МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ УКРАЇНИ

Харківський державний університет

Берест Володимир Петрович

УДК 577.3.05:57.043

Вплив температури на агрегацію тромбоцитів

у нормі та при діЇ гамма-опромінення

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Харків – 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському державному університеті.

Науковий керівник:

кандидат біологічних наук, доцент Гаташ Сергій Васильович, Харківський державний університет, кафедра молекулярної та прикладної біофізики, доцент

Офіційні опоненти:

-

- доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Осецький Олександр Іванович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, провідний науковий співробітник (м. Харків)

Провідна установа:

Київський національний університет ім. Т.Шевченка, кафедра біофізики (м. Київ).

Захист відбудеться “30” вересня 1999 року о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському державному університеті, 310077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці Харківського державного університету: 310077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий “28” серпня 1999 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. З’ясування зв’язку між структурним станом і функціональною активністю біологічних макромолекул, мембранних систем і клітин є однією з найважливіших і актуальних задач сучасної молекулярної і клітинної біофізики. Вивчення впливу температури на конформацію білків, структурних компонентів біомембран і характер протікання процесів у живих клітинах дає інформацію, як про механізми функціонування біосистем, так і про діапазон фізіологічно значимих умов їх існування. В наш час для багатьох об’єктів і процесів температурозалежні конформаційні зміни (розчинних і мембранних інтегральних білків) та функціональні особливості (агрегація і міжклітинні взаємодії) ще далеко не з’ясовані. Визначення механізмів агрегації тромбоцитів і їх взаємодії з білком крові фібриногеном мало б велике значення як для встановлення фундаментальних закономірностей біосистем, так і для медико-біологічної практики, зокрема клінічної діагностики, консервації крові, фармакології тощо. Вивчення механізму радіаційно-індукованих змін тромбоцитарної ланки системи гемостазу важливе для радіаційної біофізики й медицини, визначення механізмів променевої патології, розробки радіопротекторів і методів довготривалого зберігання препаратів крові. Найменш вивченим є вплив малих доз опромінення і дія інкорпорованих радіонуклідів, особливо “чорнобильського спектру”, що значною мірою ускладнює ранню діагностику променевих ушкоджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконувалась у відповідності з планом науково-дослідних робіт кафедри молекулярної та прикладної біофізики ХДУ за проектом Державного фонду фундаментальних досліджень № 2.4/764 (договір № Ф4/280-27) “Дослідження молекулярних механізмів дії гамма-опромінення на ДНК, фібриноген та міжклітинні взаємодії”, та за програмою Міносвіти “Здоров’я людини” за координаційним планом “Взаємодія електромагнітного випромінювання та потоків заряджених частинок з речовиною” (теми “Дослідження гідратації макромолекул і механізмів їх взаємодії з іонізуючим випромінюванням” № держреєстрації 0197U016740 та “Дослідження впливу іонізуючого випромінювання і біологічно-активних речовин на клітини та організми” № держреєстрації 0197U016741).

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було з’ясування молекулярних механізмів впливу температури в області 4-44С на агрегацію нативних та опромінених тромбоцитів. Для досягнення цієї мети вирішувались такі задачі:

1. Визначити обумовлені температурою і гамма-опроміненням зміни стану клітинної мембрани тромбоцитів та конформації білка крові фібриногену методами НВЧ-діелектрометрії та УФ-спектроскопії.

2. Встановити залежність параметрів агрегації тромбоцитів, індукованої різними агоністами, від температури в області 4-44С оптичними методами.

3. Розробити математичні моделі динаміки утворення агрегатів тромбоцитів і визначити величини кінетичних констант агрегації при різних температурах.

4. Вивчити вплив гамма-опромінення (10-250 Гр) in vitro та хронічного низькодозового зовнішнього і внутрішнього опромінення організму на функціональні властивості тромбоцитів людини і щурів.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що вперше експериментально встановлено існування конформаційного переходу у молекулі фібриногену людини при температурі 18-22С і структурні зміни при опроміненні його розчинів дозою 40-60 Гр, що супроводжуються зміною гідратації білка. Детально встановлений характер температурної залежності ступеня і швидкості агрегації тромбоцитів, індукованої АДФ, адреналіном, тромбіном, ристоміцином і Н2О2 в інтервалі температур 4-44С. Встановлено, що в суспензії тромбоцитів відбуваються зміни стану води при температурах 20-22 і 32-36С і структурні зміни мембранних білків при 18-20 і 30-32С. Розроблено математичну модель динаміки агрегації тромбоцитів і отримані оптимізовані за експериментальними даними величини констант швидкостей утворення та розпаду агрегатів. Вперше встановлена залежність кінетичних констант агрегації від температури та оцінені енергії активації міжклітинних взаємодій тромбоцитів. Показано, що характер температурної залежності агрегації тромбоцитів зумовлений механізмом утворення зв’язків між клітинами у агрегаті і визначається змінами мікров’язкості ліпідного бішару мембрани тромбоцитів, конформації молекули фібриногену і мембранних рецепторів.

