ІНСТИТУТ ГІГІЄНИ ТА МЕДИЧНОЇ ЕКОЛОГІЇ

АМН УКРАЇНИ ім. О.М.МАРЗЕЄВА

Козовий Руслан Васильович

УДК 577.21+616-06+551.510.42+616-03971

КОМПЛЕКСНЕ ОЦІНЮВАННЯ ГЕНЕТИЧНИХ НАСЛІДКІВ ЗАБРУДНЕННЯ НАВКОЛИШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА І ШЛЯХИ ЇХНЬОГО ПОПЕРЕДЖЕННЯ

03.00.15 – генетика

Автореферат

дисертація на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Івано-Франківській державній медичній академії

МОЗ України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор КОВАЛЬЧУК Лариса Євгенівна,

Івано-Франківська державна медична академія МОЗ України,

кафедра медичної біології з курсом медичної генетики,

завідувач кафедри

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Пілінська Марія Андріівна,

Науковий центр радіаційної медицини АМН України,

завідувач лабораторією цитогенетики відділу медичної генетики

кандидат медичних наук, Кіцера Наталія Іванівна,

Інститут спадкової патології, АМН України, м. Львів,

старший науковий співробітник відділу

епідеміології вродженої та спадкової патології

Провідна установа:

Одеський державний медичний університет ім. М.І. Пирогова МОЗ України,

Кафедра клінічної імунології, генетики і медичної біології

Захист відбудеться ” 10 ” червня 2005 р. о 10.00год на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д. 26. 604. 02 Інституту гігієни та медичної екології

ім. О.М.Марзеєва АМН України за адресою: 02660, м.Київ, вул. Попудренка, 50.

Автореферат розісланий ” 07” травня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук Омельченко Е.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. З розвитком науково-технічного прогресу в середовищі існування людини виявляється все більше речовин з мутагенною та канцерогенною активністю (Сердюк А. М., Тимченко О. І. та ін., 2002; Горова А. І. 2001). Комплексна взаємодія цих сполук створює реальну основу для наростання генетичного тягаря в популяціях і водночас змінює напрямок та інтенсивність природного добору (Сердюк А.М., 2001; Гнатейко О.З., 2003). Це підтверджують негативні демографічні показники (зменшення народжуваності, збільшення малюкової смертності та кількості генетично зумовлених патологій, зміни їхнього спектру), реальні цитогенетичні ефекти (Педан Л.Р., Пілінська М.А., 2004) і як наслідок – погіршення загального стану здоров’я населення. Тому проблема науково-методичної бази визначення ризиків для здоров’я людини та навколишнього природного середовища від різних видів діяльності набуває особливої актуальності та лежить в основі медико-екологічної безпеки держави.

В Україні проведено серію досліджень про комбіновану та комплексну дію чинників природного та антропогенного походження на спадковий апарат живих організмів (Бариляк І.Р., Дуган О.М., 1999; Ковальчук Л.Є. та ін., 2003; Тимченко О.І. та ін., 2000). Однак остаточно не розроблені методологічні та методичні підходи щодо оцінки їх впливу на біологічні об’єкти в умовах навколишнього та виробничого середовища.

Ведеться пошук нових тест-систем оцінювання сумарного впливу забруднювачів довкілля і мутагенів на загальний стан організму і функціонування його спадкового апарату (Бариляк І.Р. та ін., 2001; Горовая А.И., 2002; Пілінська М.А. та ін., 2003). Молекулярно-генетичні дослідження трансгенних рослин (ТР) Arabidopsis thaliana та Nicotiana tabacum дозволили створити лінії, чутливі до радіації (Kovalchuk I., Kovalchuk O., 2000). Розроблено технологію отримання нових ліній ТР, чутливих до хімічних мутагенів (Орел Н.О., 2003).

Лише поєднання екогенетичного моніторингу з біоіндикацією мутагенів за допомогою різних тест-об’єктів (вищі рослини, людина) з врахуванням трьох рівнів організації спадкового апарату (генний, хромосомний, геномний) дасть змогу верифікувати мутагенне навантаження на популяцію людини.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом двох комплексних науково-дослідних робіт кафедри медичної біології з курсом медичної генетики та ЦНДЛ Івано-Франківської державної медичної академії “Впровадження і випробування нових тест-систем на основі рослин для біомоніторингу хімічного і радіонуклідного забруднення довкілля” (№ держ-реєстрації 01024007289) та „Комплексне оцінювання генетичних наслідків забруднення довкілля і способи їх попередження” (№ держ-реєстрації 01040002434).

Мета дослідження: підвищення ефективності тестування мутагенів довкілля з наступною розробкою методів профілактики негативних генетичних наслідків техногенного забруднення навколишнього середовища.

Завдання дослідження:

1. Вивчити динаміку основних демографічних показників та репродуктивних втрат населення на основі даних первинної медичної документації пологових стаціонарів м. Івано-Франківська, м. Коломиї, Снятинської та Верховинської центральних районних лікарень.

2. Дослідити показники каріограми інтерфазних ядер соматичних клітин та рівень хромосомних аберацій, асоціацій акроцентричних хромосом лімфоцитів периферійної крові дитячого населення досліджуваних районів.

3. Встановити цито- і генотоксичність питної води та грунтів із районів Прикарпаття, що зазнали радіоактивного та хімічного забруднення, за допомогою Allium cepa-тесту.

4. Розробити методичні підходи до використання трансгенних рослин для встановлення генетичних ефектів сумарної дії забруднювачів довкілля.

Об’єкт дослідження - первинна медична документація та звітні документи пологових будинків та центральних районних лікарень районів з різним екологічним станом; 640 дітей; 30 вагітних з групи ризику; лімфоцити периферійної крові людини; рослинні тест-об’єкти (Allium cepa, трансгенні лінії Arabidopsis thaliana).

