К И Ї В С Ь К И Й Н А Ц І О Н А Л Ь Н И Й У Н І В Е Р С И Т Е Т

імені Т А Р А С А Ш Е В Ч Е Н К А

ГРИНЮК ІРИНА ІВАНІВНА

УДК 577+612.438.014.481+612.438.014.46

СТРУКТУРНИЙ СТАН ХРОМАТИНУ ТИМОЦИТІВ ЗА ДІЇ

ІОНІЗУЮЧОЇ РАДІАЦІЇ ТА ПЕРОКСИДУ ВОДНЮ

03. 00. 04 – біохімія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Матишевська Ольга Павлівна,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Виноградова Руфіна Петрівна,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

провідний науковий співробітник

відділу науково-інформаційних

та патентно-ліцензійних досліджень

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

Сиволоб Андрій Володимирович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

доцент кафедри загальної та

молекулярної генетики

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться ”12” грудня 2005 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр-т Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д .001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці університету Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий ”_11_” _листопада_ 2005 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Зміни конформації хроматину, його конденсація-деконденсація відіграють важливу роль у забезпеченні таких процесів, як транскрипція, реплікація, репарація ушкоджень ДНК, формування хромосом. Гетерогенність упаковки ДНК у складі релаксованого хроматину не лише відіграє важливу роль у забезпеченні адекватного функціонування генетичного апарату, але й визначає чутливість ДНК до дії стресорних та ушкоджувальних чинників. На сьогодні інтенсивно досліджуються механізми апоптозу, який реалізується у випадку загрози порушення стабільності геному клітин та забезпечує вибіркове видалення таких клітин. За апоптозу, як і за мітозу, має місце конденсація хроматину, проте вона супроводжується міжнуклеосомною фрагментацією ДНК у клітинах, що гинуть (Roy, 1997; Hengarten, 2000). Особливості структурної перебудови хроматину за дії апоптогенних чинників, зокрема, стадія так званої „крупномасштабної” фрагментації ДНК, що передує міжнуклеосомній, залишаються недостатньо дослідженими.

Зручним об’єктом для дослідження структурних ушкоджень хроматину є тимоцити – неповністю диференційовані клітини, які характеризуються вищою, порівняно з іншими клітинами, нестабільністю генома та нижчою активністю систем репарації однониткових розривів ДНК. Морфологічний контроль стану тимоцитів in vitro дозволяє виявити клітини з фрагментованим хроматином та апоптичні тільця, тоді як за yмов in vivo вони швидко поглинаються фагоцитуючими клітинами.

Для експериментального моделювання апоптозу тимоцитів використовують іонізуючу радіацію, головною мішенню якої є ДНК та пероксид водню - індуктор окисного стресу, яким супроводжується розвиток багатьох патологічних станів. Відомо, що у термін 3 – 8 год після після дії іонізуючої радіації у тимоцитах відбувається накопичення міжнуклеосомних фрагментів ДНК пропорційно до дози 1 – 6 Гр (Meyen et al, 1993; Zhivotovsky et al, 1993). Вплив пероксиду водню на життєздатність тимоцитів та клітин інших типів досліджено значно меншою мірою. Ефекти пероксиду водню значною мірою залежать від його концентрації – за присутності Н2О2 у концентраціях, що первищували 1 мМ, спостерігається некротична загибель клітин, тоді як у діапазоні концентрацій 30 – 200 мкМ Н2О2 в тимоцитах виявляються ознаки апоптозу (Oyama et al, 1999; Dahm-Daphi, 2000).

Пошкодження хроматину за дії апоптогенних чинників обумовлене не тільки структурно-функціональними порушеннями у ядрі, але й активацією у цитоплазмі сигнальних каскадів, компонентами яких є активні форми кисню, іони кальцію, ендонуклеази, каспази, цитохром с. У клітинах різних типів (В- та Т-лімфоцитах, клітинах мієлоїдного ряду) виявлено взаємозв’язок між конденсацією та фрагментацією ДНК у ядрі та порушенням структурно-функціонального стану мітохондрій за дії різних фізіологічних та фармакологічних індукторів апоптозу (глюкокортикоїди, етопозид, церамід та ін) (Бра и др., 2005; Zamzami et al, 1995; Bernardi et al, 1999; Orrenius, 2004). Дослідження причинно-наслідкових зв’язків та виявлення відмінних та спільних ланок у порушенні структурної організації хроматину за дії чинників різної природи є важливим для розуміння загальних закономірностей механізмів загибелі та адаптації клітин.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано згідно плану науково-дослідної роботи кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках теми № 01 БФ 036-04 “Розробка наукових основ пошуку біологічно-активних сполук радіозахисної дії” (№ державної реєстрації 0101U002291).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи – порівняльна оцінка параметрів, які характеризують структурний стан хроматину тимоцитів на ранньому етапі після дії іонізуючої радіації у дозі 4,5 Гр та 0,1 мМ пероксиду водню. Для досягнення цієї мети було поставлено такі завдання:

- оцінити морфологічний стан ядер тимоцитів після дії радіації та пероксиду водню;

- визначити параметри термічної денатурації хроматину тимоцитів у контролі та після дії досліджуваних чинників;

- дослідити вміст гістонів у хроматині, виділеному з тимоцитів, після дії радіації та Н2О2;

- оцінити вплив - токоферолу, хлороквіну, сперміну та циклоспорину А на фрагментацію ДНК у тимоцитах за дії апоптогенних чинників;

- дослідити вплив позаядерних компонентів, виділених з опромінених та оброблених Н2О2 тимоцитів, на фрагментацію ДНК з використанням безклітинної системи.