Вперше встановлено температурні залежності ступеня і швидкості агрегації -опромінених тромбоцитів і різну радіаційну чутливість їх поверхневих рецепторів. Показана залежність агрегаційної спроможності тромбоцитів від поглиненої дози опромінення і тривалості її накопичення при хронічному комбінованому (внутрішньому і зовнішньому) опроміненні організму.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблене експериментальне устаткування для дослідження залежності параметрів агрегації тромбоцитів від температури може використовуватися для вивчення різноманітних температурозалежних процесів у дисперсних біологічних системах. Отримані в роботі дані поглиблюють уявлення про механізми міжклітинних взаємодій і роль конформаційних переходів білків у клітинних функціях. Результати дослідження механізмів функціонування тромбоцитів можуть бути корисними при розробці діагностичних і фармакологічних методів у практичній медицині, при визначенні індивідуальної чутливості клітин до дії холоду та високих температур, що необхідно для вибору режимів консервування і збереження крові. Отримані дані про дію гамма-опромінення на агрегаційну спроможність тромбоцитів і білки крові in vitro та in vivo важливі для з’ясування механізмів радіаційного ушкодження живих організмів і можуть застосовуватись у радіобіології і радіаційній медицині.

Особистий внесок здобувача. В роботах 1-3, 6, 7, 15 – отримання експериментальних даних та їх опрацювання, участь у обговоренні результатів та формулюванні висновків. У роботі 4 – участь у розробці моделей, проведенні розрахунків кінетичних констант і енергії активації, участь в аналізі отриманих даних. У роботах 5,8 – участь у проведенні вимірювань, в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, обговоренні результатів. У роботах 9-11,14 – весь обсяг робіт, пов’язаний з аналізом літератури, отриманням експериментальних даних, формулюванням висновків. У роботах 12, 13 – участь у підготовці і проведенні експериментів, опрацюванні, аналізі та інтерпретації одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи за темою дисертації доповідались і обговорювались на:–

I з’їзді Українського біофізичного товариства, Київ, 20-24 червня 1994;–

Международной научной конференции “Идеи И.И.Мечникова и развитие современного естествознания”, Харьков, 28-30 ноября 1995;–

2nd European Biophysics Congress, Orleans, France, July 13-17, 1997;–

VII Українському бiохiмiчному з'їзді, Київ, вересень 1997;–

7th European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules, Madrid, Spain, September 7-12, 1997;–

Kharkov Biophysical Workshop of Young Scientists, Кharkov, 1997;–

3 съезде по радиационным исследованиям, Москва, Россия, 14-17 октября 1997;–

2nd International Conference “Long-Term Health Consequences of the Chernobyl Disaster”, Kiev, June 1-6, 1998;–

II З’їзді Українського біофізичного товариства, Харків, 29 червня-3 липня 1998;–

5th International Conference “Dielectric and Related Phenomena”, Szczyrk, Poland, 24-27 September, 1998;–

Семінарі Харківського відділення біофізичного товариства України, Харків, 1998.

Публікації. Результати дисертації опубліковано в 15 наукових працях, у тому числі в 5 статтях у наукових журналах та в 1 матеріалах і 9 тезах доповідей з’їздів, конгресів, конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, п’яти розділів, висновків. Повний обсяг дисертації складає 191 сторінку, з них 23 стор. займають 55 ілюстрацій, 20 стор. – список використаних джерел ( 181 найменування).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність обраної теми, сформульована мета і задачі дослідження, визначена наукова новизна, практична і теоретична цінність отриманих результатів, наведена загальна структура дисертації.

У розділі 1 викладено огляд літератури за темою дослідження. В ньому розглядаються сучасні дані про структуру тромбоцитів та молекули білка плазми крові фібриногену. Детально розглянуто молекулярні механізми активації та агрегації тромбоцитів, індукованої різними агоністами. Визначено роль фібриногену як основного кофактора агрегації, за допомогою якого утворюються зв’язки між клітинами у процесі агрегації. На підставі аналізу літературних джерел показано, що повинна існувати тісна залежність між структурним станом фібриногену, плазматичних мембран тромбоцитів і їх агрегаційною спроможністю. Проте механізми залежності агрегації тромбоцитів від температури в літературі практично не обговорюються.

Зроблено критичний огляд результатів досліджень впливу гамма-опромінення на структуру та функції тромбоцитів в широкому інтервалі доз. Відзначається висока радіаційна стійкість клітин in vitro, але дія малих доз, зокрема при опроміненні організму мало вивчена.

