МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

КИЇВСЬКА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ ОСВІТИ

ІМ. П.Л. ШУПИКА

Коржова Алла Станіславівна

УДК 615.07:543.42.062

АНАЛІЗ ЛІКАРСЬКИХ РЕЧОВИН З ПЕРВИННОЮ АЛІФАТИЧНОЮ АМІНОГРУПОЮ ТА СОЛЕЙ СЛАБКИХ ОРГАНІЧНИХ КИСЛОТ ПО РЕАКЦІЇ З 1,3-ДИМЕТИЛАЛОКСАНОМ ТА ПОХІДНИМИ БЕНЗОІЛГІДРАЗОНУ-1,4-БЕНЗОХІНОНОКСИМУ

15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Киів – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі аналітичної хімії Запорізького державного медичного університету Міністерства охорони здоров’я України.

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор

Петренко Володимир Васильович

Запорізький державний медичний університет,

завідувач кафедри аналітичної хімії

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор

Максютіна Ніна Павлівна

Національний медичний університет

ім. О.О.Богомольця,

професор кафедри фармакогнозії та ботаніки

кандидат фармацевтичних наук, доцент

Гринчук Іван Григорович

Головний військовий клінічний ордена Червоної Зірки

госпіталь, заступник начальника з медичного постачання

Провідна установа: Національний фармацевтичний університет

Міністерства охорони здоров’я України, кафедра

фармацевтичної хімії, м. Харків

Захист відбудеться “__25_ ”_березня_ 2005 р. о _13.00_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.04 при Київській медичній академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика за адресою:

04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика ( 04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9).

Автореферат розісланий “_28_” __січня___ 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Пилипчук Л.Б.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У теперішній час спостерігається збільшення асортименту лікарських засобів, зокрема, які використовуються практичною медициною для профілактики та лікування різноманітних захворювань. Для ефективного та безпечного застосування препаратів необхідно підвищувати вимоги до якості лікарських засобів шляхом розробки нових, а також удосконалення та уніфікації існуючих методів фармацевтичного аналізу.

Більшість наукових досліджень у цьому напрямку базуються на використанні вже відомих способів аналізу органічних сполук і пошуку нових шляхів вирішення поставлених завдань.

В арсеналі методів фармацевтичного аналізу заслуговують на увагу фотометричні, серед яких вигідно відзначаються своєю доступністю та простотою виконання спектрофотометричні у видимій області спектра. Загальною проблемою розвитку цього аналізу є пошук доступних, достатньо селективних, високочутливих реагентів, оскільки існуючий асортимент кольорореагентів не завжди може використовуватись у кількісному спектрофотометричному аналізі лікарських засобів. Більшість сполук, що містять первинну аліфатичну аміногрупу, а також солі слабких органічних кислот утворюють забарвлені продукти в реакціях з 1,3-диметилалоксаном, 4-нітробензоілгідразоном-1,4-бензохіноноксимом, 3-нітробензоілгідразоном-1,4-бензохіноноксимом, 4-бромбензоілгідразоном-1,4-бензохіноноксимом. Отже розробка на цій підставі простих у виконанні способів їх кількісного визначення спектрофотометричним методом є актуальною проблемою фармацевтичної науки.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом наукових досліджень Запорізького державного медичного університету Міністерства охорони здоров’я України і є фрагментом комплексної теми “Застосування фізико-хімічних методів для аналізу якості лікарських засобів, похідних фенолу, пурину та ароматичних амінів” (№ державної реєстрації 0101U003299).

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження є розробка високочутливих, простих у виконанні спектрофотометричних методик кількісного визначення лікарських речовин, які вміщують у своїй структурі первинну аліфатичну аміногрупу: кислота глютамінова, аміналон, метіонін, гліцин, кислота амінокапронова, амбен, норадреналіну гідротартрат, ампіциліну тригідрат, амоксициліну тригідрат, пеніциламін, тауфон, а також солей слабких органічних кислот: барбітал-натрій, барбаміл, етамінал-натрій, кофеїн-бензоат натрію, натрію бензоат, сульфацил-натрій, норсульфазол-натрій, етазол-натрій, натрію пара-аміносаліцилат, натрію мефенамінат на основі застосування 1,3-диметилалоксану, 4-нітро, 4-бром та 3-нітропохідних бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму.

Для здійснення поставленої мети вирішувались такі задачі:

- встановити оптимальні умови кількісного утворення продуктів реакції 1,3-диметилалоксану з лікарськими речовинами, які вміщують первинну аліфатичну аміногрупу;

- встановити оптимальні умови кількісного утворення продуктів реакції похідних бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму з солями слабких органічних кислот;

- обчислити аналітичні показники чутливості реакцій;

- вивчити можливості застосування 1,3-диметилалоксану як детектуючого реагенту для лікарських речовин з первинною аліфатичною аміногрупою;

- визначити константи іонізації похідних бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму і встановити взаємозв’язок з аналітичними показниками чутливості реакцій з лікарськими речовинами – солями слабких органічних кислот;

- вивчити хімічний склад і будову сполук, які утворюються в реакціях для подальшого можливого прогнозування способів аналізу лікарських речовин з досліджуваними реагентами.

Об’єкт дослідження. Лікарські речовин, які вміщують у своїй структурі первинну аліфатичну аміногрупу та солі слабких органічних кислот.

Предмет дослідження. Продукти реакцій лікарських речовин з 1,3-диметилалоксаном та похідними бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму.

Методи дослідження. Спектрофотометрія в ультрафіолетовій, видимій та інфрачервоній області спектру, спектрометрія протонного магнітного резонансу (ПМР), хромато-мас-спектрометрія, тонкошарова хроматографія (ТШХ).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показана можливість застосування 1,3-диметилалоксану та похідних бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму для якісного і кількісного визначення досліджуваних лікарських речовин. Встановлені оптимальні умови реакції 1,3-диметилалоксану та похідних бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму з 21 лікарською речовиною.