Об’єкт дослідження - порушення структури хроматину у тимоцитах за дії радіації та пероксиду водню.

Предмет дослідження – морфологічні ознаки апоптозу, термічна денатурація хроматину, вміст гістонів у хроматині, фрагментація ДНК, безклітинна система, компонентами якої є ядра, мітохондрії або груба розчинна фракція.

Методи дослідження – світлова та флуоресцентна мікроскопія, електрофорез білків, спектрофотометрична оцінка вмісту низькомолекулярних фрагментів ДНК, термічна денатурація хроматину, оцінка неспецифічної проникності мітохондріальної мембрани.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено порівняльне дослідження структурного стану хроматину в ізольованих тимоцитах за дії іонізуючою радіації у дозі 4,5 Гр та 0,1 мМ пероксиду водню, встановлено відмінності у динаміці та характері його порушень. На основі параметрів термоденатурації оцінено спектри ДНК-білкових взаємодій та їх зміни на різних рівнях структурної організації хроматину за дії досліджуваних чинників. Показано зниження вмісту гістонів Н2В та Н1 у хроматині за інкубації ядер опромінених тимоцитів. Виявлено специфічне зниження вмісту гістону у субфракції Н1b у ядрах клітин за дії Н2О2. Показано, що циклоспорин А значно пригнічує фрагментацію ДНК у тимоцитах, підданих дії Н2О2. Вперше продемонстровано, що внесення у безклітинну систему мітохондрій або постмітохондріального супернатанту, виділених з тимоцитів на різних етапах після дії радіації та пероксиду водню, викликає посилення фрагментації ДНК у ядрах контрольних клітин.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані розширюють уявлення про шляхи формування відповіді клітин на дію стрес-агентів та про початкові механізми ініціації апоптозу за дії іонізуючої радіації та пероксиду водню. Результати роботи можуть бути використані для моделювання апоптозу in vitro у клітинах різних типів. Одержані дані можуть бути корисними для розробки методів корекції патологічних змін клітинного гомеостазу, а також для направленого пошуку препаратів, здатних ініціювати або пригнічувати загибель клітин.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто здійснено інформаційний пошук, аналіз та оцінку наукової літератури за темою дисертаційної роботи, самостійно виконано експериментальні дослідження, інтерпретацію, теоретичне обгрунтування отриманих результатів та підготовлено матеріали до друку. Основні теоретичні та експериментальні ідеї було розроблено за участі наукового керівника дисертанта д.б.н., проф. Матишевської О.П.

Апробація результатів роботи. Основні результати дисертаційної роботи було представлено на: VIII Українському біохімічному з’їзді з’їзді (Чернівці, 2002); 2-ій Міжнародній конференції “Conference for students, PhD-students and young scientists on molecular biology and genetics” (Київ, 2003); III з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002); III з’їзді з радіаційних досліджень (радіобіологія i радіоекологія) (Київ,2003); First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology (Lviv, 2004); 5-th Parnas conference Molecular mechanisms of cellular signaling (Kyiv, 2005).

Публікація матеріалів. За темою дисертаційної роботи опубліковано 8 статей у фахових журналах та 7 тез у збірниках матеріалів вітчизняних та міжнародних конференцій і з’їздів.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 131 сторінці друкованого тексту, містить 18 рисунків та 6 таблиць. Робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, заключення, висновків, списку використаних джерел (248 посилань).

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Досліди проводили на щурах лінії Вістар обох статей вагою 120 - 150 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію. Тимоцити отримували шляхом протирання тимуса через нейлонову сітку у буфер такого складу (мМ): Na2HPO4 - 3, KCl - 5, NaCl - 120, CaCl2 - 1, глюкоза - 10, MgSO4 - 1, NaHCO3 - 4, HEPES - 10, рН 7,4. Кількість життєздатних клітин підраховували у камері Горяєва після фарбування 0,4 % розчином трипанового синього. Інкубацію клітин (2 – 4·106 клітин/мл) здійснювали у термостаті при 37оС у середовищі RPMI-1640, що містило 5% ембріональну телячу сироватку. Пероксид водню додавали у середовище інкубації клітин до кінцевої концентрації 0,1 мМ.

Опромінення клітинної суспензії здійснювали на установці РУМ-17 за таких умов: експозиційна доза - 11,61 х 10-2 Кл/кг (4,5 Гр), потужність дози - 0,24 Гр/хв, фільтри 0,5мм (Сu + Аl), напруга 200 кВ, сила струму 10 мА, фокусна відстань - 50 см.

Для оцінки вмісту некротичних та апоптичних клітин у суспензії застосовували метод подвійного прижиттєвого фарбування клітин флуоресцентними фарбниками Хехст 33342 (1 мкг/мл) та пропідіума йодид (0,04 мкг/мл). Морфологічну оцінку проводили під люмінесцентним мікроскопом МЛ - 2 (Росія).

Субклітинне фракціонування здійснювали після руйнування тимоцитів гомогенізацією у щільно притертому гомогенізаторі Поттера у 10-кратному об’ємі буфера, що містив (мМ): сахарозу – 250, KCl – 50, КH2PO4 – 2,5, MgCl2 – 2, HEPES – 10, pH 7,4. Грубу ядерну фракцію (1500 g, 10хв) використовували для отримання ядер методом центрифугування у градієнті 1,5 М сахарози (15000 g, 45 хв, +4оС) у присутності інгібітора протеїназ 0,1 мМ фенілметилсульфанілфториду (ФМСФ) (Борисов та ін., 1999). Надосадову центрифугували (15000g, 15 хв, +4оС) для отримання мітохондріальної та грубої розчинної фракції.