Проаналізовано існуючі підходи до побудови математичних моделей агрегації тромбоцитів. Показано, що здебільшого моделі не описують незворотну агрегацію, а параметрами виступають напівемпіричні величини, які не мають чіткого фізичного змісту.

Розглядаються діелектричні властивості розчинів макромолекул і суспензій клітин. Показано, що на підставі аналізу діелектричних характеристик дисперсних систем у НВЧ-діапазоні, зокрема статичної діелектричної проникності та частоти діелектричної релаксації, можна робити висновки про стан гідратного оточення макромолекул або клітин і його зв’язок з конформаційними та структурними змінами біосистем.

В розділі 2 наведено характеристику об’єктів та методів досліджень. Об’єктами досліджень були розчини фібриногену, нативні й опромінені тромбоцити крові людини та щурів.

Дослiдження проведенi на зразках кровi 70 здорових донорiв обох статей та на 60 самцях-щурах лінії Вістар. Збагачена тромбоцитами плазма (ЗТП) видiлялась з кровi, стабiлiзованої глюгiциром 4:1, шляхом центрифугування протягом 10 хв при 167g, а безтромбоцитарна плазма (БТП) – центрифугуванням ЗТП впродовж 15 хв при 1100g.

В дослідах використовували розчини білка фібриногену людини (препарати Харківської обласної станції переливання крові) концентрації 0,5-10 мг/мл у 0,15 М NaCl.

Індуковані температурою структурні перебудови мембран клітин і білків плазми викликають зміни структури розчинника (води). Співставляючи дані про зміну стану води у суспензії клітин і розчинах білків з інформацією про стан власне клітин і макромолекул при різних температурах, можна зробити висновки про характер температурних переходів.

Дослідження стану води проведені резонаторним методом НВЧ-діелектрометрії на частоті 9,3 ГГц, за даними відносних вимірювань дійсної (/) і уявної (//) частин комплексної діелектричної проникності.

Величину діелектричної сталої / визначали за зміною резонансної частоти (f) резонатора зі зразком відносно пустого резонатора, а величину // – за величиною затухання потужності НВЧ поля, внаслідок внесення у резонатор діелектрика.

Діелектрична релаксація більшої частини води у суспензії клітин описується рівнянням Дебая з центральною частотою дисперсії 20 ГГц (при 20-25С), дисперсія діелектричної проникності інших компонентів ЗТП – білків і ліпідів – спостерігається на частотах нижче <0,5 ГГц.

Частотна залежність комплексної діелектричної проникності диполів у рідинах описується рівнянням Дебая:

, (1)

де і s – високочастотна (оптична) та статична діелектрична проникності; fd і f – частота діелектричної релаксації та частота мікрохвильового поля, відповідно.

Розділяючи дійсну й уявну частини рівняння (1) у відповідності до

(2)

отримаємо:

, (3) . (4)

Із рівнянь (3) і (4) можна одержати вирази для fd і s:

, (5) (6)

Величина s не залежить від частоти і пропорційна відношенню кількості вільної і зв’язаної води. fd – параметр, який характеризує рухомість молекул води в полі НВЧ, а відтак – ступінь її взаємодії з оточенням.

Значення s і fd знаходили за формулами (5)-(6), беручи значення =5,5 (діелектрична проникність досліджуваних об’єктів у ІЧ-діапазоні).

Конформаційні перебудови білків при температурах 4-44С вивчали за спектрами поглинання в діапазоні довжин хвиль 250-350 нм, які реєстрували на ультрафіолетовому спектрофотометрі “PYE UNICAM SP 8000” (Великобританія). За спектрами поглинання визначали мутність розчину, інтенсивність поглинання та інтентинсивність першої похідної спектру поглинання (1ПСП).

Агрегацiю тромбоцитiв викликали додаванням до 0,9 мл ЗТП 0,1 мл розчину iндуктора. В роботi використовувались такi iндуктори: АДФ (аденозин-5'-дифосфорна кислота динатрiєва сiль у концентрацiях 210-5-210-6 М), адреналiн (210-5-210-6 М), ристомiцин (1,2-1,5 мг/мл) – всi препарати виробництва фiрми "Реанал" (Угорщина); адреналін (2-4 ед/мл) (“Simko”, Україна), пероксид водню (7,110-3 М) марки х.ч.

