МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Бараннік Тетяна Володимирівна

УДК 577.151.04:57.044:546(492+732)

МЕХАНIЗМИ ДIЇ ХЛОРИДУ РТУТI ТА

ХЛОРИДУ КОБАЛЬТУ НА АКТИВНIСТЬ

-АМIНОЛЕВУЛIНАТСИНТАЗИ В ПЕЧIНЦI ЩУРIВ

03.00.04– Біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 1999

Дисертацією є рукопис. Роботу виконано на кафедрі біохімії Харківського державного університету Міністерства освіти України.

Науковий керівник: | доктор біологічних наук, професор

Каліман Павло Авксентійович,

завідувач кафедрою біохімії

Харківського державного університету

Міністерства освіти України

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, професор

Чечоткін Олексій Васильович,

завідувач кафедрою хімії та біохімії

Харківського зооветеринарного інституту

Міністерства освіти України

доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник,

Перський Євген Ефроїмович, професор за кафедрою фізіології людини та тварин Харківського державного університету Міністерства освіти України

Провідна установа | Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (відділ біохімії коферментів), м.Київ.

Захист відбудеться " 07 " квітня 1999 р. о 1515 годині на засіданні спеціа-лі-зова-ної вченої ради К 64.051.17 при Харківському державному універси-те-ті Міністерст-ва освіти України за адресою: 310077, Харків, пл.Свободи, 4, ауд.III-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського державного університету Міністерства освіти України за адресою: 310077, Харків-77, пл.Свободи, 4.

Автореферат розісланий 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник |

Падалко В.І.

Загальна характеристика робоТИ

Актуальність теми. Широке використання важких металів в ви-роб-ни-чих цілях, збільшення об’єму їх добування та переробки спри-чи-ни-ли остан-нім часом значне накопичення важких металів та їх сполук в нав-ко-лиш-ньо-му середовищі [Трахтенберг И.М., Колесников В.С., Луковенко В.П., 1994]. Над-лиш-кове над-ход-жен--ня металів до організму людини та тварин ви-кли-кає різноманітні функ-ціо-наль-ні та ме-та--бо-лічні порушення [Москалев Ю.И., 1985; Ершов Ю.А., Плетенева Т.В., 1989], у тому числі пов'я-за-ні з біо-синтезом ге-му та гемо-про-теї-нів [Marks G., 1985]. Роз-виток токсич-них пор-фірій та зниження вмісту клітинних гемо-про-те-ї--нів під впливом солей важ-ких металів в значній мірі є наслідком пору-шен-ня ре-гу-ляції ключового фер-менту біосинтезу гему -амінолеву-лі-нат-синтази (КФ 2.3.1.37) [Rimington C., 1989]. Вста--новлено, що солі ко-баль-ту, плати-ни, ні-ке-лю або заліза викликають двох-фазні зміни активності -амі--но--ле-ву-лі-нат--син--та-зи (-АЛК-синтази) в пе-чін-ці ссавців: зни-жен--ня в перші го-ди-ни і по-дальше підвищення [Maines M.D., 1984; Калиман П.А., Беловецкая И.В., 1986]. Однак ме-ха-нізми як гальмування, так і індук-ції іонами металів клю-чо-вого фер-менту біо-син-тезу гему залиша-ються не проясненими. Не вив-че-но також вплив на -АЛК-син-тазну актив-ність неорга-нічних сполук ртуті, вміст яких в навко-лиш--нь-ому сере-до-вищі значно збіль-шилось [Трахтенберг И.М., Коршун М.Н., 1990].

Поряд з прямою інгібуючою дією на синтез або активність -АЛК-син-тази, солі важких металів можуть викликати підвищення в клітинах печінки кон-цен-т--ра-ції вільного гему [Калиман П.А. и др., 1996; Ни-кит---ченко И.В. и др., 1998], що є основним регулятором активності -АЛК-син--тази [May B.K. et al., 1990; Ades I.Z., 1990; Lathrop J.T., Timko M.P., 1993], але джере-ла накопи-чення гему не встановлені. Актуальною проблемою в цьому плані постає пошук можливих шляхів запобігання гемолізу під впливом важ--ких металів з метою виключити надмірне надходження гему в печінку з кров’яно-го руслу. Додатковим меха-ніз-мом дії іонів Co2+, Zn2+, Sn2+ на -АЛК-син--тазу може з'явитись формування метало-порфіринових комплексів, тим ча-сом як іони Hg2+, Pb2+, Ni2+, Pt2+ та інші не здатні заміщувати Fe2+ в гемо-про--теї--нах [Maines M.D., 1984]. Вказані розбіжності властивостей іонів кобаль-ту та ртуті, поряд з їх широким ви-корис-тан-ням в практичній діяль-нос--ті людини та значним розповсюдженням в зов-нішньому середовищі [Трах-тен-берг И.М., Колесников В.С., Луковенко В.П., 1994], обумовили вибір цих металів для дослідження.

Враховуючи вищевикладене, встановлення механізмів дії хлориду ртуті та хлориду кобальту на активність ключового ферменту біосинтезу гему, -АЛК-синтази, в печінці ссавців з’являється актуальним та перспективним в плані подальшої розробки рекомендацій щодо лікування гострих отруєнь солями важких металів та токсичних порфірій.

Взаємозв'язок даної роботи з науковими програмами. Дисертацій-не дослідження було частиною держбюджетної теми НДІ біології Харківсь-кого держуніверситету "Клiтиннi та молекулярнi механiзми адаптацiї мета-бо-лiзму при окисному стресi" (№ ДР 0197U008188).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було встановлення основ-них меха-ніз-мів дії іонів Hg2+ і Со2+ на активність -АЛК-синтази в печінці і ролі гемолізу та змін рівня від-нов-ле-но--го глутатіону (GSH) в реалізації цих механізмів. У зв'язку з метою до-слід--жен-ня, а також враховуючи, що рівень відновленого глутатіону в значній мірі ви-значається активністю глутатіон-редук-тази і генерацією НАДФН [Pinto R.E., Barley W., 1969], були поставлені такі задачі:

1.