Обчислені аналітичні показники чутливості реакцій 1,3-диметилалоксану з 11 лікарськими речовинами та похідних бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму з 10 лікарськими речовинами.

Вивчені детектуючі властивості 1,3-диметилалоксану до зазначених вище лікарських речовин із застосуванням метода ТШХ.

У результаті виконаних досліджень запропоновані нові, високочутливі, прості у виконанні методики кількісного визначення для 15 індивідуальних лікарських речовин та 64 прописів лікарських засобів промислового виробництва та виготовлених в умовах аптеки, що має важливе науково-практичне значення.

Способи визначення лікарських засобів захищені 2 деклараційними патентами та 1 авторським свідоцтвом на винаходи.

Практичне значення одержаних результатів. Розширено асортимент аналітичних реагентів для кількісного спектрофотометричного аналізу і розроблені методики якісного та кількісного аналізу 15 лікарських речовин як в індивідуальному вигляді, так і в лікарських формах заводського та екстемпорального виготовлення. За результатами наших досліджень Міністерством охорони здоров’я України для Державних інспекцій з контролю якості лікарських засобів видано інформаційні листи “Кількісне визначення глютамінової кислоти в екстемпоральних лікарських формах” (вип.10, № 150-2003), “Кількісне визначення метіоніну в екстемпоральних лікарських формах” (вип.11, № 151-2003), методики

яких впроваджені в практику роботи лабораторій Державних інспекцій з контролю якості лікарських засобів Запорізької (акт впровадження від 02.12.2003), Житомирської (акт впровадження від 11.11.2003), Миколаївської (акт впровадження від 06.11.2003), Одеської областей (акт впровадження від 03.12.2003).

Результати досліджень знайшли застосування в навчальному процесі при викладанні курсу фармацевтичної хімії на кафедрах фармацевтичних факультетів Запорізького державного медичного університету, Національного фармацевтичного університету (м. Харків), Одеського державного медичного університету, Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем вивчені, проаналізовані та узагальнені дані літератури з питань, що стосуються теми дисертації, визначені мета і задачі дослідження, виконана вся експериментальна частина дисертаційної роботи, проведена графічна та статистична обробка одержаних результатів, написані розділи дисертаційної роботи, сформульовані висновки та запропоновані практичні рекомендації. Персональний внесок здобувача до всіх наукових праць із співавторами вказується за текстом дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень доповідались та обговорювались на міжобласній науково-практичній конференції “Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики” ( м. Запоріжжя, 2003), Міжнародній науковій конференції “Історія та перспективи розвитку фармацевтичної науки і освіти” ( м. Запоріжжя, 2004), науково-практичній конференції молодих учених “Сучасні аспекти медицини і фармації - 2004 ” (м. Запоріжжя 2004).

Публікації. За результатами дисертаційних досліджень опублікована 21 робота, з яких 9 наукових статей ( 6 у фахових виданнях), 7 тез доповідей, отримано 2 деклараційних патенти на винаходи, 1 авторське свідоцтво, видано 2 інформаційних листи.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, уведення в експеримент, чотирьох розділів, загальних висновків, списку використаних джерел літератури і додатків. Дисертація викладена на 172 сторінках друкованого тексту (обсяг основного тексту 111 сторінок), вміщує 37 таблиць, ілюстрована 21 рисунком, 2 схемами та містить 14 додатків (16 стор.). Список використаної літератури включає 210 джерел, з яких 95 - іноземні.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Розділ 1. Методи аналізу лікарських речовин з первинною аліфатичною аміногрупою та солей слабких органічних кислот (огляд літератури). Викладено літературні дані та показано сучасний стан питання по використанню деяких полікарбонільних реагентів, хіноніміну та його похідних в органічному і фармацевтичному аналізі. Крім того, критично розглянуто фотометричні та офіцинальні методи визначення досліджуваних лікарських речовин, які є первинними аліфатичними амінами і солями слабких органічних кислот. Показано, що подальший пошук нових реагентів представляє як теоретичний, так і практичний

інтерес і сприяє розвитку фармацевтичного аналізу.

Розділ 2. Застосування 1,3-диметилалоксану для розробки методик кількісного визначення лікарських речовин з первинною аліфатичною аміногрупою. Попередніми дослідженями нами було встановлено, що 1,3-диметилалоксан взаємодіє з лікарськими речовинами з первинною аліфатичною аміногрупою з утворенням забарвлених в малиновий колір продуктів реакції.

Для встановлення оптимальних умов утворення забарвлених сполук вивчали вплив природи розчинника, температури, концентрації та кількості реагенту, стійкість продукту реакції у часі.

Встановлено, що оптимальними умовами проведення реакції 1,3-диметилалоксану з лікарськими речовинами є використання розчинника диметилформаміду (ДМФА), нагрівання на киплячому водяному огрівнику з подальшим додаванням до отриманого забарвленого розчину солі Cd2+, що зумовлює утворення внутрішньокомплексної сполуки (ВКС) оранжевого кольору.

Чутливість даних реакцій була охарактеризована значеннями молярного показника поглинання (?), питомого поглинання (а), коефіцієнту Сендела (WS), відкривального мінімуму (Сmin). В табл.1 наведено числові значення відповідних показників.

