./мл) інку-бували в чашках Петрі протягом 2-ох годин у розчинах FeSO4 різної концентрації. Для визначення активності ферментів клі-тини по досягненні культурою необхідної фази рос-ту збирали центрифугуван-ням, двічі промивали 50 мМ калій-фосфатним буфером (рН 7,0) та ресуспен-дували у тому ж буфері. Клітини руйнували шляхом вібрації густої клітинної суспензії зі скляними кульками. В дослідах з окисної інактивації ферменту клітини руйнували шляхом розтирання в ступці з кварцовим піском. Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу частково очищували (у 2–4 рази) шляхом висолювання сульфатом амонію. Безпосередньо перед експериментом препарат діалізували протягом двох годин проти 1000 об’ємів буферу.

Активність ферментів визначали спектрофотометричним методом при тем-пературі 20 ± 1 °С. Активність супероксиддисмутази [СОД, КФ 1.15.1.1] ви-значали при 400 нм на основі реакції окиснення кверцетину супероксидним ради-калом, за методом, описаним в роботі (Bagnyukova T.V. et al., 2003). Одну оди-ницю супероксиддисмутазної активності визначали як кількість ферменту (на мг біл-ка), яка сповільнює реакцію окиснення кверцетину на 50% від макси-мальної швидкості. Активність каталази визначали, реєструючи роз-кладання перокси-ду водню при довжині хвилі 240 нм. Для розрахунків викори-стовували коефіцієнт молярної екстинкції для пероксиду водню 39,4 М-1см-1. Актив-ність каталази виражали в мкмоль Н2О2/хвмг білка. Активності глутатіонредук-тази [ГР, КФ 1.6.4.2] і глюкозо-6-фосфатдегідрогенази [Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49] оцінювали при 340 нм за кількістю використа-ного та утвореного НАДФН від-повідно. Активність фер-ментів виражали в нмоль НАДФН/хвмг білка.

Вміст карбонільних груп (КБ) білків. Концентрацію динітрофенілгідра-зонових похідних, які утворюються при взаємодії карбонільної групи з 2,4-динітрофе-нілгідразином, визначали спектрофото-метрично при довжині хвилі 370 нм (Levine R.L. et al., 2000). Результати виражали в нмолях, віднесе-них на міліграм білка проби. Вміст тіобарбітурат-активних продуктів (ТБКАП) визначали спектро-фотометрично при довжині хвилі 535 нм (Rice-Evans C.A. et al., 1991). Результати досліджень виражали в пмоль, віднесених на міліграм білка супернатанту.

Концентрацію білка визначали методом Бредфорда (Bradford M.M., 1976). Як стандарт використовували бичачий сироватковий альбумін. Статистичну обробку і аналіз кінетичних параметрів ферменту проводили за допо-могою комп’ютерних програм “Mynova” та “Kinetics” (Brooks S.P., 1992). В діаграмах представлено усереднені дані з 4–6 повторів досліду. Рис. 2 та 5 побудовані на основі одиничних спостережень.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив іонів заліза на виживання і ріст дефектних за різними ізофермен-тами каталази штамів S. cerevisiae. Дефектні за каталазою штами вияви-лись чутливішими до дії екзогенного сульфату заліза (II), ніж вихідний бать-ківський штам. При інкубації в 1 мМ розчині FeSO4 дефектний за цитозольною каталазою штам мав на 42% мен-ше клітин, здатних утворювати колонії (рис. 1). Після обробки FeSO4 в кон-центрації 10 ммоль/л, штами, дефект-ні за цитозольною і перокси-сомною каталазами, мали, відповід-но, на 81 і 62% менше життєздатних клітин, аніж бать-ківський штам.

При глибинному культивуван-ні в середовищі з 0,5 мМ FeSO4 штами харак-теризувались одна-ковими кри-вими росту (рис. 2). Подібність кри-вих росту різних штамів вказує на те, що відсут-ність пероксисомної або цито-зольної каталази не впливає на ріст дріжджів у даному експери-менті. Відомо, що за цих умов дріж-джі мають невелику кількість перокси-сом та мітохондрій (Ruis H., Kцller F., 1997), які є джере-лами АФК. Окрім того, синтез обох ізо-фермен-тів каталази ре-пресується глюкозою і залежить від рівня аера-ції клітин.