1.

1.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що хлорид кобальту викликає нако-пи-чен-ня в сироватці крові модифікованих кобальтом гемопротеїнів та більш виражене і тривале, у порівнянні з хло-ри-дом ртуті, гальмування актив-нос-ті -АЛК-син-тази в печінці.

Вперше встановлено, що зниження активності -АЛК--син-тази в печінці і накопичення продуктів гемолізу в сироватці крові в перші години дії HgCl2 та CoCl2 запобігається при попередньому вве-ден-ні, від-по-відно, -адрено-бло-ка-тору пропранололу та відновленого глута-тіону.

Показано, що індукуюча дія вивчених солей металів на -АЛК--син-тазну активність може бути послаблена попереднім введенням пропранололу або, як вста-новлено для хлориду кобальту, введенням відновленого глутатіону.

Встановлено, що зміни вмісту відновленого глутатіону в печінці при дії HgCl2 та CoCl2 в певній мірі залежать від накопичення продуктів гемолізу в сироватці крові і запобігаються в умовах відсутності гемолізу.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Здобуті в цій роботі дані свідчать про залежність динаміки активності ключо-вого ферменту біо-син-тезу гему від накопичення продуктів гемолізу і здатності іонів металу формувати металопорфіриновий комплекс, що значно роз-ширює уяви щодо регуляції біосинтезу гему в печінці ссавців.

Практичне значення має встановлення важливої ролі гемолізу в меха-ніз--мах дії іонів важких металів на біосинтез гему в печінці, а також здатності -адре-но-бло-ка-тору пропранололу та відновленого глутатіону запобігати гемо-лі-зу в перші години дії, відповідно, HgCl2 та CoCl2. Зберігання актив-нос-ті -АЛК-синтази в печінці на контрольному рівні в перші години і змен-шен-ня або запобігання подальшої індукції ферменту під впливом цих металів в умовах відсутності гемолізу може бути викорис-та-но при розробці тера-пев-тичних за-хо-дів щодо лікування отруєнь солями важких металів та токсичних порфирій.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційне до-с-лід-ження виконано під нау-ковим керівництвом докт. біол. наук П.А.Калімана, в співробіт-ницт-ві з канд. біол. наук І.В.Нікітченко, з якими автор має спільні публікації. Всі ре-зуль-тати, що приведені в рукопису, одержані автором самостійно. Дисер-тантом особисто проведено екс-пе-рименти і визначення вибраних для дослід-ження біохімічних показників, проаналізована література за темою до-слід-ження, обговорено одержані результати.

Апробація результатів дисертації. За матеріалами дисертації зроблені доповіді на міжнародному симпозіумі ``Биологические механизмы старения", Харків, 1996 р ., на VII біохімічному з'їзді, Київ, 1997 р., на між-на-род-ній конфе-рен-ції ``Фундаментальные и прикладные аспекты со-вре-менной биохимии", С.-Петербург, 1998 р., на науковій конференції моло-дих вчених-біологів ХДУ, Харків 1996 р.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті та 5 тез доповідей.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, методичної частини, трьох розділів результатів досліджень та їх обговорення, висновків і переліку літературних посилань (260 джерел). Робота викладена на 136 стор. Результати досліджень ілюстровано 19 рисунками та 17 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділу роботи подано огляд літератури за темою дисер-та-ції. Особ-лива увага приді-ле-на основним механізмам регуляції -аміно-леву-лі-нат--син--тази в печінці ссавців, в тому числі ролі гему, гем-зв’язувальних білків та гормональних факторів в регуляції ферменту, а також впливу солей важ-ких металів та змін рівню відновленого глутатіону в печінці. Розглянути біо-логічні функції GSH, та фактори, що впливають на його вміст в печінці ссавців.

У другому розділу описано матеріали та основні методи дослідження.

Матеріали та методи дослідження

В роботі використані щури лінії Вістар 3-х місячного віку обох статей. Самки знаходились в фазі proestrus [Киршенблат Я.Д., 1973]. CoCl26H2O та HgCl2 було введено в сублетальній дозі, відповідно, 3 мг [Maines M.D., 1977; Калиман П.А., Бело-вецкая И.В, 1986] та 0,7 мг [Maines M.D., 1977] на 100 г маси тіла тварини. Пропранолол (0,025% розчин) було введено в дозі 0,15 мг на 100 г маси тіла [Bassukevitz Y. et al., 1989], відновлений глутатіон (10% розчин) – в дозі 50 мг на 100 г маси тіла [Конвай В.Д. и др., 1988]. Всі сполуки введено внут-рішньочеревинно. При сумісному введенні пропра-но-лол було введено за 30 хв до введення хлориду кобальту або ртуті, відновлений глутатіон – за 15 хв до введення CoCl2. Тварин брали в дослід після введення HgCl2 або CoCl2 – через 30 хв, 2 год або 24 год; після введення тільки пропранололу – через 1 год, 2,5 год або 24 год (контроль на блокатор); після введення тільки відновленого глутатіону – через 15 хв, 45 хв та 2 год (контроль на GSH). Об'єктом дослідження були печінка та кров тварин. В дослідах in vitro вико-ристано печінку інтактних щурів-самців.

Печінку перфузували холодним фізіологічним розчином in situ. Пост-міто-хондріальну фракцію отримували диференціальним центри-фу-гу-ван-ням в 0,1 М К-Na-фосфатном буфері, pH 7,5 [Ещенко Н.Д., 1982].

Визначення -АЛК-синтазної актив-ності проведено в гомогенаті печінки за методом [Marver H.S. et al., 1966]. -АЛК, що утворювалась, було переведено до форми піролу кип'ятін-ням в присутності ацетилацетону [Granick S., 1966]. Пірольну форму -АЛК відділяли від аміно-ацетону [Sassa S. et al., 1975] та ії вміст визначали після за-бар-в---лювання реактивом Эрліха. Питому активність ферменту виражали в нмоль -АЛК/ мг білку за 1 год.

