ІНСТИтУТ експериментальної і КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ

МЕДИЦИНИ УААН

ГУНЧАК ВАСИЛЬ МИХАЙЛОВИЧ

УДК 619:615.9:636.5

хронічНИЙ НІТРАТНО-НІТРИТНИЙ ТОКСИКОЗ КУРей

та його профілактика

16.00.04 – ветеринарна фармакологія та токсикологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора ветеринарних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівській національній академії ветеринарної медицини імені С.З.Ґжицького (ЛНАВМ) Міністерства аграрної політики України.

Науковий консультант: доктор ветеринарних наук, професор

Гуфрій Дмитро Федорович,

Львівська національна академія ветеринарної медицини імені С.З.Ґжицького, завідувач кафедри фармакології та токсикології.

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН Хмельницький Григорій Олександрович,

Національний аграрний університет, завідувач кафедри фармакології та токсикології;

доктор ветеринарних наук, професор, член-кор. УААН Влізло Василь Васильович,

інститут біології тварин УААН, директор;

доктор ветеринарних наук, професор

Чорний Микола Васильович,

Харківська державна зооветеринарна академія, завідувач кафедри зоогігієни.

Провідна установа: Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів і кормових добавок, відділ фармакології і імунології, Міністерства аграрної політики України, м. Львів

Захист дисертації відбудеться "22" лютого 2005 року о 930 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “19” січня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор Бабкін А.Ф.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним із головних завдань ветеринарної токсикології було і залишається вивчення біологічної дії антропогенних забруднювачів навколишнього середовища, що є факторами ризику виникнення захворювань різної патології. Мета таких досліджень полягає у прогнозуванні вірогідності тих чи інших патологічних станів та в розробленні адекватних заходів щодо їх запобігання.

Поміж речовин, що забруднюють довкілля, за обсягом застосування азотні добрива посідають провідне місце. В Україні після деякого спаду виробництво і застосування азотних добрив постійно збільшується (за даними Мінекономіки України у 1995 р. – 1,5 млн. т, 2000 р. – 1,8 млн. т, 2002 р. – 2,5 млн. т, 2003 р. – 2,8 млн. т), через що зберігається тенденція ускладнення екологічної обстановки та зростає актуальність досліджень, пов’язаних із цією проблемою. Надмірне накопичення азотовмісних речовин у навколишньому середовищі призводить до підвищення вмісту нітратів у ґрунтах, водах та кормових рослинах і, як наслідок, збільшується надходження їх в організм тварин (Вовк Д.М. та ін., 1990; Войтабов В.І., 1991; Запорожець М.Ф., 1992; Менькін в.К., 1993; Шакапуров М.М., 1993; Murphy S.A. et al., 1995; Hrubec T.c. et al., 1997; Yeruham I. et al., 1997; Духніцький В.Б., 1999; Мазуркевич а.й. та ін., 2001; Хмельницький Г.О., 2002; Гуфрій Д.Ф. та ін., 2002; Панько М.Ф., 2003). Згодовування кормів із високим рівнем нітратів тваринам і птиці призводить до виникнення отруєнь, зниження продуктив-ності, погіршення санітарної якості продукції, розладів здатності тварин до відтворення, народження нежиттєздатного приплоду та загибелі поголів’я. У птиці, крім того, погіршується несучість та виводимість курчат (Скородинський З.П., 1974; Хмельницький Г.О., 1990; Малінін О.О., 1990, 1992; Гуфрій Д.Ф., 1997; Влізло В.в., 2003)

Забруднення навколишнього середовища нітратами та їхній небажаний вплив на організм тварин роблять проблему вивчення механізму їх токсичної дії, як при роздільному, так і при комбінованому застосуванні, особливо актуальною, що має теоретичне та практичне значення. Вивченню питань, пов’язаних з отруєнням тварин нітратами, присвячена значна кількість наукових робіт вітчизняних і зарубіжних дослідників. Серед них у нашій країні найбільш фундаментальні дослідження проведені І.м.Гладенком, С.в.Баженовим, З.П.Скородинським, Г.О.Хмельницьким, А.й.мазуркевичем, О.О.Малініним, Д.Ф.Гуфрієм, О.І.Канюкою та ін. ці вчені є засновниками наукових напрямків із вивчення нітратно-нітритної проблеми. Ними зібрано та узагальнено значний експериментальний і практичний матеріал та сформулювали основні теоретичні передумови про токсичний вплив нітратів і нітритів на організм сільськогосподарських тварин. На основі фактичного матеріалу розроблені “Методичні рекомендації з профілактики, діагностики та лікування тварин при отруєнні нітратами і нітритами” (2001).

Однак, механізм токсичної дії нітратів і нітритів на організм сільськогосподарської птиці досі вивчено недостатньо. Наявна лише невелика кількість наукових праць, присвячених цій темі. Зауважимо, що вони не дають цілісного уявлення про проблему, не встановлено параметри хронічної токсичності, мало вивчені біохімічні механізми нітратно-нітритних токсикозів (далі читати Н Н токсикоз), особливо на клітинному рівні, а також токсикокінетика та токсикодинаміка нітратів і нітритів в організмі птиці. Недостатньо з’ясовано вплив нітратів на імунну систему у курчат та їх мутагенну і канцерогенну дію, що в останні роки викликає занепокоєння гігієністів різних країн світу (Чорний М.в., 2003).

