ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ ТА БІОТЕХНОЛОГІЇ

УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК

Копилов Кирило Вячеславович

удк: 575.113:636.03

ГЕНЕТИЧна КОМПОНЕНТА АГРОеКОСИСТЕМ НА ПРИкладі РіЗниХ ПОРіД великої рогатої худоби

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті агроекології та біотехнології Української академії аграрних наук, м. Київ

Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук, професор

Глазко Валерій Іванович, Інститут агроекології та біотехнології

УААН, м. Київ, завідувач відділенням радіоекології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Дуган Олексій Мартем’янович, Національний технічний

університет України, “Київський політехнічний інститут”

Міністерства освіти і науки України, заступник декана факультету

біотехнології та біотехніки

доктор сільськогосподарських наук, доцент

Писаренко Павло Вікторович, Полтавська державна аграрна академія

Міністерства аграрної політики України, декан агрономічного

факультету

Провідна установа: Харківська державна зооветеринарна академія

Міністерства аграрної політики України, м. Харків

Захист відбудеться “ 5 ” липня 2005 р. о 1300 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.371.01 Інституту агроекології і біотехнології УААН, за адресою: 03142, м. Київ, вул. Метрологічна, 12

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології та біотехнології УААН, за адресою: 03142, м. Київ, вул. Метрологічна, 12.

Автореферат розісланий “ 2 ” червня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради ____________ Л.І. Моклячук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність формування стійких агроекосистем набули особливу важливість у зв'язку з накопиченням інформації по деградації ґрунтів, зменшення біорізноманіття, посилення техногенного навантаження і зниження продуктивності агроекосистем (Патика й ін., 2004). Збільшення їхньої продуктивності визначається, зокрема, особливостями генетичної компоненти агроекосистем, основний внесок в яку вносять генофонди сільськогосподарських видів тварин і рослин. Якщо питання відтворення сільськогосподарських видів і одержання кінцевої продукції є предметом активних досліджень, то сама генетична компонента залишається дотепер недостатньо вивченою (Diamond, 2002; Kealhofer, 2002; Миркин, 2000; Глазко й ін., 2005). Підходи до оцінки внеску генетичної компоненти у тваринництво, розробка методів керування нею, залежать від ступеню вивчення особливостей генофондів доместикованих видів у порівнянні з дикими близько-родинними видами (Andersson, Georges, 2004). Важливість вивчення перетворень генофондів у процесі доместикації (Andersson, Georges, 2004) обумовлена ще і необхідністю пошуку молекулярно-генетичних маркерів підвищеної здатності сільськогосподарських видів до адаптації до нових для них умов навколишнього середовища. У зв'язку з відомими відмінностями за частиною поліморфних локусів, середньої гетерозиготності по низці генетико-біохімічних систем (білків і ферментів, що контролюють ланки загального метаболізму) між видами "космополітами" і "ендеміками" (Nevo E., 1987), можна очікувати, що успішність популяційно-генетичної адаптації сільськогосподарських видів тварин може залежати від поліморфізму деяких з таких систем. Раніше було виявлено, що доместиковані види відрізняються за поліморфізмом низки генетико-біохімічних систем від близько-родинних диких видів (Глазко, 1988; Glazko, 2003). Однак, такі дослідження виконувалися на малій кількості локусів (близько 30-ти), що складають невелику частину генома. З метою оцінки особливостей генофондів доместикованих видів тварин за полілокусними системами у даній роботі виконано порівняльний аналіз розподілу довжин фрагментів ДНК, фланкованих інвертованими повторами тринуклеотидних мікросателітних локусів (Inter-Simple Sequence Repeats - ISSR-PCR маркери), у сільськогосподарських і близько-родинних диких видів копитних, а також розглянуто процеси внутрішньовидової генетичної диференціації за генетико-біохімічними системами у порід і внутрішньо породних груп великої рогатої худоби, що розводяться у різних еколого-географічних умовах.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконувалися відповідно до науково-технічного плану наукових робіт Інституту агроекології та біотехнології УААН: "Теоретично обґрунтувати і розробити практичні заходи щодо екологобезпечного використання природно-ресурсного потенціалу агроландшафтів з метою забезпечення сталого розвитку аграрного виробництва і покращення якості умов життя людини" (№ ДР 0101U003298) і підпрограми 3 "Теоретично обґрунтувати і застосувати на практиці методи сільськогосподарської біотехнології для цілеспрямованого формування сталих агроекосистем " (№ ДР 0101U003296).

Мета і завдання досліджень. Метою досліджень була оцінка популяційно-генетичних особливостей генофондів доместикованих видів тварин (на прикладі великої рогатої худоби), а також можливі фактори, що впливають на їх формування. Отже, в роботі вирішувались наступні завдання:

- оцінити інформативність та залежність спектрів продуктів ампліфікації (ISSR-PCR – маркерів) від нуклеотидної послідовності 12-ти фрагментів тринуклеотидних мікросателітних локусів, які використовували в якості праймера;

- порівняти особливості розподілу довжин фрагментів (ISSR-PCR) у доместикованих і близько-родинних диких видів ссавців, відповідність одержуваних на їх основі оцінок генетичних взаємовідносин відомим філогенетичним зв'язкам між видами;

- виконати порівняння генетичних взаємовідносин між видами, отриманих за використанням ISSR-PCR маркерів та електрофоретичних варіантів білків і ферментів;

- оцінити популяційно-генетичну диференціацію по генетико-біохімічних системах між автохтонними і заводськими породами великої рогатої худоби;

- дослідити внутрішньопородні особливості генетичної структури автохтонних і заводських порід великої рогатої худоби, що відрізняються за походженням та еколого-географічними умовами розведення.