Предмет дослідження: позитивні і негативні індикатори здоров’я, частота вроджених вад розвитку та спадкових хвороб, мимовільних викиднів, цитогенетичні зміни соматичних клітин дітей, меристематичних клітин Allium cepa, явища гомологічної рекомбінації трансгенних рослин, зумовлені сумарною дією забруднювачів довкілля. Ефективність застосування фолієвої кислоти у комплексній терапії при загрозі передчасного переривання вагітності.

Методи дослідження: епідеміологічний, цитологічний, цитогенетичний, молекулярно-генетичний аналіз відновлення GUS-гена, варіативної статистики, кореляційний, математичного моделювання.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше оцінено динаміку позитивних і негативних індикаторів здоров’я, репродуктивних втрат серед населення Івано-Франківської області, за частотою мимовільних викиднів, вроджених вад розвитку та спадкових хвороб серед новонароджених і перинатально померлих.

Науково обгрунтовано застосування комплексу показників стану інтерфазних ядер епітелію слизової оболонки порожнини рота, мікроядерного тесту в букальному епітелії, частоти хромосомних аберацій і асоціацій акроцентричних хромосом в лімфоцитах периферійної крові дітей для виявлення та оцінки сумарного мутагенного фону довкілля.

Вперше ідентифіковано молекулярно-генетичні ефекти в різних лініях трансгенних рослин Arabidopsis thaliana: Сol-0 Bin AR/SІR2-8, Сol-0 Bin AR/SІR2-7, BAR Bin AR/RPD3-1, BAR Bin AR/RPD3-9, Col-0 pTA/SІR2-2, N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3, Col-0 pMEX/SІR2-3, Col-0 pMEX/SІR2-6, індуковані радіоактивним кобальтом – 60, залежно від дози опромінення насіння. На основі порівняльного аналізу фенотипічних змін та частоти явищ інтрахромосомної гомологічної рекомбінації здійснено селекцію трансгенних ліній, чутливих до іонізуючої радіації.

Встановлено перевагу хімічного чи радіаційного чинника, присутнього у зразках грунтів Прикарпаття за активністю відновлення GUS-гена у трансгенних лініях: 1) N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3, чутливої до хімічних мутагенів, 2) BAR Bin AR/RPD3-9, чутливої до радіонуклідів.

Практичне значення отриманих результатів. Одержані дані про динаміку генетичного тягаря різних популяцій населення Івано-Франківської області використано при аналізі екологічної ситуації.

Обґрунтовано доцільність вивчення показників каріограми, частоти мікроядер як скринінгових методів, а також частоти і спектру хромосомних аберацій, асоціацій акроцентричних хромосом як біомаркерів стану хромосомного апарату дітей.

Рекомендовано і впроваджено в натурному експерименті оптимальний підбір рослинних тест-об’єктів: Allium cepa та трансгенних ліній рослин Arabidopsis thaliana (N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3, BAR Bin AR/RPD3-9) для виявлення природи та інтенсивності мутагенного фону довкілля (деклараційний патент на винахід № 67903 А).

На підставі кореляційного аналізу отриманих результатів встановлено сильні взаємозв’язки між показниками загальної народжуваності, смертності немовлят, частоти вроджених вад розвитку та спадкових хвороб і результатами цитогенетичного дослідження дітей та тестування довкілля за допомогою рослин.

Результати дослідження впроваджено в роботу центральної науково-дослідної лабораторії Івано-Франківської державної медичної академії та Коломийської районної лікарні, в навчальний процес та наукову діяльність кафедр медичної біології з курсом медичної генетики, соціальної медицини, організації і економіки охорони здоров’я, загальної гігієни та екології, дитячих хвороб №1 Івано-Франківської державної медичної академії та кафедру екології національного технічного університету нафти і газу.

Особистий внесок здобувача. Представлені в роботі матеріали є особистим внеском автора в проблему. Огляд літературних джерел, аналіз первинної документації, дослідження стану спадкового апарату дитячого населення, лабораторні та натурні експерименти з рослинними тест-об’єктами, кореляційний аналіз отриманих даних, встановлення залежності основних демографічних показників від інтенсивності мутагенного фону, проведення низки профілактичних заходів, апробація матеріалів дисертації та підготовка до друку наукових праць виконані автором самостійно. Висновки та практичні рекомендації сформульовані разом із науковим керівником. У спільних публікаціях з іншими дослідниками автору належать частини, що стосуються теми дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати дисертації обговорювались на 4 міжнародному конгресі студентів медиків (Польша, Катовіце, 1998), І обласному дитячому екологічному конгресі (Івано-Франківськ, 1999), 68, 69, 70, 71 студентських наукових конференціях (Івано-Франківськ, 1999, 2000-2002), 5 міжнародному конгресі студентів медиків та молодих лікарів (Польша, Катовіце, 2000), ІІІ з’їзді медичних генетиків України (Львів, 2002), ІІІ з’їзді з радіаційних досліджень (Київ, 2003), науковій конференції ”Антропогенно змінене середовище України: Ризики для здоров’я та екологічних систем” (Київ, 2003), VII з’їзді ВУЛТ (Тернопіль, 2003), 72 міжвузівській студентській науковій конференції (Івано-Франківськ, 2003), Всеукраїнському симпозіумі педіатрів (Тернопіль, 2004), VII міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених (Київ, 2004), Х конгресі СФУЛТ (Чернівці, 2004).