Досі недостатньо вивчена токсична дія нітратів при хронічному токсикозі. Як зазначає г.о.Хмельницький (1990), гострі отруєння нітратами, хоча і з запізненням, діагностуються порівняно легко, а хронічні токсикози, особливо у жуйних тварин, часто проходять під іншими діагнозами. Реальну небезпеку становлять хронічні Н Н токсикози птиці. У кормах для курей часто буває високий рівень нітратів. у надмірних кількостях вони знижують санітарну та біологічну якість продукції, погіршують інкубаційні властивості яєць, а у великих дозах спричиняють масові отруєння і загибель.

Отже, враховуючи викладене вище, необхідно відзначити, що проведення досліджень саме в такому плані є актуальним. Згідно з повідомленнями в іноземній літературі, ці питання мало вивчені, а в Україні так широко розробляються вперше і мають важливе теоретичне значення для науки та практичне значення для ветеринарної медицини в плані збереження поголів’я птиці та отримання від них продукції високої біологічної цінності та санітарної якості.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Представлена наукова праця – це окремий розділ комплексної теми кафедри фармакології та токсикології Львівської національної академії ветеринарної медицини імені С.З.Ґжицького “Дослідження механізмів патогенезу розладів гідролітично-транспортної функції травної системи у худоби за дії техногенних факторів і розробки ефективних способів зменшення їх негативної дії на продукти і здоров’я тварин та вивчення токсичної дії нітратів на організм тварин і птиці” (номер державної реєстрації 0102U001339).

Мета і задачі досліджень. Метою наших досліджень було вивчити особливості перебігу хронічного нітратно-нітритного токсикозу у курей, з’ясувати вплив підвищених кількостей нітратів у кормі на метаболічні процеси, морфологічні і біохімічні показники крові, імунну систему та обґрунтувати застосування антиоксидантів для зниження токсичної дії нітратів на організм птиці.

Для досягнення поставленої мети були визначені такі задачі:

- вивчити у модельних дослідах на щурах та в експериментах на курчатах механізм розвитку хронічного нітратно-нітритного токсикозу;

- дослідити морфологічні і біохімічні зміни у крові та встановити гістологічні зміни у внутрішніх органах і електронно-мікроскопічні зміни у тканинах печінки;

- встановити мутагенну дію нітратів і нітритів;

- вивчити білоксинтезуючу, дезінтоксикаційну та антиоксидну функції печінки;

- провести дослідження стану імунної системи та вивчити вплив нітратів на напруженість поствакцинального імунітету;

- обґрунтувати можливість використання антиоксидантів як гепатопротекторних засобів;

- вивчити ефективність дезінтоксикаційних засобів при наявності у кормах нітратів у субтоксичних дозах;

- науково обґрунтувати доцільність використання аскорбінової кислоти, фенарону, метіоніну та “Метіфену” для корекції морфологічних і біохімічних показників крові та стану імунної системи при хронічному нітратно-нітритному токсикозі.

Об’єкт дослідження: хронічний нітратно-нітритний токсикоз, гемопоез, імуногенез, мутагенна дія, іонний гомеостаз, антиоксидна система, окиснювальний стрес, профілактична дія антиоксидантів.

Предмет дослідження: вплив нітратів у різних дозах на біохімічні і морфологічні показники крові, дезінтоксикаційну, білоксинтезуючу і антиоксидну функції печінки, гістоморфоструктуру печінки і нирок та електронно-мікроскопічні зміни у клітинах печінки, показники специфічної і неспецифічної резистентності організму, напруженість імунітету, мутагенну дію та ефективність профілактичної дії аскорбінової кислоти, метіоніну, фенарону і “Метіфену”.

Методи досліджень: фармакологічні, токсикологічні, біохімічні і серологічні дослідження крові, генетичні, гістологічні, електронно-мікроскопічні та математичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні науково обґрунтовано, розкрито і узагальнено нові аспекти патогенезу нітратно-нітритного токсикозу у курей. Сформульовано теоретичні основи токсикодинаміки нітратів в організмі курчат при хронічному токсикозі та встановлено гепатопротекторну дію антиоксидантів (аскорбінової кислоти, фенарону і метіоніну). Отримано нові дані стосовно дії нітратів у субтоксичних дозах на морфологічні показники крові, рівень електролітів і активність ферментів у сироватці крові. вивчено вплив нітратів на білоксинтезуючу, дезінтоксикаційну і антиоксидну функції печінки. за динамікою біохімічних показників крові і активністю ферментів у сироватці крові та оцінкою гістоструктури печінки, нирок і кишечника та електронно-мікроскопічної структури тканин печінки встановлено, що у патогенезі нітратно-нітритного токсикозу, поряд із метгемоглобіноутворенням, вирішальну роль на рівні клітини відіграють процеси вільнорадикального окиснення фосфоліпідів біологічних мембран клітин із подальшим розвитком окиснювального стресу. Висунуто і обґрунтовано положення про участь імунних механізмів у підтриманні хімічного гомеостазу в організмі курчат при нітратно-нітритному токсикозі. Досліджено вплив нітратів на імунну систему – встановлено пригнічення клітинного і гуморального імунітетів та ослаблення поствакцинальної імунної відповіді при наявності в кормі нітратів понад максимально допустимий рівень. у дослідах на щурах за показниками метафазного аналізу клітин кісткового мозку та за кількістю еритроцитів з мікроядрами встановлено мутагенну дію нітратів. Представлено принципово нову схему розвитку хронічного нітратно-нітритного токсикозу. Запропоновано ефективні методи корекції гомеостазу та встановлено гепатопротекторну дію антиоксидантів – аскорбінової кислоти, фенарону, метіоніну та “Метіфену” при хронічному Н Н токсикозі. Викладені в дисертації наукові положення розкривають нові аспекти патогенезу нітратно-нітритних отруєнь і визначають передумови теоретичного обґрунтування та практичного застосування антиоксидантів для їх профілактики.