Вплив іонів заліза на актив-ність антиоксидантних фермен-тів та вміст окиснених білків і лі-підів у дефектних за різними ізоферментами каталази штамів S. cerevisiae. При вирощуванні в середовищі з 0,5 ммоль/л FeSO4 дефектний за цито-зольною каталазою штам мав в 1,8 раза вищий вміст ТБКАП (рис. 3) і у три рази вищу активність СОД, ніж батьківський штам (рис. 4). У клітинах де-фектного за пероксисомною каталазою (Дcta1) штаму активність СОД була навпа-ки – в 1,7 раза нижчою.

Таким чином, ми бачимо, що саме цитозольна каталаза перешкоджає пере-творенням, які призводять до ініціації пероксидного окиснення ліпідів при надлишку іонів заліза. Відсутність цитозольної каталази та іони заліза зумов-люють підвищення активності СОД у Дctt1-штамі. Останній ефект можна по-яснити спектром реакцій, у які здатні вступати іони дво- і тривалентного заліза за певних умов. Так, супероксидний радикал може генеруватись в реакції три-валент-ного заліза з пероксидом водню (Buyьksцnmez F. et al., 1998). ?мовір-ність остан-ньої зростає для дефектних за каталазою штамів при вирощуванні в сере-довищі з надлишком Fe2+.

Особливості антиоксидантного захисту у дикого та дефектних за різними ізофермен-тами каталази штамів S. cerevisiae при вирощуванні у середо-вищі з етанолом. Відомо, що при утилізації дріжджами етанолу як джерела вуглецю та енергії, в їхніх клітинах зростає інтенсивність утворення АФК (Costa V., Moradas-Ferreira P., 2001). Як наслідок, повинна зростати активність ферментів антиоксидантного захисту. Якщо каталаза відіграє важливу роль в антиоксидантному захисті дріжджів, то клітини дефектних за каталазою шта-мів при вирощуванні на етанолі повинні були б зазнавати оксидативного стресу. Оксидативний стрес може впливати на розмноження дріж-джових клі-тин. Тому першим етапом даної серії експериментів була пере-вірка швидкості росту культур досліджуваних штамів. З рис. 5 видно, що культури всіх штамів при вирощуванні на етанолі рос-туть повільніше, тому характеризуються більшим часом подвоєння клітин. Зо-крема, культура батьківського штаму на етанолвмісному середовищі росла у 2,5 раза повільніше, ніж на середовищі з глюкозою. Дефектні за каталазою штами YTT7, YIT2 та YWT1 росли відповідно в 4,7, 6,9 та 8,3 раза повільніше.

Для оцінки ролі оксидативного стресу в затримці росту досліджуваних штамів S. cerevisiae на середовищі з етанолом ми визначали активність анти-оксидантних ферментів.

Виявилось, що клітини як батьків-ського штаму, так і ctt1Д- та cta1Д-шта-мів, вирощені на етанолі, мають вищу каталазну активність, ніж при ви-рощу-ванні на глюкозі (рис. 6). Проте у ctt1Дcta1Д-штаму каталазної активності взагалі не виявлено.

Всі досліджувані штами при виро-щуванні на етанолі мають у 2–3 рази вищу активність СОД (рис. 7). За цих же умов, активності ГР та Г6ФДГ у ба-тьків-ського штаму відповідно в 1,6 та 1,9 раза вищі, ніж при вирощуванні на глюко-зі. Вища активність Г6ФДГ при вирощуванні на етанолі спостерігалась також у штаму YIT2 (рис. 8). Проте клітини подвійного мутанту при виро-щуванні на етанолі мали в 1,6 раза ниж-чу активність Г6ФДГ, ніж при вирощу-ванні на глюкозі.