Публікації. Відповідно до теми дисертації опубліковано 22 наукові праці, з них - 5 статей у фахових наукових журналах, рекомендованих ВАК України, 17 - у збірниках, матеріалах, тезах міжнародних конференцій і симпозіумів.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена українською мовою на 159 сторінках машинопису і складається зі всту-пу, огляду літератури, розділу по матеріалах і методах дослідження, 2 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків, практичних рекомен-дацій, списку використаної літератури (204 джерела, з них латиною - 40, кирилицею – 164), 3 додатків. Дисертація ілюстрована 19 таблицями та 34 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Вивчення динаміки генетичного тягаря та генетичного здоров’я населення. Для дослідження вибрано райони з різним екологічним станом: міста Івано-Франківськ, Коломия – хімічно забруднені території, Снятинський район (с.Стецева, с. Русів) – зона посиленого радіологічного контролю і Верховинський район (с. Красник, с. Ільці) – умовно екологічно чиста зона. Генетичний тягар оцінювали за допомою генетичного моніторингу (ГМ) проведено за даними первинної медичної документації та звітними документами пологових стаціонарів та центральних районних лікарень вищезгаданих районів за 1986-2002 роки. Здійснено ретроспективну реєстрацію мимовільних викиднів (МВ), вроджених вад розвитку (ВВР) та спадкових хвороб серед новонароджених і перинатально померлих дітей, основних демографічних показників. Останні розраховано за формулами, які відповідають вимогам ВООЗ (Сердюк А.М. та ін., 2003).

Для оцінки генетичного здоров’я населення проведено анкетування 640 дітей (338 хлопчиків, 302 дівчаток) з вищеперерахованих районів. На підставі результатів генеалогічного аналізу створено репрезентативну виборку із 198 дітей для подальшого цитогенетичного дослідження (табл. 1).

Таблиця 1

Характеристика об’єму та методів проведених досліджень дитячого населення

Івано-Франківської області

Досліджувані регіони | Методи дослідження та кількість обстежених

анкетування | цитологічний | Цитогенетичний

м. Івано-Франківськ | 163 | 47 | 21

м. Коломия | 168 | 51 | 19

Снятинський район | 152 | 48 | 17

Верховинський район | 157 | 52 | 18

Разом | 640 | 198 | 75

Матеріалом для вивчення функціонального стану геному (ФСГ) і частоти мікроядер (МЯ) слугували епітеліальні клітини середнього шару слизової оболонки порожнини рота (СОПР) дітей. Фіксацію матеріалу проведено у суміші Карнуа (метанол : льодяна оцтова кислота – 3:1) протягом 3-5 хв. Всі препарати фарбували ацетоорсеїном та за Фьольгеном у модифікації, яка дозволяє виявити ДНК ядра і РНК ядерець. Для аналізу ФСГ відбирали по 100, а для оцінки МЯ по 500 ядровмісних клітин кожної обстежуваної дитини. У зазначених популяціях клітин вираховували індекси хроматизації (ІХ), гетеропікнотичної Х-хромосоми (СХ), ядерцевий (ЯІ), морфологічно змінених ядер (МЗЯ) (Ковальчук Л.Є., Волосянко А.Б., 2003) та частоту мікроядер (Руденко С.С. та ін., 2002).

Частоту хромосомних аберацій (ХА) та асоціацій акроцентричних хромосом (ААХ) визначено в лімфоцитах периферійної крові. Культивування лімфоцитів, приготування препаратів та ідентифікування ХА проводилися за методичними рекомендаціями, затвердженими МОЗ України (Зернова-Любимова Т. Е., Горовенко Н. Г., 2003). Від кожної дитини проаналізовано не менше 100 метафазних пластинок з добрим розкидом хромосом. Ураховувались всі структурні аберації хромосомного та хроматидного типів. Наявність ААХ оцінювали за критеріями, розробленими О.К. Фроловим та ін. (1993), з ураховуванням специфічності розміщення акроцентричних хромосом у метафазі (Нейко Є.М., Чернюк Н.В., Ковальчук Л.Є, 2003).

З метою профілактики негативних генетичних ефектів забруднення довкілля було вибрано групу з 30 вагітних, які вживали фолієву кислоту по 0,4 мг щоденно протягом трьох місяців гестації. Ефективність лікування аналізували за активністю ФСГ та частотою МЯ.

Методи оцінки інтенсивності мутагенного забруднення довкілля за допомогою рослинних тест-систем. Цитогенетичні ефекти води та грунтів встановлювалися в 1998, 2001 та 2003 роках з використанням Allium cepa-тесту. Забір зразків грунту здійснено конвертоподібним способом. Насіння пророщувалося на гомогенізованих зразках грунтів та води з вищезгаданих чотирьох районів. Активність проростання насіння ідентифікувалася через 43 – 72 год, що відповідає першому та другому мітотичним циклам. Забір корінців, їх фіксація та підготовка давлених препаратів, з наступним фарбуванням орсеїном та за Фьольгеном, проводилися за стандартними методиками (Паушева З.П., 1980). Загальний мітотичний, про-, мета-, ана- і телофазний індекси, ХА визначали шляхом аналізу 100 мітотичних клітин на препарат, по 5 препаратів на зразок.

З метою селекції трансгенних рослин, найбільш чутливих до радіонуклідів, насіння 8 ліній

Arabidopsis thaliana (Сol-0 Bin AR/SІR2-8; Сol-0 Bin AR/SІR2-7; BAR Bin AR/RPD3-1; BAR Bin AR/RPD3-9; Col-0 pTA/SІR2-2; Col-0 pTA/SІR2-4; N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3; Col-0 pMEX/SІR2-6) було опромінено 60Со на установці „Луч - 1” у дозах 0,1 Гр, 0,5 Гр, 2,5 Гр. Контролем слугувало неопромінене насіння. Аналогічний експеримент проведено з опроміненням насіння Allium cepa.