Для виділення хроматину ядра (5 х 107) обробляли буфером, що містив (мМ): ЕДТА -2, NaCl – 280, трис-НСl – 1, рН 7,9, 1% тритон Х-100, отриманий після центрифугування (12000g 10 хв) осад відмивали у буфері, що містив 2 мМ ЕДТА та 1 мМ трис-НСl, рН 7,9. Отримання хроматину проводили при t 0 +4о С за присутності 0,1 мМ ФМСФ.

Термічну денатурацію препаратів хроматину проводили у буфері, що містив 1,5 мМ NaCl та 0,15 мМ лимоннокислий натрій, рН 7,0 у термостатованих кварцевих кюветах з тефлоновими пробками на спектрофотометрі “SPEKORD – M40” (Німеччина), зі швидкістю нагрівання 0,3є С за хвилину. На основі інтегральних кривих термічної денатурації ДНК було побудовано диференціальні криві та визначено площу піків диференціальних кривих плавлення, як описано у (Мозжухина та ін., 1990).

Електрофоретичний аналіз вмісту гістонів проводили у блоці 20% поліакриламідного гелю в присутності 0,1% додецилсульфату натрію за методом Laemmly. Отриманні на цифрових фотографіях електрофореграм патерни забарвлених Кумасі G-250 білкових смуг аналізували з використанням програми TotalLab 1.11 фірми Phoretix.

Кількість високомолекулярної та фрагментованої ДНК у ядрах та клітинах визначали за методом Бартона (Burton, 1956). Вміст полідезоксирибонуклеотидів (ПДН) визначали після лізису клітин у буфері, що містив мМ: ЕДТА - 10, трис-HCl – 10, рН 7,4, 0,5 % тритон Х-100, як описано у (Гринюк та ін., 2004).

Деградацію ДНК оцінювали у безклітинній системі, що містила (мМ): сахарозу -250, КН2РО4-2,5, НЕРЕS - 10, КСl - 50, МgCl2, - 2, ЕГТА 0,1, дітіотрейтол - 1, АТФ – 2, креатинфосфат – 10, креатинкіназу та ядра (3 х 106) контрольних тимоцитів. До середовища вносили 1 мг білка мітохондріальної або 0,5 - 2 мг білка грубої розчиної фракції (постмітохондріального супернатанту 15000g), проби інкубували протягом 2 год при 37? С.

Набухання мітохондрій оцінювали за зміною світлорозсіювання суспензії, що містила (мМ): сахарозу 150, КСl – 50, КН2РО4 – 2, сукцинат – 1, тріс НСl – 5 (рН 7,4,) та 2 – 3 мг білка мітохондріальної фракції. Реєстрацію світлорозсіювання здійснювали у термостатованій кюветі (30оС) на спектрофотометрі КФК-3 при довжині хвилі 520 нм (Olenev et al, 1976).

Статистичну обробку результатів дослідження проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики (Плохинский, 1981). Розрахунки та побудову графіків виконували на комп’ютері з використанням прикладної програми „Microsoft Excel 98”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Морфологічна оцінка тимоцитів на ранньому етапі після дії радіації та пероксиду водню. Оцінку структурного стану хроматину у контрольних та підданих дії іонізуючої радіації (4,5 Гр) або 0,1 мМ Н2О2 тимоцитах здійснювали упродовж 3-годинної інкубації клітин – терміну, який передує виявленому раніше (Коваль та ін., 2001) накопиченню полідезоксирибонуклеотидів у клітинах, спричиненому міжнуклеосомною фрагментацією ДНК.

Дані флуоресцентної мікроскопії, проведеної із застосуванням специфічних до ДНК барвників Хехст 33342 та пропідію йодида показали, що кількість життєздатних клітин після опромінення та обробки пероксидом водню знижується порівняно з контролем майже однаково,

Таблиця 1

Вміст клітин з ознаками апоптозу та некрозу у суспензії тимоцитів за дії радіації або пероксиду водню (% від загальної кількості, М ± m, n = 6)

Інку-бація

3 год

Життєз-датні

Некро-тичні Апоптичні клітини

разом

апоптичні тільця з конденсованим хроматином з фагменто-ваним ядром

Контроль 85,0 ± 9,2 2,2 ± 0,2 12,8 ± 1,3 5,7 ± 0,4 6,1 ± 0,7 1,0 ± 0,2

4,5 Гр 60,1 ± 5,0* 3,8 ± 0,3* 36,1±3,0* 28,2 ± 2,7* 5,0 ± 0,4 2,9 ± 0,1

0,1 мМ Н2О2 65,2 ± 4,8* 3,6 ± 0,4* 31,2 ± 3,2* 9,1 ± 0,8* 20,2 ± 2,5* 1,9 ± 0,2

* - р< 0,05 порівняно з контролем

причому не внаслідок некрозу, а внаслідок індукції апоптозу (табл. 1), ознаки якого виявляються у 36,1 та 31,2 % клітин відповідно.