Об'єкт досліджень: специфічні особливості генофондів доместикованих сільськогосподарських видів тварин.

Предмет досліджень: подібності та відмінності поліморфізму різних типів молекулярно-генетичних маркерів у доместикованих і близько-родинних видів ссавців, внутрішньопородна диференціація генетичних структур груп великої рогатої худоби, що відтворюються в різних еколого-географічних умовах.

Методи досліджень. У роботі використовували такі методи: електрофоретичний розподіл білків у горизонтальному крохмальному і вертикальному поліакріламідному гелях; полімеразна ланцюгова реакція з використанням у якості праймерів тринуклеотидних тандемних повторів мікросателітних локусів (ISSR-PCR); методи статистичної обробки експериментальних даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що для сільськогосподарських видів Ungulata характерна перевага фрагментів ДНК малої довжини в спектрах продуктів ампліфікації ділянок геномної ДНК, фланкованої інвертованими тринуклеотидними повторами мікросателітних локусів. Отримано нові дані про спектри маркерів ISSR-PCR у розглянутих видів ссавців в залежності від нуклеотидної послідовності праймера. Вперше обґрунтовано доцільність використання у популяційно-генетичних дослідженнях ссавців в якості праймерів фрагментів тринуклеотидних мікросателітних локусів, що належать до пурин-піримідинових послідовностей. Вперше показано подібність між представниками Ungulata і Delphinidae за цілим рядом молекулярно - генетичних маркерів, що узгоджується з літературними даними про розбіжність Cetacea і Ungulata від загального древнього предка до поділу останніх на парно - і непарнопалих. Отримано нові дані про особливості генетичної структури груп великої рогатої худоби, що відтворюються в різних еколого-географічних регіонах. Виявлено подібність генетичних структур тварин сірої української породи з адаптованими до екстремальних умов розведення, а також з деякими внутрішньопородними групами, що відтворюються в умовах високого рівня техногенного забруднення.

Практичне значення отриманих результатів. Пропонується для одержання найбільш поліморфних і відтворених спектрів продуктів ампліфікації ДНК (ISSR-PCR), у різних видів ссавців, використовувати в якості праймерів тринуклеотидні повтори, які є фрагментами мікросателітних локусів з пурин-піримідиновими послідовностями. Отримані дані по генотипічній мінливості по ряду локусів генофондів великої рогатої худоби, у конкретних регіонах їх розведення, можливо безпосередньо використовувати при комплексному моніторингу екологічної ситуації локальних агроекосистем. Одержані результати досліджень, висновки, пропозиції використані для написання рекомендацій присвячених методології досліджень генетичної структури порід великої рогатої худоби за використанням різних типів молекулярно-генетичних маркерів.

Особистий внесок здобувача. Полягає в підборі первинних матеріалів, проведенні лабораторних досліджень, аналізі та узагальнені отриманих результатів. Частина матеріалів експериментальних досліджень, в яких дисертант приймав безпосередню участь, використані в роботі по погодженню з співавторами спільних публікацій.

Апробація роботи. Результати досліджень доповідались: на “Научной генетической конференции посвященной 100-летию со дня рождения А. Р. Жебрака и 70-летию образования кафедры генетики в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева” (Москва, 2002); “Засади сталого розвитку аграрної галузі” (Київ, 2002); ”Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології в Україні” (Київ, 2002); “Сільськогосподарська мікробіологія: здобутки і проблеми” (Чернігів, 2002); “Conference for young scientists, students and students on molecular biology and genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine“ (Київ, 2003); на засіданнях відділу молекулярно-генетичних досліджень Інституту агроекології та біотехнології УААН.

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані у 12-ти наукових працях, в тому числі 5-ти статтях у фахових виданнях, 6-ти збірниках, матеріалах і тезах конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація викладена на 136 сторінках комп’ютерного набору і включає: вступ, огляд літератури, матеріали і методи, результати досліджень та їх обговорення, заключення, висновки та рекомендації виробництву, список літератури (205 джерел, у тому числі 139 закордонних авторів). Дисертація проілюстрована 21 таблицею і 19 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Цей розділ складається з п’яти підрозділів, у яких представлено експериментальні і теоретичні дані закордонних і вітчизняних авторів з питань, що пов'язані з формуванням генофондів видів, як у процесі доместикації, так і під впливом різних еколого-географічних чинників. На підставі аналізу літературних джерел обґрунтована необхідність і актуальність проведення досліджень по темі дисертації.

Матеріали і методи досліджень. Молекулярно-генетичні дослідження виконувалися на зразках крові 11 видів ссавців, включаючи 8 порід (20 внутрішньопородних груп) великої рогатої худоби, що були відібрані під час експедицій у різні регіони України, а також люб'язно надані Інститутом цитології і генетики СВ РАН, Інститутом радіаційної медицини м. Київ, НДЦ Державний океанаріум м. Севастополь. Загальний обсяг досліджень наведений у (табл.1).

