Копач Ольга Володимирівна

удк 612.014.42:612.31:591.431.2

Роль ендоплазматичного ретикулуму

у регуляції внутрішньоклітинної Са2+-сигналізації та функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент

Федірко Наталія Вікторівна,

Львівський національний університет імені Івана Франка

Міністерства освіти і науки України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Рибальченко Володимир Корнійович,

завідувач лабораторії мембранології

Київського національного університету імені

Тараса Шевченка

доктор біологічних наук

Янчій Роман Іванович,

провідний науковий співробітник відділу імунології та

цитотоксичних сироваток

Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України

Провідна установа: Науково-дослідний інститут фармакології та токсикології

АМН України, м. Київ

Захист відбудеться “ 26 ” грудня 2005 року о 1500 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 у Львівському національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Грушевського, 4, біологічний факультет, ауд. № 321.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 17.

Автореферат розісланий “ 13 ” листопада 2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради К 35.051.14,

кандидат біологічних наук, доцент _____________________________ Манько В.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Основною функцією слинних залоз є синтез та секреція слини – секрету, який забезпечує підтримання фізіологічного стану органів ротової порожнини, нормальний перебіг процесу травлення, містить біологічно-активні речовини, а відтак відіграє важливу роль у життєдіяльності організму людини і тварин. Зменшення слиновиділення та патологічні зміни складу слини підвищують ризик патологій слизової оболонки ротової порожнини та органів травлення, захворювань зубів, порушення мовлення та ін. Внутрішньоклітинні механізми, які опосередковують процеси пов’язані із слиновиділенням, залишаються остаточно не з’ясованими, тому дослідження шляхів регуляції функцій слинних залоз має важливе значення для сучасної фізіології та медицини.

Функціонування слин-них залоз перебуває під контролем симпатичної та парасимпатичної іннервації, а секреція білкового та рідинного компонентів слини реалізуються різними сигнальними механізмами: цАМФ-генеруючим та Са2+-мобілізуючим (; . Зокрема, секреція рідкого компоненту слини ацинарними клітинами підщелепної слинної залози знаходиться виключно під холінергічним контролем, який опосередковується шляхом підвищення концентрації іонізованого кальцію у цитоплазмі ([Са2+]i) клітин ; . В екзокринних клітинах основним механізмом підвищення [Са2+]i є його вивільнення із внутрішньоклітинних депо, зокрема, ендоплазматичного ретикулуму (ЕР), та, як наслідок, активації надходження Са2+ ззовні (; ; ; . Таким чином, оскільки первинною ланкою в ініціації [Са2+]i-сигналів, які запускають секрецію, є вивільнення Са2+ з ЕР, актуальною проблемою сучасної фізіології є детальне дослідження механізмів активації та регуляції цього процесу.

Необхідною умовою вивільнення Са2+ з ЕР, що відіграє ключову роль у [Са2+]i-сигналізації, є підтримання високої концентрації Са2+ в ЕР ([Са2+]EР). Відомо, що зменшення [Са2+]EР призводить до розвитку „ЕР-стресу”, що проявляється порушенням [Са2+]i-сигналізації, накопиченням секреторних білків внаслідок припинення їх виведення з ЕР та пригніченням синтезу і процессінгу білків, що може бути причиною загибелі клітини (; . Однак, на сьогодні остаточно не з’ясованими є не лише механізми виникнення „ЕР-стресу”, але і особливості перебігу Са2+-сигналізації в ЕР ацинарних клітин підщелепної слинної залози за фізіологічних умов. Для виявлення ролі ЕР у [Са2+]i-сигналізації важливим є проведення комплексного дослідження механізмів її перебігу в ЕР на пермеабілізованих клітинах та вкладу депонованого Са2+ у [Са2+]i-сигналізацію в інтактних клітинах підщелепної слинної залози.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у рамках науково-дослідної держбюджетної теми БЛ-114Ф “Механізми Са2+- і NO-залежної регуляції функціонування секреторних клітин”, № держреєстрації 0103 U 001872 та за сприяння Західно-Українського центру біомедичних досліджень.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у вивченні функціонування Са2+-транспортних систем внутрішньоклітинних депо Са2+ в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози та з’ясуванню особливостей їх регуляції.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1. Провести аналіз кальцій-залежних змін функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози при активації холінорецепторів in vivo та in vitro.

2. Розробити методичний підхід для реєстрації [Са2+]EР в ацинарних клітинах та довести його адекватність для дослідження механізмів Са2+-сигналізації в ЕР.

3. Вивчити властивості, шляхи регулювання та провести кінетичний аналіз вивільнення Са2+ з інозитолтрифосфат-чутливого депо ЕР ацинарних клітин.

4. Виявити наявність функціонально-активних ріанодинових рецепторів в ацинарних клітинах, вивчити їх властивості, шляхи регулювання та вклад у [Са2+]і-сигналізацію.

5. Кількісно оцінити пасивний витік Са2+ з ЕР та депо-керований вхід Са2+ в ацинарні клітини та дослідити їх механізми.

6. Вивчити роль мітохондрій у регуляції [Са2+]і-сигналізації в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози.

Об’єкт досліджень – [Са2+]і-сигналізація в екзокринних секреторних клітинах.

Предмет досліджень – функціонування та регуляція Са2+-транспортних систем внутрішньоклітинних депо Са2+ ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів.