Вища активність антиоксидантних ферментів у дріжджів, вирощених на етанолі, швидше за все, пов’язана з тим, що дріжджі утилізують незброджу-вані джерела вуглецю (включаючи етанол) шляхом аеробного окиснення в мі-тохондріях. Оскільки мітохондрії вважа-ються одним з основних джерел АФК, то в клітинах, які вирощуються на ета-нолі, АФК можуть генеруватися інтенсивніше. В цьому випадку виживання клітин буде залежати від потуж-ності систем антиоксидантного захисту. Пору-шення функціонування системи антиоксидантного захисту могли б бути при-чиною оксидативного стресу, характерною ознакою якого є зростання вмісту окиснених білків і ліпідів. Дефектні за каталазою штами YIT2, YTT7 та YWT1 при вирощуванні на ета-нолі мали відповідно у 1,7, 4,6 та 4,7 раза вищий вміст КБ, ніж при вирощу-ванні на глюкозі (рис. 9). Незважаючи на це, у батьків-ського штаму вміст КБ був у два рази нижчим при вирощуванні на етанолі, порівняно з таким у кліти-нах, вирощених на глюкозі. Нижчий вміст КБ в клі-тинах дикого штаму, вирощених на етанолі, може пояснюватись відміннос-тями в наборі білків, характерних для тих чи інших умов вирощування.

Додаткову інформацію можна отримати, порівнявши досліджувані показ-ники між штамами. При вирощуванні на етанолі, порівняно з батьківським штамом, подвійний мутант відповідно мав у 1,5 і 3,0 раза нижчу активність ГР і Г6ФДГ. За цих же умов, дефектні за каталазою штами YIT2, YTT7 та YWT1 мали відповідно в 2,5, 4,5 та 7,1 раза вищий вміст КБ, ніж такий у дикого штаму. Ми встановили, що каталазна активність та вміст КБ негативно коре-люють в клітинах, вирощених на етанолі (r2 = 0,857). Тому можна припустити, що каталаза захищає білки від окиснення, коли клітини отримують енергію шляхом окисного фосфорилювання.

Відомо, що глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа легко інактивується активова-ними формами кисню. Сильна негативна кореляція між вмістом КБ та актив-ні-стю Г6ФДГ (r2 = 0,988) дає підстави припустити, що в умовах нашого експе-рименту Г6ФДГ може бути одним з білків, карбонільованих у результаті окис-нення. Таким чином, з отриманих результатів може витікати те, що недостат-ність каталази у дріжджів призводить до оксидативного стресу, при якому від-бувається накопичення окиснених білків та інактивація чутливих до дії АФК ферментів. Отже, каталази in vivo можуть захищати Г6ФДГ від окисної інакти-вації при оксидативному стресі.

Вплив амінотріазолу на активність каталази Saccharomyces cerevisiae in vivo. В наступній серії експериментів ми інактивували каталази 3-аміно-1,2,4-тріазолом (АМТ), додаючи його в різних концентраціях в середовище, де інкубували клітини. Додатковою умовою, яка могла б сприяти розвитку окси-дативного стресу, була нестача поживних речовин. Показано, що при нестачі джерела вуглецю в дріжджах активуються регулятори транскрипції генів, про-дукти яких залучені в утилізації альтернативних, відмінних від глюкози, дже-рел вуглецю. Під час голодування в клітинах активно функціонують мітохон-дрії – основні джерела АФК, – тому в цих умовах активуються механізми антиоксидантного захисту.

З рис. 10А видно, що в контролі спостерігається порівняно висока каталаз-на активність, співставна з такою в клітинах дріжджів, вироще-них на середо-вищі з етанолом. Ця обставина підтверджує факт про активацію системи анти-оксидантного захисту при нестачі поживних речовин. Присут-ність АМТ в се-редовищі для інкубації у від-но-с-но низьких концентраціях – від 0,1 до 0,5 мМ – не призводить до суттєвого зниження каталазної активності. Проте клітини, інкубовані в присутності 0,75 мМ АМТ, мали в середньому на 22% нижчу ак-тивність, ніж контрольні клітини. При інкубації дріжджів з 1 мМ АМТ ката-лазна активність була вже в 1,9 раза нижча, ніж в контролі. Зі збільшенням концентрації АМТ активність каталази поступово знижувалася і при 10 мМ становила 39% від такої в контролі.

В експериментах, описаних в попередньому підрозділі, ми виявили, що ін-тенси-фікація продукції АФК, зумовлена вирощуванням клітин на етанолі, може призводити до зниження активності Г6ФДГ і підвищення вмісту карбо-нільних груп у білках клітин, дефектних за каталазами. З рис. 10Б видно, що активність Г6ФДГ зі збільшенням концентрації АМТ істотно не знижується. Найменша активність спостерігалася у клітин, які інкубувалися в 0,25 мМ роз-чині АМТ. Тут вона становила 84% від такої в контрольному варіанті.