Вміст GSH визначали в гомогенаті печінки спектрофотометрично по поглинанню комплексу з аллоксаном при 305 нм [Пути-ли-на Ф.Е., 1982] та виражали в мкмоль/г сирої тканини. Активність глутатіонредуктазы [Чернов Н.Н., 1979] та глю-ко--зо--фосфатдегидрогенази [Bottomley R.H. et al., 1963] визначали в пост-міто-хонд-рі-аль-ній фракції спектрофотометрично по зміні поглинання НАДФН (340 нм) при 37oC в присутності відповідних суб-стратів. Актив-ність ферментів вира-жали в нмоль НАДФН/мг білку за 1 хв.

Спектр поглинання сироватки крові реєстрували на двохпроменевому спектрофотометрі Specord UV-VIZ при 37oC в 0,1 М Na-фосфатному буфе-рі, рН 7,1 [Hrkal Z., Muller-Eberhard U., 1971]. На підставі змін оптичної густини сироватки крові в Soret-зоні (зона поглинання гемопротеїнів: 380-450 нм) та при 280 нм роби-ли висновок про вміст, відповідно, гему та гемопротеїнів [Smith A., 1993; Yone T. et al., 1974] (продукти гемолізу), та гемопексину [Takahashi N. et al., 1985]. Оптичну густину розраховували по різ-ниці максимуму та мінімуму погли-нання в відповідній зоні [Perkampus H.-H., 1992] та виражали в A/мг білку.

Вміст білку визначали за методом Лоурі в модифікації Міллера [Miller G.L., 1959]. Статистичну обробку проведено за методом Стьюдента-Фішера.

У третьому, четвертому та п’ятому розділах дисертації наведено основні результати досліджень та їх обговорення.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив хлориду ртуті та хлориду кобальту на активність -аміно-ле-ву-лі-нат--синтази та вміст відновленого глутатіону в печінці щурів. Хло-рид ртуті та хлорид кобальту викликають двохфазну зміну -АЛК-син-таз-ної ак-тив-ності в печінці щурів обох статей в першу добу після введення: зни-жен-ня в перші години з наступним підвищенням на 24 годину (табл.1,2).

Таблиця 1

Активність -АЛК-синтази, глутатіонредуктази, глюкозо-6-фосфат-дегидро-ге-нази (Гл-6-ФДГ) та вміст GSH в печінці і оптична густина сироватки крові щурів-самців в різні строки після введення HgCl2 або CoCl2 (M±m, n=6-8) |

Час після дії

Дія | Контроль | 30 хв | 2 год | 24 год

Активність -АЛК-синтази, нмоль АЛК/мг білку за 1 год

HgCl2 | 0,098±0,003 | 0,067±0,006(p3) | 0,096±0,007 | 0,168±0,009(p3)

CoCl2 | 0,085±0,007 | 0,025±0,004(p3) | 0,036±0,004(p3) | 0,141±0,010(p2)

Оптична густина сироватки крові в Soret-зоні, А/мг білку

HgCl2 | 0,045±0,002 | 0,064±0,004(p2)––

CoCl2 | 0,045±0,002 | 0,052±0,003(t) | 0,060±0,002(p2) | 0,036±0,002(p1)

Оптична густина сироватки крові при 280 нм, А/мг білку

HgCl2 | 0,69±0,06 | 0,52±0,03(p1)––

CoCl2 | 0,71±0,05 | 0,60±0,06 | 0,55±0,02(p1) | 0,69±0,03

Вміст відновленого глутатіону, мкмоль/г тканини

HgCl2 | 4,81±0,24 | 4,19±0,2(t) | 3,47±0,14(p3) | 5,34±0,23

CoCl2 | 4,41±0,22 | 3,64±0,3(t) | 3,88±0,3 | 5,08±0,26(t)

Активність глутатіонредуктази, нмоль НАДФН/мг білку за 1 хв

HgCl2 | 73,9±5,8 | 70,3±4,1 | 55,2±4,9(p1) | 75,9±5,2

CoCl2 | 69,9±5,4 | 82,9±5,1 | 53,7±7,1(p1) | 66,8±4,2

Активність Гл-6-ФДГ, нмоль НАДФН/мг білку за 1 хв

HgCl2 | 27,3±2,5 | 30,2±2,4 | 20,8±1,2(p1) | 32,3±2,6

CoCl2 | 31,3±2,4 | 37,7±3,0 | 42,5±3,2(p1) | 53,2±5,1(p2)

Примітки: p1 – p<0,05 відносно до контролю; p2 – p<0,01 відносно до конт-ро-лю; p3 – p<0,001 відносно до контролю; t – 0,05<p <0,1 відносно до контролю

Гальмування ферменту в печінці супроводжується накопиченням продуктів гемолізу в сироватці крові (див.табл.1,2, рис.1). Основним механіз-мом гемолізу в перші години після введення СоCl2 за даними літера-тури яв-ляєть-ся посилення віль-но--радикального окислення [Ribarov S.R., Benov L.C., 1981], тим часом, як гемоліз під впливом HgCl2 пов’язано, насам-перед, з пря-мою модифікацією сульф-гідрильних ком--по-нентів мембран [Yang M., 1993]. Зни-жен-ня вмісту гемо-пек-сину в сироватці крові щурів через 30 хв після вве-дення HgCl2 та 2 год після введення CoCl2 може бути зумовлено його при-єднуванням до специфічних рецеп-то-рів при транспорті гему з кров'яного русла в печінку [Smith A., 1981] в умовах накопичен-ня продуктів гемолізу (див.табл.1,2).