Динаміка та характер порушення структури хроматину після дії досліджуваних чинників були різними. В опроміненій суспензії вже через 1 год підвищувалась кількість клітин з гіперконденсованим хроматином, домени якого рівномірно розподілялись у ядрі, а через 3 год значно зростав вміст клітин з фрагментованим ядром та апоптичними тільцями.

За дії пероксиду водню значне підвищення вмісту у суспензії клітин із конденсованим хроматином спостерігалось через 3 год, ущільнений хроматин у таких клітинах був зміщеним до одного з полюсів ядра. Виявлені відмінності у ранньому порушенні структури хроматину тимоцитів за дії іонізуючої радіації та пероксиду водню зумовлені особливостями реорганізації хроматину на різних рівнях та передують деградації ДНК, яка розпочинається у відповідь на апоптогенний сигнал, що виникає у самому ядрі, або у цитозолі чи інших клітинних компартментах.

Оцінка параметрів термічної денатурації хроматину. Зважаючи на взаємозв’язок між ступенем стабілізації подвійної спіралі ДНК, характером взаємодій білок-ДНК, білок-білок у хроматині та параметрами плавлення ДНК у його складі було проаналізовано криві термоденатурації хроматину та оцінено внесок окремих ділянок ДНК з визначеною термостабільністю (інтервали I - VI) у загальний гіперхромний ефект. Криві термоденатурації хроматину, виділеного з опромінених або підданих дії Н2О2, тимоцитів, зміщувались порівняно з контролем у область більш високих температур, за яких відбувається термоденатурація ділянок ДНК, стабілізованих взаємодією з білками (рис. 1). Такі зміни відповідають виявленій у тимоцитах конденсації хроматину.

Зміни параметрів плавлення ДНК у складі хроматину, виділеного через 1 год після дії досліджуваних чинників, були частково подібними – в обох випадках внесок у сумарний гіперхромізм ділянок лінкерної ДНК (інтервал ІІІ) знижувався, а ділянок ДНК, стабілізованих взаємодією з негістоновими білками (інтервал VI) – зростав (рис.2, б, в), що свідчить про реорганізацію хроматину, спричинену порушенням структури у певних транскрипційно-активних ділянках.

Структурні перебудови у хроматині опромінених тимоцитів зачіпають і ті ділянки ДНК, які не змінюються за дії Н2О2 – зростає частка дестабілізованої та вільної (інтервали І-ІІ) ДНК (рис.2, б). У хроматині, виділеному через 3 год після опромінення, внесок цих ділянок у сумарний гіперхромізм знижується порівняно з контролем, що, вірогідно, зумовлено деконденсацією та деградацією ДНК у цих ділянках під дією ендонуклеаз та специфічних до гістонів протеїназ.

Рис. 1. Криві термічної денатурації хроматину тимоцитів у контролі та через 1 год після дії радіації або пероксиду водню

Рис. 2. Внесок у загальний гіперхромізм хроматину, виділеного з тимоцитів у контролі (а) та через 1 год після дії радіації (б) або пероксиду водню (в) ділянок ДНК з визначеною термостабільністю: I - 50 - 600С – дестабілізована ДНК; II - 65 - 700С – вільна ДНК; III - 71 - 75oC – лінкерна ДНК; IV – 76 - 80o C - корова ДНК; V – 81 - 85oС - ДНК у сайтах сильної взаємодії з гістонами; VI – 86 - 96оС - ДНК, стабілізована структурними негістоновими білками та зв’язана з ядерним матриксом

Структурна дезорганізація хроматину за обробки тимоцитів пероксидом водню виявляється переважно на рівні взаємодії ДНК-білок. Так, упродовж 3 год залишається зниженим порівняно з контролем внесок у сумарний гіперхромізм ділянок ДНК, що зазнають температурного переходу у інтервалі IV і підвищеним – ділянок, які плавляться за високих температур (інтервал VI). Це свідчить про певну релаксацію взаємодії ДНК з коровими гістонами та локальну реорганізацію міцних контактів ДНК з негістоновими білками ядерного матриксу.

Важливу роль у підтриманні структурно-функціональної організації хроматину відіграють взаємодії ДНК-гістони. Тому надалі було проведено електрофоретичний аналіз вмісту гістонів у хроматині після дії радіації та пероксиду водню.

Дослідження вмісту гістонів у хроматині тимоцитів. Припускають, що дезорганізація структури хроматину та порушення взаємодії ДНК-гістон на ранніх стадіях апоптозу відбувається внаслідок активації протеїназ, які розщеплюють гістони або викликають їх вивільнення зі складу хроматину. Оскільки активність in vitro протеїназ, для яких гістони є субстратом, досить низька, застосувують тривалу інкубацію клітин або ядер після дії апоптогеного чинника (Тюленев и др., 2000; Wu et al, 2002). За 8-годинної інкубації ядер, виділених через 1 год після опромінення тимоцитів, виявляється зниження вмісту у складі хроматину обох субфракцій гістону Н1, а через 3 год – зниження вмісту корового гістону Н2В, подальше падіння вмісту субфракції гістону Н1а та зростання інтенсивності смуги, що відповідає гістону Н4, можливо, внаслідок продуктів протеолізу гістонів Н1 та Н2В (табл. 2).