Натурний експеримент полягав у висаджуванні насіння двох ліній ТР BAR Bin AR/RPD3-9 та N1DC4 no.651 pMEX/SІR2-3 у зразки грунтів досліджуваних районів. Вирощування проводилося в стандартних умовах - 16 год день/8 год ніч, за температури 220С протягом 2 тижнів. Частоту явищ інтрахромосомної гомологічної рекомбінації (ІГР), оцінювали шляхом ідентифікації відновленого GUS-гена. Останній візуалізовано за допомогою X-gluс аналізу (Ковальчук О.В. та ін., 2003; Орел Н.О., 2003).

Статистичну обробку результатів та визначення кореляцій між показниками здійснено за допомогою комп’ютерної програми “Excel”, що входить до складу пакету Microsoft office 2000.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Динаміка основних демографічних показників. Оцінка впливу мутагенного забруднення на стан генофонду населення базувалася на вивченні основних демографічних показників, у тому числі індикаторів здоров’я. Аналіз частоти МВ за період 1986-2001 років довів її зростання в 1,7-3,2 рази в усіх досліджуваних районах. Найбільша кількість МВ (60-70%) реєструвалася в першому триместрі вагітності, що корелює з частотою хромосомних аберацій у зародка.

Частота ВВР та спадкових хвороб у м. Івано-Франківську, Коломиї та Снятинському районі до 1996 року зросла порівняно з такою в 1986 р. Однак в наступні роки спостерігалася тенденція до його зменшення. За період спостереження у Верховинському районі дітей з ВВР та спадковими хворобами було найменше, окрім 1991 та 1992 років. Питома вага ВВР та спадкових хвороб серед перинатально померлих переважала в м. Івано-Франківську та Снятинському районі порівняно з показниками Верховинського району за весь досліджуваний період. Істотне зростання від 6,66 до 28,61% цього показника відмічено в обласному центрі. В м. Коломиї він коливався від 18,12 до 31,23 % і залежав від рівня ефективності пренатальної діагностики.

Вивчення позитивного показника здоров’я популяції – народжуваності, довело тенденцію до його зниження в усіх районах області з 1987 до 2002 року в 1,5 - 1,8 рази (рис. 1). Враховуючи те, що народжуваність залежить від низки соціально-економічних факторів та питомої ваги жінок фертильного віку, було визначено спеціальний показник народжуваності (рис. 2). Його максимальні значення зареєстровано у Верховинському районі, а мінімальні - у м. Івано-Франківську. Встановлено позитивну кореляцію між цим показником у динаміці та загальною народжуваністю (r = 0,717 в 1989 та r = 0,982 в 1999 роках).

Рис. 1. Загальний показник народжуваності (ПН, ‰) в окремих районах Івано-Франківської області. | Рис. 2. Спеціальний коефіцієнт народжуваності (КН, ‰) серед насе-лення Івано-Франківської області.

Негативний підхід до виміру здоров’я відображено показниками поширеності хвороб та смертності. Відмічено тенденцію до зростання поширеності захворювань і захворюваності за останні роки по всіх районах області та у м. Івано-Франківську, що корелює з даними по Україні (r = 0,81). Максимального рівня поширеність захворювань досягала у 2001 році в м. Івано-Франківську (1629,2) та у Снятинському районі (1598,0). У Верховинському районі вона була найнижчою за досліджуваний період порівняно з іншими районами області та з всеукраїнським показником.

Цікавим виявився той факт, що у Снятинському районі зареєстровано максимальне значення показника загальної смертності у 2002 році (16,1‰), що майже у 2 рази більше від такого у м. Івано-Франківську (8,9‰). Коефіцієнт смертності немовлят знизився в усіх районах за винятком м. Івано-Франківська, де він склав у 2001 році – 40,5‰ .

Аналіз рівня фетальної, неонатальної та перинатальної смертності не виявив значних коливань за досліджуваний період. Максимальні цифри зареєстровано у м. Івано-Франківську. У Верховинському районі таких випадків у 1998, 2000, 2002 роках не було.

Результати дослідження стану здоров’я та спадкового апарату дітей Івано-Франківської області. З метою створення репрезентативної виборки дитячого населення для наступного цитогенетичного дослідження проведено анкетування 640 дітей різного віку, які проживають в досліджуваних районах.

Проведений аналіз анкет показав, що лише 198 дітей (30,9%) належали до першої групи здоров’я та батьки яких тривалий час проживали на даній території. Родоводи інших були обтяжені різними факторами, які не дозволили включити їх до подальших обстежень. Дітей було розділено на дві вікові групи: перша віком 4-8 (хлопчиків - 56, дівчаток - 31), друга – 9-15 років (хлопчиків - 65, дівчаток - 46).

Порівняльний аналіз ФСГ усіх досліджуваних дітей довів статеві закономірності цитологічних показників, а також їхню залежність від екологічних умов довкілля. Так, деконденсація хроматину була істотніша у хлопчиків, ніж у дівчаток (табл. 2).

Таблиця 2

Цитологічні показники епітеліоцитів слизової оболонки порожнини рота у дітей досліджуваних районів, (М±m)

Досліджу-вані райони | Стать

дітей | Індекс хроматизації, ум.од | Ядерцевий індекс,%

Вікова група | Вікова група

4-8 років | 9-15 років | 4-8 років | 9-15 років

м. Івано-Франківськ | дівчатка | 0,85±0,09 | 0,79±0,03 | 3,61±0,83* | 3,82±0,65*

хлопчики | 0,99±0,08 | 0,94±0,07 | 3,68±0,51* | 3,96±0,62*

м. Коломия | дівчатка | 0,92±0,04* | 0,81±0,02 | 4,58±0,52* | 4,89±0,67*

хлопчики | 0,97±0,02 | 0,92±0,51 | 4,89±0,67* | 4,61±0,48*

Снятинський район | дівчатка | 0,94±0,03* | 0,89±0,04* | 7,64±0,44* | 6,32±0,51*

хлопчики | 0,98±0,02 | 0,93±0,03 | 8,41±0,41* | 7,53±0,38*

Верховинський район | дівчатка | 0,80±0,02 | 0,78±0,04 | 1,51±0,13 | 1,45±0,26

хлопчики | 0,94±0,02 | 0,91±0,01 | 1,75±0,15 | 1,67±0,68

Примітка. *Р<0,001 – порівняно з показниками дітей з Верховинського району.