Методи досліджень – для досягнення поставленої мети використовували біофізичні, біохімічні, статистичні методи досліджень, а також метод електронної мікроскопії.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне дослідження механізмів функціонування Са2+-каналів мембрани ЕР ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів та їх взаємодії з іншими Са2+-транспортними системами. Розроблено експериментальні моделі для проведення прямої реєстрації концентрації Са2+ всередині внутрішньоклітинних органел пермеабілізованих ацинарних клітин і доведено адекватність їх використання для дослідження механізмів функціонування Са2+-транспортних систем. Вперше проведено реєстрацію зміни [Са2+]ЕР в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози при активації InsP3-чутливих рецепторів та досліджено механізми модуляції їх активності. Зареєстровано зменшення [Са2+]ЕР в ацинарних клітинах при активації ріанодин-чутливих рецепторів та вперше доведено їх вклад у [Ca2+]i-сигналізацію у досліджуваних клітинах. Виявлено наявність процесу швидкого захоплення Са2+, який вивільняється при активації ріанодинових рецепторів, за участю мітохондрій (МХ). На основі змін [Ca2+]i та [Са2+]ЕР, а також даних електронної мікроскопії постулюється важлива фізіологічна роль колокалізації МХ, Са2+-АТФаз та ріанодинових рецепторів у визначенні просторово-часових параметрів [Ca2+]i-сигналізації. Встановлено, що в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози транслоконовий комплекс є основним шляхом пасивного витоку Са2+ з ЕР. Кількісно оцінено депо-керований вхід Са2+ в ацинарні клітини підщелепної слинної залози і вперше виявлено роль МХ у його регуляції. Показано локалізацію МХ безпосередньо під плазматичною мембраною (ПМ) у базальному полюсі ацинарних клітин, що визначає їх важливу роль у підтриманні депо-керованого входу Са2+.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати розширюють уявлення щодо механізмів функціонування Са2+-транспортних систем внутрішньоклітинних органел ацинарних клітин слинних залоз. Вони можуть бути теоретичною основою для подальших досліджень механізмів Са2+-сигналізації у секреторних клітинах, причин і розвитку патологій травних залоз та розробки методів їх фармакологічної корекції, тому мають значення для медицини і ветеринарії. Отримані дані використовуються при викладанні загальних курсів „Фізіологія людини і тварин”, „Біофізика” та спецкурсів „Фізіологія травлення”, „Клітинні механізми регуляції обміну речовин” у Львівському національному університеті імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача полягає у виконанні всього обсягу експериментальних досліджень, поданих у дисертаційній роботі, статистичному опрацюванні результатів, підборі та обробці даних літератури, а також, за участю наукового керівника, у плануванні напрямків досліджень, розробці методик пермеабілізації ПМ ацинарних клітин, вимірювання концентрацій іонізованого кальцію у цитоплазмі та ЕР, аналізі одержаних результатів, формулюванні висновків.

У роботі використано обладнання, надане старшим науковим співробітником Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України д.б.н. Войтенко Н.В. Електронно-мікроскопічні дослідження проведено спільно із співробітником Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України к.б.н. Півневою Т.А.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень та основні положення, включені до дисертації, були представлені на: VII міжнародному медичному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль, 2003 р.), I з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004 р.), науково-практичній конференції “Сечєнов та Одеська школа фізіологів” (Одеса, 2004 р.), Міжнародній школі-семінарі IBRO “Receptors, Channels, Messengers” (Ялта, 2004 р.), І Українській науковій конференції “Прoблеми бiологiчної і медичної фізики” (Xapків, 2004 р.), Міжнародній конференції “Клітинні та субклітинні механізми функціонування травної системи” (Львів, 2004 р.), регіональному біофізичному з’їзді (Zrece, Словенія, 2005 р.), XXXV Міжнародному Конгресі фізіологічних наук (Сан-Дієго, США, 2005 р.), III Конференції товариства нейронаук (Донецьк, 2005 р.), XV Міжнародному біофізичному конгресі (Монтпельєр, Франція, 2005 р.), семінарах кафедри фізіології людини і тварин (2002-2005 рр.), щорічних звітних конференціях біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка (2002-2005 рр.) та на міжкафедральному семінарі біологічного факультету у липні 2005 р.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 5 статей у фахових наукових журналах та 10 тез доповідей у матеріалах міжнародних та українських наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 200 сторінках і включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновки та список використаної літератури з 313 джерел. Робота ілюстрована 81 рисунком і 7 таблицями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Визначення показників слиновиділення підщелепною слинною залозою щурів. Експерименти проводили на щурах-самцях лінії Вістар віком 1,5 міс. Відбір слини проводили за модифікованою методикою, запропонованою для привушної слинної залози щурів (Kawaguchi еt al., 2000). Перед початком експерименту тварину наркотизували ін’єкцією кетаміну та лістенону. Слину, яка виводилась протоками підщелепної слинної залози, відбирали канюлею, якy впритул підводили до проток підщелепної слинної залози. Виділення слини оцінювали за швидкістю слиновиділення, б-амілолітичною активністю слини, вмісту у ній загального білка та концентрації Са2+.

Ізолювання ацинарних клітин підщелепної слинної залози. Перед початком гострого експерименту тварину наркотизували ефіром і проводили швидку декапітацію. Ацинарні клітини підщелепної слинної залози ізолювали шляхом піпетування тканини залози після її ферментативної обробки у базовому зовнішньоклітинному розчині, який містив колагеназу (тип І, 270 од/мг), протягом 25-30 хв (35 оС). Базовий зовнішньоклітинний розчин містив (у ммоль/л): NaCl – 140; KCl – 4,7; CaCl2 – 1,3; MgCl2 – 1,0; гідроксиетилпіперазин-N-2-етансульфонову кислоту (HEPES) – 10; глюкоза – 10 ммоль/л; рН 7,4.

Визначення сумарного вмісту Са2+ у клітинах та секреції ними білка. Сумарний вміст Са2+ в ацинарних клітинах визначали фотоколориметрично з використанням металохромного барвника арсеназо ІІІ. Принцип методу полягає у тому, що Са2+ утворює з арсеназо III комплекс синього кольору, інтенсивність забарвлення якого еквівалентна концентрації Са2+ у пробі. Вміст кальцію виражали в наномолях у перерахунку на 1 мкг білка, який визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951). Секрецію загального білка ацинарними клітинами виражали у процентах від сумарного вмісту білка у гомогенаті та супернатанті.