Таблиця 2

Активність -АЛК-синтази, глутатіонредуктази, глюкозо-6-фосфат-дегидро-генази (Гл-6-ФДГ) та вміст GSH в печінці і оптична густина сироватки крові щурів-самиць в різні строки після введення HgCl2 або CoCl2 (M±m, n=6-8) |

Час після дії

Дія | Контроль | 30 хв | 2 год | 24 год

Активність -АЛК-синтази, нмоль АЛК/мг білку за 1 год

HgCl2 | 0,081±0,005 | 0,049±0,005(p2) | 0,079±0,005 | 0,266±0,013(p3)

CoCl2 | 0,084±0,005 | 0,038±0,005(p2) | 0,033±0,004(p3) | 0,196±0,016(p3)

Оптична густина сироватки крові в Soret-зоні, А/мг білку

HgCl2 | 0,021±0,002 | 0,049±0,006(p2)––

CoCl2 | 0,021±0,002 | 0,060±0,006(p2) | 0,039±0,004(p2) | 0,022±0,002

Оптична густина сироватки крові при 280 нм, А/мг білку

HgCl2 | 0,76±0,03 | 0,54±0,02(p1)––

CoCl2 | 0,76±0,06 | 0,64±0,02(t) | 0,52±0,02(p2) | 0,61±0,03(p1)

Вміст відновленого глутатіону, мкмоль/г тканини

HgCl2 | 4,10±0,22 | 3,26±0,3(t) | 2,78±0,20(p2) | 7,54±0,3(p3)

CoCl2 | 4,11±0,16 | 5,07±0,33(t) | 4,33±0,32 | 8,13±0,4(p3)

Активність глутатіонредуктази, нмоль НАДФН/мг білку за 1 хв

HgCl2 | 61,3±4,4 | 62,7±6,7 | 68,5±3,7 | 67,0±5,1

CoCl2 | 54,5±4,7 | 61,1±3,6 | 66,8±5,5 | 70,8±3,8(p1)

Активність Гл-6-ФДГ, нмоль НАДФН/мг білку за 1 хв

HgCl2 | 43,3±3,9 | 49,5±4,8 | 68,5±3,7(p2) | 77,0±3,9(p3)

CoCl2 | 45,3±4,0 | 46,1±6,2 | 45,4±4,2 | 39,5±4,4

Примітки: p1 – p<0,05 відносно до контролю; p2 – p<0,01 відносно до конт-ро-лю; p3 – p<0,001 відносно до контролю; t – 0,05<p <0,1 відносно до контролю

Результати дослідів in vitro свідчать про можливість прямої інгібуючої дії іонів ртуті на активність -АЛК-синтази, але для цього необхідні досить ви-сокі концентрації HgCl2 (50 мкМ, табл.3). За даними літератури, лише незначна доля іонів ртуті надходить до печінки при введенні HgCl2 in vivo [Zalups R.K., 1993], крім того, реакційно-здібні сульфгідрильні групи в ключовому ферменті біосинтезу гему відсутні [Ferreira G.C., Gong J., 1995]. Таким чином, враховуючи ці дані, а також збереження на рівні контролю вмісту GSH та активності ферментів, що вмі-щують сульфгід-риль-ні гру-пи в активному центрі (глутатіонредуктази, глю-ко-зо-6-фосфат-дегидро-ге-нази, див.табл.1,2) через 30 хв після ін’єкції HgCl2, концентрація вільних іонів ртуті в печінці в ці строки, очевидно, не досягає достатнього рівню щодо прямого гальмування -АЛК-синтазної активності.

Таблиця 3

Активність -АЛК-синтази в печінці щурів в дослідах in vitro при інкубації гомогенату печінки інтактних щурів-самців в присутності HgCl2, геміну, або сироватки крові (кінцева концентрація 10%) інтактних і дослідних щурів (нмоль АЛК/мг білку за 1 год, M±m, n=4-5)

Умови інкубації | Активність | Ступень інгі-бу-вання

Контроль | 0,0960,006 | 0

35 мкМ HgCl2 | 0.0430.005(p1) | 50%

50 мкМ HgCl2 | 0 | 100%

50 мкМ HgCl2 + 50 мкМ Цис | 0,0990,015 | 0

50 мкМ HgCl2 + 100 мкМ ДТТ | 0,105±0,007 | 0

0,1 мкМ гемін | 0,0410,006(p1) | 53%

1 мкМ гемін | 0 | 100%

Сироватка I а | 0,0800,009 | 18%

Сироватка II b | 0,0790,008 | 17%

Сироватка III c | 0,0490,010(p1) | 49%

Примітки: p1 - p<0,05 відносно до контролю; а – сироватка крові інтакт-них щурів; b – сироватка крові щурів через 10 хв після введення СoCl2; c – сиро-ватка крові щурів через 10 хв після введення HgCl2

Низька чутливість -АЛК-синтази до дії in vitro іонів ртуті і висока – до геміну (50% гальмування при концентрації 0,1 мкМ, табл.3), а також встановлений раніше факт появи в клітинах печінки віль-ного гему після введення HgCl2 [Калиман П.А. и др., 1998; Нікітченко И.В. и др., 1998], дозволяють зробити висновок, що зниження активності -АЛК-синтази під впливом хлориду ртуті (див.табл.1,2) зв'язане не з прямим гальмуванням іонами ртуті, а зі зростанням рівня вільного гему в печінці. Слід відзначити, що вільний гем є основним регуляторним фактором щодо активності клю-чо-во--го ферменту біосинтезу гему в нормі, здібний інгібувати перенесення по-пере-д-ника ферменту в міто-хон-дрії та зменшувати період напіврозпаду мРНК -АЛК-синтази [Lathrop J.T., Timko M.P., 1993; Cable E.E. et al., 1994]. Зв'язу-ван-ня вільного гему специфічними білками та розщеплення його в гемокси-ге-наз-ній реакції [Никитченко И.В. и др., 1998] робить можливим повернення ак-тив--ності -АЛК-синтази до контролю через 2 год після введення HgCl2.