Агрегацiя тромбоцитiв спостерігалась методом світлорозсіювання. Зміну оптичної густини ЗТП під час агрегації реєстрували за допомогою фотоелектроколориметра ФЕК-М (у полосі із максимумом світлопропускання 540 нм) з автоматичним потенцiометром ЕПП-09М. Ступiнь агрегацiї (D) визначали як максимальну зміну оптичної густини, а швидкiсть (V) – за тангенсом кута нахилу дотичної до кривої на напiввисотi. Вимiрювання проводилися в iнтервалi температур 4-44С в спецiально розробленiй термостабiлiзуючій кюветi. Температура дослiджуваного зразка вимiрювалась термопарою мiдь-константан, з точнiстю 0,1С.

В розділі 3 наведено результати експериментального дослідження впливу температури на конформацію молекули фібриногену; представлено результати експериментальних досліджень впливу температури на стан тромбоцитів людини і процес агрегації за допомогою методів НВЧ-діелектрометрії, УФ-спектроскопії та світлорозсіювання,

Рис. 1. Залежність дійсної / та уявної // частин комплексної діелектричної проникності фібриногену (а) та фізіологічного розчину (б) від температури

За допомогою методу НВЧ-діелектрометрії отримано температурні залежності дійсної та уявної частин комплексної діелектричної проникності, частоти діелектричної. релаксації води у розчинах фібриногену. Залежності мають особливості в інтервалах температур 8-10, 18-20 та вище 35С, які відсутні у розчинника (Рис.1). Це свідчить про зміну стану зв’язаної та вільної води у розчині фібриногену при даних температурах, яка обумовлена, очевидно, зміною “щільності” пакування ділянок молекули при зміні структури білка.

Рис. 2. Залежність інтенсивності максимуму 1ПСП 292-294 нм (б), 288 нм (в), 284 нм (г), 281 нм (д) і мутності (а) розчину фібриногену від температури

Аналіз спектрів поглинання в УФ-діапазоні показує, що при нагріванні розчину фібриногену спостерігається зменшення інтенсивності максимуму 292-294 нм першої похідної спектру поглинання в області температур 16-22С (рис.2.б) і мутності в інтервалі 16-18С (рис.2.а). Інтенсивності максимуму 284 нм та піку 288 нм змінюються синхронно, але протилежно одна одній (рис.2. в, г). Зі зростанням температури інтенсивність піку 1ПСП 281 нм зменшується в інтервалі 8-12С, а потім зростає при температурі вище 35С (рис.2.д). Пік 1ПСП 281 нм, очевидно, відбиває стан центрів полімеризації фібриногена, а зміна його інтенсивності при температурах близько 10 та 35С говорить про зміну у структурі Д-домена білка.

Співставляючи мутність та інтенсивність максимуму 1ПСП 292-294 нм, можна стверджувати, що при температурах 18-22С відбуваються зміни розмірів та розташування внутрішніх ділянок молекули фібриногену із залишками триптофану, частина яких стає більш доступною для розчинника. Описані зміни, очевидно, пов’язані зі зміною структури Д-домена фібриногену, бо в Е-домені всі триптофаніли доступні для розчинника. Зміни на поверхні молекули, за нашими даними, відбуваються при температурах близько 10С та вище 35С.

У температурному інтервалі 18-22С спостерігаються також особливості на залежностях діелектричних параметрів розчинів фібриногену, які відбивають зміни стану води у системі білок-вода та зміни в молекулі білка, що торкаються внутрішніх гідрофобних ділянок і геометрії молекули. Можливо, це пов’язано зі зміною конформації молекули фібриногену, що призводить до зміни константи зв’язування його з тромбоцитарним рецептором, послаблення зв’язку між клітинами і зменшення ступеня агрегації тромбоцитів при подальшому підвищенні температури.

Таким чином, на підставі отриманих результатів зроблено висновок про те, що в області температур 4-50С, крім конформаційного переходу II, що відбувається при 8-12С, у фізіологічних умовах виявлений конформаційний перехід при 18-20С. Цей перехід пов’язаний зі зміною розташування внутрішніх ділянок молекули фібриногену, які належать, очевидно, Д-домену. У результаті переходу частина триптофанілів стає більш доступною для розчинника. Припускається, що зміна конформації білка при 20С визначає екстремальний характер температурної залежності агрегації тромбоцитів, необхідним кофактором якої є фібриноген.

Рис. 3. Залежність частоти діелектричної релаксації води у ЗТП і БТП від зворотної температури

Досліджено температурну залежність статичної діелектричної проникності та частоти діелектричної релаксації ЗТП в інтервалі температур 4-42С.

Температурні залежності / і // води та 0,15 М NaCl не мають особливостей в усьому дослідженому інтервалі температур. Спостерігається плавне зростання / і зменшення // при підвищенні температури. Температурні залежності / та // плазми і ЗТП мають ряд особливостей, що полягають у відхиленні при певних температурах від монотонності зміни параметрів. Врахування поправок до величини // за рахунок електропровідності зразків не змінює характеру температурних залежностей //(Т), а лише зсуває графік вниз по осі ординат.