Таблиця 1

Аналітичні показники чутливості реакцій 1,3-диметилалоксан – лікарська речовина

Лікарська речовина | лmax, нм | е | а | WS·10-3 | Сmin , мкг/мл

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6

Кислота глютамінова | 487 | 10760 | 0,0430 | 23,42 | 0,68

Аміналон | 485 | 10340 | 0,1002 | 9,900 | 0,49

Метіонін | 485 | 10560 | 0,0707 | 14,14 | 0,71

Гліцин | 487 | 9270 | 0,1235 | 8,097 | 0,40

Кислота

амінокапронова | 487 | 10090 | 0,0769 | 13,01 | 0,65

Амбен | 485 | 16160 | 0,1069 | 9,353 | 0,47

Норадреналіну г/т | 465 | 11430 | 0,0339 | 29,52 | 1,48

Ампіциліну тригідрат | 485 | 17130 | 0,0425 | 23,55 | 1,18

Амоксициліну тригідрат | 485 | 17800 | 0,0424 | 23,60 | 1,18

Пеніциламін | 485 | 8580 | 0,0575 | 17,39 | 0,86

Тауфон | 485 | 22870 | 0,1828 | 5,471 | 0,27

Аналіз наведених даних свідчить про високу чутливість запропонованих реакцій – відкривальний мінімум складає 0,27-1,48 мкг/мл.

Для лікарських речовин з первинною аліфатичною аміногрупою встановлено взаємозв’язок між чутливістю реакції та процентним вмістом функціональних аналітичних груп. У більшості випадків спостерігається пряма залежність чутливості реакції від відсоткового вмісту аміногрупи в молекулі лікарської речовини.

В ході роботи була вивчена можливість застосування 1,3-диметилалоксану як детектуючого реагенту для 11 лікарських речовин з первинною аліфатичною аміногрупою, що в поєднанні з ТШХ може бути з успіхом використано для встановлення тотожності та напівкількісного аналізу вказаних речовин. Експериментально встановлено умови детектування, при яких межа визначення лікарських речовин складає 0,10 – 1,26 мкг і залежить від складу систем розчинників. Визначенню не заважають інші лікарські речовини та допоміжні речовини складних лікарських форм.

Досліджувані реакції перебігають, на наш погляд, аналогічно мурексидній реакції з попереднім утворенням тетраметилмурексиду, і після додавання розчину солі Cd2+ утворюється ВКС, яка є кінцевою сполукою. Тому ми визнали за доцільне провести вивчення структури початкового продукту реакції з наступним підтвердженням структури кінцевої сполуки.

Спектрофотометричними методами дослідження складу продуктів реакції (неперервних змін, насичення та відносного виходу) визначено, що 1,3-диметилалоксан реагує з лікарськими речовинами у співвідношенні 3/1 – 4/1, що свідчить про складність цієї реакції. Згідно з встановленим співвідношенням компонентів реакції “лікарська речовина - 1,3-диметилалоксан” та оптимальних умов, розроблених для субстанцій лікарських речовин, було проведено препаративний синтез та виділені в індивідуальному стані, що підтверджено хроматографічно, продукти реакції з кислотою глютаміновою, норадреналіну гідротартратом та амоксициліну тригідратом.

З метою з’ясування хімічної будови виділених продуктів нами були вивчені їх спектри поглинання в ультрафіолетовій, видимій та інфрачервоній областях спектру. Як модельна речовина був використаний мурексид. Спектри поглинання виділених речовин та мурексиду мають три смуги поглинання з максимумами 265-270, 325-327 та 527-532 нм (табл.2). Для ідентифікації отриманих продуктів реакції нами додатково була використана ІЧ-, -ПМР та хромато-мас-спектрометрія.

В ІЧ-спектрах всіх продуктів реакції спостерігаються однакові смуги поглинання: смуги 1706-1707 см-1 зумовлені наявністю карбонільних груп, валентні коливання при 3203-3206 см-1 та деформаційні при 1371-1472 см-1 пов’язані з амонійним характером сполук, метильні групи відображені смугами поглинання в області 2854-2989 см-1, спостерігаються характерні смуги С=С (1626-1627 см-1 ), С-О (1015-1115 см-1 ), С-N (1319-1322 см-1 ), С=N (1507-1560 см-1), причому, смуги С=N трохи зміщені в низькочастотну область спектру через вплив сильної поляризуючої дії карбонільних груп.

В ПМР-спектрі зареєстровано мультиплет в області 3,45-3,25 м.ч., віднесений нами до резонансного поглинання протонів метильних груп. Характерні протони амонійної групи спостерігаються у короткохвильовій області спектру у вигляді чітко вираженого сигналу при 7,3-7,0 м.ч.

На мас-хроматограмі відзначено одиничний пік з масою молекулярного іону 324,0 і часом утримання 0,761 хвилини, що є певним доказом наявності у досліджуваному зразку аніону тетраметилмурексиду:

Зіставлення отриманих даних свідчить про утворення однакових сполук, які мають будову тетраметилмурексиду.

Для підтвердження припущення, що кінцевий продукт реакції має будову ВКС нами були вивчені спектри поглинання синтезованих продуктів реакції 1,3-диметилалоксану з досліджуваними лікарськими речовинами та мурексиду як модельної речовини в ДМФА з додаванням розчину солі Cd2+ в ультрафіолетовій та видимій областях.

Дані спектри поглинання характеризуються трьома ідентичними смугами з максимумами 270-275 нм, 310-322 нм, 482-487 нм (табл.2).

Характер спектрів поглинання, а саме, наявність однакових смуг поглинання, вказує на тотожність отриманих сполук за своєю будовою.

Таблиця 2

Максимуми смуг поглинання мурексиду, продуктів реакції 1,3-диметилалоксану з кислотою глютаміновою, норадреналіну гідротартратом, амоксициліну тригідратом та їх сполук з солями Cd2+

Речовина | Максимуми смуг поглинання | 1 | 2 | 3

+Cd2+ | +Cd2+ | +Cd2+

Мурексид | 270 | 275 | 327 | 315 | 527 | 482 | Продукт реакції

1,3-диметилалоксану з:

кислотою глутаміновою |

267 |

275 |

325 |

322 |

530 |

487 | амоксициліну тригідратом | 265 | 270 | 325 | 315 | 532 | 487 | норадреналіну гідротартратом | 265 | 270 | 325 | 310 | 530 | 487 |

Таким чином, виходячи з одержаних нами експериментальних та літературних даних, можна стверджувати, що кінцева сполука має будову ВКС:

Розділ 3. Застосування похідних бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму для розробки методик кількісного аналізу лікарських речовин – солей слабких органічних кислот. Як реагенти застосовували 4-нітробензоілгідразон- 1,4-бензохіноноксим, 3-нітробензоілгідразон-1,4-бензохіноноксим, 4-бромбензоілгідразон-1,4-бензохіноноксим.