Наукова новизна отриманих результатів підтверджена рішенням про видачу деклараційного патенту на винахід “Спосіб профілактики токсичної дії нітратів корму і корекції обміну речовин у курей-бройлерів” (№2004604928 від 18 листопада 2004 р.).

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати дали можливість поглибити уявлення про патогенетичні механізми токсичної дії нітратів та розробити ефективні методи корекції порушень, які виникають при хронічній нітратно-нітритній патології у курей. Комплексна оцінка інтенсивності наслідків ендогенної інтоксикації дає змогу всебічно оцінити ступінь ураження організму та вибрати адекватні способи профілактики токсикозу.

На основі проведених досліджень із вивчення хронічної дії нітратів на організм курей визначені теоретичні аспекти та розроблені практичні методи застосування аскорбінової кислоти, фенарону, метіоніну і “Метіфену” для профілактики розвитку токсикозу при наявності у кормі нітратів у кількостях, що перевищують максимально допустимий рівень (МДР). Встановлені зміни активності амінотрансфераз у сироватці крові курей використовуються як тест ранньої діагностики скритого Н Н токсикозу.

Окремі положення дисертаційної роботи ввійшли до “Методичних рекомендацій з профілактики, діагностики та лікування тварин при отруєнні нітратами і нітритами”, затверджених Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України (2000 р.). Отримані результати досліджень були основою для розробки Технічних умов України (ТУ-У 24.4.-31003546-001-2004) на препарат “Метіфен”, затверджених Державним департаментом ветеринарної медицини України та Настанови щодо його застосування (2004). Результати експериментальних досліджень з вивчення Н Н токсикозів використовуються у навчальних закладах І-ІV рівнів акредитації при вивченні курсу “Ветеринарна токсикологія”.

Спеціалісти ветеринарної медицини західних областей України для запобігання нітратно-нітритних токсикозів у курей застосовують аскорбінову кислоту, фенарон і метіонін за розробленим нами методом та препарат “Метіфен”. При наявності в кормах для птиці нітратів у кількостях понад МДР, для профілактики Н Н токсикозу до корму додають антиоксиданти з розрахунку на 1 т: аскорбінової кислоти – 50 г, метіоніну – 80 г, фенарону – 200 г або “Метіфену” 280 г. антиоксиданти можна включати до складу мінерально-вітамінних преміксів. Вони захищають жири корму та жиророзчинні вітаміни від окиснення та підвищують несучість курей.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто обґрунтував наукову концепцію розвитку хронічного Н Н токсикозу, яка покладена в основу дисерта-ційної роботи, сформулював мету і основні етапи досліджень, здійснив пошук та аналіз літератури, організував досліди і провів експериментальні дослідження. Аналіз та інтерпретацію одержаних результатів, викладення висновків та пропозицій автор здійснив з методичною допомогою наукового консультанта.

Гістологічні та електронномікроскопічні дослідження внутрішніх органів курчат проведені нами спільно із співробітниками лабораторії гістоморфології Ольштинської аграрної академії (Республіка Польща).

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися і отримали загальне схвалення на щорічних наукових звітах і конференціях викладацького складу і аспірантів Львівської національної академії ветеринарної медицини імені С.З.Ґжицького у 1995-2004 рр.; Міжнародній науковій конференції, присвяченій 50-річчю заснування зооінженерного факультету ЛДАВМ (Львів, 1999); І-ому національному з’їзді фармакологів України “Сучасні проблеми фармакології”, Київ, 1995; І та ІІ-ій науково-практичній конференції “Неінфекційна патологія тварин (Біла Церква, 1995, 1998); І та ІІ-ій Всеукраїнських науково-методичних конференціях ветеринарних фармакологів і токсикологів (Київ, 1998, 2003); І, ІІ та ІІІ-ому міжнародних симпозіумах “Україна-Австрія” (Львів, 1996; Відень, 2000; Чернівці, 2002); Міжнародній науковій конференції до 100-річчя ЛДАВМ імені С.З. Ґжицького (Львів, 2000); науково-практичній конференції “Проблеми зооінженерії і ветеринарної медицини”, присвяченій 150-річчю заснування Харківського зооветеринарного інституту (Харків, 2001); науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчю від дня народження проф. Солярова Я.п., „Механізми фізіологічних функцій в експерименті і клініці” (Львів, 2001); науково-практичній конференції “До 75-річчя зооінженерного факультету Полтавської державної аграрної академії” (Полтава, 2002); VІІ-ій міжнародній науково-практичній конференції “Проблеми ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин” (Київ, 2002); VІІІ-ому українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); ІІІ-ій Міжнародній науково-практичній конференції “Молоді вчені – майбутнє вітчизняної ветеринарної медицини” (суми, 2004); V-ій українській конференції з птахівництва з міжнародною участю (Алушта, 2004).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи опубліковані у 30 наукових працях, з яких 21 публікація у фахових виданнях (13 одноосібних), що входять до переліку, затвердженого ВАК України; методичні рекомендації, навчальний посібник, технічні умови та настанова на препарат “Метіфен”.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 299 сторінках комп’ютерного тексту, містить 51 таблицю і 50 рисунків (які займають 25 сторінок) та складається з таких розділів: “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріал та методи досліджень”, “Результати власних досліджень”, “аналіз і узагальнення результатів досліджень”, “Висновки”, “практичні рекомендації”, „Додатки”. Список використаних літературних джерел, містить 613 найменувань, у тому числі 292 іноземних авторів.