ІХ у них коливався від 0,78±0,04 до 0,94±0,07 ум.од. Причому найбільші значення цього індексу ідентифіковано у дітей з м. Івано-Франківська, м. Коломиї та із зони посиленого радіологічного контролю. Найнижчий ІХ характерний для дітей контрольного району.

Другий показник ФСГ - ядерцевий індекс у дітей міст Івано-Франківська та Коломиї був більшим, ніж такий у дітей Верховинського району в 2,4 та 2,9 рази відповідно. Особливо значущим було збільшення ЯІ у дітей Снятинського району (Р<0,001).

Істотні відмінності СХ забезпечують статевий диморфізм і нормальне статеве дозрівання дітей. Якщо у дівчаток 4-8 річного віку з контрольної зони цей показник перевищував такий у хлопчиків у 21,0 раз (відповідно 27,05±0,52 та 1,25±0,5%), то різниця між СХ у хлопчиків (8,13±0,87%) і дівчаток (27,11±0,84%) м. Івано-Франківська та м. Коломиї (відповідно 26,51±0,64, 6,58±0,45%) достовірно менша, ніж у контролі (Р<0,001). Ще меншою була відмінність СХ у хлопчиків та дівчаток Верховинського району. Аналогічні закономірності спостерігалися і в 9-15 річних дітей. Виявлено істотну залежність частоти МЗЯ у всіх обстежених дітей від місця їхнього проживання. При порівняно незначному відхиленні від контролю у них частіше ідентифікувалися великі ядра з дифузним хроматином. Найбільша кількість МЗЯ зустрічалася у хлопчиків (8,85±0,36%) та дівчаток (8,01±0,58%) Снятинського району.

Доповненням даного дослідження був мікроядерний тест. Доведено достовірні зміни частоти та структури МЯ у букальному епітелії залежно від зони проживання дітей. Найбільшу кількість МЯ виявлено в дітей з Снятинського району, дещо менша – у дітей з міст Івано-Франківська та Коломиї. Мікроядра розташовувалися в цитоплазмі поблизу ядра, мали оболонку та були заповнені хроматином. Наші дослідження підтверджують літературні дані про те, що причиною збільшення МЯ у епітеліоцитах СОПР дітей є проживання на територіях з високим техногенним навантаженням (Горовая А.И., Климкина И.И., 2002).

Оскільки МЯ є індикатором порушеннь клітинного поділу та / або цілісності хромосом, наступним етапом дослідження був цитогенетичний аналіз (табл. 3).

Встановлено, що середньогрупова частота ХА у дітей м. Івано-Франківська складала 2,85±0,25, м. Коломиї – 2,98±0,24 та Снятинського району – 3,05±0,15%, що переважало таку у Верховинському районі в 2,5, 2,7 і 2,8 рази відповідно (Р<0,01) (рис. 3). Водночас відзначено індивідуальну мінливість частоти ХА серед обстежених дітей. У спектрі ХА обстежених з м. Івано-Франківська та м. Коломиї переважали одиночні ацентричні фрагменти, які засвідчують перевагу мутагенного фону хімічної природи. Маркери радіаційного мутагенезу (дицентрики, парні фрагменти) частіше зустрічалися у дітей зі Снятинського району.

Таблиця 3

Осносні кількісні цитогенетичні показники в лімфоцитах периферійної крові обстежених осіб

Показники | Місце проживання

м.Івано-Франківськ | м. Коломия | Снятинський район | Верховинський район

Кількість обстежених дітей | 21 | 19 | 17 | 18

Загальна кількість метафаз | 2135 | 1906 | 1749 | 1831

Середньогрупова частота метафаз з абераціями, % | 2,85±0,25* | 2,98±0,24* | 3,05±0,15* | 1,12±0,17

Діапазон індивідуальних коливань | 0,78-2,95 | 0,74-2,81 | 0,69-3,01 | 0,51-2,23

Кількість аберацій

на 100 клітин | 2,81 | 2,98 | 3,04 | 1,11

на аберантну метафазу | 1,05 | 1,04 | 1,06 | 1,2

Асоціації акроцентричних хромомсом

частота клітин з ААХ, % | 91,0 | 91,0 | 93,0* | 85,0

середня кількість ААХ в одній клітині, % | 1,67±0,13 | 1,66±0,17 | 1,51±0,19 | 1,50±0,18

число асоційованих хромосом в одній клітині, % | 3,2±0,27 | 3,3±0,15 | 3,8±0,18* | 2,80±0,31

Примітка. *Р<0,01 порівняно з показниками дітей з Верховинського району.

При вивченні імуногенетичного показника – частоти ААХ виявлено його залежність від зони проживання (див. табл. 3, рис.4). Отримані характеристики корелювали з результатами метафазного аналізу (r=0.75). Середня кількість ААХ в одній клітині коливалася від 1,55±0,15 до 1,45±0,21 у дітей Верховинського району, від 1,75±0,03 до 1,59±0,23 – м. Івано-Франківська, від 1,78±0,05 до 1,52±0,31 - м. Коломиї та від 1,81±0,31 до 1,21±0,06 - Снятинського району.