Вимірювання [Са2+]i в ацинарних клітинах. [Са2+]i в ацинарних клітинах реєстрували з використанням мембранно-проникної форми флуоресцентного Са2+-барвника фура-2/АМ. Для завантаження барвника суспензію клітин інкубували у базовому розчині, який містив 5 мкмоль/л фура-2/АМ, протягом 30-40 хв при 35?С, після чого відмивали базовим розчином і додатково інкубували протягом 30 хв для повної деетерифікації барвника. Для точного визначення [Ca2+]i використовували формулу Грінкевича (Grynkiewicz et al., 1985): [Ca2+]i = Kd · B · (R – Rmin) / (Rmax – R).

Значення констант, одержані шляхом калібрування, становили: Rmin=0,9, Rmax=19, В=26. Параметр Kd становив 224 нмоль/л (Grynkiewicz et al., 1985).

Хімічна пермеабілізація ацинарних клітин. Ацинарні клітини пермеабілізували дигітоніном та -есцином. Робочу концентрацію детергентів та час інкубування клітин з ними підбирали експериментально. Детергенти вносили до розчину, складом наближеного до внутрішньоклітинного середовища (НДВ), який містив (у ммоль/л): KCl – 120; NaCl – 20; MgSO4 – 2; HEPES – 10; АТР – 3; EGTA – 1; CaCl2 – 0,75; рН 7,2. Концентрація іонізованого Са2+, розрахована за допомогою програми “WinMAXC v2.10”, у такому НДВ-розчині становила ~250 нмоль/л. Тривалість інкубування клітин з дигітоніном (20 мкг/мл) становила 2-5 хв у всіх експериментах, за виключенням окремо згадуваних, з -есцином (40 мкг/мл) – 3-6 хв. Пермеабілізацію клітин контролювали візуально з використанням трипанового синього (0,4 %) під світловим мікроскопом, а у випадку маг-фура 2/АМ-зафарбованих клітин оцінювали за падінням флуоресцентного сигналу Са2+-барвника.

Визначення [Ca2+]ЕР у секреторних клітинах. Для моніторингу концентрації Са2+ в ЕР, ацинарні клітини заванта-жували мембранно-проникною формою низько-афінного флуоресцентного Са2+-барвника маг-фура 2/АМ. Фарбування клітин проводили протягом 45-60 хв при 37С, що забезпечує компартменталізацію барвника у внутрішньоклітинних органелах (Hofer & Machen, 1993). Зміни [Ca2+]ЕР виражали не як абсолютне значення, а як співвідношення інтенсивності флуоресцентного сигналу маг-фура 2/АМ на довжині хвилі збудження 360 нм до такої на 390 нм (F360/F390) і оцінювали як прямо пропорційні до змін співвідношення F360/F390 (Hofer & Machen, 1994).

Метод електронної мікроскопії. Ізольовані ацинарні клітини фіксували протягом 12 год при 20С у суміші розчинів глютаральдегіду (2 %) та параформальдегіду (2 %), приготовлених на 0,1 моль/л фосфатному буфері (рН 7,2-7,4). Дофіксацію проводили в 1 % розчині OsO4 у фосфатному буфері протягом 1 год при кімнатній температурі. Зразки зневоднювали у зростаючих концентраціях спиртів та заливали в епоксидну смолу (аралдит) при поступовій заміні ацетону епоксидною смолою. Ультратонкі зрізи отримували за допомогою ультрамікротому ІІІ (LKB, Швеція) і контрастували у розчині нітрату свинцю та уранілацетату. Дослідження проводили на електронному мікроскопі JEM 100 (JEOL, Японія) при 80 кВ із збільшенням 5000 – 40000.

Оригінальні записи [Ca2+]і та [Ca2+]ЕР опрацьовували за допомогою програм Tida 5.0 (Німеччина). Статистичну обробку результатів здійснювали з використанням Microsoft Excel, аналіз змін співвідношення F360/F390 проводили за допомогою Microcal Origin. Достовірність змін встановлювали за t-критерієм Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Кальцій-залежні зміни функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів при активації холінорецепторів

Для з’ясування кальцієвої залежності функціональних відповідей секреторних клітин слинних залоз ми досліджували ефекти активації холінорецепторів in vivo та in vitro. Встановлено (табл.1) виражене зростання швидкості слиновиділення та білково-ферментного вмісту слини після внутрішньочеревного введення тваринам М-холіноміметиків – карбахолу (2 мкг/кг) та пілокарпіну (2 мг/кг). Агоніст Н-холінорецепторів цитизин (2 мг/кг) спричиняв підвищення лише амілолітичної активності слини на 88 ± 9 % (n=10; р<0,01), тоді як швидкість слиновиділення зменшувалась на 51 ± 8 % (n=12; р<0,001). Блокування холінорецепторів атропіном (2 мкг/кг) супроводжувалось зменшенням швидкості слиновиділення на 74 ± 6 % (n=17; р<0,001) та амілолітичної активності слини – на 73 ± 9 % (n=13; р<0,001), а при попередньому його введенні атропін повністю елімінував стимулюючий ефект агоністів.

Одержані результати підтверджують важливу функціональну роль М-холінорецепторів у стимуляції секреції рідинного компоненту слини підщелепною слинною залозою, а також вперше показують фізіологічну роль Н-холінорецепторів, при активації яких відбувається пригнічення секреції рідкої слини, а виділяється невелика кількість слини з високим вмістом ферментів.