Швидкий гемоліз під впливом HgCl2 та висока чутливість -АЛК-син-та-зи до геміну in vitro пояснюють інгібуючу дію на фермент сироватки крові, от--риманої через 10 хв після введення щурам HgCl2 (див.табл.3). Таким чи-ном, надходження в клітини печінки продуктів гемолізу може з'яви-тись ос-нов-ним механізмом зростання вмісту гему в печінці під впли-вом іонів ртуті.

Хлорид кобальту, в порівнянні з хлоридом ртуті, викликає більш ви-ражене по ступеню та тривалості інгібування -АЛК-синтази (див. табл.1,2). Однак відомо, що введення CoCl2 не викликає зростання вмісту вільного гему в печінці [Калиман П.А., Беловецкая И.В., 1986]. За даними літератури в печінці з’являються модифіковані кобальтом гемопротеїни та Со2+-прото-порфірин, що пов’язано зі здатністю Co2+ заміщувати іони Fe2+ в прото-пор-фіриновому кільці [Sinclair P. et al., 1979; Igarashi J. et al., 1978; Maines M.D., 1984]. Отримані в цій роботі результати свідчать, що дже-ре-лом Co2+-про-то-порфірину можуть з'явитись і модифіковані кобальтом продукти гемолізу, появу яких зафік-совано по зміні max піку поглинання сироватки крові в Soret-зоні через 30 хв після введення CoCl2 (рис.1).

Рис.1. Спектри поглинання сироватки крові щурів в Soret-зоні в нормі та через 30 хв після введення HgCl2 або CoCl2 . (А – абсорбція, 1 – норма, 2 – хлорид ртуті, 3 – хлорид кобальту).

Накопичення іонів ко-баль-ту в клітинах печінки вже в перші хвилини після введення [Москалев Ю.И., 1985], формування Co2+-про-то--порфіри-ну та Co2+-про-то--порфіри-н-вміщуючих білків (див.рис.1), висока чутливість -АЛК-синтази до інгібу-ючої дії Co2+ та Co2+-про-то--порфіри-ну [Maines M.D., 1984], а також по-віль-не виведення з клітин печінки моди-фікованих кобальтом гемо-про-теїнів [Yoshida T., Kikuchi G., 1978; Maines M.D., 1984] зумовлюють гли-бо-ке та тривале гальмування активності -АЛК-синтази при введенні CoCl2.

Підвищення активності -АЛК-синтази в печінці щурів через 24 год піс-ля введення солей важких металів обумовлено індукцією ферменту de novo [Maines M.D., 1984; Кали-ман П.А., Беловецкая И.В., 1986], що за останніми да-ними, пов'язана з акти-ва-цією ядер-них дихальних факторів та спосте-рі-гається у відповідь на розвиток гіпоксії [Braidotti G. et al., 1993]. Статевих роз-біж-ностей в динаміці актив-нос-ті -АЛК-син-тази в печінці не спос-те-рігається. Більш ви-ра-же-ний приріст активності ферменту в печінці щурів-самиць на 24 годину після вве-дення солей ртуті та кобальту може бути наслідком знач-ного гемолізу в пер-ші години в крові щурів-самиць (див.табл.2) та роз-витком сильнішої гіпо-ксії [Braidotti G. et al., 1993].

Хлорид ртуті, на відміну від хлориду кобальту, викликає через 2 год після введення зниження рівня від--новленого глутатіону в печінці щурів обох статей, що у самців су-про-вод-жується зниженням активності глутатіон-ре-дук-тази та глю-козо-6-фо-с-фат-дегидро-генази (див.табл.2). Різна динаміка актив-нос-ті глю-ко-зо-6-фос-фат-де-гидро--генази у щурів різної статі (див.табл.2) обумов-люється стат-евими особ--ли-востями регуляції активності цього ферменту [Hansen R.J., Jungermann K., 1987].

Вплив сумісного введення пропранололу і HgCl2 на активність -АЛК-синтази та вміст відновленого глутатіону в печінці щурів – Під сумісним введенням пропранололу та HgCl2 розуміється введення хлориду ртуті через 30 хв після ін’єкції пропранололу; під часом після сумісного введення пропранололу та HgCl2 розуміється час, що минуле з моменту введення хлориду ртуті. Cуміс-не введення пропранололу та хлориду ртуті запобігає накопиченню про-дук-тів гемолізу та зниженню активності -АЛК-синтази в печінці в першу годину дії хлориду ртуті (табл.4). Очевидно, зв’язування пропранололу, що має амфіфільні та мем-бранотропні властивості [Dash D., Rao G.R., 1990], з мембранами ерит-ро-цитів захищає мембрани від взаємодії з іонами ртуті. Таким чином, під-твер-д-жується зроблений раніше висновок, що інгібування -АЛК-синтази хло-ридом ртуті in vivo опосередковано гемолізом та над-ход-жен-ням гему з кров’яного русла до печінки.

Підвищення активності ферменту через 2 год після сумісного введення про-пранололу та хлориду ртуті свідчить, що синтез ферменту може поси-лю-ватись вже в перші години дії іонів металів в умовах відсутності гемолізу та накопичення вільного гема в клітинах печінки. Попереднє введення пропра-нололу запобігає також зниженню рівня відновленого глутатіону в печінці че-рез 2 год дії HgCl2 (див.табл.4), що може бути пов’язано з відсутністю на-копичення гему, що є прооксидантом [Vincent S.H. et al. 1988]. Зростання вмісту GSH в печінці через 24 год супроводжується підвищенням актив-нос-ті глюкозо-6-фосфатдегидрогенази (див.табл.4).