Таблиця 1

Загальний обсяг досліджень

Показник | Кількість

Види ссавців | 11 видів (велика рогата худоба, вівці, коні, свині, осли,

дельфіни, кулани, кінь Пржевальського, зебра

Чапмана, лінія мишей BALB/c, людина)

Породи і внутрішньопородні

групи великої рогатої худоби | 8 порід і 20 групп (голштинська, симентальська, сіра

українська, червона степова, червона польська,

якутська, галловейська, лебединська)

Проаналізовано тварин за різними

біохімічними системами | 1090 голів

Проведено аналізів за різними

біохімічними системами | 16200 аналізів

Проведено аналізів у 11-видів

ссавців по ISSR-PCR маркерах | 2610 аналізів за 12 праймерами

Всього проведено аналізів | 18810 аналізів

Оцінка поліморфізму транспортних білків і ферментів. В якості молекулярно-генетичних маркерів розглядали розподіл аллельних та генотипових частот за локусами, що кодують ряд білків та ферментів крові тварин. Аналіз проводили за поліморфізмом ряду транспортних білків і ферментів: трансферин (TF), посттрансферин (РTF-2), рецептор до вітаміну Д (GC), альбумін (ALB), гемоглобін (HB), церулоплазмін (CP); ферменти внутрішньоклітинного енергетичного метаболізму - фермент гліколізу - лактатдегідрогеназа (LDН) (К.Ф.1.1.1.27); аденілаткіназа (АК) (К.Ф. 2.7.4.3); гексокіназа (НК) (К.Ф. 2.7.1.1); глюкозофосфатізомераза (GPI) (К.Ф. 5.3.1.9); фосфоглюкомутаза (PGM) (К.Ф. 2.7.5.1); 6-фосфоглюконатдегідрогеназа (6-PGD) (К.Ф. 1.1.1.43); глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа (G-6-PD) (ДО.Ф. 1.1.1.49); ізоцитратдегідрогеназа (IDG) (К.Ф. 1.1.1.42); фермент циклу Кребса - малатдегідрогеназа (MDH) (К.Ф.1.1.1.37), малик-ензим (ME) (К.Ф.1.1.1.40); ферменти метаболізму екзогенних субстратів – амілаза-I (АМ-I) (КФ3.2.1.1), лужна фосфатаза (АР) (К.Ф.3.1.3.1); лейцинаминопептидаза (LAP) (К.Ф.3.4.1.1); фермент метаболізму пуринових основ - пуриннуклеозидфосфорилаза (PN) (К.Ф.2.4.2.1).

Аналіз генетико-біохімічних систем проводили методами вертикального електрофорезу в 10-12 % поліакриламідному гелі (PAGE) (Gahne,1977) і горизонтального електрофорезу у 11-13% крохмальному гелі (Глазко, 1988) з деякими модифікаціями.

Аналіз послідовностей ДНК, фланкованих інвертованими повторами мікросателітних локусів (метод ISSR-PCR). Геномну ДНК виділяли з лейкоцитів периферійної крові за методикою (Маниатис і др., 1984, Соколов, Джмелинский, 1989). Оцінка поліморфізму фрагментів ДНК проводилася за допомогою порівняння спектрів продуктів ампліфікації ДНК у полімеразній ланцюговій реакції (PCR), отриманих з використанням у якості праймерів 12-ти фрагментів тринуклеотидних мікросателітних локусів, а саме: (AGC)6T, (TGC)6A, (AGC)6G, (ACC)6G, (GCT)6A, (GAG)6C, (TCG)6G, (CTC)6A, (CAC)7A, (CTC)6C, (GTG)7C, (CAC)7T (Zietkiewicz E. et al., 1994). Продукти ампліфікації (амплікони) розділяли методом електрофорезу в 1,8 % агарозному гелі у трис-боратному буфері з візуалізацією отриманих ампліконів під УФ - променями після фарбування бромистим етидієм. Розмір ампліконів визначали, використовуючи маркер молекулярних мас ДНК плазміди лямбда, рестрикованої HindIII/EcoRI. В аналіз включали амплікони які стабільно відтворювалися не менш ніж у трьох процедурах ампліфікації.

Статистична обробка даних. Результати досліджень обробляли за допомогою методів математичної статистики і біометрії (Животовский Л.А., 1991, Плохинский Н.А., 1969). Виконано підрахунок частот зустрічаємості алельних і генотипових варіантів поліморфних генетико-біохімічних систем. Для характеристики рівня генетичної мінливості обчислювали гетерозиготність для всіх досліджуваних локусів окремо, а також середню гетерозиготність на локус, генетичні дистанції (Nei M., 1972), відхилення генотипових частот від рівноважного стану відповідно до закону Харді-Вайнберга використовуючи комп'ютерні програми “BIOSIS-1”, “Statistica” (Swofford D.L.,1981), проводили кластерний аналіз.

Залежність оцінок генетичної структури видів ссавців від нуклеотидної послідовності праймерів при аналізі поліморфізму ISSR-PCR маркерів. Для того, щоб оцінити поліморфізм і інформативність ISSR-PCR маркерів, в залежності від нуклеотидної послідовності праймерів, виконано порівняльний аналіз спектрів продуктів ампліфікації фрагментів ДНК (ампліконів) за використанням в якості праймерів 12-ти фрагментів тринуклеотидних тандемних повторів у широко представлених сільськогосподарських видів - великої рогатої худоби (червона польська порода) і овець (кулундинська порода). Для порівняння в експеримент були включені інші представники ссавців - людина і миші лабораторної лінії BALB/c, види найбільш таксономічно віддалені один від одного, а також афаліна чорноморська (T.truncatus ponticus), у зв'язку з наявними в літературі даними про те, що представники Cetacea за походженням можуть бути близькі до копитних (О’Leary M.A., 1999; Nikaido M., 2001). В результаті аналізу, сумарно при використанні 12 тринуклеотидних праймерів ідентифіковано 310 ампліконів (75 – у великої рогатої худоби, 56 – у кулундинської вівці, 53 – у дельфіна, 71 – у людини і 55 – у мишей). Аналіз розподілення в спектрах ампліконів різних довжин дав змогу одержати такі дані (табл.2).