ОсновниЙ зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Експериментальна частина роботи виконана у 1995-2003 роках на кафедрі фармакології та токсикології ЛНАВМ і у клініці академії за схемою, представленою на рис. 1.

Модельні досліди проведені на 186 нелінійних білих щурах, а експериментальні дослідження на 400 курчатах відповідно до методичних рекомендацій “Токсикологічний контроль нових засобів захисту тварин” (1997).

У крові щурів і курчат досліджували морфологічні та біохімічні показники: кількість еритроцитів у щурів підраховували на КФК-2 з використанням калібрувального графіка (Заблоцький В.м., Поляков В.Ф., 1985); у курчат – за методикою Н.а.Сєдих і співавт. (1985); вміст гемоглобіну – спектрофотометрично (Кондрахин И.п. и соавт., 1985); концентрацію метгемоглобіну – спектрофото-метрично (Прохорова м.І., 1982); кількість лейкоцитів підраховували у камері Горяєва, лейкоцитарний профіль – у мазках крові за загальноприйнятою методикою, загальний об’єм еритроцитів – мікрометодом центрифугування крові (Архангельський І.І., 1993); у сироватці крові визначали активність АсАТ (КФ 2.6.1.1) і АлАТ (КФ 2.6.1.2.) – за методом Райтмана-Френкеля у модифікації К.г.Капетанакі (1981); активність ЛФ (КФ 3.1.3.1) і КФ (КФ 3.1.3.2) – фотоколориметрично (Комаров ф.І., 1981); активність каталази (КФ 1.11.1.6) – спектрофотометрично (Королюк М.А., 1988); рівень неорганічного фосфору, кальцію, магнію, натрію та хлору – спектрофотометрично (Козинець Г.ч., 1997); вміст загального білка і його фракцій – за допомогою біуретового реактиву (Лемперт М.д., 1968); концентрацію нітратів і нітритів – за методичними вказівками по визначенню нітратів і нітритів у кормах, продуктах харчування, біологічних рідинах організму (2001); рівень сечовини – за методикою з використанням диметилгліоксиму (Петрунь Н.М., 1970); загальний і вільний холестерол – за

методом М.а.Петрунь (1970); загальні ліпіди у реакції з фосфованіловим реактивом (А.А.Пентюк, 1987), фосфоліпіди – фотоколориметрично (Пентюк А.А., 1987), триацилгліцероли і гідроперекиси ліпідів – за методикою А.В.Мірошниченко (1984), швидкість перекисного окиснення ліпідів – за А.П.Владіміровим і В.С.арчаковим (1984); БАСК і ЛАСК - фотоколориметрично (Чумаченко В.Е., 1991); ФАЛ – тестом із суспензією стафілококів (Чумаченко В.е., 1991); титр комплементу в сироватці крові за гемолізом еритроцитів (Лефковіте І., 1981); активність лізоциму у сироватці крові за В.Е.Чумаченко (1991); кількість Т-лімфоцитів методом спонтанного розеткоутворення (Єськов А.п., 2002); мутагенну дію нітратів і нітритів визначали за метафазним аналізом клітин кісткового мозку та кількістю еритроцитів з мікроядрами (Schmid W., 1973); гістологічні та електронно-мікроскопічні дослідження проводили за загальноприйнятими методиками.

Цифрові величини результатів досліджень виражали у міжнародних одиницях системи СІ. Результати досліджень піддавали статистичному аналізу біометрично з використанням комп’ютерної техніки.

результати досліджень

Досліди на лабораторних тваринах

Вивчення токсичності нітратів і нітритів за умов хронічного досліду. модельні досліди на щурах проведені з метою вивчення токсичної дії нітрату натрію (100 мгNO3?/кг м.т. (далі читати 100 мг/кг м.т.) – 2 група) і нітриту натрію (1 мгNO2?/кг м.т. (далі читати 1 мг/кг м.т.) – 3 група) окремо та при сукупній дії обох препаратів (4 група). Упродовж 30 діб щурам з кормом давали нітрати у вказаних дозах. На 31-у добу їх піддавали евтанзії, відібрали кров для дослідження морфологічних та біохімічних показників (рис. 2).

Рис. 2. Вміст нітратів, нітритів і метгемоглобіну у крові щурів при хронічному нітратно-нітритному токсикозі

Встановлено, що після тривалого згодовування щурам корму, до якого додавали нітрат натрію (100 мг/кг м.т.) на 30- у добу рівень нітратів у сироватці крові підвищився на 34 %. за цих умов рівень нітритів збільшився удвічі, а метгемоглобіну на 16%. Загальна кількість еритроцитів та вміст гемоглобіну крові зменшилися, відповідно, на 7 і 10%. Еритроцити мали меншу величину та знижений вміст гемоглобіну, що, поряд із зменшенням величини кольорового показника, вказує на пригнічення кровотворної функції кісткового мозку.

При наявності в кормі курчат нітриту натрію в дозі 1 мг/кг м.т. на 30-у добу досліду рівень нітратів був на 60%, нітритів у 7 разів, а метгемоглобіну крові у 22 рази вищим за показники контролю. У дослідних щурів при зниженні вмісту гемоглобіну на 11% зменшилась кількість еритроцитів на 24%. Останні мали менший об’єм та знижений вміст гемоглобіну, внаслідок чого зменшувалася величина кольорового показника, що свідчить про розвиток макроцитарної гіпохромної анемії.