Рис. 3. Частота хромосомних Рис. 4. Асоціації двох (1) та трьох (2)

аберацій в лімфоцитах периферійної акроцентричних хромосом в метафазній

крові досліджуваних дітей, %. пластинці дівчинки В. з м. Коломиї.

Заб.: фарбою Гімза. Зб.: х1000.

Отримані дані корелюють з показниками частоти ХА (r = 0,73 – 0,9) та результатами попередніх досліджень (Кочерга З.Р., 2000). Це підтвердило зниження імуногенетичного статусу дітей в містах Івано-Франківську, Коломиї та Снятинському районі.

Результати досліджень стали підставою для проведення профілактичних заходів. Нами розроблено та розповсюджено у вищезгаданих районах рекламну листівку про можливість реабілітації організму антимутагенами, які містяться у вітамінних комплексах, продуктах харчування та про ефективність застосування фолатів. Для практичного втілення попереджувальної терапії було вибрано групу з 30 вагітних жінок, які вживали фолієву кислоту по 0,4 мг щоденно, протягом трьох місяців гестації. Ефективність профілактики, оцінена змінами ФСГ та МЯ, засвідчила необхідність вживання фолієвої кислоти та вітамінних комплексів природного походження. Це узгоджується з даними інших авторів щодо застосування антиоксидантів з метою захисту і відновлення генетичних структур (Бариляк І.Р., 2003).

Результати тестування інтенсивності мутагенного фону за допомогою Allium cepa-тесту. Першочергово встановлювали залежність активності пророста-н-ня насіння цих рослин від ступеня забруднення довкілля. Трьохразове дослідже-н-ня МІ рослин, пророщених на двох зразках води м. Івано-Франківська, довело зниження цього показника у 2001 і 2003 роках порівняно з таким у 1998 році. Однак за відношенням до контролю МІ первинної меристеми Allium cepa, пророщеної на воді з централізованої мережі водопостачання м. Івано-Франківська та джерела на окраїні міста (за винятком 2001 року), був вищим. Інтенсивність росту Allium cepa у зразках води р. Прут за весь досліджуваний період була більшою в 1,53 рази, порівняно з контролем (Р<0,01). Цитотоксичність проб води з централізованої мережі водопостачання м. Коломиї збільшувалася у 2001 і зменшувалася у 2003 роках порівняно з 1998 роком (Р<0,01). Однак отримані цифри перевищували контроль відповідно у 1,91, 2,12 та 1,93 рази за досліджуваний період. Питна вода з сіл Стецева та Русів, знижувала інтенсивність поділу клітин Allium cepa у 2003 році відповідно в 1,48 та 1,22 рази порівняно з 1998 р. (Р<0,01). Однак її активність була більшою, ніж у контролі в середньому в 2,41 рази. Активність мітотичного процесу в первинних корінцях Allium cepa, пророщених на зразках Верховинського району в 1998 і 2003 роках, істотно не відрізнялась від контролю.

Зразки грунтів з хімічно забрудненого м. Івано-Франківська гальмували поділ клітин первинної меристеми, порівняно зі зразками інших зон, хоча показники були близькі до контролю. Комплексна дія екзогенних чинників усіх зразків грунтів м. Коломиї спричиняла перевищення контрольних значень та результатів поділу клітин корінців Allium cepa екологічно чистого гірського села Ільці. Діапазон мінливості МІ коливався від 7,13±0,32 в 2001 році (грунт з берега річки Прут при вході в місто) до 11,27±0,75% в 1998 році (грунт з центральної частини міста). Значущі відхилення від контролю та від умовно екологічно чистої зони виявив МІ рослин, пророщених на зразках грунту з центральної частини м. Коломиї (Р<0,01). Варто зазначити, що за весь досліджуваний період найкраще проростали рослини у грунтах с. Стецева та с. Русів, що засвідчує стимулюючий вплив малих доз іонізуючої радіації (Гродзинський Д.М., 2000). МІ первинної меристеми Allium cepa, пророщеної на зразках грунту з умовно екологічно чистої зони с. Красник, був більшим за контрольні значення у 1998 році в 1,12, в 2001 – в 1,32 і у 2003 році в 1,4 рази (Р<0,01). Результати, отримані з проб грунтів сусіднього с. Ільці, від контролю суттєво не відрізнялися.

Оскільки цитотоксичність визначається на різних етапах клітинного циклу, було вивчено розподіл клітин первинної меристеми залежно від фази мітозу. Найбільш значущі відмінності всіх мітотичних індексів від контролю встановлено у рослин, пророщених на воді з центральної мережі водопостачання міст Івано-Франківська та Коломиї, особливо в 1998 році. Характерною ознакою цитогенетичних ефектів води із зони посиленого радіологічного контролю за всі досліджувані роки було збільшення профазного та зниження телофазного індексів. Профазний МІ рослин, які пророщувалися на зразках води Верховинського району, коливався від 29,2±0,61 (с. Красник, 1998 рік) до 37,1±0,42% (с. Ільці, 2001 рік) (Р<0,01). Показники мета-фазного індексу в 1998 році були близькі до контрольних значень. Отримані результати дослідження впливу грунтів на активність поділу первинної меристеми корелювали з такими у зразках води.

Наступним етапом роботи було вивчення патологій мітозу, які є результатом сумарного ефекту метаболічних порушень. На мікропрепаратах Allium cepa, пророщеної на досліджуваних зразках грунтів і води, реєструвалися численні порушення мітозу: фрагментації, злипання і відставання хромосом, утворення мостів. Серед спектру ХА у рослинах, пророщених на зразках Снятинського району, реєструвалися хромосомні мости, парні фрагменти (маркери радіаційного мутагенезу), а в Коломиї та Івано-Франківську - хроматидні мости і одиночні фрагменти (маркери хімічного мутагенезу).