Між активністю каталази і Г6ФДГ при інгібуванні каталази амінотріазо-лом in vivo спостерігалася менш тісна кореляція (r2 = 0,476), ніж в попередній серії експериментів, коли різні штами дріжджів вирощували на етанолвміс-ному се-редовищі. Отже, в даному випадку, зміни активності Г6ФДГ, можливо, мало пов’язані з окисною модифікацією ферменту, викликаною пероксидом водню або продуктами його метаболізму.

Багато авторів зазначають, що ймовірність окиснення білків пероксидом водню підвищується в присутності іонів металів зі змінною валентністю. Ця обставина може бути причиною зниження кореляції між активністю Г6ФДГ і каталази. Так, амінотріазол може виступати хелатором іонів деяких металів, зокрема заліза (Eaton J.W., Qian M., 2002).

Таким чином, з отриманих результатів видно, що АМТ здатний інгібувати каталазну активність S. cerevisiae in vivo. Ступінь інгібування залежить від концентрації АМТ. Проте інгібування каталаз S. cerevisiae амінотріазолом за відсутності поживних речовин в середовищі не рівноцінне відсутності якогось одного або обидвох ізоферментів каталази при вирощуванні клітин на етанол-вмісному середовищі.

Окисна інактивація глюкозо-6-фосфатдегідрогенази in vitro. Система окиснення Fe2+/Н2О2 часто використовується в експериментах з окисної ін-ак-тивації ферментів. Високоочищені ферменти інактивуються при нижчих кон-центраціях пероксиду водню та іонів двовалентного заліза, ніж неочищені або очищені частково (Hermes-Lima M., Storey K.B., 1993; Szweda L.I., Stadtman E.R., 1992). В даній роботі проводили часткове очищення Г6ФДГ, і тому концентрація загального білка в інкубаційній суміші під час інактивації була відносно високою – 1,5 мг/мл. Можливо, саме це було причиною того, що інактивація досліджуваного нами ферменту досягалася при відносно високих концентраціях як пероксиду водню, так і сульфату заліза (II). Фермент прибли-зно наполовину інактивувався при інкубації з 2 мМ Н2О2 та 3 мМ FeSO4 про-тягом 5 хвилин, причому основна частина активності втрачалася вже на пер-ших хвилинах інкубації. Подальше збільшення часу інкубації ферменту в су-міші, де проводилась інактивація, мало впливало на його активність.

Надалі ми порівняли кінетичні характеристики нативного та частково ін-ак-тивованого ферменту. Фермент може втрачати активність різними шляхами. Одним з них є безпосереднє пошкодження центрів зв’язування субстрату та коферменту, що могло б відобразитись на кінетичних характеристиках фер-менту. Так, у дослідах з Г6ФДГ Leuconostoc mesenteroides константи Мі-хаеліса нативного та частково інактивованого ферментів були однаковими (Szweda L.I., Stadtman E.R., 1992).

З рис. 11А видно, що в нашому випадку для нативного ферменту концен-т-рація НАДФ+, необхідна для забезпечення половини максимальної швидкості реакції, була в 1,6 раза більша за таку в частково інактивованого. Ця ж вели-чина для глюкозо-6-фосфату для нативного ферменту була в 2,1 рази нижчою. Максимальна активність (рис. 11Б) частково інактивованого ферменту була в 3-5 разів нижча за таку для нативного, але коефіцієнт Хіла у нативної та част-ково інактивованої Г6ФДГ фактично не відрізнявся.

Зменшення максимальної активності Г6ФДГ при інактивації свідчить про відповідне зменшення кількості активних молекул ферменту. Молекули фер-менту, які забезпечують залишкову активність, відрізняються за кінетичними параметрами від молекул нативної Г6ФДГ. Таким чином, інактивація фермен-ту може відбуватися двома шляхами: перший – частина молекул ферменту пов-ністю втрачає активність, і другий – частина молекул зберігає активність, але модифікується зі зміною спорідненості до субстрату чи коферменту.