Констатуємо, що при додаванні щурам до корму нітрату натрію (100 мг/кг м.т.) сукупно з нітритом натрію (1 мг/кг м.т.) у крові встановлено високий рівень нітратів, нітритів та метгемоглобіну. Підтвердженням пригнічення кровотворної функції кісткового мозку була макроцитарна гіпохромна анемія і лейкопенія. При сукупній дії нітратів і нітритів їх токсичність проявляється різними метаболічними шляхами та призводить до виразніших розладів метаболічних процесів ніж кожного препарату зокрема. Нітрити біологічно менш активні, але значно токсичніші порівняно з нітратами. Проте при сукупній дії настає сумація токсичної дії обох препаратів. Першопричиною цих процесів є активне метгемоглобінутворення, яке спричиняє тканинну гіпоксію, наслідком якої є окиснювальний стрес, що призводить до пригнічення кровотворної функції кісткового мозку та сповільнення окисно-відновних процесів. У наших дослідах встановлено, що при високому рівні нітратів у крові щурів настає лейкопенія, зменшується кількість лімфоцитів, еозинофілів та зростає кількість гранулоцитів, що вказує на наявність в організмі щурів запальних процесів.

Вплив нітратів на дезінтоксикаційну функцію печінки. вплив нітратів і нітритів на дезінтоксикаційну функцію печінки визначали за рівнем загального білка та його фракцій, концентрацією ліпідів, холестеролу, триацилгліцеролів, сечовини, активністю ферментів у сироватці крові та за гексеналовою пробою (рис. ,4,5).

При наявності в кормі нітрату натрію у дозі 100 мг/кг м.т. у сироватці крові щурів на 15% підвищився рівень загальних ліпідів, на 24% тригліцеролів та на 16% сечовини. У щурів вірогідно вищою була активність АсАТ, АлАТ і ЛФ, відповідно на 16%, 15% і 11% порівняно з контролем. У межах нормальних величин був рівень загального і вільного холестеролу та білків. Отже, нітрати у вказаній дозі не зменшували дезінтоксикаційну функцію печінки. Встановлена підвищена активність амінотрансфераз і фосфатаз та рівня ліпідів і триацилгліцеролів на тлі нормального рівня загального білка у сироватці крові вказує на посилення метаболічних процесів у відповідь на дію нітратів.

При задаванні щурам нітриту натрію (1 мг/кг м.т.) у сироватці крові встановлено підвищену, у порівнянні з контролем, активність АлАТ, АсАТ і ЛФ - відповідно, на 42%, 58% і 23% та зростання рівня ліпідів на 39% і загального білка на 8%. Натомість, рівень вільного і загального холестеролу, триацилгліцеролів і сечовини був, відповідно, на 6%, 24%, 24% і 23% (Р < 0,025) нижчим, ніж у тварин контрольної групи.

Рис. 3. Вміст загальних ліпідів і триацилгліцеролів у крові щурів при хронічному нітратно-нітритному токсикозі

Отже, нітрити спричиняють токсичне ураження печінки, що супроводжується вивільненням із гепатоцитів внутрішньоклітинних ферментів та пригніченням метаболічних процесів, на що вказує зниження рівня триацилгліцеролів, холестеролу і сечовини.

Рис. 4. Вміст холестеролу у крові щурів при хронічному нітратно-нітритному токсикозі

При сукупній дії нітратів і нітритів знижується дезінтоксикаційна функція печінки, що виникає внаслідок сумації токсичних ефектів обох препаратів і призводить до ураження печінки, деструкції мембран клітин гепатоцитів та активації перекисного окиснення фосфоліпідів.

Рис. 5. Вміст загального білка і сечовини у крові щурів при хронічному нітратно-нітритному токсикозі

Пригнічення функціонального стану печінки при нітратно-нітритному токсикозі підтверджено методом гексеналової проби. Для цього у щурів викликали експериментальний фармакологічний сон внутрішньочеревним введенням гексеналу (60 мг/кг м.т.) на тлі Н Н токсикозу ( 0,5 і 0,2 г/кг м.т., що відповідає 1/2 і 1/5 ЛД50). Встановлено, що через 1, 3, 5 і 24 год. після додавання до корму нітратів (1/2 ЛД50) час біотрансформації гексеналу в печінці (тривалість сну) був на 46, 52, 65 і 27 хв. тривалішим, ніж у щурів контрольної групи. Нітрати у перші 5 год. різко пригнічували дезінтоксикаційну функцію печінки, яка не відновлювалась упродовж 24 год. У дозі 1/5 ЛД50 нітрати незначно і лише на короткий час продовжували тривалість експериментального гексеналового сну.

Отже, пригнічення дезінтоксика-ційної функції печінки є результатом впливу нітратів на мікросомальні ферменти гепатоцитів, що беруть участь у біотрансформації токсичних сполук.

Вивчення мутагенної дії нітратів і нітритів. Віддалені ефекти побічної дії нітратів визначали після введення нітратів і нітритів щурам у субтоксичних дозах за метафазним аналізом клітин кісткового мозку та кількістю еритроцитів з мікроядрами у периферичній крові. критерієм цитогенетичної дії нітратів був спонтанний рівень хромосомних і хроматичних аберацій у ядрі клітин (рис. 6).