Виведення Са2+ є важливим компонентом стимульованої секреції екзокринними клітинами і може бути зумовлено як активацією секреції електролітів, так і виведенням Са2+ разом із вмістом секреторних гранул (Liu et al., 1998). Підтвердженням цього є підвищення концентрації Са2+ у секретованій слині на 245 ± 21 % (n=8, p<0,001) при стимуляції пілокарпіном, яке не спостерігалось після попередньої атропінізації тварин. В той же час активація М-холінорецепторів in vitro супроводжувалась підвищенням сумарного вмісту кальцію в ацинарних клітинах, яке також повністю елімінувалось атропіном. Зокрема, при дії АХ (5 мкмоль/л) вміст кальцію у клітинах підвищувався на 80 ± 8 % (n=7; р<0,01), карбахолу (5 мкмоль/л) – на 60 ± 7 % (n=7; р<0,01), пілокарпіну (5 мкмоль/л) – на 22 ± 3 % (n=6; р<0,01). Отже, зміни слиновиділення in vivo та вмісту кальцію у клітинах in vitro свідчать про те, що холінергічна стимуляція слиновиділення підщелепною слинною залозою опосередковується змінами Са2+-гомеостазу в ацинарних клітинах.

2. Пермеабілізовані клітини як модель для вивчення Са2+-транспортних систем внутрішньоклітинних органел

Оскільки секреція екзокринними клітинами ініціюється підвищенням [Са2+]і, опосередкованим, в основному, вивільненням Са2+ з ЕР, то для дослідження функціонування Са2+-транспортних систем внутрішньоклітинних органел ми пермеабілізували ПМ клітини з використанням неіонних детергентів дигітоніну та -есцину. Виявилось, що ефекти дигітоніну на вміст сумарного кальцію у пермеабілізованих клітинах та білка у середовищі їх інкубування (як інтегрального показника секреції) виражено залежали від концентрації детергенту та часу його дії.

Дигітонін викликав двохфазне підвищення вмісту загального білка: у концентрації 20 мкг/мл – на 10 1,3 % (n=7; p<0,05) та у концентрації 100 мкг/мл і вище – на 17 2 % (n=7; p<0,01). Динаміка змін сумарного вмісту кальцію у клітинах та секреції ними білка мала дзвоноподібний вигляд з максимумом при концентрації дигітоніну 20-50 мкг/мл протягом перших 5 хв його дії. Вже через 2,5 хв дії 20 мкг/мл дигітоніну вміст білка зростав на 21 ± 0,2 % (n=6, p<0,001), сумарний кальцій -– на 48 ± 16 % (n=6; р<0,05). Таке підвищення обумовлено дигітонін-індукованим порушенням ПМ та вивільненням вмісту секреторних гранул, а також накопиченням кальцію в ЕР за рахунок роботи Са2+-АТФази у АТФ-вмісному НДВ-розчині. Низхідна гілка кривої, отримана при більш тривалій інкубації клітин з дигітоніном (5-15 хв) чи високими його концентраціями (50-200 мкг/мл), обумовлена порушенням цілісності мембран внутрішньоклітинних органел та втратою ними білків і Са2+.

Підтвердженням ефективної пермеабілізації ПМ дигітоніном (20 мкг/мл) є вимивання флуоресцентних Са2+-барвників із цитоплазми та зниження інтенсивності флуоресцентного сигналу у пермеабілізованих клітинах. У випадку фура 2/АМ сигнал падав практично до фонового рівня, у випадку маг-фура 2/АМ – зменшувався в середньому на 60-80 % від початкового, решта (40-20 %) відображає світіння барвника всередині депо Са2+ (рис.1). Подальша перфузія клітин НДВ-розчином, який містив 3 ммоль/л АТФ, супроводжувалась зростанням співвідношення F360/F390 (рис.1), що відповідає підвищенню [Ca2+]ЕР, тоді як за відсутності АТФ, як і при дії тапсигаргіну, спостерігалось зменшення [Ca2+]ЕР. Таким чином, тапсигаргін-інгібована АТФ-залежна акумуляція Са2+ у депо ЕР свідчить про функціональну цілісність ЕР після обробки клітин дигітоніном.

Для вивчення процесів [Ca2+]і-сигналізації при активації рецепторів ПМ ми розробили модель пермеабілізації клітини за допомогою b-есцину. Так, пермеабілізовані b-есцином клітини, як і оброблені дигітоніном, здійснюють АТФ-залежне накопичення Са2+ в ЕР, а підтвердженням того, що b-есцин не порушує цілісності рецептор-зв’язаних сигнальних шляхів, є зареєстрований [Ca2+]ЕР-транзиєнт при дії АХ (рис.2). Отже, пермеабілізовані клітини є адекватною моделлю як дослідження механізмів підтримання гомеостазу Са2+ у внутрішньоклітинних депо (дигітонінова модель), так і ролі ЕР у [Ca2+]і-сигналізації (b-есцинова модель).

3. Функціонування тапсигаргін-чутливого та -нечутливого депо Са2+ в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози

Для виявлення гетерогенності внутрішньоклітинних депо Са2+ в ацинарних клітинах ми підібрали умови максимального спустошення ЕР тапсигаргіном та АХ. При дослідженні динаміки тапсигаргін-індукованих змін сумарного вмісту кальцію в інтактних клітинах виявлено підвищення вмісту кальцію у кальцієвмісному середовищі та зменшення – у безкальцієвому. Максимальним ефект тапсигаргіну (0,1 мкмоль/л) був після 20-ти хвилин його дії як в інтактних, так і у пермеабілізованих ацинарних клітинах. При цьому кількість кальцію, який вивільняється при блокуванні Са2+-АТФази ЕР, складало ~ 30 % від загального його вмісту у депо. АХ (5 мкмоль/л), як і тапсигаргін, викликав подібні зміни сумарного вмісту кальцію в інтактних та пермеабілізованих клітинах, однак ефект АХ максимальним був після 10 хв його дії.

Для з’ясування того, чи мішенню дії тапсигаргіну і АХ є одне і те ж депо Са2+, клітини попередньо преінкубували 20 хв з тапсигаргіном, після чого інкубували 10 хв з АХ. Виявилось, що після спустошення депо тапсигаргіном АХ (5 мкмоль/л) викликав додаткове підвищення сумарного вмісту кальцію ще на 38 3 % (р<0,01; n=8) в інтактних клітинах (рис.3А) і зменшення ще на 38 7 % (р<0,01; n=9) – у пермеабілізованих (рис.3Б), яке повністю елімінувалось гепарином – блокатором ІnsР3-чутливого вивільнення Са2+.