Експериментально встановлено, що для реакції лікарських речовин – солей слабких органічних кислот з похідними бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму оптимальним є розчинник ацетон і температура 18-25оС. При цьому утворюються забарвлені продукти реакцій з максимумом поглинання в області 540-570 нм.

В оптимальних умовах були розраховані аналітичні показчики чутливості досліджуваних реакцій (табл. 3).

Таблиця 3

Аналітичні показники чутливості реакцій похідних бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму з лікарськими речовинами

Лікарська речовина | лmax, нм | е | а | WS·10-3 | Сmin , мкг/мл

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6

4-нітробензоілгідразон-1,4-бензохіноноксим

Барбітал-натрій | 560 | 30050 | 0,1465 | 6,860 | 0,34

Барбаміл | 560 | 32480 | 0,1111 | 8,998 | 0,45

Етамінал-натрій | 560 | 33580 | 0,1149 | 8,705 | 0,44

Натрію бензоат | 560 | 13240 | 0,0919 | 10,88 | 0,54

Кофеїн-бензоат натрію | 560 | 24150 | 0,0714 | 14,01 | 0,70

Натрію мефенамінат | 560 | 18030 | 0,0685 | 14,61 | 0,73

Сульфацил-натрій | 560 | 18160 | 0,0714 | 14,00 | 0,70

Норсульфазол-натрій | 560 | 24330 | 0,0631 | 15,84 | 0,79

Етазол-натрій | 560 | 13560 | 0,0443 | 22,58 | 1,13

Натрію

пара-аміносаліцилат | 560 | 5280 | 0,0249 | 40,01 | 2,00

4-бромбензоілгідразон-1,4-бензохіноноксим

Барбітал-натрій | 545 | 23810 | 1155 | 8,660 | 0,43

Барбаміл | 545 | 25930 | 0,1045 | 9,573 | 0,48

Етамінал-натрій | 550 | 26520 | 0,0813 | 12,30 | 0,61

Натрію бензоат | 540 | 7980 | 0,0554 | 18,05 | 0,90

Кофеїн-бензоат натрію | 540 | 14340 | 0,0424 | 23,59 | 1,18

Продовження табл.3

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6

Натрію мефенамінат | 540 | 7730 | 0,0294 | 34,05 | 1,70

Сульфацил-натрій | 540 | 10330 | 0,0406 | 24,60 | 1,23

Норсульфазол-натрій | 540 | 7220 | 0,0187 | 53,40 | 2,67

Етазол-натрій | 540 | 3170 | 0,0103 | 96,79 | 4,84

Натрію

пара-аміносаліцилат | 540 | 1750 | 0,0083 | 120,50 | 6,02

3-нітробензоілгідразон-1,4-бензохіноноксим

Барбітал-натрій | 545 | 37230 | 0,1280 | 7,850 | 0,39

Барбаміл | 550 | 25660 | 0,0878 | 11,39 | 0,57

Етамінал-натрій | 545 | 31020 | 0,1061 | 9,422 | 0,47

Натрію бензоат | 545 | 9840 | 0,0683 | 14,65 | 0,73

Кофеїн-бензоат натрію | 545 | 14100 | 0,0417 | 23,99 | 1,20

Натрію мефенамінат | 550 | 10200 | 0,0388 | 25,80 | 1,29

Сульфацил-натрій | 550 | 9940 | 0,0391 | 25,58 | 1,28

Норсульфазол-натрій | 547 | 6700 | 0,0174 | 57,56 | 2,88

Етазол-натрій | 545 | 3220 | 0,0105 | 95,52 | 4,75

Натрію

пара-аміносаліцилат | 545 | 1620 | 0,0076 | 130,66 | 6,53

Наведені дані свідчать про високу чутливість реакцій, межі відкривання становлять 0,34-6,53 мкг/мл. Більш чутливим реагентом є 4-нітробензоілгідразон-1,4-бензохіноноксим – значення Сmin лікарських речовин становить 0,34-2,0 мкг/мл.

Склад сполук, що утворюються при взаємодії похідних бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму з лікарськими речовинами, встановлювали методами неперервних змін, насичення та відносного виходу на прикладі реакцій барбамілу та кофеїну-бензоату натрію з 3-нітробензоілгідразон-1,4-бензохіноноксимом.

Лікарські речовини взаємодіють з реагентом у співвідношенні 1:1, що узгоджується також з даними хромато-мас-спектрометрії як для реагенту, так і продуктів реакції, які характеризуються наявністю одиничних піків з масою молекулярного іону 287,1, 287,0, 287,0 і часом утримання 0,974, 0,970, 0,971 хвилини відповідно.

Для підтвердження індивідуальності та тотожності отриманих сполук, нами було проведено їх хроматографічне дослідження методом ТШХ. Проведені дослідження показали, що виділені продукти є індивідуальними, а практично однакові значення hRf (Rf ·100) та температури плавлення (т. пл. реагенту 220-221?С, т. пл. продуктів 222-224?С) вказують на тотожність отриманих сполук за складом та хімічною будовою між собою і реагентом.

Виходячи із структури реагенту, необхідно відзначити, що для 3-нітробензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму характерна міграція протону, і реагент може знаходитись у вигляді двох таутомерних форм: гідразоноімідній (А) та гідразоноімідольній (Б), причому кожна з них може існувати у вигляді іонів (схема 1 ) :

(А) (Б)

Схема 1. Таутомерні форми 3-нітробензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму.