Таблиця 4

Активність -АЛК-синтази, глутатіонредуктази, глюкозо-6-фосфат-дегидро-ге-на-зи (Гл-6-ФДГ) та вміст GSH в печінці і оптична густина сироватки крові щу-рів-самиць в різні строки після сумісного введення HgCl2 та пропранололу (M±m, n=6-8) |

Час після дії HgCl2

Контроль | 30 хв | 2 год | 24 год

Активність -АЛК-синтази, нмоль АЛК/мг білку за 1 год

0,081±0,005 | 0,071±0,008 | 0,110±0,005(p1) | 0,188±0,014(p3)

Оптична густина сироватки крові в Soret-зоні, А/мг білку

0,021±0,002 | 0,026±0,003––

Оптична густина сироватки крові при 280 нм, А/мг білку

0,76±0,06 | 0,45±0,02(p2)––

Вміст відновленого глутатіону, мкмоль/г тканини

4,10±0,22 | 3,20±0,3(t) | 3,52±0,23 | 8,02±0,48(p3)

Активність глутатіонредуктази, нмоль НАДФН/мг білку за 1 хв

61,3±4,4 | 63,4±7,7 | 81,0±6,1(p3) | 80,9±6,3(p1)

Активність Гл-6-ФДГ, нмоль НАДФН/мг білку за 1 хв

43,3±3,9 | 54,1±5,8 | 84,8±5,2(p2) | 90,5±9,8(p3)

Примітки: p1 – p<0,05 відносно до контролю; p2 – p<0,01 відносно до конт-ро-лю; p3 – p<0,001 відносно до контролю; t – 0,05<p <0,1 відносно до контролю

Введення тільки пропранололу викликає in vivo нетривале інгі-бу-ван-ня -АЛК-синтазы в печінці (0,0630,005 нмоль АЛК/мг білку за 1 год, p<0,05 відносно 0,0810,007 в контролі), що може бути спричинено підвищенням рів-ня вільного гему, як показано при введенні пропранололу в культуру ге-па-тоци-тів [Epstein O. et al., 1982]. Оптична густина сироватки кро-ві в Soret-зо-ні через 1 год після дії пропранололу складає 0,0180,001 А/ мг білку, що на рів-ні 0,0210,002 в контролі, а при 280 нм – знижується до 0,480,04 А/ мг білку проти 0,760,03 в контролі (p<0,05). Таким чином, пропранолол не викликає по-си-лення гемолізу, але впливає на обмін гемопексину. В цих умо-вах інгі-бу-ван-ня -АЛК-синтази в печінці може явитись наслідком впливу пропра-но-лолу на обмін внутришньоклітинного гему та гем-зв’язувальних білків, що спри-чинить по-ру-шення транспорту гему та накопичення вільного гему в клітинах печінки [Epstein O. Et al., 1982].

Вплив сумісного введення пропранололу і хлориду кобальту на активність -АЛК-синтази і вміст GSH в печінці щурів – Під сумісним введенням пропранололу та СоCl2 розуміється введення хлориду кобальту через 30 хв після ін’єкції пропранололу; під часом після сумісного введення пропранололу та СоCl2 розуміється час, що минуле з моменту введення хлориду кобальту.

. Суміс-не введен-ня пропранололу та СoCl2 не зменшує ступеню та три-валості гальму-вання -АЛК-синтази в перші години дії хлориду кобальту (табл.5). При цьому спос-терігається більш швидке накопичення продуктів гемо-лізу, ніж після введен-ня тільки CoCl2 (вже через 30 хв проти 2 год, див. табл.1), що може бути наслідком впливу пропра-но-ло-лу на мембрани ерит-ро-цитів [Соминский В.Н. и др., 1988] та відсутності активації цАМФ-залежних анти-окси-дант--них фер-мен-тів в умовах блокади -адренорецепції [Колес-ни-чен-ко Л.С. и др., 1987]. Таким чином, пропранолол не запобігає гемолізу при введенні CoCl2, на відміну від HgCl2, що вказує на різні механізми гемолітичної дії цих металів.

Таблиця 5

Активність -АЛК-синтази, глутатіонредуктази, глюкозо-6-фосфат-дегидро-ге-нази (Гл-6-ФДГ) та вміст GSH в печінці і оптична густина сироватки крові щурів-самців в різні строки після сумісного введення СоCl2 та пропранололу (M±m, n=6-8) |

Час після дії

Контроль | 30 хв | 2 год | 24 год

Активність -АЛК-синтази, нмоль АЛК/мг білку за 1 год

0,085±0,007 | 0,030±0,005(p3) | 0,020±0,006(p3) | 0,104±0,010

Оптична густина сироватки крові в Soret-зоні, А/мг білку

0,047±0,001 | 0,063±0,004(p2) | 0,052±0,004 | 0,038±0,005

Оптична густина сироватки крові при 280 нм, А/мг білку

0,71±0,05 | 0,56±0,02(p1) | 0,55±0,03(p1) | 0,71±0,04

Вміст відновленого глутатіону, мкмоль/г тканини

4,40±0,22 | 3,28±0,33(p2) | 4,04±0,39 | 6,42±0,48(p2)

Активність глутатіонредуктази, нмоль НАДФН/мг білку за 1 хв

69,9±5,4 | 78,1±4,3 | 78,9±7,1 | 75,9±5,7

Активність Гл-6-ФДГ, нмоль НАДФН/мг білку за 1 хв

31,3±2,4 | 41,5±5,6 | 46,7±5,0(p1) | 59,8±5,6(p2)

Примітки: p1 – p<0,05 відносно до контролю; p2 – p<0,01 відносно до конт-ро-лю; p3 – p<0,001 відносно до контролю; t – 0,05<p <0,1 відносно до контролю

Зниження рівня GSH через 30 хв після сумісного введення пропра-но-ло-лу та хлориду кобальту може бути пов’язано з більш швидким нако-пи-чен-ням продуктів гемолізу в сироватці крові (див.табл.5) та участю глутатіону в антиоксидантних реакціях [Griffith O.W., Meister A., 1985], враховуючи про-окси-дантні властивості вільного гему [Vincent S.H. et al., 1988]. Слід за-зна-чи-ти, що від-новлення рівня GSH та його подальше підви-щен-ня супроводжується зрос-тан-ням активності глюкозо-6-фосфат-дегидрогенази (див.табл.5).