Таблиця 2

Частка ампліконів різної довжини в спектрі у 5-ти досліджених видів за 12-ти тринуклеотидними праймерами

Частка ампліконів різної довжини в спектрі

Розмір амліконів в п.н / Вид | Дельфіни | ВРХ | Вівці | Людина | Миші

2500-1800 п.н. | 0,04 | 0,01 | 0,05 | 0,12 | 0,06

1800-1100 п.н. | 0,36 | 0,45 | 0,27 | 0,44 | 0,36

1100- 400 п.н. | 0,60 | 0,54 | 0,68 | 0,44 | 0,58

Отримані дані вказують на перевагу фрагментів малої довжини (1100-400 пар нуклеотидів - п.н.) в спектрах у великої рогатої худоби (0,54) і вівці (0,68); та ж тенденція спостерігалася і у дельфінів (0,60), а у людини (0,44).

Генетичні взаємовідносини між видами, що оцінені на підставі генетичних відстаней (розраховані за присутності/відсутності ампліконів в сумарних спектрах), відповідали відомим таксономічним взаєминам між ними. Виявилося, що оцінки генетчних взаємин між видами істотно залежать від послідовності мікросателіта, що використовувався в якості праймера. Заміна навіть одного ”якірного“ нуклеотиду приводила до одержання спектрів, що істотно відрізнялись (Рис.1).

(-)

(+)

При аналізі спектрів продуктів ампліфікації (ISSR-PCR) у 5-ти видів ссавців найбільша загальна кількість ампліконів у спектрах (101), у тому числі і однакової довжини (15) між великою рогатою худобою і вівцями виявлено при використанні праймерів (CTC)6A, (СТС)6С, (GAG)6C, які є частиною мікросателітних локусів, що входять у пурин-пиримидинові послідовності.

Таким чином, виконаний аналіз свідчить про залежність складності спектра, від нуклеотидної послідовності, обраної в якості праймера в (ISSR-PCR). З розглянутих тринуклеотидних праймерів фрагменти пурин-піримідинових послідовностей дозволяли одержувати найскладніші за кількістю ампліконів і найбільш подібні у різних видів спектри. Можна очікувати, що такий міжвидовий консерватизм виявлених повторів зумовлений їхньою передбачуваною участю в організації просторових структур ДНК (Damha et al., 1998; Noronha et al., 1998; Hashem et al., 1999; Глазков, 2001).

Порівняльний аналіз послідовностей ДНК (ISSR-PCR) у сільськогосподарських і близькородинних диких видів Ungulata. Для оцінки оцінки особливостей генетичної структури сільськогосподарських видів, було виконано порівняльний аналіз поліморфізму ISSR-PCR маркерів, у представників доместикованих і диких видів Artiodactyla і Perissodactyla, з використанням трьох найінформативніших праймерів (CTC)6A, (СТС)6С, (GAG)6C. Отримано такі дані. Спектр ампліконів містив від 3 до 12-ти локусів в залежності від використовуваного праймера. Розміри ампліконів варіювали в межах від 400 п.н. до 2500 п.н. Сумарно по всіх трьох праймерах виявлено 150 ампліконів, що стабільно відтворювалися при триразових повторах (27 – у великої рогатої худоби, 23 – у кулундинської вівці, 17 - у коня, 16 – у дельфіна, 16 – у зебри, по 14 - у кулана і коня Пржевальського, 12 - у осла і 11 – у свині). Загалом, по всіх досліджених видах з використанням праймера (CTC)6A виявлено 51 амплікон, (CTC)6C – 51 амплікон, (GAG)6C - 48 ампліконів (Рис. 2, 3).

(-)

(+)

Амплікони довжиною в 1600 п.н., 1200 п.н., 950 п.н. були наявні в спектрах продуктів ампліфікації всіх трьох праймерів і зустрічались тільки у представників дельфінів і непарнопалих (зебра, кулан, кінь Пржевальського, осел), а амплікон в 1400 п.н. (CTC)6A спостерігався тільки у великої рогатої худоби і дельфінів. Об'єднання отриманих нами спектрів ампліконів у парно - і непарнопалих видів за використанням в якості праймерів фрагментів пурин-піримідинових послідовностей - (CTC)6A, (СТС)6С, (GAG)6C – і виявлених за чотирма варіантами динуклеотидних повторів (Димань, 2002), дало змогу оцінити внески фрагментів ДНК різної довжини в спектри ампліконів у різних видів. В результаті було отримано дані, які свідчать про те, що спектри доместикованих видів істотно відрізнялися від диких за перевагою в них фрагментів малої довжини (табл. 3).

Таблиця 3

Внесок ампліконів різної довжини у диких і доместикованих видів ссавців та дельфінів у сумарні спектри, що отримані при використанні в якості праймерів у (ISSR-PCR) 7-ми фрагментів мікросателітних локусів

Вид | Дикі види | Доместиковані види | Дельфіни

Розмір спектру амліконів в п.н.

2500-1800 п.н. | 0,17 | 0,12 | -

1800-1100 п.н. | 0,44 | 0,38 | 0,47

1100- 400 п.н. | 0,39 | 0,50 | 0,53

За розподілом фрагментів ДНК в спектрах ампліконів (ISSR-PCR) дельфіни виявилися подібними, приблизно однаковою мірою, із представниками як непарнопалих, так і парнопалих. У дельфінів, так само, як і у доместикованих видів, основний внесок у спектри ампліконів вносили фрагменти малої довжини (400-1100 п.н.), на відміну від диких видів (табл.3).