ІЧ-спектри у кристалічному стані дозволяють провести ідентифікацію реагенту і продуктів реакції, а також визначити окремі структурні угруповання.

Так, спектр реагенту має дві смуги поглинань в області валентних коливань атомів водню, що приєднані до атомів кисню та азоту. Смуга в області 3426 см-1 належить оксимній групі хіноїдного циклу. Необхідно відзначити, що вона незначно зміщена за рахунок наявності кумулятивних зв’язків, і, крім цього, має деформаційне коливання при 1267 см-1. Друга смуга більш розширена (3300-3010 см-1) і належить асоційованій імідній групі, що підтверджує наявність прототропної таутомерії. Валентні коливання карбонільної групи (гідразиноімідна) розщеплені на дві смуги: смуга А (імід I) – 1656 см-1 і смуга Б (імід II) – 1544 см-1. Крім цього, спектр характеризується валентними коливаннями при 1518 і 1395 см-1, вони належать асиметричним і симетричним поглинанням нітрогрупи, відповідно. В області 1588 см-1 у спектрі реагенту є смуга, яка належить валентним коливанням зв’язку С=С бензохінону і ароматичній системі, яка також характеризується деформаційними коливаннями при 785-614 см-1.

ІЧ-спектр продуктів реакції характеризується коливаннями подібних функціональних груп, але має відмінну рису за рахунок появи валентних коливань кумульованих (сполучених) подвійних зв’язків при 2400-2300 см-1. Крім цього, спостерігається зсув валентних коливань імідної групи: смуги А і Б зміщені на 41 та 23 см-1, і проявляються при 1697 і 1567 см-1, відповідно. Отже, виходячи з досліджених спектрів продукту реакції, можна однозначно стверджувати про утворення відповідного аніона (Б).

ПМР-спектр реагенту характеризується набором сигналів протонів, серед яких можна виділити “ароматичну область”, а також сигналами протонів оксимної та гідразонімідної групи. Так, для реагенту в “ароматичній області” спектру спостерігається набір протонів м-нітрофенільного залишку (8,78 м.ч., с., 1Н, Н2 фен.; 8,44 м.ч., д., 1Н, Н4 фен.; 8,34 м.ч., д., 1Н, Н6 фен.; 7,75 м.ч., т., 1Н, Н5 фен.). Слід зазначити, що в слабкому полі знаходяться уширений синглет, який належить протонам NH-групи гідразинового залишку (12,5 м.ч.) та дуплет (11,7 м.ч.), який належить протону оксимної групи. Значне зміщення протону NH-групи гідразинового залишку можливо обумовлено прототропною таутомерією. Характеристичними сигналами для реагенту є дуплети протонів бензохіноїдної системи, два з них (Н2, Н6) спостерігаються при 7,5 та 7,25 м.ч., два інші (Н3, Н5) при 7,0 та 6,7 м.ч. відповідно. Значне зміщення даних протонів у сильне поле може бути пояснено комуляцією подвійних зв’язків.

У ПМР-спектрі продукту реакції спостерігаються сигнали обмінних протонів (12,3-10,4 м.ч.) NH-групи гідразинового залишку та оксимної групи у вигляді не розрішеного мультиплету, що підтверджує утворення аніону. Відмінною особливістю є незначне сильнопольне зміщення сигналів протонів фенільного залишку (8,85 м.ч., д., 1Н, Н2 фен.; 8,2 м.ч., д., 1Н, Н6 фен.). Крім того, відзначається накладання сигналів протонів бензохіноідної системи, вони реєструються у вигляді мультиплетів при 7,6-7,4 (Н1, Н4) та 7,2-6,8 (Н2, Н3) м.ч. відповідно, що можна пояснити утворенням спряженої системи подвійних зв’язків (Б).

Вивчення спектрів поглинання реагенту та продуктів реакції у видимій та УФ- областях в етанолі, ацетоні, 0,1 М розчинах гідроксиду натрію та хлористоводневої кислоти (табл.4) також підтверджує, що продуктом реакції є гідразоноімідольна таутомерна форма реагенту.

Таблиця 4

Смуги поглинання 3-нітробензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму та продуктів його взаємодії з лікарськими речовинами

Об’єкт дослідження |

Розчинник | Максимуми смуг поглинання, нм | 1 | 2 | 3 |

Реагент | етанол | 260 | 360 | 485 | 0,1 М НCl | 265 | 360 | -

0,1 М NaOH | 265 | 315 | 410 | ацетон | - | 360 | 455 | Продукти реакцій :

реагент – барбаміл | етанол | 255 | 357 | 490

0,1 М НCl | 265 | 360 | -

0,1 М NaOH | 255 | 312 | 410 | ацетон | - | - | 540 | реагент –

кофеїн-бензоат натрію | етанол | 255 | 357 | 480 | 0,1 М НCl | 265 | 360 | - | 0,1 М NaOH | 255 | 312 | 410 | ацетон | - | - | 540

Оскільки взаємодія досліджуваних реагентів з лікарськими речовинами базується на протонодонорських властивостях реагентів, то можна припустити, що чутливість реакцій залежить від рухомості атому водню в молекулі реагенту. У зв’язку з чим нами були обчислені значення показників кислотності (рКа) та вивчена залежність аналітичних показників чутливості реакцій від значення рКа реагентів. Встановлено, що зі зменшенням рКа (зростанням рухомості атому водню) спостерігається підвищення чутливості реакцій.

Розділ 4. Розробка методик кількісного визначення лікарських засобів за їх реакціями з 1,3-диметилалоксаном та 3-, 4- похідними бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму. Отримані результати було покладено в основу розробки методик кількісного визначення досліджуваних лікарських речовин з первинною аліфатичною аміногрупою та солей слабких органічних кислот як в субстанції, так і в лікарських формах.