Встановлено, що при хронічному Н Н токсикозі нітрати у дозі 0,8 г/кг м.т. упродовж 30 діб не викликали мутагенної дії. У субтоксичній дозі (1,6 г/кг м.т.) нітрати не спричиняють змін у клітинах кісткового мозку, проте кількість еритроцитів з мікроядрами на 10 і 20-у добу досліду збільшилась на 44 і 76%, а на 30-у добу їх число було вдвічі більшим, ніж в контролі.

При гострому Н Н токсикозі після одноразового введення щурам нітриту натрію (1/2 ЛД50) у клітинах кісткового мозку встановлено порушення мітозу, на що вказує збільшення на 5-7% кількості хромосомних і хроматидних аберацій. Зростання числа еритроцитів з мікроядрами на 24, 48 і 72 годину, відповідно на 54%, 67%, 43%, свідчить про вплив нітритів на генетичний апарат клітин. У дозі (1/5 ЛД50) нітрити не викликали мутагенних змін в еритроцитах. За оцінкою мутагенного аналізу клітин кісткового мозку та кількістю еритроцитів з мікроядрами встановлено, що за генотоксичністю нітрати належать до препаратів слабкої мутагенної дії. Небезпеку становлять нітрити. Вони уражають генний апарат клітин і можуть бути індукторами канцерогенезу. Підтвердженням цього є роботи А.д.Дурнєва і с.в.Середенін (1981), Г.а.Хмельницького і Б.л.Рубенчик (1986), які відзначають канцерогенну дію нітрозамінів – проміжних продуктів відновлення нітратів у нітрити та високу кореляцію мутагенності із канцерогенезом і тератогенезом.

Рис. 6. Хромосомні і хроматидні аберації у кістковому мозку щурів при нітратно-нітритному токсикозі

Мутагенна дія нітратів становить небезпеку в тому плані, що в шлунково-кишковому каналі тварин під впливом ферментів декарбоксилюванння кишкової мікрофлори утворюються ендогенні нітрозосполуки, які з амідами утворюють канцерогенні нітрозаміни. Вони порушують процеси мітозу і спричиняють розлади “розшивання” ДНК на стадії реплікації за типом делецій і змінюється молекулярна структура хромосом. Порівнюючи результати наших досліджень із повідомленнями в літературі, відзначаємо, що характер мутацій, які спричиняють нітрити, такий як і при дії інших генотоксичних чинників, і вони не відрізняються від спонтанних природних мутацій, встановлених у дослідах інших авторів.

Вважаємо, що механізм мутагенної дії нітратів необхідно інтерпретувати з позиції мутагенезу подібних до них окислів азоту. Враховуючи, що мутагенну дію проявляють агресивні форми кисню і продукти окиснення ліпідів, всі сполуки, що сприяють їх утворенню, можна вважати потенційно мутагенними (Дурнєв А.Д., 1981).

Вплив нітратів на імунну систему щурів. Стан імунної системи у лабораторних тварин оцінювали за величинами біохімічних показників крові, що відображають клітинний і гуморальний імунітети, зокрема, за бактерицидною та лізоцимною активністю сироватки крові, лізоцимною активністю лейкоцитів та фагоцитарною активністю. Нами встановлено, що при наявності в кормах білих щурів нітрату натрію в дозі 0,8 г/кг м.т. у сироватці крові на 30-у добу вірогідно знизилась, порівняно з контрольною групою тварин, лізоцимна активність до 36,1±0,6 % (P<0,05) та бактерицидна активність до 70,8±3,0(Р<0,05). Значно нижчим був показник лізоцимної активності лейкоцитів – 7,9±0,5 % (Р<0,001). Натомість збільшилась величина фагоцитарного числа та фагоцитарного індексу нейтрофілів, відповідно, до 50,0±0,7 та 2,7±0,08 (Р<0,001). У межах нормальних величин знаходилась комплементарна активність сироватки крові. При тривалому навантаженні організму щурів нітратом натрію в субтоксичній дозі (1,6 г/кг м.т.) на 30-у добу у сироватці крові встановлено зниження активності комплементу на 26 %, лізоцимної активності на 27 % та бактерицидної активності – на 22 %. Активність лізоциму у лейкоцитах підвищилась на 15 %. Фагоцитарне число нейтрофілів було на 23 %, а їхній фагоцитарний індекс на 40 % більшим, ніж у тварин контрольної групи.

Отже, нітрати у дозі, вдвічі більшій за допустиму добову, при надходженні в організм щурів упродовж 30-и діб знижують захисні властивості організму. В якості компенсаторної реакції організму у відповідь на зниження окремих показників, що характеризують імунний статус (бактерицидна, лізоцимна активність сироватки крові), підвищується лізоцимна активність лейкоцитів, збільшується фагоцитарне число нейтрофілів та їхній фагоцитарний індекс. Вірогідно зростає кількість фагоцитарних макрофагів. Зниження комплементарної активності сироватки крові свідчить про деградацію гепатоцитів, оскільки основні компоненти системи комплементу синтезуються в печінці.

Досліди на курчатах

Результати, отримані у модельних дослідах на щурах, стали підставою для проведення подальших експериментальних досліджень на курчатах. Метою досліджень було вивчити вплив нітратів при хронічному Н Н токсикозі на морфоло-гічні і біохімічні показники крові, функціональний стан печінки, імунну систему та напруженість поствакцинального імунітету, дослідити можливість застосування антиоксидантів для профілактики згаданого вище токсикозу. Курчатам упродовж 30 діб із кормом задавали нітрати відповідно із схемою досліджень (0,4 гNO3?/кг м.т. (далі читати 0,4 г/кг м.т.). – максимально допустимий добовий рівень нітратів у кормах для курей; 0,8 і 1,6 гNO3?/кг (далі читати 0,8 і 1,6 г/кг м.т.) – кількість нітратів що, відповідно, в 2 і 4 рази більша за МДР). На тлі хронічного нітратно-нітритного токсикозу (1,6 г/кг м.т.) вивчали профілактичну дію аскорбінової кислоти (50 мг/кг), метіоніну (80 мг/кг), фенарону (200 мг/кг) та “метіфену” – 280 мг/кг корму. Кров для досліджень відбирали на 1, 10, 20 і 30 доби.