При зростанні температури спостерігається сходинкоподібна зміна / і // суспензії тромбоцитів в області температур 8-10С, 18-22С і 32-36С. Відхилення від монотонного зниження температурної залежності s спостерігаються при 8-10, 18-20 та 32-36С.

Залежності частоти діелектричної релаксації води досліджених зразків у координатах ln(fd) – 1/Т представлені на рисунку 3. В областях сходинкоподібних змін /(Т) і //(Т) ЗТП графіки мають розрив або злам. Видно різку зміну нахилу залежності ЗТП в області 18-26С зі збільшенням ентальпії активації від 7,9 кДж/моль до 13,8 кДж/моль. Це свідчить про значні зміни стану вільної та зв’язаної води у суспензії тромбоцитів при даних температурах, які очевидно обумовлені перебудовами клітинних структур під впливом температури.

Методом УФ-спектроскопії досліджено зміни структурного стану тромбоцитів в області температур 6-40С. Відзначено зміну форми тромбоцитів при температурах 14-18С при нагріванні суспензії клітин. Цей процес супроводжується змінами структури актину примембранного цитоскелету: при температурах 14-16С спостерігається зменшення кількості G-актину в тромбоцитах (зменшення інтенсивності піку 1ПСП 284 нм) і збільшення вмісту F-форми актину (що виражається у збільшенні інтенсивності максимуму 1ПСП 288 нм). У цій же області температур відзначено зміну інтенсивності максимуму 298 нм, який відбиває стан насамперед тромбоцитарного рецептора АДФ і, можливо, рецепторів фібриногену. Очевидно, зміни структури мембранних рецепторів і цитоскелету пов’язані між собою.

Зміна інтенсивності піка 1ПСП 280 нм при температурах 30-32С свідчить про зміну структури гідрофільних екстрацеллюлярних білкових ділянок рецепторів АДФ і фібриногену, які містять залишки тирозину.

Таким чином, зміни морфо-функціональних характеристик тромбоцитів в залежності від температури пов’язані, при температурах нижче 20, зі зміною структури –примембранного цитоскелету і стану мембранних рецепторів для індукторів і кофакторів агрегації; а в області температур близько 30С – зі зміною структури рецепторів плазматичної мембрани тромбоцитів.

Досліджено вплив температури на агрегацію тромбоцитів, індуковану АДФ, адреналіном, тромбіном, ристоміцином та Н2О2 за допомогою метода світлорозсіювання.

Кінетичні криві агрегації значно змінюються при різних експериментальних температурах для всіх індивідуумів. Для АДФ- и Н2О2-індукованої агрегації тромбоцитів при температурі 20-25С і вище спостерігається зміна форми клітин, яка передує утворенню агрегатів. При використаннi адреналiну, тромбіну і ристоміцину як iндукторів в усьому діапазонi температур на початкових стадiях агрегацiї змiна форми тромбоцитiв не спостерiгається.

Ступiнь і швидкiсть агрегацiї, iндукованої ристомiцином, зменшуються при пiдвищеннi температури. Очевидно, різний характер температурних залежностей параметрів агрегації тромбоцитів, індукованої ристоміцином і такими фізіологічними індукторами як тромбін, адреналін, АДФ, пов’язаний з іншим, не залежним від фібриногену, механізмом утворення зв’язків між тромбоцитами при агрегації і зумовлений ослабленням кулонівської взаємодії при збільшенні температури.

Рис. 4. Залежність ступеня агрегації тромбоцитів, індукованої різними агоністами від температури. 1 - АДФ, 2 - адреналін, 3 - тромбін, 4 - ристоміцин

Для чотирьох досліджених індукторів агрегації – АДФ, адреналіну, тромбіну й пероксиду водню залежності ступеня і швидкості агрегації від температури мають вид кривих з максимумом. Причому для кожного індуктора максимум швидкості агрегації спостерігається завжди при більшій температурі ніж максимум ступеня. Форма кривих, розташування максимумів та їх віддалення один від одного відрізняються для різних індукторів. Так для АДФ максимум ступеня агрегації спостерігається при температурі 18-22С, швидкості – 30-34С; адреналіну – 18-22С, 24-28С; тромбіну – 18-22С, 22-26С, Н2О2 – 16-22С, 26-30С відповідно (рис. 4). Екстремальний характер залежності параметрів агрегації зберігається при зміні швидкості перемішування суспензії тромбоцитів і кількості клітин, що свідчить про те, що частота зіткнень тромбоцитів один з одним не є лімітуючою стадією агрегації.