Природу інактивації ферменту в тій чи іншій системі окиснення можна з’ясувати, вивчаючи вплив на цей процес різноманітних хімічних агентів, а саме: антиоксидантів, інгібіторів вільнорадикальних реакцій, хелаторів, суб-стратів ферменту тощо. З рис. 12 видно, що речовини, структурно подібні до НАДФ+ – НАД+, АМФ, АДФ та АТФ, а також структурно подібна до глюкозо-6-фосфату глюкоза – не захищають фермент від інактивації. Окрім того, АТФ і АДФ, а також ЕДТА в концентрації 0,5 мМ призводять до більшої інактивації Г6ФДГ в системі Fe2+/Н2О2. Відомо, що ЕДТА, АТФ і АДФ можуть утворю-вати комплекси з іонами двовалентного заліза (Eaton J.W., Qian M., 2002). У таких комплексах іони заліза менш здатні до спонтанного окиснення, але ак-тивніше реагують з іншими сполуками. Давно було помічено, що ЕДТА у ви-соких концентраціях перешкоджає утворенню тетрамерної форми Г6ФДГ, так званого “НАДФ-ферменту” (Yue R.H., Noltmann E.A., Kuby S.A., 1969).

Глюкозо-6-фосфат та НАДФ+ відповідно в концентраціях 1,0 та 0,5 мМ проявляли захисний ефект. Ці дані добре узгоджуються з результатами, отри-маними в експериментах з інактивації Г6ФДГ з L. mesenteroides (Szweda L.I., Stadtman E.R., 1992). При зв’язуванні ферменту із субстратами можуть маску-ватися чутливі до окиснення амінокислотні залишки. Проте відомо також, що в присутності високих концентрацій НАДФ+ фермент тетрамеризується (Yue R.H., Noltmann E.A., Kuby S.A., 1969), що теж може сприяти його захисту від окиснення.

Етанол, манітол, диметилсульфоксид та сечовина вважаються ефективними знешкоджувачами гідроксильних радикалів (Eaton J.W., Qian M., 2002; Davies K.J. et al., 1987). У наших експериментах, Г6ФДГ, яка інактивувалась в системі Fe2+/Н2О2 у присутності манітолу та диметилсульфоксиду, мала на 12% вищу залишкову активність, ніж та, яка інактивувалась у контрольних зразках (рис. 12). З усіх досліджуваних речовин найкращий захисний ефект проявила сечовина. Так, активність ферменту, інактивація якого відбувалась у присутності сечовини, була в 1,5 раза вищою за активність в контрольних зраз-ках.

Таким чином, результати наших експериментів дозволяють припустити, що в системі Fe2+/Н2О2 інактивація Г6ФДГ відбувається внаслідок окиснення фер-менту гідроксильними радикалами. Про це свідчить наявність захисного ефек-ту при інактивації в присутності диметилсульфоксиду, манітолу та сечовини, які вважаються знешкоджувачами цього типу радикалів. Субстрати також за-хищають Г6ФДГ від інактивації, як це було показано раніше. Однією з причин втрати активності ферменту є зміни у характері його зв’язування з субстратом і коферментом. Оскільки субстрати захищають Г6ФДГ від інактивації, то мо-жна припустити, що окиснюються амінокислотні залишки ферменту, які зна-ходяться або в активному центрі, або поблизу нього.

На основі проведених нами експериментів можна запропонувати метод для виявлення білків, чутливих до окисної модифікації. Суть цього методу можна представити у вигляді узагальнюючої схеми (рис. 13).

Дана схема демонструє взаємозв’язок між активністю певних анти-окси-дантних ферментів (в нашому випадку – це каталаза), активністю фермен-тів, які можуть бути чутливими до окисної модифікації, та вмістом модифіко-ваних окисненням білків. Доки підтримується баланс між утворенням і зне-шкоджен-ням АФК, клітина не зазнає оксидативного стресу. Цей баланс у на-шому ви-падку визначався трьома факторами, а саме: функціонуванням сис-теми анти-оксидантного захисту, інтенсивністю метаболічної генерації АФК і наявністю чинників, які підвищують імовірність окисної модифікації біологіч-но важли-вих молекул. Дефект якогось з антиоксидантних ферментів призво-дить до зниження потужності антиоксидантного захисту. Якщо одночасно з цим зни-женням підсилюється інтенсивність продукування АФК, то зростає імовірність окиснення чутливих до нього ферментів. Окиснення ферментів можна зафік-сувати за зниженням їх активності і одночасним підвищенням вмісту карбоні-льних груп білків. В свою чергу, чутливість певних ферментів до окиснення можна визначати in vitro, генеруючи АФК у штучних системах окиснення.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і вирішення окремих ас-пектів проблеми захисту організму при оксидативному стресі. Виявлено, що каталаза відіграє суттєву роль у зменшенні імовірності вільнорадикального окиснення білків і ліпідів у дріжджів Saccharomyces cerevisiae. Отримані ре-зультати поглибили відомості про функціонування антиоксидантної системи у дріжджів за умов дії іонів заліза та при утилізації ними незброджуваних дже-рел вуглецю.