Таблиця 2

Відносний вміст гістонів (% від загального, M ± m, n = 4) у хроматині після інкубації ядер, виділених з контрольних, опромінених та підданих дії пероксиду водню тимоцитів

Тип гістону Контроль опромінення Н2О2

1 год 3 год 1 год 3 год

Н1а 4,9±0,84 1,8±0,05* 0,8±0,03* 4,3±0,58 4,5±0,38

Н1b 4,2±0,85 1,9±0,07* 1,9±0,05* 2,4±0,35* 2,5±0,19 *

Н3 18,3±1,91 19,6±1,75 19,7±2,76 20,2±1,87 19,3±2,01

Н2В 21,9±2,5 21,5±1,89 17,8±1,85* 21,3±2,98 23,5±2,96

Н2А 21,5±1,87 21,7±1,56 21,5±3,31 19,5±1,98 18,1±1,90

Н4 29,2±3,28 33,5±2,29* 38,3±2,72* 32,3±2,55* 32,1±3,91*

* - р< 0,05 порівняно з контролем

Такі зміни можуть відбуватися внаслідок розщеплення гістонів розчинними та зв’язаними з хроматином протеїназами, зокрема, зв’язаною з гістоновим кором та специфічною до гістону Н1 протеїназою, яка активується у разі спричинених дією радіації розривів ДНК та виникнення порівняно довгих денатурованих ділянок ДНК [Газиев и др., 1992; Куцый и др., 2002].

За інкубації ядер, виділених з оброблених пероксидом водню тимоцитів, виявлено більш специфічні зміни – зниження відносного вмісту гістону лише у субфракції Н1b (у 1,7 разів порівняно з контролем). Вміст гістону Н1 у хроматині підданих дії Н2О2 тимоцитів може падати через його гідроліз протеїназами, активність яких зростає у випадку підвищення рівня окисненого глутатіона та інших дисульфідів за умов окисного стресу (Гребинык и др., 2004; Tschesche et al, 1981). Звертає на себе увагу той факт, що зниження вмісту гістону виявлено саме у субфракції Н1b, де знаходиться гістон Н1.2, залучений до активації апоптозу. Припускають, що у цьому випадку відбувається вихід певної кількості гістону Н1.2 зі складу хроматину та його експорт у цитозоль, де гістон спричинює вивільнення цитохрому с з мітохондрій та активацію проапоптичних факторів (Gillespie et al, 2003; Konishi et al, 2003).

Для більш детального з’ясування можливих шляхів ушкодження структури хроматину було досліджено вплив таких сполук, як ?-токоферол, хлороквін, спермін та циклоспорин А на фрагментацію ДНК у тимоцитах після дії іонізуючої радіації та Н2О2.

Вплив ?-токоферолу, хлороквіну, сперміну та циклоспоріну А на фрагментацію ДНК. Згідно даних кількісної біохімічної оцінки стану ДНК у опромінених тимоцитах накопичуються низькомолекулярні фрагменти ДНК – полідезоксирибонуклеотиди, вміст яких через 3 год досягає 42,5 ± 3,8% від загального вмісту ДНК у ядрі (рис. 3, 2). У тимоцитах, підданих дії Н2О2 також виявлено підвищення кількості ПДН, однак, воно є нижчим порівняно з виявленим у опромінених клітинах, і через 3 год становить 30 ± 2,6% від загального вмісту ДНК (рис. 3, 3). Такі фрагменти є кратними довжині нуклеосомної ДНК (200 п.о.), оскільки за електрофоретичного розділення ДНК розподіляються у вигляді „драбини”, що є біохімічним критерієм апоптозу (Коваль та ін., 2004).

Спільною ланкою у механізмах ушкодження структури хроматину за дії як іонізуючої радіації, так і пероксиду водню є генерація активних форм кисню внаслідок радіолізу води вздовж треку іонізації або інтенсифікації реакції Фентона. Активні форми кисню можуть безпосередньо ушкоджувати структуру ДНК, або ж діяти опосередковано, через посилення таких процесів, як ендонуклеоліз у ядрі, перекисне окиснення мембраних ліпідів, фосфоліпідний гідроліз, зростання проникності мітохондріальних мембран.

Рис. 3. Вплив 100 мкМ ?-токоферолу та 2 мкМ циклоспорину А на фрагментацію ДНК (% ПДН від загального вмісту ДНК) у контрольних (1), підданих дії радіації (2) або пероксиду водню (3) тимоцитах

* - р< 0,05 порівняно з контролем,

** - р< 0,05 порівняно з пробою без інгібітора

Внесення універсального антиоксиданта ?-токоферолу до середовища інкубації тимоцитів призводило до часткового пригнічення фрагментації ДНК у опромінених тимоцитах – вміст накопичених ПДН знижувався у 1,5 рази (рис. 2, 2). У клітинах, підданих дії Н2О2 фрагментація ДНК запобігалась повністю – вміст ПДН за присутності антиоксиданта був на рівні контролю (рис. 3, 3).

Інгібітор фосфоліпази А2 хлороквін у концентрації 20 мкМ більшою мірою пригнічував фрагментацію ДНК у опромінених тимоцитах, ніж у підданих дії Н2О2 (у 2,9 та 1,7 рази відповідно).

Ефект сперміну як інгібітора ендонуклеолізу пов’язують з його здатністю впливати на йонне мікрооточення хроматину. Спермін пригнічував деградацію ДНК однаковою мірою як у опромінених, так і оброблених Н2О2 тимоцитах – вміст ПДН знижувався у 1,9 та 1,7 разів відповідно. Інтерпретація даних щодо пригнічувального ефекту сперміну ускладнена, оскільки за його присутності посилюється здатність мітохондрій накопичувати та утримувати Са2+ та спостерігається нормалізація підвищеного рівня Са2+ у цитоплазмі (Дерябина и др., 2000).