Наявність максимуму у температурних залежностей параметрів агрегації свідчить про існування як мінімум двох факторів, що визначають форму залежності.

Максимум ступеня iндукованої агрегацiї, який вiдбиває мiцнiсть зв'язування тромбоцитiв у агрегатi, спiвпадає з iнтервалом температур, у якому вiдбувається змiна фазового стану лiпiдiв біологічних мембрани і структурні зміни мембранних рецепторів, зареєстровані нами методами НВЧ-діелектрометрії та УФ-спектроскопії. Крім того при 18-22С встановлено зміну конформації фібриногену, молекули якого з’єднують сусідні клітини, викликаючи їх агрегацію. Отже можемо зробити висновок, що збільшення параметрів агрегації при 4-20С обумовлене природним збільшенням швидкості молекулярних взаємодій при підвищенні температури, а зменшення при температурах вище 20С – структурними змінами тромбоцитарних рецепторів і фібриногену плазми.

В розділі 4 наведена математична модель індукованої агрегації тромбоцитів in vitro на клітинному рівні. Вважається, що процеси активації тромбоцитів індуктором, внаслідок яких експонуються рецептори для фібриногену (глікопротеїни ІІв-ІІІа) на мембранній поверхні та молекулярна реакція утворення комплексів рецептор-фібриноген, є, порівняно з об’єднанням тромбоцитів у клітинні агрегати, швидкими процесами. Тому концентрації індуктора, фібриногену та рецепторів не розглядаються як динамічні змінні. Натомість використовуються їх стаціонарні концентрації. В експериментальних дослідженнях звичайно використовують досить високі концентрації індукторів, достатні для первинної активації практично всіх тромбоцитів досліджуваного зразка. За таких умов можна вважати, що на початку ми маємо систему, яка складається тільки з активованих тромбоцитів, здатних до з’єднування один з одним. Враховуючи те, що процес агрегації спостерігають в умовах швидкого перемішування, коли виникають великі зсувні сили у потоці, можна знехтувати ймовірністю об’єднання відносно великих агрегатів, порівняно з можливістю приєднання окремих клітин до вже утворених агрегатів. Тоді в загальному вигляді процес агрегації може бути представлений схемою

(7)

де – Pact, Paggr, Pinact – кількість (концентрація) активованих, об’єднаних у агрегати та інактивованих тромбоцитів, відповідно; ki – константи швидкостей взаємодій.

Динаміка зміни кількості тромбоцитів у відповідних станах описується системою диференційних рівнянь:

. (8)

(9)

(10)

В умовах зсувних потоків з великими градієнтами швидкостей, при врахуванні рівномірного розташування рецепторів на поверхні тромбоцитів, можна очікувати, що форма агрегатів буде наближатися до кулеподібної. При щільній упаковці тромбоцитів і збереженні об’єму клітин у агрегаті, його розмір буде визначатися як

, (11)

де RA і reff – радіус агрегату і ефективний лінійний розмір тромбоцита, N – кількість клітин в агрегаті.

Розглянемо процес утворення агрегатів як результат ефективних пружних зіткнень окремих тромбоцитів з відносно великими агрегатами. Швидкість цього процесу буде пропорційною ефективному перетину розсіювання () частинок. Для частинок кулеподібної форми у нашому випадку

. (12)

Припустімо, що з поверхні агрегату можуть відділятися окремі тромбоцити. Тоді цей процес буде визначатися кількістю клітин у поверхневому шарі агрегату, яка, враховуючи (11), буде:

. (13)

Крім того враховуємо, що агрегати можуть частково руйнуватися під час пружних зіткнень один з одним, пропорційно їх кількості та ефективному перетину розсіювання.

Тоді система рівнянь (8-10) у випадку, коли Pinact=0, з урахуванням очевидного алгебраїчного рівняння

(14)

зводиться до одного диференційного рівняння

, (15)

де АА=RA2. Вважаючи, що кількість агрегатів у системі і , після деяких перетворень маємо для швидкості зміни кількості тромбоцитів у середньостатистичному агрегаті

(16)

де P0 – початкова кількість тромбоцитів, Nmax – максимальна кількість клітин в агрегаті при повній їх активації.

Для співставлення теоретичних кривих N(t) з експериментальними кривими агрегації, одержаними методом світлорозсіювання, використовували залежність зміни оптичної густини (D) дисперсної системи від величини перетину розсіювання світла частинками кулеподібноі форми у вигляді

, (17)

де – коефіцієнт розсіювання, який залежить від оптичних властивостей дисперсних частинок, l – довжина оптичного шляху світла. Величину Nmax визначали за експериментальними значеннями максимальної зміни Dmax , за умови, що практично всі тромбоцити знаходяться в агрегатах, із виразу:

. (18)

Рис. 5. Температурна залежність констани швидкості утворення агрегатів k1 та відповідна Арреніусова залежність.