1. Різні ізоферменти каталази, зокрема цитозольна каталаза, забезпечують стій-кість дріжджів Saccharomyces cerevisiae до дії іонів двовалентного заліза. Так, дефектні за цитозольною та пероксисомною каталазами штами після об-робки FeSO4 в концентрації 10 ммоль/л мали, відповідно, на 81 і 62% меншу кількість життєздатних клітин, ніж батьківський штам.

2. При вирощуванні в середовищі з 0,5 ммоль/л FeSO4 вміст тіобарбітурат-ак-тивних продуктів у дефектного за цитозольною каталазою штаму Saccharo cerevisiae був вищим, ніж у батьківського штаму. Отже, цитозольна ка-та-лаза перешкоджає перетворенням, які призводять до ініціації пероксидного окиснення ліпідів при надлишку іонів заліза в живильному середовищі.

3. За використання етанолу як джерела вуглецю та енергії у Saccharomyces cere каталаза сприяє зменшенню ймовірності вільнорадикального окис-нення білків, зокрема глюкозо-6-фосфатдегідрогенази. Так, при культивуванні в аерованому середовищі з етанолом як джерелом вуглецю дефектні за різ-ними ізоферментами каталази штами дріжджів мали в 2–7 разів вищий вміст карбонільних груп білків, ніж батьківський штам. При вирощуванні у середо-вищі з етанолом глюкозо-6-фосфатдегідрогеназна активність батьківського штаму була в 1,9 раза вища, ніж при вирощуванні на середовищі з глюкозою, тоді як у штаму, дефектного за обома ізоферментами каталази – в 1,6 раза нижча.

4. Каталазна активність Saccharomyces cerevisiae пригнічується in vivo
3-аміно-1,2,4-тріазолом в концентраціях 1–10 мМ. Проте таке пригнічення не рівноцінне генетично зумовленій відсутності одного або обидвох ізоферментів каталази, про що свідчить відсутність адекватних змін в активності анти-оксидантних та пов’язаних з ними ферментів, у вмісті продуктів вільно-ради-кального окиснення білків, тощо.

5. Диметилсульфоксид, манітол та сечовина частково запобігають інактивації глюкозо-6-фосфатдегідрогенази в системі окиснення “Fe2+/Н2О2”.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Господарьов Д.В., Лущак В.І. Обмін іонів заліза у дріжджів // Укр. біохім. журн. – 2005. – Т. 77, № 3. – С. 5–19.

2. Господарьов Д.В., Мандрик С. Я., Лущак В. І. Роль каталаз у захисті білків від окислення у дріжджів Saccharomyces cerevisiae за використання ними ета-нолу як джерела вуглецю // Укр. біохім. журн. – 2005. – Т. 77, № 2. – С. 162-165.

Дисертант запланував роботу, здійснював посів культур дріжджів, готував безклітинні екстракти для аналізу, визначав всі показники і підготував руко-пис статті

3. Господарьов Д.В., Байляк М.М., Лущак В.І. Вільнорадикальна інактивація in vitro глюкозо-6-фосфатдегідрогенази Saccharomyces cerevisiae // Укр. біохім. журн. – 2005. – Т. 77, № 1. – С. 58–64.

Планування, всі етапи очищення і визначення активності ферменту, а також статистична обробка даних і написання статті здійснені дисертантом

4. Lushchak V.I., Gospodaryov D.V. Catalases protect cellular proteins from oxidamodification in Saccharomyces cerevisiae // Cell Biol. Intl. – 2005. – Vol. 29, №3. – P. 187-192.

Дисертант запланував роботу, здійснював посів культур дріжджів, готував безклітинні екстракти для аналізу, визначав всі показники, статистично об-робив дані і підготував рукопис статті

5. Господарьов Д.В., Лущак В.І. Вплив іонів заліза на активність антиоксидант-них ферментів дріжджів Saccharomyces cerevisiae // Укр. біохім. журн. – 2004. – Т. 76, № 6. – С. 100–105.