Для оцінки можливої ролі мітохондріального шляху ініціації апоптозу було використано циклоспорин А - блокатор неселективної пори внутрішньої мембрани мітохондрій. За присутності 2 мкМ циклоспорину спостерігалось зниженя у 1,4 рази вмісту ПДН, накопичених у опромінених

тимоцитах. Значно більшою мірою ефект циклоспорину виявлявся у клітинах, підданих дії Н2О2 – інгібітор пригнічував процес фрагментації в 2,3 рази порівняно з контролем (рис.3, 3).

Дані щодо пригнічення фрагментації ДНК в опромінених клітинах переважно сперміном та хлороквіном вказують на залучення процесів ендонуклеолізу та фосфоліпідного гідролізу до активації шляхів апоптозу в тимоцитах після дії іонізуючої радіації. Пригнічувальний ефект -токоферолу та циклоспорину на фрагментацію ДНК у тимоцитах за дії Н2О2 свідчить про першочергову роль процесів генерації активних форм кисню, реакцій вільнорадикального переокиснення та порушення бар’єрної функції мітохондріальних мембран у ініціації Н2О2 – залежного апоптозу.

Дослідження фрагментації ДНК тимоцитів у безклітинній системі. Для з’ясування можливої ролі мітохондрій у сигнальних шляхах, що ведуть до деградації ДНК у тимоцитах, було використано безклітинну систему, компонентами якої були 0,25 М сахароза, ізольовані ядра контрольних тимоцитів, система регенерації АТФ та мітохондрії, виділені з контрольних та підданих дії досліджуваних чинників тимоцитів. Згідно даних флуоресцентної мікроскопії з використанням барвника Хехст 33342 цілісність ядер упродовж їх 2-годинної інкубації у безклітинній системі зберігалась. Внесення у безклітинну систему мітохондрій, виділених з контрольних тимоцитів, не впливало на структурний стан хроматину у ядрах та на вміст накопичених за інкубації полідезоксирибонуклеотидів (рис. 4, 2).

Оскільки незалежно від типу клітин та індуктора апоптозу структурно-функціональні порушення у мітохондріях передують появі типових морфологічних ознак апоптозу в ядрах (Zamzami et al., 1996; Crompton, 2000), у безклітинну систему вносили мітохондрії, виділені з тимоцитів через 1 та 3 год після дії досліджуваних чинників.

Рис. 4. Фрагментація ДНК тимоцитів (% ПДН від загального вмісту ДНК) у ядрах контрольних тимоцитів за інкубації: без добавок (1); після внесення мітохондрій контрольних тимоцитів (2); мітохондрій, виділених з тимоцитів через 1 год (3) або 3 год (4) після дії радіації; мітохондрій, виділених з тимоцитів через 1 год (5) або 3 год (6) після додавання Н2О2

*- р< 0,05 порівняно з контролем

За умови додавання до безклітинної системи мітохондрій (1 мг білка), виділених через 1 год після опромінення тимоцитів, вміст накопичених у ядрах ПДН достовірно не змінювався. Очевидно, пошкодження мітохондрій, які виникають локально внаслідок безпосередньої дії радіації, поглиблюються з часом - внесення мітохондрій, виділених через 3 год після опромінення клітин, супроводжувалось посиленням фрагментації ДНК, вміст ПДН зростав до 21,3 % порівняно з 12 % у контролі (рис. 4, 4).

Найбільш значне посилення фрагментації ДНК у ядрах спостерігалось у випадку внесення до безклітинної системи мітохондрій, виділених з тимоцитів через 1 год після додавання Н2О2 – вміст ПДН зростав до 25,7 % від загального вмісту ДНК (рис. 4, 5). Отже, на ранньому етапі після дії Н2О2 відбуваються порушення структурно-функціонального стану мітохондрій, які сприяють виходу з мітохондрій у середовище факторів, що посилюють фрагментацію ДНК у ядрах.

Фактори, які можуть активувати процес деградації хроматину, містяться як у міжмембранному просторі, так і у матриксі мітохондрій, а необхідною умовою їх виходу є відкриття неселективних пор у внутрішній мембрані мітохондрій. У зв’язку з цим було досліджено вплив Н2О2 та іонів Са2+ на неспецифічну проникність мітохондріальної мембрани, яку оцінювали за зниженням світлорозсіювання суспензії мітохондрій, зумовленого їх набуханням.

За інкубації ізольованих мітохондрій тимоцитів упродовж 3 хв у середовищі інкубації, що містило субстрат дихання (сукцинат), спостерігалось незначне зниження світлорозсіювання суспензії (рис. 5, крива 1).

Рис. 5. Вплив Н2О2 та СaCl2 на світлорозсіювання суспензії мітохондрій у контролі (1), за додавання 0,1 мМ Н2О2 (2) та 50 мкМ СаCl2 (3).

Додавання 0,1 мМ Н2О2 в середовище інкубації мітохондрій призводило до поступового зниження світлорозсіювання суспензії, швидкість набухання збільшувалась у 9,3 рази. Внесення у середовище інкубації іонів Са2+ у порівняно низькій концентрації (50 мкМ) викликало більш значне набухання мітохондрій - швидкість процесу зростала у 18,1 рази. Вплив Н2О2 на структурний стан мітохондрій слід пов’язувати насамперед з його перетворенням за присутності Fe2+ на високореакційний гідроксил-радикал, посиленням продукції супероксид-аніону у ході одноелектронного відновлення О2 у дихальному ланцюгу, окисненням тіолових груп білків мітохондріальних мембран. Такі ж ефекти можуть розвиватись і у випадку перевантаження мітохондрій іонами Са2+ (Акопова и др., 2004; Brookes et al, 2004).