Розроблена модель була використана для оцінки констант швидкостей утворення (k1) і розпаду (k2) агрегатів за експериментально отриманими кривими агрегації при різних температурах шляхом оптимізації цих параметрів у рівнянні (16) разом з (17). Константу k1 визначали за оптимальним наближенням теоретичної кривої до експериментальної на початковій ділянці кривої агрегації, а k2 – на кінцевій ділянці. Рівняння (16,17) чисельно розв’язувалися методом Рунге-Кутта. Розраховано величини енергій активації процесів приєднання і відокремлення тромбоцитів від агрегату.

В розділі 5 наведено результати досліджень впливу гамма-опромінення на стан молекули фібриногену; температурної залежності агрегації тромбоцитів, індукованої АДФ, адреналіном і тромбіном, при опроміненні in vitro дозами 10-250 Гр та динаміки змін функціональної активності тромбоцитів щурів, при дії комбінованого опромінення інкорпорованих радіонуклідів “чорнобильського спектру” і низькодозового зовнішнього опромінення протягом 12 місяців.

Отримано залежності діелектричних констант і ступеня гідратації () для нативного й опроміненого фібриногену. При опроміненні білка відзначено зменшення , і зростання при збільшенні дози опромінення. В області доз близько 50 Гр характер залежностей діелектричних констант і ступеня гідратації змінюється на протилежний, що свідчить про конформаційні зміни білка, очевидно пов’язані зі зміною структури, як центрального, так і периферичних доменів молекули. Встановлено, що при цьому поверхня білка стає більш гідрофобною.

Отримано залежності ступеня та швидкості агрегації тромбоцитів від дози -опромінення. Максимальне збільшення параметрів агрегації, індукованої різними агоністами, відзначене при опроміненні in vitro дозами 30-50 Гр. Великі дози опромінення ведуть до загального зниження агрегації.

Показано, що зміни агрегації тромбоцитів при дії радіації пов’язані з активацією ПОЛ у мембранах тромбоцитів і зміною структури білків клітин і плазми крові. Температурні залежності ступеня і швидкості агрегації опромінених тромбоцитів для різних індукторів відрізняються, що свідчить про різну радіочутливість відповідних мембранних рецепторів.

При дії хронічного комбінованого іонізуючого опромінення в малих дозах in vivo спостерігається збільшення функціональної активності тромбоцитів щурів, яке немонотонно зростає протягом всього терміну спостереження (12 місяців). Відзначена залежність величини агрегації тромбоцитів від поглиненої дози опромінення і тривалості її накопичення. Спостережений відгук тромбоцитів супроводжується змінами у системі гемопоезу і структурними порушеннями білків плазми, зокрема фібриногену, і мембран тромбоцитів. Залежність агрегації тромбоцитів від терміну дії радіації показує зростання ризику тромбоутворення, з максимумами біля 1,5 і 12 міс опромінення. Показано, що дія чорнобильських факторів опромінення протягом року вичерпує можливості адаптаційних антикоагулянтних систем: спостерігається дозозалежне зменшення дезагрегації тромбоцитів – активації протизгортуючої системи організму, відбувається зрив адаптації.

ВИСНОВКИ

1.

1.

1.

1.

1.

1.

список опублікованих праць за темою дисертації

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Анотація

Берест В.П. Вплив температури на агрегацію тромбоцитів у нормі і при дії гамма-опромінення. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Харківський державний університет, м. Харків, 1999.

Методами НВЧ-діелектрометрії, УФ-спектроскопії та світлорозсіювання досліджено вплив температури в області 4-44С на структуру та функції тромбоцитів і фібриногену людини. Знайдено конформаційний перехід фібриногену при 18-22С, який пов’язується зі зміною структури Д-домену. У суспензії тромбоцитів встановлені зміни стану води при 18-22 і 32-36С і структурні зміни мембранних білків при 18-20 і 30-32С. Отримані залежності ступеня і швидкості агрегації тромбоцитів від температури для різних індукторів і показано їх екстремальний характер. Запропоновано математичну модель агрегації тромбоцитів. Розраховано теоретичні криві агрегації, оптимізовані значення констант швидкостей за експериментальними даними для різних температур і визначені значення енергії активації. Показано, що характер залежності агрегації тромбоцитів від температури визначається фазовим переходом ліпідів мембрани і конформаційними змінами мембранних рецепторів і фібриногену при 18-22С. Досліджено вплив -опромінення тромбоцитів in vitro (10-250 Гр) і хронічного комбінованого зовнішнього і внутрішнього in vivo (0,16-50 сГр) на залежність агрегації від температури. Показана різна радіовразливість білків плазми і мембранних компонентів

Ключові слова: тромбоцити, агрегація, фібриноген, температура, конформаційні переходи, НВЧ-діелектрометрія, УФ-спектроскопія, світлорозсіювання, математичні моделі, кінетика, гамма-опромінення

Аннотация

Берест В.П. Влияние температуры на агрегацию тромбоцитов в норме и при действии гамма-излучения. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Харьковский государственный университет, г.Харьков, 1999.