Таким чином, отримані дані свідчать про високий рівень цито- і генотоксичності води та грунтів хімічно і радіаційно забруднених районів Івано-Франківської області.

Визначення змін спадкового апарату Allium cepa та ТР Arabidopsis thaliana, зумовлених іонізуючою радіацією. Цитологічний аналіз препаратів Allium cepa довів, що активність поділу клітин верхівкової меристеми рослин, опромінених в дозі 0,1 Гр, була збільшеною порівняно з контролем і дорівнювала відповідно 8,19±0,39 та 7,76±0,71%. Значну активацію мітотичного процесу (9,68±2,62%) зафіксовано в корінцях, пророщених з насіння, опроміненого в дозі 0,5 Гр. У цих же рослин було найістотнішим гальмування профази. Збільшення дози до 2,5 Гр викликало зниження МІ до 6,3±0,36%. Цікавим виявився факт затримки телофаз і формування дочірніх клітин під впливом іонізуючої радіації в дозі 0,1 Гр. Можливо, інгібіція цитокінезу зумовлює більший анафазний індекс.

Частота ХА, індукованих 60Со наростала зі збільшенням дози опромінення (табл. 4).

Таблиця 4

Частота та спектр хромосомних аберацій у опромінених рослин Allium cepa,%

Доза опромінення, Гр | Частота

хромосомних аберацій | Спектр хромосомних аберацій

К-мітози | мости | фрагменти

0,1 | 10,89±2,41* | 5,54±2,12 | 3,85±0,42 | 1,50±0,92

0,5 | 17,75±2,72* | 6,93±1,11* | 6,33±1,61* | 4,50±2,21*

2,5 | 17,15±3,73* | 5,22±2,12 | 4,35±2,13 | 7,58±2,31*

Контроль | 4,68±1,85 | 2,96±1,25 | 1,11±1,12 | 0,61±0,64

Примітка. *р<0,01 порівняно з показниками контролю.

В спектрі патологій мітозу переважали такі ХА: К-мітози, хромосомні, рідко хроматидні мости, подвійні фрагменти. Встановлено залежний ефект між дозою опромінення та кількістю хромосомних фрагментів.

Таким чином, встановлено залежність мітотичної активності, частоти хромосомних аберацій верхівкової меристеми корінців Allium cepa від дози опромінення.

З метою селекції найбільш чутливих до 60Со ТР здійснено опромінення насіння 8 ліній Arabidopsis thaliana: Сol-0 Bin AR/SІR2-8; Сol-0 Bin AR/SІR2-7; BAR Bin AR/RPD3-1; BAR Bin AR/RPD3-9; Col-0 pTA/SІR2-2; N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3;Col-0 pMEX/SІR2-3; Col-0 pMEX/SІR2-6. Виявлено зниження активності проростання насіння Arabidopsis thaliana на 50% в першій (доза опромінення 0,1 Гр), на 70% - в другій (0,5 Гр) та на 80% - в третій пробі (2,5 Гр). В останній пробі зафіксовано значущі зміни фенотипу: малі ріст та товщина стебла рослин, порушена еластичність листків, затримка появи перших листків на 3-4 дні та формування розетки на 3-5 днів. Серед всіх восьми ліній найменша активність проростання спостерігалася у трангенних лініях BAR Bin AR/RPD3-1 та BAR Bin AR/RPD3-9. Недостовірні фенотипові зміни при опроміненні насіння в дозі 0,1 Гр показали лінії Сol-0 Bin AR/SІR2-8; Сol-0 Bin AR/SІR2-7; Col-0 pTA/SІR2-2 та N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3. Проміжне місце по пригніченню мітотичних процесів займали трансгенні рослини Col-0 pMEX/SІR2-3; Col-0 pMEX/SІR2-6. Тому для подальшого молекулярно-генетичного аналізу явищ ІГР використано 4 лінії ТР Arabidopsis thaliana. Перші дві (BAR Bin AR/RPD3-1 та BAR Bin AR/RPD3-9) показали достовірні зміни фенотипових характеристик під впливом 60Со. Нечутливі до цього чинника були ТР Сol-0 Bin AR/SІR2-2 та N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3. Останні тестовано в Інституті генетики рослин (Гатерслебен, Німеччина) і доведено високу сенситивність до хімічних сполук.

Встановлено, що число явищ ІГР зростало зі збільшенням дози опромінення. У ліній BAR Bin AR/RPD3-1 та BAR Bin AR/RPD3-9 при дозі опромінення 2,5 Гр, кількість синіх плям перевищувала контрольні значення у 3,9-3,94 рази (рис. 5). Сині плями були ідентифіковані не тільки у листках, але й у корінцях та стеблах рослин (рис. 6). Це доводить їхню чутливість до променевого ураження.

Рис. 5. Частота рекомбінаційних Рис. 6. Явища відновлення GUS- гена

явищ у трасгенних лініях, у трансгенній лінії BAR Bin AR/RPD3-9

опромінених 60Со, %. (доза опромінення 2,5 Гр).

У лініях Сol-0 Bin AR/SiR2-2 та N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3 явища відновлення гена-маркера реєструвалися в окремих листках як поодинокі сині плями. Найбільша кількість рекомбінаційних явищ, індукованих радіаційним чинником, виявлена у трансгенних ліній BAR Bin AR/RPD3-1 та BAR Bin AR/RPD3-9. Це дозволило використати їх для подальших досліджень з визначення радіонуклідів у довкіллі. Трансгенні лінії Сol-0 Bin AR/SІR2-2 та N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3 мають незначну здатність до відновлення гена ?-глукуронідази під впливом 60Со.