Вплив нітратів на морфологічні і біохімічні показники крові курчат. При додаванні до корму курчат нітрату натрію в дозі 0,4 г/кг м.т. у сироватці крові упродовж досліду встановлено незначне підвищення рівня нітратів (9-10%), нітритів (6-8%) та метгемоглобіну крові – на 7-12%. на тлі нормального рівня білка, вміст альбумінів у сироватці крові був на 10-17% нижчим. Крім того, встановлено вірогідне збільшення кількості еритроцитів (14-25%) та підвищення рівня гемоглобіну крові (на 9-10%). Отримані результати свідчать про посилення метаболічних процесів та подразнення кровотворної системи.

При наявності в кормах нітратів у кількості, що вдвічі перевищує МДР, у крові на 10 добу на 34% підвищилась концентрація нітратів та на 31% – нітритів, рівень метгемоглобіну збільшився на 29%. Встановлено вірогідне зниження на 11% рівня загального білка і на 16% – альбумінів. кількість еритроцитів зменшилася на 9%, а рівень гемоглобіну – на 13%. на 20 і 30-у доби досліду рівень нітратів підвищився, відповідно, на 70% і 74%, а нітритів на 52% і 43%. Високою була концентрація метгемоглобіну та вміст сечовини, відповідно, на 20% і 16%. За показниками середньої величини одного еритроцита та вмісту в ньому гемоглобіну і за величиною кольорового показника встановлено наявність мікроцитарної гіпохромної анемії. Активність каталази на 10, 20 і 30-у доби підвищилася, відповідно, на 26%, 19% і 14%, на 7-19% була вищою активність лактатдегідрогенази, на 6-8% лужної фосфатази, на 7% АлАТ і 28% – АсАТ. Отримані результати свідчать про високу активність метаболічних процесів за участю вказаних ферментів. Рівень сечовини у крові курчат за дослідний період підвищився на 8,5-9,3%, що підтверджує посилення метаболічних процесів, оскільки сечовина є кінцевим продуктом обміну білків. Встановлені зміни морфологічного і біохімічного складу крові та активності ферментів необхідно розцінювати як наслідок захисної реакції та включення адаптативно-компенса-торних процесів в системі гомеостазу у відповідь на токсичну дію нітратів. Вони протікають з участю електролітів, тому на 30-у добу рівень кальцію, фосфору і хлору у сироватці крові був нижчим порівняно з контролем. У травному каналі курчат під впливом нітратредуктази наявні в кормі нітрати відновлюються до нітритів і активно всмоктуються. Рівень нітрат- і нітрит-іонів перебуває у прямій залежності від кількості їх у кишечнику. Встановлено, що найбільш інтенсивно нітрати всмоктуються у перші 10 діб, їх рівень досягає максимуму на 20-у добу і дещо знижується на 30-у добу (рис. 7).

При наявності в кормі курчат нітратів у субтоксичній дозі (1,6 г/кг м.т.) на 10, 20 і 30-у доби досліду рівень нітратів був вищим, відповідно, на 79%, 76%, 70%, а нітритів удвічі. Рівень метгемоглобіну в крові упродовж досліду на 37-59% перевищував показники контрольної групи курчат. У сироватці крові за дослідний період рівень білка знизився на 8%, а вміст альбумінів на 26%. максимальний рівень метгемоглобіну в крові сягав 28%, проте клінічного проявлення Н Н токси-козу не встановлено. Однак, це спричиняло розвиток тканинної гіпоксії та зниження дезінтоксикаційної функції печінки. Кількість еритроцитів та рівень гемоглобіну упродовж досліду поступово знижувались на 13-19%. Середня величина одного еритроцита була більшою, а вміст і концентрація гемоглобіну в еритроциті меншими, порівняно з контролем, що вказує на наявність у крові молодих формених елементів крові. Встановлено розлади іонного гомеостазу з вивільненням у кров іонів натрію, високою утилізацією іонів кальцію і фосфору та виведенням з організму іонів калію і хлору.

Рис. 7. Концентрація нітратів, нітритів і метгемоглобіну в крові курчат залежно від дози нітрату натрію

Поступове зниження рівня сечовини у сироватці крові (на 11-17%) свідчить про зниження активності метаболічних процесів в організмі курчат та пригнічення функціональної здатності печінки синтезувати білки.