Попередньо були знайдені межі концентрацій лікарських речовин, в яких спостерігається підпорядкованість світлопоглинання закону Бера та розраховані величини питомих показників поглинання (табл.5).

Таблиця 5

Значення питомих показників поглинання лікарських речовин та межі концентрацій, в яких спостерігається підпорядкованість світлопоглинання закону Бера

Лікарська речовина | лmax, нм | Межі концентрацій, що визначаються, мг/100 мл | __ __

А1%1СМ ( Х+Д? )

1 | 2 | 3 | 4

За реакцією з 1,3-диметилалоксаном

Кислота глютамінова |

487 |

0,60-1,40 |

740 + 3

Аміналон | 485 | 0,80-1,00 | 988 + 15

Метіонін | 485 | 0,80-1,20 | 595 + 8

Гліцин | 487 | 0,40-0,80 | 1290 + 17

Кислота

амінокапронова | 487 | 0,80-1,00 | 730 + 5

Амбен | 485 | 0,64-0,96 | 1060 + 8

Норадреналіну г/т | 465 | 0,80-2,00 | 338 + 1

Ампіциліну тригідрат | 485 | 1,60-2,40 | 413 + 9

Амоксициліну тригідрат | 485 | 1,60-2,40 | 375 + 15

Пеніциламін | 485 | 1,20-1,60 | 510 + 5

Тауфон | 485 | 0,40-0,80 | 850 + 19

За реакцією з 4-нітробензоілгідразоном-1,4-бензохіноноксимом

Кофеїн-бензоат натрію | 560 | 0,50-0,90 | 687+3,2

Барбітал-натрій | 560 | 0,16-0,64 | 1114+14,4

За реакцією з 4-бромбензоілгідразоном-1,4-бензохіноноксимом

Продовження табл.5

1 | 2 | 3 | 4

Барбаміл | 545 | 0,16-0,40 | 1126 + 57,4

Натрію бензоат | 540 | 0,60-1,00 | 465 + 3,6

Кількісне визначення лікарських речовин проводили по оптичній густині стандартних розчинів відповідних субстанцій, які відповідали вимогам АНД.

Сутність розроблених нами методик кількісного визначення полягала в обробці досліджуваної проби кольорореагентом у вибраному розчиннику. Реакцію проводили при температурі киплячого водяного огрівника або при кімнатній температурі. В реакціях з 1,3-диметилалоксаном до отриманого забарвленого розчину додавали розчин солі Cd2+. Оптичну густину отриманих забарвлених розчинів вимірювали на фоні контролю при аналітичних довжинах хвиль за допомогою спектрофотометра в кюветах з товщиною шару 1 см.

В табл.6 наведені результати кількісного визначення лікарських речовин в субстанції.

Таблиця 6

Результати кількісного визначення досліджуваних лікарських речовин в субстанції

(п = 6, Р= 95%)

Лікарська речовина | Метрологічні характеристики

Х |

S |

S r |

__

+ Д?

За реакцією з 1,3-диметилалоксаном

Кислота глютамінова | 100,0 | 0,4940 | 0,0049 | 0,5182

Аміналон | 100,0 | 0,4337 | 0,0043 | 0,4549

Метіонін | 99,90 | 0,5826 | 0,0058 | 0,6111

Гліцин | 100,3 | 0,4037 | 0,0040 | 0,4234

Кислота амінокапронова | 99,75 | 0,4539 | 0,0046 | 0,4761

Амбен | 100,2 | 0,3409 | 0,0034 | 0,3576

Норадреналіну г/т | 99,98 | 0,6259 | 0,0063 | 0,6565

Ампіциліну тригідрат | 100,2 | 0,2825 | 0,0028 | 0,2963

Амоксициліну тригідрат | 99,80 | 0,4506 | 0,0045 | 0,4726

Пеніциламін | 100,0 | 0,5778 | 0,0058 | 0,6061

Тауфон | 99,89 | 0,6511 | 0,0065 | 0,6829

За реакцією з 4-нітробензоілгідразоном-1,4-бензохіноноксимом

Кофеїн-бензоат натрію

(вміст натрію бензоату) | 99,81

59,89 | 0,3859

0,2290 | 0,0039

0,0023 | 0,4048

0,2405

Барбітал-натрій | 100,2 | 0,5900 | 0,0059 | 0,6188

За реакцією з 4-бромбензоілгідразоном-1,4-бензохіноноксимом

Продовження табл.6

1 | 2 | 3 | 4 | 5

Барбаміл | 99,98 | 0,5741 | 0,0057 | 0,6020

Натрію бензоат | 99,96 | 0,3789 | 0,0038 | 0,3974

Для вивчення можливості застосування розроблених методик в аналізі якості лікарських речовин була проведена їх порівняльна оцінка з методиками АНД.

Порівняльний аналіз отриманих результатів свідчить про більш високу точність кількісного визначення запропонованими методиками. Стандартне відхилення в розроблених методиках менше, ніж в методиках АНД. Розраховані значення t-критерію Стьюдента та F-критерію Фішера свідчать про правильність отриманих результатів та добре їх відтворення.

Для розробки спектрофотометричних методик кількісного визначення лікарських речовин у лікарських формах вивчено вплив на реакцію “реагент – лікарська речовина” допоміжних речовин. Встановлено, що кількісному визначенню в розроблених умовах не заважають допоміжні речовини та інші лікарські речовини, у структурі яких нема характеристичних груп.

Розроблені методики були апробовані на 38 прописах заводського та екстемпорального виготовлення по реакції з 1,3-диметилалоксаном і 26 прописах лікарських форм по реакції з 4-нітро- та 4-бромпохідними бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму.