Дослідження забруднення грунтів за допомогою ТР Arabidopsis thaliana., Використано дві лінії ТР: чутливу до радіонуклідів – BAR Bin AR/RPD3-9 та до хімічних мутагенів - N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3. Найкраще проростання рослин обох трансгенних ліній зафіксовано на зразках грунтів з Верховинського району. Для лінії BAR Bin AR/RPD3-9 цей показник склав 89,9±2,8% та для лінії N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3 – 72,7±1,2%. Активність проростання досліджуванх ліній була найменшою на зразках грунту с. Стецева. Водночас відзначено, що відсоток проростання рослин лінії BAR Bin AR/RPD3-9 у 1,24 рази був меншим, ніж у хімічно чутливої лінії N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3. Схожість рослин на грунтах з хімічно забруднених міст Івано-Франківська та Коломиї була також менша за таку в рослин, вирощених на грунтах з с. Ільці. Показники проростання лінії N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3 на грунтах вищезгаданих міст дорівнювали відповідно 65,5±3.3 та 70,5±2,5% і були менші, ніж у лінії BAR Bin AR/RPD3-9.

Таким чином, активність проростання насіння двох ліній Arabidopsis thaliana залежала від вмісту хімічних або радіологічних чинників у грунті.

Рослини, які виросли на зразках грунтів з Верховинського району, мали нормальну товщину стебла, на 5-6 день у них з’являлися листочки, на 29-30 - утворювалася розетка. На відміну від описаних вище рослин, еластичність листків, товщина стебла у двох ліній, що виросли на зразках грунтів зі Снятинського району, були меншими. В цих рослин відмічено затримку появи перших листків та формування розетки на 3-5 днів. Фенотипічними особливостями рослин, пророщених на зразках грунтів з хімічно забруднених міст Коломиї та Івано-Франківська, були малий ріст та мала товщина стебла.

Підрахунок синіх плям у листках, стеблах та корінцях трансгенної лінії N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3 дав змогу довести її найбільшу чутливість при пророщуванні на зразках грунтів з міст Коломиї та Івано-Франківська (табл. 5).

Таблиця 5

Частота рекомбінаційних явищ у трансгенних лініях рослин Arabidopsis thaliana, пророщених на зразках грунтів з досліджуваних територій, (М±m)

Трансгенні лінії | Досліджувані території та частота рекомбінаційних явищ

м. Івано-Франківськ | м. Коломия | с. Стецева | с. Ільці

N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3 | 15,3±1,4* | 14,2±0,7* | 8,5±0,2 | 7,1±0,3

BAR Bin AR/RPD3-9 | 3,9±0,8 | 4,1±0,3 | 12,3±0,4* | 3,5±0,6

Примітка. *Р<0,001 порівняно з показниками з с. Ільці.

Водночас найбільшу кількість синіх плям зареєстровано у рослин лінії BAR Bin AR/RPD3-9, які виросли на зразках грунтів с. Стецева Снятинського району.

Таким чином, проведені експерименти з пророщуванням ТР у зразках грунтів Івано-Франківської області дав змогу виявити залежність активності проростання Arabidopsis thaliana від ступеня забруднення грунтів. Відмічено від-мі-н-ності між лініями N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3 та BAR Bin AR/RPD3-9, що пророщувались на зразках грунтів хімічно та радіаційно забруднених територій. Частота явищ ІГР у трансгенної лінії N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3, була істотно вищою при тестуванні грунтів м. Івано-Франківська та м. Коломиї, порівняно з такою с. Стецева та с. Ільці. Активність відновлення GUS-гена у рослин лінії BAR Bin AR/RPD3-9, яка проросла на зразках грунтів із зони посиленого радіологічного контролю, суттєво переважала таку в усіх інших досліджуваних зразках. Отже, за результатами проведених досліджень можна зробити висновок про ефективність застосування трансгенних ліній Arabidopsis thaliana, що містять у геномі візуальний ген-маркер, для індикації хімічного (лінія N1DC4 no. 651 pMEX/SІR2-3) чи радіаційного (лінія BAR Bin AR/RPD3-9) впливу, для моніторингових досліджень потенційних мутагенів довкілля та ідентифікації домінуючого чинника забруднення.

Висновки

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і вирішення наукового завдання, що полягає в удосконаленні тестування інтенсивності мутагенного фону довкілля на підставі комплексного дослідження індикаторів здоров’я різних популяцій, цитологічних і цитогенетичних показників дітей, що проживають на територіях з різним техногенним навантаженням, цито- та молекулярногенетичних змін рослинних тест-об’єктів.

1. Встановлено динаміку основних демографічних показників та репродуктивних втрат за 1989 – 2002 роки в різних групах населення Івано-Франківської області, яка проявляється зниженням рівня народжуваності в м. Івано-Франківську та в усіх районах області в 1,5-1,8 рази, зростанням загальної смертності в 1,1-1,2 рази, частоти мимовільних викиднів в 2,9-3,1 рази, вродженої та спадкової патології в 5,1 – 7,2 рази.

2. Визначено контрольні показники індексів хроматизації (у дівчаток 0,79±0,03 та у хлопчиків 0,92±0,01), гетеропікнотичної Х-хромосоми (у дівчаток 1,62±0,13 та у хлопчиків 1,56±0,22), статевого хроматину (у дівчаток 26,17±0,58 та у хлопчиків 1,20±0,64) та морфологічно змінених ядер (у дівчаток 3,41±0,07 та у хлопчиків 3,29±0,06), мікроядерного індексу (у дівчаток 0,63±0,36 та у хлопчиків 0,98±0,45), спонтанного рівня хромосомних аберацій (1,12±0,18), асоціацій акроцентричних хромосом (1,50±0,18) у дітей з умовно екологічно чистого Верховинського району. Виявлено збільшення частоти вищеназваних показників у дітей з хімічно забруднених міст Івано-Франківська та Коломиї, і зони посиленого радіоекологічного контролю Снятинського району.

3. Встановлено