Індуковане дією Н2О2 набухання мітохондрій посилювалось ще більшою мірою після внесення іонів Са2+ у середовище інкубації мітохондрій, а максимальний ефект набухання спостерігався за поєднання дії обох факторів. Отже, за умов проникнення Н2О2 у внутрішньоклітинний простір та підвищення концентрації вільного цитозольного Са2+ у тимоцитах зростає вірогідність вивільнення апоптогенних факторів з мітохондрій у цитозоль. Як було показано у роботах (Гребинык, 2004; Матишевська, 2005), за дії Н2О2 у тимоцитах відбувається значне зростання концентрації вільного цитозольного Са2+. Тому було досліджено фрагментацію ДНК у ядрах контрольних тимоцитів після внесення у безклітинну систему постмітохондріального супернатанту.

Вміст ПДН у ядрах не змінювався після додавання до середовища постмітохондріального супернатанту, виділеного через 1 год інкубації контрольних або опромінених тимоцитів, незалежно від кількості внесеного білка (0,5 – 2 мг) (рис. 6, А, криві 1, 2). Дані, представлені на рис. 6, Б, крива 3, вказують на те, що у випадку більш тривалої інкубації тимоцитів (3 год) після дії іонізуючої радіації у постмітохондріальному супернатанті з’являються фактори, які спричинюють фрагментацію ДНК у ядрах.

Рис. 6. Фрагментація ДНК (% ПДН від загального вмісту ДНК) у ядрах контрольних тимоцитів після внесення у безклітинну систему постмітохондріального супернатанту, отриманого через 1(А) та 3 (Б) год інкубації контрольних (1), опромінених (2) та підданих дії Н2О2 (3) тимоцитів

Було виявлено значне посилення фрагментації ядерної ДНК після внесення у безклітинну систему постмітохондріального супернатанту, отриманого з тимоцитів на ранній стадії (1 год) після дії Н2О2 – вміст накопичених ПДН зростав за додавання 0,5 мг білка розчинної фракції і продовжував зростати пропорційно до кількості доданого білка (рис. 6, А, крива 3). Ефект зберігався і у випадку внесення у безклітинну систему супернатанту, отриманого після 3-годинної інкубації оброблених Н2О2 тимоцитів, хоча і був дещо меншим за величиною (рис. 6, Б, крива 3).

На основі отриманих даних можна припустити, що першочергову роль у активації реакцій протеолізу та ендонуклеолізу, які призводять до деградації структури хроматину у тимоцитах за дії Н2О2, відіграють позаядерні фактори, зокрема, мітохондрії, як джерело низки апоптогенних чинників (цитохрому с, ендонуклеази G, фактору індукції апоптозу АІF та ін.), що вивільняються у цитозоль.

Структурні порушення хроматину у тимоцитах, опромінених у дозі 4,5 Гр, є більш ранніми і значними, про що свідчить аналіз морфологічного стану ядер, термоденатурації хроматину та змін у вмісті гістонів. Очевидно, першочергову роль у порушенні структури хроматину тимоцитів за дії радіації відіграють одно- та двониткові розриви ДНК, активація ендонуклеаз та специфічних до гістонів протеїназ, проте на більш пізньому етапі до процесу деградації хроматину можуть бути залучені мітохондрії.

Таким чином, незважаючи на конвергенцію сигнальних шляхів індукованого радіацією або пероксидом водню апоптозу тимоцитів до міжнуклеосомного розщеплення ДНК, встановлено відмінності в шляхах порушення структури хроматину на ранньому етапі, який передує деградації ДНК.

ВИСНОВКИ

Методом прижиттєвого фарбування клітин специфічними до ДНК флуоресцентними барвниками Хехст 33342 та пропідію йодид встановлено, що упродовж 3-годинної інкубації тимоцитів після рентгенівського опромінення у дозі 4,5 Гр або додавання 0,1 мМ Н2О2 вміст клітин з морфологічними ознаками апоптозу підвищується (до 36,1% та 31,2% від загального вмісту клітин відповідно). У цей термін вміст низькомолекулярних фрагментів ДНК, екстрагованих з хроматину опромінених та оброблених Н2О2 тимоцитів, зростає у 4,2 та 3,1 рази порівняно з контролем відповідно.

Динаміка та характер порушення структури хроматину у тимоцитах за дії іонізуючої радіації та Н2О2 розрізняються. В опромінених тимоцитах спостерігається рання конденсація хроматину, яка супроводжується його фрагментацією та появою апоптичних тілець, тоді як серед підданих дії Н2О2 клітин переважають клітини зі зміщеним у ядрі конденсованим хроматином.

Аналіз параметрів термоденатурації хроматину показав, що початкові порушення його структури за дії обох чинників відбуваються у ділянках лінкерної ДНК. В опромінених клітинах дезорганізація хроматину виявляється у зниженні внеску у сумарний гіперхромізм ділянок вільної, дестабілізованої, лінкерної та зв’язаної з гістонами ДНК. Порушення структури хроматину клітин, підданих дії Н2О2, виявляються переважно на наднуклеосомному рівні.