У зафарбованих фура 2/AM клітинах тапсигаргін викликав підвищення [Ca2+]і, максимальне на 20 хв дії, яке у кальцієвмісному середовищі було платоподібним з амплітудою 112 ± 11 нмоль (n=8, рис.4), а у безкальцієвому – транзиєнтного характеру (амплітуда 51 ± 14 нмоль/л (n=6). При аплікаціях АХ на фоні тапсигаргіну зареєстровано градуальне зменшення амплітуди [Ca2+]і-транзиєнтів у кальцієвмісному (рис. 4) та безкальцієвому розчинах. Додаткове підвищення Са2+ (сумарного та іонізованого), свідчить про те, що тапсигаргін не повністю спустошує ІnsР3-чутливе депо Са2+.

Прямим доказом наявності тапсигаргін-нечутливого депо Са2+ є зменшення [Ca2+]ЕР при дії окремо АХ, ванадату (блокатору Са2+-АТФаз широкого спектру дії) чи іономіцину (іонофору, який призводить до вивільнення Са2+ у рецептор- та енергонезалежний спосіб) після попереднього спустошення ЕР тапсигаргіном. Зокрема, тапсигаргін (3 мкмоль/л) викликав зменшення [Ca2+]ЕР на 0,045 ± 0,006 (n=12), а наступна аплікація 100 мкмоль/л ванадату на фоні тапсигаргіну супроводжувалась подальшим зменшенням F360/F390 ще на 0,042 ± 0,008 (n=6). Характерно, що ефекту АХ не спостерігалось після спустошення депо тапсигаргіном та ванадатом, тоді як на фоні лише тапсигаргіну АХ (5 мкмоль/л), як і іономіцин (10 мкмоль/л), викликав виражене зменшення [Ca2+]ЕР.

Отже, в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози функціонує тапсигаргін-чутливе та тапсигаргін-нечутливе депо Са2+, обоє з яких є ІnsР3-залежними.

4. Властивості та регуляція інозитолтрифосфат-чутливих рецепторів ацинарних клітин підщелепної слинної залози

У незбудливих клітинах вивільнення Ca2+ через InsP3-рецептор відіграє основну роль у визначенні просторово-часових параметрів Ca2+-сигналізації (Ambudkar, 2000; Berridge, 2002). Для з’ясування механізмів ІnsР3-чутливого вивільнення Са2+ ми провели реєстрацію зміни [Са2+]ЕР при активації холінорецепторів ПМ АХ та безпосередньо InsP3-рецепторів екзогенним InsP3.

Амплітуда АХ-індукованого [Ca2+]ЕР-транзиєнту становила 0,1 ± 0,02, розрахований час напівспаду – 28 ± 2 с (n=23, р<0,001, рис.2). Викликана InsP3 [Ca2+]ЕР-відповідь прямо залежала від концентрації агоніста з ефективною концентрацією InsP3 (ЕС50) – 1,3 мкмоль/л. Зменшення [Ca2+]ЕР при дії АХ та InsP3 ефективно блокувалось гепарином, отже, опосередковане активацією тільки InsP3-рецепторів. Для дослідження залежності ІnsР3-індукованого зменшення [Ca2+]ЕР від цитозольного кальцію [Ca2+]і у НДВ-розчині фіксували на рівні 30, 100, 400 і 2000 нмоль/л. Викликане ІnsР3 (1, 3, 5 мкмоль/л) зменшення [Ca2+]ЕР потенціювалося Ca2+ при фізіологічних його концентраціях (100-400 нмоль/л), а подальше підвищення [Са2+]і інгібувало вивільнення Ca2+ (табл. 2).

Для багатьох об’єктів показано, що активність ІnsР3-рецептора, подібно до [Са2+]і, модулюється АТФ (Ferris & Snyder, 1992; Bezprozvanny & Ehrlich, 1993). З’ясувалось, що в ацинарних клітинах ефект АТФ на ІnsР3-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР залежить від концентрації АТФ: є позитивно кооперативним при низьких концентраціях та негативно кооперативним – при високих. Зокрема, за наявності у НДВ-розчині 0,5, 1 та 2 ммоль/л АТФ амплітуда ІnsР3-індукованого [Са2+]ЕР-транзиєнту зростала на 14 ± 1 %, 27 ± 5 % та 28 ± 6 % (n=6), порівняно з таким при 3 ммоль/л АТФ. У присутності 10 і 20 ммоль/л АТФ спостерігалось, навпаки, зменшення [Са2+]ЕР-відповіді на 5 ± 0,3 % (p<0,05) та 15 ± 3 % (n=6, p<0,01).

Виявлено також здатність кофеїну (4 ммоль/л) пригнічувати InsP3-індуковане вивільнення Са2+ на 11 ± 3 % (n=9, p<0,05), що, однак, не спостерігалось при дії InsP3 у субмаксимальній концентрації (20 мкмоль/л). Пригнічуючого ефекту кофеїну не спостерігалось і в присутності АТФ (1 ммоль/л), навпаки – потенціювання InsP3-індукованого зменшення [Ca2+]ЕР на 65 ± 12 % (р<0,01; n=8), порівняно до такого без АТФ.

Отже, активація ІnsP3-рецепторів індукує дозозалежне вивільнення Ca2+ з ЕР, яке є максимальним при значенні [Са2+]і у фізіологічних межах, пригнічується кофеїном та модулюється АТФ.