В цілому проведене наукове дослідження дало змогу запропонувати 79 методик кількісного визначення кислоти глютамінової, аміналону, метіоніну, гліцину, кислоти амінокапронової, амбену, норадреналіну гідротартрату, ампіциліну тригідрату, амоксициліну тригідрату, пеніциламіну, тауфону, барбітал-натрію, барбамілу, етамінал-натрію, кофеїн-бензоату натрію, натрію бензоату, сульфацил-натрію, норсульфазол-натрію, етазол-натрію, натрію пара-аміносаліцилату, натрію мефенамінату в індивідуальному стані та в їх складних лікарських формах.

ВИСНОВКИ

1. Вперше науково обґрунтована та експериментально показана можливість застосування в практиці фармацевтичного аналізу 1,3-диметилалоксану та похідних бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму як високочутливих аналітичних кольорореагентів для якісного і кількісного визначення лікарських речовин з первинною аліфатичною аміногрупою та солей слабких органічних кислот.

2. Вивчено умови фотометричних реакцій 1,3-диметилалоксану та похідних бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму з досліджуваними лікарськими речовинами. Встановлено, що оптимальними умовами при використанні реакції з 1,3-диметилалоксаном є: розчинник диметилформамід, температура киплячого водяного огрівника, додавання до забарвленого продукту реакції розчину солі Cd2+.

3. При використанні реакції з похідними бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму оптимальними умовами є: розчинник ацетон, температура 18-25 є?.

4. Обчислені аналітичні показники чутливості реакцій 1,3-диметилалоксану з кислотою глютаміновою, аміналоном, метіоніном, гліцином, кислотою амінокапроновою, амбеном, норадреналіну гідротартратом, ампіциліну тригідратом, амоксициліну тригідратом, пеніциламіном, тауфоном; похідних бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму з барбітал-натрієм, барбамілом, етамінал-натрієм, кофеїн-бензоатом натрію, натрію бензоатом, сульфацил-натрієм, норсульфазол-натрієм, етазол-натрієм, натрію пара-аміносаліцилатом, натрію мефенамінатом. Реакції характеризуються високою чутливістю - межі виявлення становлять 0,27-1,18 мкг/мл і 0,34-6,53 мкг/мл відповідно. Встановлено взаємозв’язок між чутливістю реакції і відсотковим вмістом функціональних аналітичних груп для лікарських речовин з первинною аліфатичною аміногрупою.

5. Визначені коефіцієнти стехіометричних співвідношень “реагент – лікарська речовина”, склад та хімічна будова продуктів реакцій. Показано, що в реакціях лікарських речовин з 1,3-диметилалоксаном взаємодія проходить через одержання внутрішньокомплексних сполук тетраметилмурексиду з солями кадмію, в реакціях з похідними бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму продуктом є забарвлена таутомерна форма самого реагенту.

6. Запропоновано використання 1,3-диметилалоксану як детектуючого реагента для лікарських речовин з первинною аліфатичною аміногрупою. Експериментально встановлені умови детектування, в яких межі відкривання лікарських речовин становлять 0,103-1,257 мкг.

7. Розроблено високочутливі методики кількісного визначення 11 субстанцій лікарських речовин та 38 прописів лікарських форм за реакцією з 1,3-диметилалоксаном, 4 субстанції та 26 прописів лікарських форм за реакцією з 3-нітро- і 4-бромпохідними бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму.

8. Розроблені методики кількісного визначення досліджуваних лікарських речовин в їх лікарських формах за відтворенням результатів аналізу не поступаються методам АНД, відзначаються простотою виконання, правильністю і об’єктивністю.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Коржова А.С. Спосіб кількісного визначення кислоти глютамінової // Фармац. журн. – 2003. - № 3. – С. 71-74.

2. Коржова А.С., Петренко В.В. Розробка методу кількісного визначення метіоніну в субстанції та екстемпоральних лікарських формах // Вісник фармації. – 2003. – Т. 36, № 4. – С.45-47. (Дисертант самостійно виконав експериментальні дослідження, статистично обробив та описав отримані дані, підготував статтю до друку).

3. Васюк С.А., Коржова А.С. Спектрофотометричне визначення амоксициліну в лікарських формах // Медична хімія. – 2003. - Т. 5, № 3. – С. 121-125. (Дисертант особисто брав участь у здійсненні літературного огляду, самостійно виконав експеримент, обробку та інтерпретацію отриманих даних по реакції з 1,3-диметилалоксаном).

4. Коржова А.С., Петренко В.В. Застосування 1,3-диметилалоксану як детектуючого реагенту // Фармац. журн. – 2004. - № 1. – С. 21-24. (Дисертант самостійно здійснив літературний пошук, виконав експеримент, статистично обробив отримані дані, підготував статтю до друку).

5. Коржова А.С., Петренко В.В. Вивчення аналітичних властивостей 1,3-диметилалоксану та використання його для аналізу деяких лікарських речовин // Запорожский медицинский журнал. – 2004. - Т. 2, № 1. – С. 121-125. (Дисертант самостійно здійснив літературний пошук, виконав експериментальні дослідження, статистично обробив та описав отримані дані, підготував статтю до друку).

6. Коржова А.С. Застосування 4-нітробензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму для аналізу якості лікарських форм з кофеїн-бензоатом натрію // Медична хімія. – 2004. - Т. 6, № 2. – С. 93-96.

7. Васюк С.А., Марковская А.С., Стрелец Л.Н. Изучение аналитических свойств замещённых бензоилгидразона-1,4-бензохиноноксима // Пути повышения эффективности фармацевтической науки и практики: Сб. науч. трудов Запор. мед инст. – Запорожье, 1991. – С. 362-364. (Дисертант приймав безпосередню участь у проведенні експериментальних досліджень та обробці отриманих даних).

8. Васюк С.А., Стрелец Л.Н., Марковская А.С. Способ количественного определения барбамила в экстемпоральных лекарственных формах // Пути повышения эффективности фармацевтической науки и практики: Сб. науч. трудов Запор. мед. инст. – Запорожье, 1991. – С. 364-367. (Дисертант приймав безпосередню участь у проведенні експериментальних досліджень, обробці отриманих даних).