Виходячи з відомого факту активації -адре-но--ре-цеп-торів адре-наліном в умовах блокади -адренорецепції [Кулинский В.И., Ольхов-ский И.А., 1992] при розвитку стрес-реакції, а також стресорної дії солей важких металів [Го-ли-ков С.Н. и др., 1986], відсутність підвищення активності -АЛК-син-тази че-рез 24 год після сумісного введення пропранололу та CoCl2 (див.табл.5), так само як менший приріст активності ферменту після сумісного введення пропра-но-ло-лу та HgCl2 (див.табл.4), можуть бути пов’язані з активацією в пе-чінці протеїнкінази С, що за остан-німи даними інгібує синтез ферменту de novo [Varone C.L., Canepa E.T., 1997].

Введення тільки пропранололу викликає зни--жен-ня -АЛК-син-тазної активності в печінці щурів-самців через 1 год (0,0660,008 нмоль АЛК/мг білку за 1 год, р<0,05 відносно 0,0850,007 нмоль АЛК/мг білку за 1 год в контролі,), але гемо-ліз не спостерігається. Оптична густина сироватки кро-ві в Soret-зоні через 1 год після вве-ден-ня про-пранололу не перевищує контроль, через 2,5 год змен-шується до 0,0290,002 А/мг білку (p<0,002 відносно 0,0470,002 А/мг білку в контролі) і зберігається на цьому рівні че-рез 24 год (0,0320,005А/мг білку, p<0,01). Зниження вмісту продук-тів гемолізу та вміс-ту гемопексину так саме, як інгібування -АЛК-синтази в печінці піс-ля введен-ня про-пра--но-ло-лу можуть бути пов’язані з амфіфільними влас-ти-востями пропранололу [Dash D., Rao G.R., 1990] та його здібністю ви-кли--кати нако-пи-чення вільного гему in vitro [Epstein O. et al., 1992]. Вивіль-нення гему із ком--плексів з гем-зв’я-зу-вальними білками та порушення його тран-с-пор-ту під впливом пропранололу спричинить зни-ження -АЛК-син-таз-ної активності в печінці. Анти-гемо-літична дія пропранололу може бути зумов-лена зростанням приступності геміну, що накопився в цитоскелеті та мембра-нах еритроцитів [Solar I., Shaklai N., 1989], для гем-зв’язувальних білків, в тому числі гемо-пек-сину [Solar I. et al, 1989], та зростання періоду поновлення еритроцитів.

Вплив GSH та сумісного введення GSH та СoCl2 на активність -АЛК-синтазы та вміст відновленого глутатіону в печінці щурів Під сумісним введенням GSH та СоCl2 розуміється введення хлориду кобальту через 15 хв після ін’єкції відновленого глутатіону; під часом після сумісного введення GSH та СоCl2 розуміється час, що минуле з моменту введення хлориду кобальту.. Запобі-гання гальмування -АЛК-синтази в печінці та накопичення продуктів ге-мо-лізу в крові під впливом іонів кобальту досягається при сумісному введенні CoCl2 та відновленого глутатіону (табл.6). Це може бути зумов-ле-но прямим зв’язуванням іонів кобальту від-нов-ле-ним глутатіоном [Maines M.D., Kappas. A., 1977], участю глута-тіо-ну в анти-оксидантних реак-ці-ях [Meister A., Anderson M.E., 1983] та відновленні метгемоглобіну [Кения М.В. и др., 1993], що запобігає пошкодженню ерит-ро-ци-тар-них мемб-ран. Від-сут--ність гемолізу та накопичення вільних іонів кобальту обумовлює збері-ган-ня активності ключового ферменту біосинтезу гему в печінці на рівні контролю.

Таблиця 6

Активність -АЛК-синтази, глутатіонредуктази, глюкозо-6-фосфат-дегидро-ге-на-зи (Гл-6-ФДГ) та вміст GSH в печінці і оптична густина сироватки крові щу-рів-самиць в різні строки після сумісного введення GSH та СоCl2 (M±m, n=6-8) |

Час після дії

Контроль | 30 хв | 2 год | 24 год

Активність -АЛК-синтази, нмоль АЛК/мг білку за 1 год

0,099±0,006 | 0,104±0,010 | 0,101±0,009 | 0,106±0,010

Оптична густина сироватки крові в Soret-зоні, А/мг білку

0,029±0,003 | 0,033±0,005 | 0,030±0,006 | 0,046±0,004(p3)

Оптична густина сироватки крові при 280 нм, А/мг білку

0,55±0,02 | 0,61±0,05 | 0,59±0,04 | 0,57±0,02

Вміст відновленого глутатіону, мкмоль/г тканини

4,25±0,25 | 6,12±0,4(p3) | 4,07±0,24 | 3,98±0,23

Активність глутатіонредуктази, нмоль НАДФН/мг білку за 1 хв

62,2±2,5 | 60,2±3,2 | 68,4±4,36 | 68,2±4,99

Активність Гл-6-ФДГ, нмоль НАДФН/мг білку за 1 хв

50,8±4,5 | 57,7±3,9 | 60,7±6,2 | 75,5±5,7(p2)

Примітки: p1 – p<0,05 відносно до контролю; p2 – p<0,01 відносно до конт-ро-лю; p3 – p<0,001 відносно до контролю; t – 0,05<p <0,1 відносно до контролю

Разом з тим, введення тільки глутатіону спричиняє тривале інгібування -АЛК-синтази в печінці. Враховуючи відсутність гемолізу в перші години після введення глутатіону, зниження активності ферменту не може бути пов’язане з надходженням продуктів гемолізу до печінки з крові (табл.7). Різке зростання рівню GSH вже в перші хвилини після введення екзогенного глутатіону (див.табл.7) може викликати зміщення окис-лю-валь-но-відновленої рівноваги та конформаційні перебудови гем-зв’язувальних білків, що містять сульфгідрильні групи [Iwahara S. et al, 1995; Hitomi M. et al, 1990], з наступним накопиченням вільного гему. Інгібування -АЛК-синтазної активності при введенні відновленого глутатіону пояснює відомий факт нормалізації екскреції порфіринів у хворих зі спадковими та набутими порфіріями при введенні GSH [Ferioli A. et al., 1992]. Відсутність підвищення ак-тив-ності -АЛК-синтази через 24 год після сумісного введення хлориду ко-баль-ту і GSH може бути наслідком відсутності гемолізу в перші години, що може запобігати розвитку гіпоксії в клітинах печінки.