5. [Cа2+]і-сигналізація при активації ріанодинових рецепторів секреторних клітин підщелепної слинної залози

Молекулярно-біологічними дослідженнями виявлено (Giannini et al., 1995) наявність у тканині підщелепної слинної залози мРНК, відповідальної за експресію ріанодинових рецепторів та доведено (Lee et al., 1997) їх наявність в ацинарних клітинах цієї залози. З іншого боку, при активації ріанодинових рецепторів не виявлено змін [Cа2+]і (Seo et al., 1997), тому питання їх функціональної активності в ацинарних клітинах слинних залоз залишається відкритим.

Підтвердження функціонування ріанодинових рецепторів в ацинарних клітинах. З’ясувалось, що у пермеабілізованих ацинарних клітинах кофеїн викликає дозозалежне зменшення в них сумарного вмісту кальцію на 20 5 %, 31 7 % та 42 7,5 % (p<0,05; n=10) при дії відповідно 0,2, 0,5 та 1 ммоль/л кофеїну та 77 5 %, 81 10 %, 86 11,5 %, 89 3 % (p<0,01; n=3) при підвищенні концентрації кофеїну до 10, 20, 30 та 40 ммоль/л. Шляхом реєстрації зміни [Ca2+]ЕР нами показано кофеїн-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР (ЕС50 по кофеїну становить 7,3 ммоль/л), яке було нечутливим до гепарину, а, отже, не опосередковується активацією ІnsP3-рецепторів. Кофеїн-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР блокувалося високими концентраціями ріанодину (100 мкмоль/л, рис.5А) та потенціювалось ріанодином у середніх концентраціях (10 мкмоль/л, рис.5Б), що є класичними ознаками ріанодинового рецептора. Отже, в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози наявні функціонально-активні ріанодин-чутливі рецептори.

Зміни [Cа2+]і при активації ріанодинових рецепторів. При аплікації кофеїну (10-40 ммоль/л) до інтактних ацинарних клітин нами, як і іншими авторами (Seo et al., 1997), не виявлено достовірних змін [Ca2+]i, причому, відсутність [Ca2+]і-відповіді не пов’язана із спустошенням депо Ca2+, оскільки наступна аплікація АХ супроводжувалась генерацією [Ca2+]і-транзиєнту значної амплітуди. Змін [Ca2+]i не спостерігалось також при аплікації кофеїну на фоні блокування Са2+-АТФаз ПМ чи Са2+-АТФаз ЕР, лише при заблокованих МХ кофеїн (30 ммоль/л) викликав незначне підвищення [Ca2+]i на 48 4 нмоль/л (n=8, p<0,001). Оскільки таке підвищення [Ca2+]i не відповідало кофеїн-індукованому [Ca2+]ЕР-транзиєнту, ми припустили можливість швидкого виведення Са2+ із цитоплазми системами активного його транспорту. Дійсно, генерація [Ca2+]i-транзиєнту при дії кофеїну спостерігалась лише при одночасному попарному блокуванні МХ разом з Са2+-АТФазою ПМ чи МХ і Са2+-АТФазою ЕР. Амплітуда кофеїн-індукованого [Ca2+]i-транзиєнту на фоні ванадату (10 мкмоль/л) та СССР (10 мкмоль/л) становила 176 68 нмоль/л (n=6, p<0,001), тапсигаргіну (3 мкмоль/л) та СССР – 137 40 нмоль/л (n=6, p<0,001).

Отже, ріанодинові рецептори, очевидно, просторово колокалізовані з МХ та Са2+-АТФазами. При цьому Са2+, який вивільняється при активації ріанодинових рецепторів, практично повністю захоплюється МХ, оскільки прикладання 10 мкмоль/л СССР одразу після кофеїну супроводжувалось різким викидом Са2+ з МХ і зростанням [Ca2+]i на 184 39 нмоль/л (n=5, p<0,001, рис. 6).

Електронно-мікроскопічний аналіз розташування мітохондрій в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. Дослідження ультраструктури клітин підщелепної слинної залози щурів виявило локалізацію МХ у безпосередній близькості до ЕР, більше того, оточення МХ ламелами ЕР (рис.7В). У 36 досліджуваних клітинах щільність МХ, розташованих біля ЕР, була вищою, ніж в інших регіонах клітини, а форма МХ, оточених ламелами, – більш витягнутою, порівняно з іншими МХ, що може бути обумовлено збільшенням площі контакту між мембранами органел. Таким чином, близьке розташування МХ біля ЕР підтверджує припущення про їх колокалізацію із структурами ЕР та свідчить про можливість контактів між Ca2+-транспортними системами ЕР і МХ.

В ацинарних клітинах підщелепної слинної залози спостерігалося також характерне угрупування МХ у базальному полюсі клітини (рис.7Б). З огляду на те, що МХ переважно локалізуються в областях підвищення [Ca2+]i, ми припускаємо, що група МХ в області між ПМ та ЕР, очевидно, відіграє роль регуляторів входу Ca2+ через депо-керовані Са2+-канали ПМ.

6. Базальний витік Са2+ з ЕР ацинарних клітин підщелепної слинної залози

У стані спокою [Ca2+]ЕР підтримується шляхом активного захоплення кальцію Са2+-АТФазою ЕР на фоні його стаціонарного пасивного витоку (Hofer et al.,1999). Витік Са2+ є характерною особливістю ЕР, однак у клітинах слинних залоз залишається невивченим. Для візуалізації та дослідження механізмів пасивного витоку Са2+ ми провели: i) перфузію ацинарних клітин безкальцієвим НДВ-розчином (1 ммоль/л EГTA) для пригнічення прямого (але не реверсивного) режиму роботи Са2+-АТФази ЕР; ii) блокування обох режимів роботи Са2+-АТФази ЕР тапсигаргіном.