На 10, 20 і 30-у доби на 32-42% підвищилась активність каталази, на 34-74% креатинфосфокінази і на 12-13% лужної фосфатази, що вказує на високу активність процесів фосфорилювання. Активність АлАТ упродовж досліду була на 23-38% вищою, ніж у контролі. Активність АсАТ на 20-у добу підвищилася на 10%, а на 30-у добу на 19%, що вказує на деструкцію гепатоцитів і вивільнення з них внутрішньоклітинних ферментів – цитоплазматичної АлАТ та мітохондріальної АсАТ. При метгемоглобінутворенні звільняється значна кількість вільнорадикальних форм кисню, які спричиняють деструкцію цитоплазматичних мембран, і в першу чергу, їхнього фосфоліпідного шару. Деструкцію клітинних мембран гепатоцитів нами підтверджено при електронно-мікроскопічних дослідженнях печінки, а зменшення кількості рибосом на ендоплазматичному ретикулумі свідчить про пригнічення білоксинтезуючої функції печінки. Нітрати у субтоксичній дозі при тривалому надходженні в організм курчат, пригнічують еритропоетичну функцію кісткового мозку, знижують білоксинтезуючу функцію печінки, сповільнюють перебіг процесів фосфорилювання і переамінування та спричиняють деструкцію клітинних мембран гепатоцитів і вивільнення з них внутрішньоклітинних ферментів. Зміни морфологічного і біохімічного складу крові при наявності в кормі нітратів вказують на скритий токсикоз. Його можна діагнозувати за зниженням рівня загального білка і альбумінів та підвищенням активності АлАТ і АсАт у сироватці крові курей.

Отже, у наших дослідах встановлено, що чим більша кількість нітратів у кормі, тим вищий їх рівень у крові курчат. Проте пропорційної залежності між цими показниками не встановлено. Так, за наявності у кормі нітратів (0,4 г/кг м.т.) їх рівень у крові на 10, 20 і 30-у доби досліду, порівняно з контрольною групою курчат, підвищився, відповідно, на 4,4%, 9,8% і 1,5%. При зростанні в кормі кількості нітратів удвічі, їх рівень у крові за вказані періоди збільшився, відповідно, на 33,8%, 69,7% і 74,6%. При збільшенні кількості нітратів у кормі в 4 рази, їх концентрація у крові зростала, відповідно, на 79,4%, 78,8%, 70,1%. У дослідах також встановлено, що рівень нітратів у крові різко збільшувався на 10-у добу досліду, досягав максимального рівня на 20-у добу, відтак стабілізувався і на 30-у добу навіть знизився. Відповідно до зміни рівня нітратів аналогічно змінювалася динаміка рівня нітритів як у кормі, так і у сироватці крові дослідних курчат. А від концентрації нітрит-іонів напряму залежить рівень метгемоглобіну, що і визначає ступінь розладу гомеостазу. За наявності в кормі курчат нітратів у кількості 0,4 г/кг м.т. (МДР), максимальний рівень метгемоглобіну складав 12,3%. За наявності нітратів, що удвічі перевищує МДР – 21,7%. При субтоксичній дозі (1,6 г/кг м.т.) максимальний рівень метгемоглобіну складав 28%. Проте, клінічного прояву токсикозу у курчат не встановлено.

Отримані нами результати досліджень свідчать, що кури менш чутливі до метгемоглобінемії, у них в меншій мірі проявляються розлади гомеостазу, зумовлені тканинною гіпоксією.

Профілактична дія антиоксидантів при нітратно-нітритному токсикозі. У наших дослідженнях встановлено, що у субтоксичній дозі нітрати не виявляють прямої гепатотоксичної дії. проте, опосередковано, через переокиснення фосфоліпідів біологічних мембран агресивними формами кисню, що звільняються при метгемоглобіноутворенні, нітрати пригнічують білоксинтезуючу та знижують дезінтоксикаційну функції печінки. з метою профілактики скритого нітратно-нітритного токсикозу у курчат ми вивчили можливість застосування антиоксидантів. Упродовж 30-и діб курчатам, які отримували з кормом нітрат натрію в дозі 1,6 г/кг м.т., додатково задавали аскорбінову кислоту (0,05 г/кг), метіонін (0,08 г/кг) та фенарон 0,2 г/кг корму. Кров досліджували на 10, 20 і 30-у доби досліду (рис. 8).

Рис. 8. Вплив антиоксидантів на рівень нітратів, нітритів і метгемоглобіну в крові курчат

У крові курчат, яким додавали нітрати і аскорбінову кислоту, на 10, 20 і 30-у доби досліду рівень нітратів підвищився, відповідно, на 19%, 39%, 28% а нітритів – на 17%, 23% та 18%. Концентрація метгемоглобіну упродовж досліду була на 12-15% вищою. Проте ці величини у 10-20 разів менші порівняно з курчатами, яким при нітратному навантаженні до корму не додавали аскорбінову кислоту. У дослідних курчат у сироватці крові не встановлено вірогідного зниження вмісту загального білка, а рівень альбумінів був на 6-7% меншим при зростанні на 6-13% рівня глобулінів. Концентрація сечовини була такою, як у інтактних курчат, що вказує на високий функціональний стан печінки. На 10-у добу встановлено незначне (7%) зменшення кількості еритроцитів та зниження на 5% рівня гемоглобіну крові. На 20 і 30-у добу величини досліджуваних показників були такими, як у курчат контрольної групи. При застосуванні аскорбінової кислоти активність креатинфосфокінази та лактатдегідрогенази упродовж досліду була в межах нормальних величин. Активність каталази на 10-39% а лужної фосфатази на 10-20% була вищою, що вказує на високу активізацію окиснювальних процесів.

Аналогічні зміни морфологічних і біохімічних показників крові встановлені у курчат, яким разом із нітратами задавали метіонін і фенарон. у курчат цих двох груп рівень метгемоглобіну в крові був на 38-43% вищим, порівняно з курчатами, яким із профілактичною метою задавали аскорбінову кислоту. Внаслідок посиленого метгемоглобіноутворення у сироватці крові встановлено підвищення рівня сечовини: у дослідах з метіоніном на 5%, з фенароном – на 7% та