9. Коржова А.С. Диметилалоксан – високочутливий реагент для лікарських засобів з первинною аліфатичною аміногрупою // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики: Збірн. наук. статей . – Запоріжжя, 2003. – Вип. Х. – С.60.

10. Коржова А.С. Розробка спектрофотометричних способів кількісного визначення деяких антибіотиків // Вопросы химии и химической технологии. – 2004. - № 2. – С. 12-13.

11. А.с.1617339 СССР, МКИ5 G 01 N 21/78. Способ количественного определения барбамила / С.А. Васюк, В.В. Петренко, С.С. Артёмченко, Л.Н. Стрелец, А.С. Марковская и К.С. Бурмистров (СССР). - № 4665641/30-04; Заяв. 22.03.89; Опубл. 30.12.90, Бюл. № 48. – 2 с. (Дисертант приймав безпосередню участь у проведенні експериментальних досліджень та обробці отриманих даних).

12. Пат. 60779 А. Україна, МКИ7 G 01 N 21/78. Спосіб кількісного визначення аміналону: Пат. 60779 А. Україна, МКИ G 01 N 21/78/ А.С. Коржова, В.В. Петренко. - № 2003021495; Заяв. 20.02.03; Опубл. 15.10.03, Бюл. № 10. – 2 с. (Дисертант самостійно здійснив патентний пошук, розробив методику кількісного визначення аміналону, підготував формулу винахіду, опис до патенту).

13. Пат. 61631 А. Україна, МКИ7 G 01 N 21/78. Спосіб кількісного визначення гліцину: Пат. 61631 А. Україна, МКИ G 01 N 21/78/ А.С. Коржова. - № 2003032410; Заяв. 20.03.03; Опубл. 17.11.03, Бюл. № 11. – 2 с.

14. Коржова А.С. Використання 1,3-диметилалоксану у фотометричному аналізі лікарських засобів // Матеріали VII міжнародного медичного конгресу студентів і молодих учених: Тез. допов. – Тернопіль, 2003.- С.252.

15. Коржова А.С. Використання 1,3-диметилалоксану для спектрофотометричного визначення тауфону // Актуальні проблеми сучасної медицини: Тез. доп. 58 науково-практичної конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету імені О.О.Богомольця з міжнародною участю. – Київ, 2003. – С.15.

16. Васюк С.О., Коржова А.С. Спектрофотометричне кількісне визначення норадреналіну гідротартрату // Матеріали VII міжнародної науково-практичної конференції “Наука і освіта”: Тез. допов. – Дніпропетровськ, 2004. - С.59-60. (Дисертант самостійно виконав експериментальні дослідження, обробку та інтерпретацію отриманих даних по реакції з 1,3-диметилалоксаном).

17. Коржова А.С. Спосіб кількісного визначення кофеін-бензоату натрію у субстанції та заводських лікарських формах // Тези 78-ої підсумкової наукової конференції студентів та молодих вчених з міжнародною участю. – Чернівці, 2004. – Вип. 5. – С. 81.

18. Коржова А.С. Встановлення складу та будови продуктів реакції 1,3-диметилалоксану з лікарськими речовинами // Матеріали до наукової конференції студентів та молодих вчених з міжнародною участю: Тез. допов. – Вінниця, 2004.- С.27.

19. Коржова А.С. Застосування похідних бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму у фармацевтичному аналізі // Матеріали VIIІ міжнародного медичного конгресу студентів і молодих учених: Тез. допов. – Тернопіль, 2004.- С.189.

20. Коржова А.С., Петренко В.В. Кількісне визначення глютамінової кислоти в екстемпоральних лікарських формах // Інформаційний лист. – Київ, 2003. – 3 с. (Дисертант самостійно виконав експериментальні дослідження, статистично обробив та описав отримані дані, підготував матеріал до друку).

21. Коржова А.С., Петренко В.В. Кількісне визначення метіоніну в екстемпоральних лікарських формах // Інформаційний лист. – Київ, 2003. – 3 с. (Дисертант самостійно виконав експериментальні дослідження, статистично обробив та описав отримані дані, підготував матеріал до друку).

Коржова А.С. Аналіз лікарських речовин з первинною аліфатичною аміногрупою та солей слабких органічних кислот по реакції з 1,3-диметилалоксаном та похідними бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія. – Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, Київ, 2004.

Дисертацію присвячено розробці простих у виконанні спектрофотометричних методик кількісного визначення лікарських речовин, що містять первинну аліфатичну аміногрупу, або є солями слабких органічних кислот по реакції з 1,3-диметилалоксаном, 4-нітро-, 4-бром- та 3-нітропохідними бензоілгідразону-1,4-бензохіноноксиму, які до теперішнього часу не використовувались у фармацевтичному аналізі.

В ході роботи було вивчено оптимальні умови та аналітичні характеристики

реакцій вказаних реагентів з лікарськими речовинами, вивчено склад та хімічну будову отриманих сполук, можливість застосування даних реагентів як детекторів при хроматографічному дослідженні речовин, що вивчаються, в субстанції та в лікарських формах.

Ключові слова: спектрофотометрія у видимій області спектру, 1,3-диметилалоксан, 4-нітробензоілгідразон-1,4-бензохіноноксим, 4-бромбензоілгідразон-1,4-бензохіноноксим, 3-нітробензоілгідразон-1,4-бензохіноноксим, лікарські речовини з первинною аліфатичною аміногрупою, солі слабких органічних кислот.

Коржова А.С. Анализ лекарственных веществ с первичной алифатической аминогруппой и солей слабых органических кислот по реакции с 1,3-диметилаллоксаном и производными бензоилгидразона-1,4-бензохиноноксима. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия. - Киевская медицинская академия последипломного образования им. П.Л. Шупика, Киев, 2004.

Диссертация посвящена разработке высокочувствительных,