Сумарний вміст кальцію у пермеабілізованих клітинах зменшувався після тривалого (20 хв) інкубування їх у безкальцієвому НДВ-розчині на 30 4 %, з тапсигаргіном ([Ca2+]і=100нмоль/л) – на 29 4 %, з тапсигаргіном у безкальцієвому НДВ-розчині – на 36 6,5 % (p<0,01; n=8). За цих умов зареєстровано також зменшення [Ca2+]ЕР. Аналіз амплітуди зменшення F360/F390, характеристичного часу (), розрахованого шляхом апроксимації зміни F360/F390 за допомогою експоненти, та лінійної швидкості показав наявність SERCA-залежного та -незалежного компонентів пасивного витоку Са2+ (табл.3). Причому, переважаючим є витік Са2+ не опосередкований роботою Са2+-АТФази ЕР, тоді як SERCA-залежне виведення Са2+ шляхом реверсивного режиму роботи становить близько ~ 35 %.

Відповідно, можна припустити, що витік Са2+ з ЕР здійснюється через Са2+-канали InsP3- і ріанодинового рецепторів, однак, зменшення [Ca2+]ЕР було нечутливим до гепарину (300 мкг/мл) та рутенієвого червоного (10 мкмоль/л), але дозозалежно потенціювалося пуроміцином – інгібітором синтезу білка. Антибіотик пуроміцин від’єднує новоутворені поліпептиди від транслоконного комплексу мембрани ЕР, в результаті чого транслоконова пора стає проникною для Са2+ (Simon & Blobel, 1991). Викликане пуроміцином (500 мкмоль/л) зменшення [Ca2+]ЕР було нечутливим до гепарину, рутенієвого червоного та тапсигаргіну, а характеристичний час достовірно не відрізнявся від викликаного тапсигаргіном ( = 244 ± 52 с), що свідчить про те, що SERCA-незалежний витік Са2+ здійснюється через транслокон. Крім того, ефект пуроміцину не спостерігався на фоні 200 мкмоль/л анізоміцину, який селективно блокує такий механізм витоку Ca2+ (рис.8).

Отже, в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози базальний витік Са2+ з ЕР не опосередковується Са2+-каналами чи порушенням роботи Са2+-АТФази, а здійснюється через пору транслоконного комплексу.

7. Дослідження депо-керованого входу Са2+ у секреторні клітини підщелепної слинної залози

Єдиним відомим механізмом входу Са2+ у незбудливі клітини є активація депо-керованих Са2+-каналів ПМ (Putney, 1986; Ambudkar, 2000; Shuttleworth, 2004), механізми активації та інактивації якого залишаються остаточно нез’ясованими. Ми вивчали, чи існує залежність між способом спустошення депо ЕР і тривалістю дії агоністів та активацією входу Са2+ ззовні. Для активації входу Са2+ індукували різні шляхи спустошення ЕР кальцієм: і) блокування Са2+-АТФази ЕР, іі) активація ІnsР3- чи ріанодинових рецепторів. Згідно проколу експерименту інтактні ацинарні клітини інкубували у безкальцієвому зовнішньоклітинному середовищі з відповідним агоністом, після чого перфузували клітини кальцієвмісним розчином.

Блокування Са2+-АТФази ЕР тапсигаргіном призводило до активації потужного входу Са2+ у клітини з амплітудою 186 ± 50 нмоль/л (p<0,01; n=10, табл.4, рис.10), тоді як інкубування клітин у безкальцієвому середовищі без тапсигаргіну (незалежно від тривалості), не призводило до змін [Ca2+]і. Свідченням того, що зареєстрований [Ca2+]і-транзиєнт опосередкований активацією депо-керованих Са2+-каналів ПМ, є його пригнічення на 69 12 % (n=3) 2-аміноетоксидифеніл боратом (50 мкмоль/л) – специфічним блокатором SOC-каналів ПМ (Bootman et al., 2002).

Вхід Са2+, індукований InsP3-чутливим спустошенням ЕР, залежав від тривалості дії/кількості аплікацій АХ – найбільшої амплітуди був при тривалому (5 хв) спустошенні депо АХ та сумісній дії АХ і тапсигаргіну. Спустошення ріанодин-чутливого депо Са2+ також активувало вхід Са2+, хоча й значно меншої амплітуди. При цьому кінетика розвитку депо-керованих [Ca2+]i-транзиєнтів, яка вважається показником кількості відкритих SOC-каналів, достовірно не відрізнялась між собою, незалежно від способу спустошення ЕР (агоністами чи блокаторами), що свідчить про єдиний механізм активації входу Са2+ ззовні (табл.4).

Отже, спустошення ЕР активує вхід Са2+ ззовні, незалежно від способу спустошення (InsP3-залежного чи -незалежного), а рівень входу Са2+ прямо визначається ступенем спустошення депо.

8. Роль мітохондрій у регуляції депо-керованого входу Ca2+

Функціонування [Ca2+]i-транспортних систем мітохондрій у стані спокою. Для з’ясування ролі Са2+-уніпортеру МХ у підтриманні базального рівня [Ca2+]i використовували роз’єднувач протонного градієнту на мембрані МХ карбоніл ціанід м-хлорфенілгідразон (СCCP). СССР (10 мкмоль/л) викликав підвищення [Ca2+]i на 50 6,7 нмоль/л (n=8) у кальцієвмісному розчині і на 37 4 нмоль/л (n=5) – у безкальцієвому (рис.9). Для підтвердження того, що така зміна [Ca2+]і обумовлена блокуванням Ca2+-уніпортеру МХ, а не пригніченням роботи Ca2+-АТФаз у результаті припинення МХ синтезу АТФ, використали ротенон (інгібітор комплексу І ланцюга транспорту електронів) та олігоміцин (інгібітор АТФ-синтази), що запобігає активації реверсивного режиму роботи АТФ-синтази (Nicholls & Budd, 2000). Оскільки ефект 10 мкмоль/л ротенону та 1 мкмоль/л олігоміцину не відрізнявся від викликаного СССР, отже, підвищення [Ca2+]i опосередковане блокуванням Са2+-уніпортеру та вивільненням Са2+ з МХ.