Дисертант знімав криві росту мікроорганізмів, здійснював посів культур дріжджів, готував безклітинні екстракти для аналізу, визначав всі показники, статистично обробив дані і підготував рукопис статті

6. Господарьов Д., Мандрик С., Русин У., Паньків Л. Вплив іонів заліза на показ-ники оксидативного стресу і активність антиоксидантних ферментів у дріжджів Saccharomyces cerevisiae // Вісник Прикарпатського університету. – 2003. – Вип. 3. Біологія. – С. 137–144.

Дисертант запланував роботу, здійснював посів культур дріжджів, готував безклітинні екстракти для аналізу, визначав всі показники, статистично об-робив дані і підготував рукопис статті

7. Господарьов Д.В. Роль каталази та супероксиддисмутази у захисті клітин дрі-жджів Saccharomyces cerevisiae від оксидативних пошкоджень // VII Між-народна науково-практична конференція “Наука і освіта ‘2004”. – Дніпропет-ровськ, 2004. – С. 14–16.

8. Господарьов Д.В. Регуляторна та захисна роль цитозольної каталази у дріж-джів Saccharomyces cerevisiae // X З’їзд Товариства мікробіологів України. – Одеса, 2004. – С. 42.

9. Gospodaryov D., Pankiv L., Rusyn U., Mandryk S. The effect of iron on catalase and superoxide dismutase activities in yeast Saccharomyces cerevisiae // First (InUkrainian Congress for Cell Biology. – Lviv, 2004. – P. 68.

10. Gospodaryov D., Mandryk S., Bailyak M., Lushchak V. Catalases protect pro-teins of Saccharomyces cerevisiae against oxidation under growth on ethanol // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology. – Lviv, 2004. – P. 75.

АНОТАЦІЯ

Господарьов Д. В. Окиснення білків і ліпідів у дріжджів Saccharomyces cerevisiae та можлива роль каталаз у його запобіганні. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Чернівецький національний університет ім. Ю. Федьковича, Чернівці, 2005.

Дисертація присвячена проблемі окиснення білків і ліпідів у системах in vitro та in vivo. Знайдено, що у концентраціях більших за 1 мМ сульфат заліза знижує виживання дріжджів. Дефектні за каталазою штами виявились чутли-вішими до дії іонів заліза, ніж батьківський штам. Доданий в живильне сере-довище в концентраціях 0,02 та 0,5 мМ сульфат заліза не впливав на швидкість та характер росту культур дріжджів. Проте клітини дефектного за цитозоль-ною каталазою штаму на середовищі з 0,5 мМ сульфату заліза мали в 1,8 раза вищий вміст тіобарбітурат-активних продуктів та в три рази вищу активність супероксиддисмутази, ніж батьківський штам.

Дефектні за каталазами дріжджі повільніше росли на середовищі з етано-лом як джерелом вуглецю. У дріжджів, вирощених на середовищі з етанолом, вміст карбонільних груп білків негативно корелював з активністю глюкозо-6-фосфат-дегідрогенази та каталази. Позитивну кореляцію знайдено між активні-стю каталази та глюкозо-6-фосфатдегідрогенази. Зроблено висновок про те, що каталази можуть in vivo запобігати модифікації білків, чутливих до окис-нення.

Досліджено інактивацію глюкозо-6-фосфатдегідрогенази in vitro у системі окиснення Fe2+/Н2О2. Сечовина, манітол, диметилсульфоксид, а також НАДФ+ і глюкозо-6-фосфат деякою мірою запобігали інактивації, тоді як АТФ, АДФ та ЕДТА посилювали її. Виявилось, що частково інактивований фермент від-різняється від нативного за кінетичними параметрами – максимальною швид-кістю реакції та константою Міхаеліса.

Ключові слова: дріжджі Saccharomyces cerevisiae, каталаза, ТБК-активні продукти, карбонільні групи білків, антиоксидантна система, іони заліза.

АННОТАЦИЯ

Господарёв Д. В. Окисление белков и липидов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и возможная роль каталаз в его предотвращении. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Черновицкий национальный универ-ситет им. Ю. Федьковича, Черновцы, 2005.