За інкубації ядер опромінених тимоцитів відбувається зниження вмісту корового гістону Н2В та обох субфракцій гістону Н1, а за інкубації ядер підданих дії Н2О2 тимоцитів - зниження вмісту гістону лише у субфракції Н1b.

Фрагментація ДНК у опромінених тимоцитах значно пригнічується за присутності у середовищі інкубації 1 мМ сперміну або 20 мкМ хлороквіну, а у підданих дії Н2О2 тимоцитах – за присутності 100 мкМ -токоферолу та 2 мкМ циклоспорину А.

Внесення у середовище інкубації мітохондрій іонів Са2+ (50 мкМ) та 0,1 мМ Н2О2 викликає посилення неселективної проникності мітохондріальної мембрани. Кальцій був ефективнішим у індукції цього процесу та посилював викликане пероксидом водню набухання мітохондрій.

Через 1 год після дії Н2О2, але не іонізуючої радіації, у мітохондріях тимоцитів відбуваються порушення, які зумовлюють їх здатність викликати фрагментацію ДНК у ядрах контрольних тимоцитів за умови внесення у безклітинну систему.

Внесення у безклітинну систему постмітохондріального супернатанту 15000 g, виділеного з тимоцитів через 1 год після додавання Н2О2 або через 3 год після опромінення, призводило до посилення фрагментації ДНК у ядрах, що свідчить про залучення позаядерних та позамітохондріальних факторів до порушення структури хроматину та деградації ДНК за дії досліджуваних чинників.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ,

ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Солодушко В.О., Гринюк І.І., Борисов С.І., Матишевська О.П. Залежність від кальцію індукованого радіацією ендонуклеолізу хроматину у лімфоїдних клітинах // Вісник Київського університету. Серія: Біологія. - 1998. – Вип. 28. - С. 16-18. (Особистий внесок здобувача – визначення вмісту полідезоксирибонуклеотидів у клітинах).

Борисов С.І., Гринюк І.І., Ковальова В.А., Птиця О.М., Матишевська О.П. Отримання та характеристика препарату ядер лімфоцитів тимуса і селезінки щурів // Вісник Київського університету. Серія: Біологія. - 1999. – Вип. 29. - С. 12-14. (Особистий внесок здобувача – виділення лімфоїдних клітин з селезінки і тимусу щурів, отримання ядерної фракції).

Дворщенко К.О., Гринюк І.І., Капралов О.О., Матишевська О.П. Інтенсифікація реакцій переокислення у мітохондріях тимоцитів передує фрагментації ДНК за радіаційного апоптозу // Вісник Київського національного університету. Серія: Біологія. - 2002. - Вип. 36. - С. 10-14. (Особистий внесок здобувача – виділення ядерної та мітохондріальної фракцій тимоцитів, статистична обробка та аналіз отриманих даних).

Гринюк І.І., Коваль Т.В., Степанська Е.Р., Коноплич Л.О., Капралов О.О. Дослідження вмісту гістонів у ядрах, виділених з тимоцитів на ранніх стадіях радіаційного апоптозу // Вісник Київського національного університету. Серія: Біологія. - 2002. – Вип. 37. - С. 102-106. (Особистий внесок здобувача – виділення ядерної фракції тимоцитів, проведення електрофорезу білків ядер, аналіз електрофореграм).

Гринюк І.І., Капралов О.О., Матишевська О.П. Використання безлітинної системи для дослідження участі цитозолю та мітохондрій у індукції апоптозу тимоцитів // Вісник Київського національного університету. Серія: Біологія. - 2003. - Вип. 40. - С. 70-72. (Особистий внесок здобувача – виділеня ядерної, мітохондріальної та грубої розчинної фракції тимоцитів, визначення вмісту полідезоксирибонуклеотидів у ядрах, статистична обробка та аналіз отриманих даних).

Гринюк І.І., Чабанний В.М., Матишевська О.П., Кучеренко М.Є. Дослідження структури хроматину у тимоцитах in vitro після дії радіації та пероксиду водню // Фізика живого. – 2003. – Вип. 11. - № 2. – С. 37 – 45. (Особистий внесок здобувача – виділення ядерної фракції, хроматину, електрофорез гістонів, оцінка параметрів термоденатурації хроматину).

Гринюк І.І., Корнійчук Г.М, Капралов О.О., Матишевська О.П. Зміни структурного стану хроматину у тимоцитах на ранньому етапі апоптозу за індукції пероксидом водню та радіацією // Український біохімічний журнал. – 2004. - № 5. – С. 90 – 95. (Особистий внесок здобувача – флуоресцентний аналіз тимоцитів, виділення ядерної, мітохондріальної та грубої розчинної фракцій, визначення вмісту полідезоксирибонуклеотидів у клітинах та ядрах, аналіз отриманих даних).

Гребинык Д.М., Гринюк И.И., Матышевская О.П. Исследование кальциевого гомеостаза в тимоцитах при апоптозе. II. Аккумуляция Са2+ митохондриями и эндоплазматическим ретикулумом // Український біохімічний журнал. – 2005. – Т. 77, № 2. – С. 78 – 81. (Особистий внесок здобувача – визначення вмісту полідезоксирибонуклеотидів у клітинах).

Петрова Г.В., Гринюк І.І. Пригнічення D,L--токоферолом апоптозу тимоцитів і гепатоцитів, викликаного дією радіації, дексаметазону та перекису водню // Український біохімічний журнал. Спеціальний випуск. Матеріали VIII Українського Біохімічного з’їзду (1-3 жовтня 2002р.). Чернівці, 2002.