Методами СВЧ-диэлектрометрии, УФ-спектроскопии и светорассеяния исследовано влияние температуры в области 4-44С на структуру и функции тромбоцитов и фибриногена человека. Обнаружен конформационный переход фибриногена при 18-22С, связываемый с изменением структуры Д-домена. В суспензии тромбоцитов установлены изменения состояния воды при 18-22 и 32-36С и структурные изменения мембранных белков при 18-20С и 30-32С . Получены зависимости степени и скорости агрегации тромбоцитов от температуры для различных индукторов и показан их экстремальный характер. Предложена математическая модель агрегации тромбоцитов. Рассчитаны теоретические кривые агрегации, оптимизированы значения констант скоростей по экспериментальным данным для различных температур и определены значения энергии активации. Показано, что характер зависимости агрегации тромбоцитов от температуры определяется фазовым переходом липидов мембраны и конформационными изменениями мембранных рецепторов и фибриногена при 18-22С. Исследовано влияние -облучения тромбоцитов in vitro (10-250 Гр) и хронического комбинированного внешнего и внутреннего in vivo (0,16-50 сГр) на зависимость агрегации от температуры. Показана различная радиочувствительность белков плазмы и мембранных компонент.

Ключевые слова: тромбоциты, агрегация, фибриноген, температура,, конформационные переходы, СВЧ-диэлектрометрия, УФ-спектроскопия, светорассеяние, математические модели, кинетика, гамма-облучение

SUMMARY

Berest V.P. Influence of temperature on platelet aggregation under normal conditions and under action of -irradiation. – Manuscript.

Thesis for candidate’s degree by speciality 03.00.02 – biophysics. – Kharkov State University, Kharkov, 1999.

The experimental and theoretical investigation of temperature influence on the platelet and fibrinogen structures under the action of -irradiation with doses 10-250 Gy has been performed for the range of 4-44C.

The information concerning the structural changes of fibrinogen molecule at temperatures from 4 to 44C has been obtained by means of the very high frequency dielectric spectroscopy and UV-spectroscopy methods. А new conformational transition has been observed in fibrinogen at 18-22C. This transition might be connected to structural transition in D-domain of fibrinogen and accompanied by an increase in tryptophanyl accessibility to the solvent. The conformational transition revealed probably determines the character of the temperature dependence of blood platelet aggregation.

The structural changes of platelet membrane receptors have been registered as changes of intensities of derivative maxima in the UV-range at the temperatures of 18-20C and 30-32C.

The data on water structure change has been obtained by using very high frequency dielectric spectroscopy for the platelet suspension at 18-22C and 32-36C. The values of activation enthalpy for the process of dielectric relaxation of bulk waters in cell suspension have been calculated.

The influence of the temperature on platelet aggregation induced by various agents has been studied by using the light scattering method. It has been shown that the temperature dependences of degree and rate of platelet aggregation have maxima. The extreme nature of the temperature dependences does not depend on the platelet count, agonist concentration, and rate of suspension stirring.

The mechanism of the temperature dependence of platelet aggregation has been discussed. The existence of the membrane phase transition and change of receptor mobility allow one to explain the kink at the 20C. The membrane proteins and fibrinogen conformational transitions take place at the same temperature. These lead to the decrease of aggregation.

The mathematical model of platelet aggregation kinetics has been suggested. The case of the total platelet activation has been considered. The aggregation is modeled as the process of elastic collisions platelets and spherical aggregates. The possibility of the disassociation of platelets from an aggregate due to the breakdown of molecular bridges and collisions between aggregates. The time variations of the numbers of platelets included into an aggregate for various temperatures have been obtained as the result of the numerical simulations. The optimization of the aggregation and disaggregation rate constants has been performed using experimental data obtained with the help of light scattering method. The temperature dependences of kinetic constants have been obtained, the corresponding values of activation energies have been calculated.

The temperature dependence of the aggregation platelet irradiated in vitro with doses 10-250 Gy has been studied by using light scattering method. The irradiation leads to the change of membrane viscosity and platelet protein conformation. The maximal values of aggregation have been registered for the doses 30-50 Gy. The change of the fibrinogen hydration has been registered at the same doses. The differences of the temperature dependences features of irradiated platelet aggregation induced by various agonists are