Диссертация посвящена проблеме окисления белков и липидов в системах in vitro и in vivo. В качестве модельной системы выбраны клетки дрожжей S. cerevisiae, дефектные по каталазам. Найдено, что двухчасовая обработка клеточных суспензий сульфатом железа в концентрации 10 мМ снижает на 81 и 62% количество жизнеспособных клеток у дрожжей, дефектных по цито-зольной и пероксисомной каталазе, соответственно. Добавленный в питатель-ную среду в концентрациях 0,02 и 0,5 мМ сульфат железа не влиял на скорость и характер роста культуры дрожжей. Тем не менее, клетки исследуемых штаммов, выращенные в среде с 0,5 мМ сульфата железа, различались по со-держанию тиобарбитурат-активных продуктов и активности супероксиддис-мутазы. У штамма, дефектного по цитозольной каталазе, наблюдалась в три раза более высокая активность супероксиддисмутазы и в 1,8 раза более высо-кое содержание тиобарбитурат-активных продуктов, чем у родительского штамма.

Дефектные по каталазам дрожжи медленней росли на среде с этанолом в качестве источника углерода. Активности таких ферментов, как каталаза, супероксиддисмутаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и глутатионредуктаза, были значительно выше у дрожжей, выращенных на среде с этанолом. У них же со-держание карбонильных групп белков негативно коррелировало с актив-ностью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и каталазы. Положительная корреля-ция найдена между активностью каталазы и активностью глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы. Сделан вывод о том, что при выращивании дрожжей на не-сбраживаемых источниках углерода каталазы могут предотвращать модифи-кацию белков, чувствительных к окислению. Тем не менее, генетически обу-словленная недостаточность того или иного изофермента каталазы не равно-ценна отсутствию каталазной активности при ингибировании. Действие инги-битора каталазы, 3-амино-1,2,4-триазола, на S. cerevisiae в концентрациях 1–10 мМ приводило к снижению каталазной активности в 1,9–2,6 раза. Одна-ко существенного снижения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при этом не отмечалось.

Инактивацию глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы исследовано in vitro в сис-теме окисления Fe2+/Н2О2. Мочевина, маннитол, диметилсульфоксид, а также НАДФ+ и глюкозо-6-фосфат в некоторой мере предотвращали инактивацию, тогда как АТФ, АДФ и ЭДТА усугубляли её. Оказалось, что частично ин-акти-вированный фермент отличается от нативного по кинетическим пара-метрам – максимальной скорости реакции и константе Михаэлиса.

Ключевые слова: дрожжи Saccharomyces cerevisiae, каталаза, ТБК-актив-ные продукты, карбонильные группы белков, антиоксидантная система, ионы железа.

SUMMARY

Gospodaryov D. V. Protein and lipid oxidation in the yeast Saccharomyces cerevisiae and possible role of catalases for its prevention. – Manuscript.

The thesis for the candidate’s degree in speciality 03.00.04 – Biochemistry. – Chernivtsi National University named after Yu. Fed’kovich, Chernivtsi, 2005.

The thesis is devoted to the problem of protein and lipid oxidation in in vitro and in vivo systems. It has been found that in concentrations more than 1 mM fersulphate lowered the survival of yeast cells. Catalase deficient strains were more sensitive to iron, than parental strain. Ferrous sulphate added in the medium at conof 0.02 and 0.5 mM did not affect the pattern and the rate of growth. Neverthe-less, cells of cytosolic catalase deficient strain grown with 0.5 mM ferrous sulhad 1.8-fold higher content of thiobarbituric-acid-reactive substances and 3-fold higher superoxide dismutase activity.

Catalase deficient yeast grew slowly in the medium with ethanol as a sole carbon source. In the ethanol-grown yeast, content of protein carbonyls negatively corre-lated with glucose-6-phosphate dehydrogenase and catalase activities. Therefore, it can be supposed that in vivo catalases prevent the modification of proteins, sensitive to oxidation.

It has been investigated the inactivation in vitro of glucose-6-phosphate dein the Fe2+/Н2О2 oxidation system. Urea, mannitol, ethanol, dimethyland also NADP+ and glucose-6-phosphate to some extent prevented inwhile ATP, ADP and EDTA exacerbated it. It was found that kinetic pa-rameters, the maximal velocity and the Michaelis constant, were different in native and partially inactivated enzyme.

Key words: yeast Saccharomyces cerevisiae, catalase, TBA-reactive substances, protein carbonyls, antioxidant system, iron ions.