Основним шляхом транспорту Са2+ з МХ є його виведення Na+/Ca2+-обмінником (Badcock & Hille, 1998). Виявилось, що блокування Na+/Ca2+-обмінника МХ селективним блокатором – CGP 37157 (20 мкмоль/л) не супроводжувалось змінами [Ca2+]i (n=5). Змін [Ca2+]i не виявлено також при одночасному прикладанні СССР і СGP 37157, що є свідченням того, що у спокої клітин є неактивною мітохондріальна пора проникного переміщення (permeability transition pore), яку вважають додатковим механізмом виведення Ca2+ з матриксу МХ (Zoratti & Szabo, 1995).

Модуляція мітохондріями депо-керованого входу Са2+. За умови блокування акумуляції Са2+ мітохондріями виявлено пригнічення депо-керованого входу Са2+ щонайменше вдвічі та сповільнення його кінетики, як у випадку тапсигаргін-індукованого, так і агоніст-опосередкованого спустошення ЕР (табл.4). Зокрема, на фоні СССР амплітуда депо-керованого підвищення [Ca2+]i при спустошенні ЕР тапсигаргіном зменшувалась на 51 ± 15 % (p<0,01; n=5, рис. 10), АХ – на 73 ± 12 %.

При дослідженні ролі транс-мітохондріального транспорту Са2+ у регуляції його входу ззовні виявлено подібне зменшення рівня депо-керованого входу Ca2+ на фоні CGP 37157. При цьому зменшувалась лише амплітуда [Ca2+]i-транзиєнту (на 53 ± 11 % (p<0,01)), тоді як час напівзростання достовірно не змінювався (табл.4, рис.11). Очевидно, пригнічення входу Са2+ при дії CGP 37157 не опосередковане зменшенням кількості відкритих SOC-каналів ПМ, а обумовлено припиненням виведення Са2+ з МХ, що супроводжується відповідно пригніченням акумуляції Ca2+ МХ і як наслідок – підвищенням [Ca2+]i, яке, в свою чергу, призводить до Са2+-залежної інактивації SOC-каналів ПМ.

Отже, МХ належить важлива фізіологічна роль у підтриманні депо-керованого входу Са2+ в ацинарні клітини підщелепної слинної залози.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Аналіз результатів дослідження параметрів слиновиділення при активації холінорецепторів in vivo та вмісту кальцію in vitro дозволяє зробити висновок про те, що секреторна активність ацинарних клітин підщелепної слинної залози опосередкована змінами внутрішньоклітинного гомеостазу кальцію, що цілком узгоджується із даними літератури . Про кальцієву залежність секреції слини свідчить як зростання концентрації Са2+ у слині при холінергічній стимуляції тварин in vivo, так і підвищення сумарного вмісту кальцію у клітинах при інкубуванні їх in vitro з агоністами М-холінорецепторів. Виявлене нами виведення Са2+ разом із вмістом секреторних гранул є важливим компонентом стимульованої секреції і, очевидно, служить для більш швидкого відновлення [Са2+]і після завершення дії стимулу, що показано й іншими авторами (; Martinez et al., 1996).

Основним механізмом підвищення [Ca2+]і для запуску секреції ацинарними клітинами є вивільнення Са2+ з ЕР, механізми якого остаточно нез’ясовані. Для дослідження перебігу та регуляції вивільнення Са2+ з ЕР ми розробили методичний підхід для прямої реєстрації зміни [Ca2+]ЕР. Падіння флуоресцентного сигналу маг-фура 2/АМ при пермеабілізації клітин детергентами (дигітоніном та ?-есцином) свідчить про опроникнення ПМ, тоді як підвищення [Са2+]ЕР при наступній перфузії клітин АТФ-вмісним НДВ-розчином підтверджує інтактність мембрани ЕР. Більше того, зареєстрований [Ca2+]ЕР-транзиєнт при аплікації АХ до в-есцин-пермеабілізованих клітин свідчить про цілісність рецептор-зв’язаних сигнальних механізмів при пермеабілізації, що показано і на пермеабілізованих панкреацитах (Lomax et al., 2000).

У секреторних клітинах основним депо Са2+ є ЕР ; ), проте, здатністю депонувати та вивільняти Ca2+ характеризуються також секреторні гранули, МХ (, ядро (Gerasimenko et al., 1995) і апарат Гольджі (Pinton et al., 1998). Виявлене нами функціонування в ацинарних клітинах тапсигаргін-нечутливого іономіцин-чутливого немітохондріального депо Са2+ є фізіологічно доцільним, оскільки Са2+, локалізований в інших субклітинних компонентах секреторного шляху, зокрема, апараті Гольджі, як і Са2+ в ЕР, відіграє важливу роль у трансляції, транслокації та процессінгу секреторних білків (Lodish et al., 1992). Враховуючи це, ми припускаємо, що InsP3-чутливе депо Са2+ наявне в апараті Гольджі.

Шляхом реєстрації [Ca2+]ЕР нами показано, що АХ- та ІnsР3-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР опосередковується тільки ІnsР3-рецепторами. На основі цього ми вважаємо, що холінергічна стимуляція слиновиділення in vivo пов’язана виключно із активацією ІnsР3-рецепторів, а опосередковане ними вивільнення Са2+ з ЕР є основним механізмом запуску секреції рідкої слини. Таке ІnsР3-індуковане вивільнення Са2+ потенціюється цитозольним Са2+ (100-400 нмоль/л), що зумовлено, очевидно, зростанням ймовірності перебування ІnsР3-каналів у відкритому стані (Iino, 1990). АТФ також характеризується біфазним впливом на ІnsР3-рецептор, оскільки у високих концентраціях АТФ, як і кофеїн, є конкурентним антагоністом ІnsР3-зв’язуючого центру рецептора (Bezprozvanny & Ehrlich, 1993).

Ми довели наявність в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози функціонально-активних ріанодинових рецепторів