Міжвидові взаємовідносини, що були оцінені за розподілом довжин ампліконів в спектрах, загалом, відповідають таксономічним взаємовідносинам між видами за морфологічними та палеонтологічними даними (Рис. 4). Привертає увагу той факт, що дельфіни виявляються більш подібними з представниками непарнокопитних: коня і осла.

Індекс генетичної подібності (М.Ней, 1978)

.50 .60 .70 .80 .90 .00

--+----+----+----+----+----+

************************** зебра

*

** ****** осел

** ****************

****** ****** дельфін

****** *

* * ********************** кінь

**** *

* * *************************** кулан

******************* *

* * ******************************** свиня

* *

* *********************************** кінь Пржевальського

*

* *************************************** велика рогата худоба

***************

*************************************** вівця

---+----+----+----+----+----+

.50 .60 .70 .80 .90 1.00

Рис. 4. Дендрограма генетичних взаємовідносин між різними видами ссавців, розрахована на підставі розподілу довжин фрагментів ISSR-PCR маркерів в спектрі за 3-ма праймерами.

Таким чином, одержані дані, свідчать про те, що генофонди доместикованих видів Ungulata відрізняються від близькородинних диких частішою наявністю коротких фрагментів ДНК, фланкованих інвертованими повторами мікросателітних локусів. Виявилося також, що за цією ознакою дельфіни більш подібні з доместикованими видами, ніж з дикими.

Порівняльний аналіз генетичної структури за рядом генетико-біохімічних систем представників Ungulata і Delphinidae. З метою перевірки відповідності оцінок, отриманих на підставі аналізу поліморфізму ISSR-PCR був виконаний порівняльний аналіз поліморфізму електрофоретичних варіантів білків і ферментів у представників Ungulata і Delphinidae. По таких генетико-біохімічних системах, як TF, GC, CP, ALB, ME, PTF-2 спостерігалася подібність за електрофоретичною рухливістю і поліморфізму у дельфінів з представниками непарнокопитних (кінь, кінь Пржевальського, кулан і осел), по іншим LDH, GDH - з парнокопитними. За локусом HB у дельфінів спостерігався найповільніший по електрофоретичній рухливості варіант серед усіх досліджених видів, що, можливо, зумовлено їхнім водним середовищем існування. За поліморфізмом таких систем, як TF, GC, PTF-2, дельфіни виявилися подібними з доместикованими видами копитних (велика рогата худоба, коні, свині), ніж з дикими видами, що увійшли до аналізу (Рис. 5, 6).

(+)

Загалом, як за фрагментами ДНК, так і за транспортними білками і ферментами, дельфіни виявляються подібні приблизно однаковою мірою з представниками, як непарнокопитних (Perissodactyla), так і парнокопитних (Artiodactyla), що відповідає припущенню про їх відділення від загального древнього предка до того часу, як останні розділилися на парно - і непарнокопитих. Виявлена подібність за генетичною структурою у представників Delphinida і різних видів копитних, дає можливість зробити висновок про існування деяких загальних тенденцій у формуванні генома у Delphinida і Ungulata.

На підставі значень генетичних відстаней (М. Ней, 1978) по ряду генетико-біохімічних систем була побудована дендрограма генетичних взаємовідносин між видами (Рис.7). Представники різних таксонів формували кластери на дендрограмі, в основному, відповідно до їх філогенетичних взаємовідношень. Варто звернути увагу, що, як за маркерами ISSR-PCR, так і за біохімічними системами, представники Cetacea знаходяться в одному підкластері із представниками непарнокопитних, і в обох випадках спостерігається подібність дельфінів з конем і ослом.

Генетичні відстані (М.Ней, 1978)

.67 .50 .33 .17 .00

--+----+----+----+----+----+-

****************************************** дельфін

*

********************** ******************************* кінь

* ***********

* * ******************************* кіньПржевальського

* *

* *

* ****************************************** осел

*

* ************************************ велика рогата худоба

* *******

* ******* ************************************* вівця

* * *

************** ******************************************** свиня

*

*

* ************************* кулан

**************************

************************* зебра

Рис 7. Дендрограма генетичних взаємин між різними видами ссавців, побудована на основі значень генетичних відстаней за рядом генетико-біохімічних систем.

Загалом, отримані нами дані, підтверджують припущення про наявність специфічних особливостей генофондів доместикованих видів Ungulata, що відрізняють їх від близько- родинних видів, як по розподілу у їхніх геномах ділянок ДНК, фланкованих мікросателітними локусами, так і по поліморфізму структурних генів, що кодують транспортні білки і ферменти. Для того, щоб оцінити можливі механізми формування таких особливостей, далі були розглянуті характеристики генетичних структур порід і внутрішньопородних груп великої рогатої худоби.

Популяційно-генетичний аналіз автохтонних та заводських порід великої рогатої худоби. Оскільки прийнято вважати, що рівні генетичної мінливості в природних популяціях безпосередньо залежать від ефективної чисельності (кількості особин, що вносять вклад у наступне покоління) (Алтухов, 2004), можна було б очікувати, що широко розповсюджені заводські породи повинні бути генетично більш гетерогенні, ніж автохтонні. Серед автохтонних порід найменший рівень генетичної мінливості повинний бути характерним для порід, що відтворюються на краю ареалу, ніж у його центрі. Для того, щоб перевірити ці припущення, у наших дослідження було виконано порівняння генофондів заводських і автохтонних порід, з яких дві, якутська і галловейская, представляють породи краю ареалу стосовно низьких температур і високогір'я, а сіра українська – перехідну форму між предковим видом - туром і всіма європейськими породами великої рогатої худоби (Bos taurus).