Таблиця 7

Активність -АЛК-синтази, глутатіонредуктази, глюкозо-6-фосфат-дегидро-ге-нази (Гл-6-ФДГ) та вміст GSH в печінці і оптична густина сироватки крові щурів-самиць в різні строки після введення GSH (M±m, n=6-8) |

Час після дії

Контроль | 15 хв | 45 хв | 2 год 15 хв

Активність -АЛК-синтази, нмоль АЛК/мг білку за 1 год

0,099±0,007 | 0,082±0,004(t) | 0,038±0,058 (p3) | 0,077±0,005(p1)

Оптична густина сироватки крові в Soret-зоні, А/мг білку

0,029±0,003 | 0,029±0,005 | 0,018±0,002(p1) | 0,025±0,002

Оптична густина сироватки крові при 280 нм, А/мг білку

0,55±0,02 | 0,57±0,04 | 0,49±0,04 | 0,50±0,03

Вміст відновленого глутатіону, мкмоль/г тканини

4,25±0,25 | 5,76±0,49(p2) | 5,31±0,38(p1) | 5,04±0,22(t)

Активність глутатіонредуктази, нмоль НАДФН/мг білку за 1 хв

62,2±2,5 | 55,1±2,3(t) | 51,7±2,9(p1)–

Активність Гл-6-ФДГ, нмоль НАДФН/мг білку за 1 хв

50,8±4,5 | 62,0±2,5(t) | 69,4±3,9(p1)–

Примітки: p1 – p<0,05 відносно до контролю; p2 – p<0,01 відносно до конт-ро-лю; p3 – p<0,001 відносно до контролю; t – 0,05<p <0,1 відносно до контролю

Зниження рівня GSH передує індукції -АЛК-синтази в проведених експериментах тільки при введенні HgCl2. В ці ж строки після введення CoCl2, а також cумісного введення хлориду ртуті та пропрано-лолу, що викликають подальшу індукцію ферменту, вірогідних змін вмісту GSH не зазначено. Зниження вмісту GSH в перші години після сумісного введення пропранололу та CoСl2 не викли-кає підвищення -АЛК-синтазної активності в печінці через 24 години. Таким чи-ном, зниження рівня GSH не є визначним в реалізації ме-ха-нізмів дії іонів ртуті та кобальту на активність -АЛК-синтази в печінці, тим часом, як накопичення продуктів гемолізу в сироватці крові та здатність іону металу до формування метало-порфіринового комплексу може розглядатись як важливий фактор щодо регуляції ключового ферменту біосинтезу гему при дії важких металів.

Висновки

1. Одержано дані про можливість послаблення дії важких металів на -АЛК-синтазну активність печінки шляхом упередження гемолізу та над-мір-ного надходження гему та металопорфіринів з кров’яного руслу до клітин печін-ки і про вплив на активність ферменту змін вмісту відновленого глутатіону в печінці.

2. Встановлено, що CoCl2 викликає накопичення моди-фі-ко-ва-них ко-баль-том продуктів гемолізу в сироватці крові та більш виражене по сту-пе---ню і тривалості, ніж HgCl2, гальмування -АЛК-синтази в печінці щурів.

3. Гемолітична дія іонів кобальту, на відміну від іонів ртуті, не запо-бі-гається попереднім введенням -адреноблокатору пропранололу, що вказує на різні механізми гемолізу під впливом HgCl2 та CoCl2. Гемоліз при дії хлориду кобальту може бути упереджено попереднім введенням від-нов-леного глутатіону.

4. Зберігання -АЛК-синтазної активності в печінці щурів на рівні конт-ролю в умовах від-сут-ності гемолізу після сумісного введення HgCl2 та -адре-но--бло-ка-тору пропранололу, а також CoCl2 та відновленого глутатіону, свід-чить про важливу роль гемолізу в механізмах дії іонів важких металів на біосинтез гему в печінці ссавців.

5. Не виявлено статевих розбіжностей в активності -АЛК-синтази у інтактних щурів, а також в характері змін активності ферменту під впливом HgCl2 та СоCl2. Більшому приросту -АЛК-синтазної активності в печінці щурів-самиць через 24 год після введення солей металів передує більш виражений гемоліз еритроцитів.

6. Встановлено, що зниження вмісту GSH в печінці в перші години дії іонів важких металів не може бути розглянуте як необхідна умова для наступного підвищення -АЛК-синтазної активності. Введення екзогенного відновленого глутатіону викликає тривале гальмування -АЛК-синтази в печінці щурів.

7. Встановлені статеві розбіжності в динаміці активності глутатіон-редуктази та глюкозо-6-фосфатдегидрогенази після введення CoCl2, HgCl2 та пропранололу in vivo. Зниження рівню GSH в печінці щурів-самців через 2 год після введення HgCl2 супроводжується інгібу-ван-ням глутатіонредуктази та глюкозо-6-фосфат-дегидро-генази.

8. Гальмування -АЛК-синтази в печінці після введення -адрено-бло-катору пропранололу і відновленого глутатіону, а також послаблення індукуючої дії іонів ртуті та кобальту на -АЛК-синтазу при сумісному введенні пропранололу та HgCl2 або CoCl2 та сумісному введенні CoCl2 і GSH підтверджують доцільність використання пропранололу та відновленого глутатіону при терапії порфірий.

Список опубликованих праць за темою дисертації

1.

2.

1.

3.

1.