Генетичні структури порід порівнювали за 18-ма генетико-біохімічними системами. Розподіл алельних частот у більшості випадків відповідав рівноважному стану (за законом Харді-Вайнберга). Найбільший рівень середньої гетерозиготності за 18-ма генетико - біохімічними системами спостерігався у галловейської (0,146), а найменший - у сименталів (0,125), потім у сірої української породи і у голштинської - 0,128, далі у якутської - 0,130. У червоної степової породи рівень середньої гетерозиготності складав 0,137, червоної польської – 0,133, лебединської – 0,138. Який-небудь зв'язок між приналежністю тварин до заводських чи автохтонних порід, автохтонних порід центру та краю ареалу і рівнем середньої гетерозиготності був відсутній. Тобто, на відміну від природних популяцій, у великої рогатої худоби не виявляється зв'язків рівня генетичної розмаїтості з ефективною чисельністю популяцій. У той же час, судячи з генетичних відстаней між породами, спостерігається зв'язок між подібністю генетичних структур порід з їхньою приналежністю до різних напрямків продуктивності. Так, на дендрограмі (Рис. 8), побудованої на основі генетичних відстаней, розрахованих по генетико-біохімічним системам, породи молочного напрямку продуктивності (гоштинська, червона степова), виявляються зближені між собою і відрізняються від всіх інших порід. Тобто, фактори штучного добору впливають на поліморфізм генетико-біохімічних систем, прямо не контрольованими у селекційному процесі.

Генетичні відстані (М.Ней, 1978)

.13 .10 .07 .03 .00

----+----+----+----+----+----+

******************************* Лебединска

*

* *********************** Симентальська

**** ***

* * ***** *********************** Сіра українска

* * * *

* *** ************************* Якутська

* *

* * ********************** Галловейська

* ********

* ********************** Червона польська

*

* *********************** Червона степова

************

********************** Голштинська

Рис 8. Дендрограмма генетичних взаємин між породами, побудована на підставі значень генетичних відстаней за 18-ма генетико-біохімічними системами.

Отримані дані дають змогу вважати, що у формуванні особливостей генетичних структур порід великої рогатої худоби по розглянутих генетико-біохімічних системах, безпосередньо беруть участь фактори штучного добору. У той же час, необхідно відзначити, що тварини галловейської породи, адаптовані до низьких температур гірських районів, за генетичною структурою виявилися подібні з такими породами, як якутська та сіра українська. Для сірої української і групи галловейської худоби виявили наявність рідкого варіанта TF F, типового для предкової худоби подолянського походження. Генетична близькість галловейської і якутської порід (DN-0,007) дає змогу припускати істотний вплив на формування їхніх генетичних структур екстремальних факторів умов розведення, тобто, факторів природного добору. Для того, щоб оцінити можливий вплив факторів природного добору на формування генетичної структури у великої рогатої худоби, були розглянуті генетичні взаємовідношення між внутрішньопородними групами, що відтворюються в різних еколого-географічних умовах.

Внутрішньопородні особливості генетичної структури автохтонних і заводських порід великої рогатої худоби в зв'язку з еколого-географічними умовами їхнього відтворення. Виявлено, що істотний вплив на генетичну структуру порід мають міжпородні схрещування. При порівнянні груп лебединської породи, двох чистопорідних і однієї, поліпшеної биками швицької породи, виявлена виражена генетична диференціація між ними. Внутрішньопородні генетичні відстані були малими між чистопородними групами (DN-0,004), а між кожною з них і помісною групою помітно більшими (DN-0,018; DN-0,020).

Генетичні відстані між групами чистопородних заводських порід (голштинська, симентальська), розраховані за 18-ма генетико-біохімічними системами, у ряді випадків виявилися більшими, ніж міжпородні відстані. Так, наприклад, між тваринами голштинської породи з господарств “Березова лука” і “Степове" DN-0,039, а між групою з того ж господарства “Березова лука” і групами червоної степової з Донецької, Кіровоградської і Запорізької областей відповідно, DN-0,013; 0,014; 0,023. Між двома групами сименталів з Полтавської і Сумської областей DN-0,014, а між групою сименталів із Сумської області, сірої української з “Черги” і якутської порід DN-0,008 і DN-0,005 відповідно.

На основі індексів генетичної подібності (М.Ней, 1978), була побудована дендрограма, на якій внутрішньопородні групи червоної степової з Донецького, Запорізького та Кіровоградського, найбільш забруднених промислових регіонів, виявилися зближеними між собою і входили в загальний кластер із групою галловейської худоби, адаптованої до низьких температур і гірських умов розведення.

Отримані дані свідчать про те, що фактори природного відбору, пов'язані із збільшенням техногенного забруднення, впливають на генетичну структуру внутрішньопородних груп по дослідженим генетико-біохімічних системах. Генетична структура внутрішньопородних груп у таких умовах зазнає змін, що зближає їх з характерними для предкової худоби і порід, адаптованих до екстремальних умов. Популяційно-генетичний моніторинг внутрішньопородних груп великої рогатої худоби по розглянутих генетико-біохімічних системах у тих самих господарствах у різний час, дає змогу одержувати об'єктивну інформацію про зміни умов їхнього відтворення. Так, для групи тварин голштинської породи у 2003р. у господарстві “Степове” (Полтавської області) спостерігається статистично достовірне збільшення середньої гетерозиготності (0,410) порівняно з тваринами, узятими до аналізу у 2001р. (0,310). Підвищений рівень гетерозиготності виявлений і у сименталів господарства “Щорс” Полтавської області у порівнянні з групами сименталів господарств Київської і Сумської областей, а також найбільший рівень середньої гетерозиготності (0,423) серед усіх проаналізованих груп тварин голштинської порди спостерігався у групі тварин з господарства “Березова лука” Полтавської області. Отримані дані вказують на зміни умов відтворення тварин у цій області.

Загалом, рівні середньої гетерозиготності у досліджених порід не залежали від їхньої ефективної чисельності. На їхню генетичну структуру впливав штучний відбір, зокрема, у зв'язку із селекцією на молочну продуктивність, однак так само, як у природних популяціях, фактори природного відбору (наприклад, техногенне забруднення) приводили до збільшення гетерозиготності по ряду локусів. Своєрідність генофондів сільськогосподарських видів на прикладі великої рогатої худоби, на відміну від природних популяцій, може бути зумовлене постійно мінливим співвідношенням дії факторів штучного і природного відборів. При перевазі дії факторів природного відбору чітко просліджується зрушення характеристик генетичних структур до типового для предкової худоби і порід, адаптованих до екстремальних умов розведення.

Таким чином, на основі результатів виконаної роботи можна зробити такі висновки.

ВИСНОВКИ

1. Виявлено відмінності між генофондами доместикованих і диких видів Ungulata за розподілом фрагментів ДНК, фланкованих тринуклеотидними мікросателітними локусами (ISSR-PCR маркери), а також вплив на внутрішньовидову популяційно-генетичну диференціацію у великої рогатої худоби еколого-географічних умов розведення.

2. Вперше виявлено, що в спектрах продуктів ампліфікації ДНК, фланкованих 12-ма тринуклеотидними мікросателітними локусами (ISSR-PCR маркери), переважають фрагменти малої довжини (400 - 1100 п.н.) у великої рогатої худоби, овець (0,54 і 0,68 часткою спектра, відповідно).

3. Спектр продуктів ампліфікації (ISSR-PCR) залежить від нуклеотидної послідовності використовуваного праймера. Найбільш інформативними у різних видів ссавців по кількості, відтворюваності спектрів, а також наявності фрагментів ДНК однакової довжини, виявилися фрагменти мікросателлітних локусів, що належать до пурин-піримідинових послідовностей (сумарно у різних видів виявлено 150 продуктів ампліфікації).

4. Вперше показаний збіг оцінок генетичних взаємовідношень між видами, розрахованих на підставі поліморфізму двох типів молекулярно-генетичних маркерів (структурні гени і послідовності ДНК, що фланковані мікросателітними локусами), а так само їхня відповідність філогенетичним зв'язкам між дослідженими видами. Так, з їхнім використанням виявлено подібність між представниками дельфінів (T. truncatus ponticus) і представниками Artiodactyla і Perissodactyla, що відповідає палеонтологічним даним про відділення Cetacea від загальних з копитними древніх предків до поділу останніх на два загони.

5. Виходячи з генетичних відстаней (DN - 0,006) між породами молочного напрямку продуктивності (голштинська, червона степова), на генетичну структуру великої рогатої худоби впливає селекція на молочну продуктивність, причому в цей процес утягуються генетико-біохімічні системи, по яких прямо не ведеться селекційний процес.

6. При міжпородних порівняннях у груп сірої української і галловейської порід великої рогатої худоби виявлено рідкісний варіант TF F, типовий для предкової худоби подолянського походження, частота його зустрічаємості у груп сірої української худоби (0,068 - 0,143) і (0,038) - у тварин галловейської породи. Найменші значення генетичних відстаней (DN - 0,003-0,005) виявлені між сірою українською породою і породами, що відтворюються в екстремальних еколого-географічних умовах (якутська, галловейська породи).

7. Внутрішньопородні генетичні відстані у заводських порід (голштинська, симентальська) у ряді випадків виявляються більшими ніж міжпородні (між групою тварин голштинської породи з господарств “Березова лука” і “Степове" (DN-0,039), а між групою з того ж господарства і групами тварин червоної степової породи з Донецької, Кіровоградської і Запорізької областей (DN-0,013; 0,014; 0,023), відповідно). Групи червоної степової породи, що відтворюються в умовах високого і підвищеного рівнів техногенного забруднення за генетичною структурою виявилися близькими до галловейської породи (DN - 0,007).

8. При популяційно-генетичному моніторингу у груп тварин голштинської породи з господарства “Степове” (Полтавська обл.), обстеженого у 2001 і 2003р., виявлене статистично достовірне збільшення рівня середньої гетерозиготності (0,410) - 2003р., у порівнянні з 2001р. - (0,310). Для сименталів з цієї області спостерігається так само переважне відтворення гетерозигот, що вказує на зміни умов відтворення тварин у Полтавській області.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. Пропонується у розглянутих видів ссавців для популяційно-генетичних досліджень, в тому числі популяційно-генетичного моніторингу, використовувати в якості праймерів тринуклеотидні повтори (ISSR-PCR), що належать до пурин-піримідинових послідовностей.

2. Отримані дані про генофонди сільськогосподарських видів тварин, зокрема, великої рогатої худоби, у конкретних регіонах їхнього розведення, можуть безпосередньо використовуватися при комплексному моніторингу екологічної ситуації в локальних агроекосистемах.

3. В умовах техногенного забруднення, з метою зниження економічних втрат при селекції тварин, необхідно контролювати зміни, що відбуваються в генофондах великої рогатої худоби і розводити породи, близькі до автохтонних порід за генетичною структурою.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Копилов К.В., Маріуца А.Е., Тарасюк С.І., Глазко В.І. Вплив еколого-географічних чинників на генетичну структуру різноманітних порід великої рогатої худоби // Екологічний вісник. – 2002. - № 3 - 4 . - С.13-14 (проведення досліджень, аналіз експериментальних даних).

2. Глазко В.І., Тараріко Ю.О., Тарасюк С.І., Копилов К.В., Маріуца А.Е. Генетична компонента стійких агроекосистем // Вісник аграрної науки. – 2002.- № 6. – С. 63-68 (проведення досліджень, аналіз експериментальних даних).

3. Копылов К.В., Нагорнюк Т.А., Андреева Н.А., Кущев В.Ю., Глазко В.И. Сравнительный анализ генетико-биохимических систем дельфинов и представителей надотряда копытных // Агроекологічний журнал. – 2003. – №4.- С. 37-39 (проведення досліджень, аналіз експериментальних даних і написання статті).

4. Копылов К.В., Иванченко Е.В., Глазко В.И. Зависимость спектров продуктов амплификации (ISSR-PCR) от мотивов тринуклеотидных тандемных повторов, используемых в качестве праймеров // Агроекологічний журнал. – 2004. – № 3. - С. 34-43 (проведення досліджень, аналіз експериментальних даних і написання статті).

5. Копылов К.В., Глазко В.И. Молекулярно – генетические маркеры в популяционно-генетическом мониторинге видов космополитов // Зб. наук. праць. Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. - Київ-Луганськ-Харків, 2005. - Вип. 3(66). - С.17-29 (проведення досліджень, аналіз експериментальних даних і написання статті).

6. Глазко В.И., Копылов К.В., Андреева Н.А. Сравнительный анализ молекулярно-генетических маркеров у представителей Ungulata и Delphinidae // Материалы Международной конференции "Морские млекопитающие Голарктики". – Москва, 2004.- С.153-157 (проведення досліджень, написання статті).

7. Копылов К.В., Глазко В.И. Генетическое разнообразие по ряду генетико-биохимических систем заводских и аборигенных пород крупного рогатого скота // Зб. наук. праць. Фактори експериментальної еволюції організмів. - Київ, 2004. - Т. 2. - С.354-360 (проведення досліджень, аналіз експериментальних даних і написання статті).

8. Копылов К.В., Мариуца А.Э., Тарасюк С.И., Глазко В.И. Генетическая дифференциация красной степной породы и голштинов в связи с условиями разведения // Материали Международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.Р.Жебрака.– Москва, 2002.- С.176-178 (проведення досліджень, написання тексту).

9. Копылов К.В., Андреева Н.А., Глазко В.И. Сравнительный анализ общего белкового спектра у видов дельфинов и представителей сельскохозяйственных видов копытных // Засади сталого розвитку аграрної галузі: Матеріли Всеукраїнської конференції.- Київ, 2002.- С.71-72 (проведення досліджень, написання тексту).

10. Тарасюк С.И., Копылов К.В. Мариуца А.Э. Сравнительный анализ популяционно-генетических механизмов адаптации у крупного рогатого скота и овец // Сталий розвиток агроекосистем: Матеріали Міжнародної конференції.- Вінниця, 2002. - С.153-155 178 (проведення досліджень, написання тексту).

11. Kopylov K.V. Comparison of various sites DNA at the interspecific analysis at mammal // “Conference for young scientists, students and students on molecular biology and genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine“. – Киев, 2003. – P. 163 (проведення досліджень, написання тексту).

Методичні рекомендації, в розробці та підготовці яких автор приймав безпосередню участь

12. Глазко В.И., Копылов К.В. Молекулярно-генетические маркеры в популяционно-генетическом мониторинге крупного рогатого скота // Методические рекомендации.- Киев.-2005. - С.19 (безпосередня участь в розробці та підготовці рекомендацій).

АННОТАЦИЯ

Копылов К. В. Генетическая компонента агроэкосистем на примере различных пород крупного рогатого скота. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.15- генетика. - Институт агроэкологии и биотехнологии УААН, Киев, 2005.

Разработка методов управления генетической компонентой агроэкосистем связана с поиском молекулярно-генетических особенностей генофондов сельскохозяйственных видов животных и с оценкой специфики их популяционно-генетической адаптации к меняющимся условиям окружающей среды.

С целью оценки генетических особенностей у сельскохозяйственных видов животных в работе проведен сравнительный анализ распределения длин фрагментов ДНК, с использованием в качестве праймеров 12-ти фрагментов тринуклеотидных простых тандемных повторов (метод ISSR-PCR). Впервые получены данные о преобладании фрагментов ДНК малой длины (1100 - 400п.н.) в спектрах ампликонов у крупного рогатого скота (0.55) и овец (0,65). Наибольшее количество ампликонов, как в общем спектре (101), так и равной длины (15) между крупным рогатым скотом и овцами получено при использовании 3-х фрагментов тринуклеотидных микросателлитных локусов (CTC)6A, (CTC)6C, (GAG)6C., принадлежащих к пурин/пиримидиновым последовательностям. Их использование в качестве