Українська Академія Аграрних Наук

Інститут Експериментальної і клінічної ветеринарної медицини

КУЧЕРЯВЕНКО ВІКТОРІЯ ВІКТОРІВНА

УДК 619:615.371:578.825.15:616.98:578.833.3

Розробка ТА ВИВЧЕННЯ ВЛАСТИВОСТЕЙ вакцини емульсійної інактивованої проти інфекційного ринотрахеїту та вірусної діареї

великої рогатої худоби

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН.

Науковий керівник: доктор ветеринарних наук, професор

Білокінь Віктор Степанович

Інститут експериментальної і клінічної

ветеринарної медицини УААН, головний науковий співробітник лабораторії біотехнології.

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН

Романенко Володимир Пилипович

Інститут ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії імунології і генетики;

доктор ветеринарних наук, професор

Скибицький Володимир Гурійович

Національний аграрний університет, завідувач

кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології.

Провідна установа: Харківська державна зооветеринарна академія,

кафедра епізоотології і ветеринарного менеджменту.

Захист відбудеться “ 12 ” квітня 2005 р. о 900 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків,
вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “ 9 ” березня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор А.Ф. Бабкін

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Успішний розвиток скотарства можливий лише при стійкому благополуччі господарств з інфекційних хвороб, забезпечення якого може бути здійснено шляхом обов’язкового дотримання загальних ветеринарно-санітарних правил і створення імунного поголів’я за допомогою засобів специфічної профілактики. Серед інфекційних хвороб великої рогатої худоби значного поширення набули інфекційний ринотрахеїт (ІРТ) і вірусна діарея (ВД), які спричиняють досить значні економічні збитки галузі тваринництва
(Андрєєв Є.В. і співавт., 1975; Чечеткина Н.П. и соавт., 1984; Атамась В.А. и соавт., 1986; Красочко П.А., 1997; Сюрин В.Н. и соавт., 1998).

Сучасна епізоотична ситуація з ІРТ та ВД характеризується змішаним перебігом цих хвороб (Ковалев Н.А. и соавт., 1998; Глотов А.Г. и соавт., 2002). Їх поширенню сприяє здатність вірусів ІРТ та діареї до персистенції, внаслідок чого перехворілі тварини залишаються довічними вірусоносіями й джерелом збудника інфекції (Юров К.П. и соавт., 1998; Castrucci G. at al., 2002).

В деяких країнах Європи (Австрія, Данія, Норвегія, Фінляндія, Швейцарія та Швеція) розроблені й впроваджені програми з контролю та боротьби з ІРТ і ВД великої рогатої худоби, які передбачають повну ліквідацію хворих та серопозитивних до цих збудників тварин. В інших країнах світу (США, Німеччина, Великобританія, Франція) розроблені програми з контролю та профілактики ІРТ та ВД за допомогою вакцин, виготовлених як з інактивованих, так і атенуйованих вірусів (Akermann M., 1998; Grooms D.L. at al., 2002;
Lindberg A., 2003).

В Україні для профілактики інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби застосовують живу вакцину „ІРТ-LG” (Фукс П.П., Волосянко Е.В., 1995). На цей час завершується розробка живої вакцини проти ВД (Чебанюк І.В. та співавт., 2004). Проте, внаслідок можливої персистенції вакцинних вірусів в організмі імунізованих тварин, а нерідко і залишкової вірулентності їх використання дещо обмежене, а в племінних господарствах взагалі заборонене.

Що стосується інактивованих засобів профілактики хвороб вірусної природи великої рогатої худоби, в Україні застосовують вакцину „Рипавак” проти інфекційного ринотрахеїту й парагрипу – 3 великої рогатої худоби (Кучерявенко Л.І. та співав., 2004). Інактивована вакцина проти вірусної діареї великої рогатої худоби знаходиться в стадії розробки (Годовский А.В., 2004). Зазначені вакцини індукують високий рівень накопичення у щеплених тварин специфічних вірусонейтралізуючих антитіл, однак схема їх почергового засто-сування для профілактики ІРТ та ВД збільшує витрати на профілактичні заходи.

Враховуючи дані відносно домінуючого останнім часом змішаного перебігу ІРТ та ВД, актуальною є проблема як з теоретичної, так і практичної точок зору розробка інактивованої бівакцини проти ІРТ і ВД, яку можна без обмежень застосовувати в господарствах для профілактики цих інфекцій великої рогатої худоби.

В той же час створення засобів специфічної профілактики ІРТ та ВД неможливе без відпрацювання технологічних процесів отримання вірусовмісної сировини для виготовлення біопрепарату, що залежить від властивостей штамів вірусу, клітинної тест-системи, умов їх культивування та інших факторів (Закутский Н.И., 1997).

Вирішенню цих актуальних завдань і присвячена наша робота.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану НДР ІЕКВМ УААН за завданнями: 05. (2001-2005 рр.) „Розробити та впровадити комплексну систему діагностики, терапії та профілактики інфекційних та незаразних хвороб жуйних тварин” (номер державної реєстрації 0101U001610), 05.01. „Розробити засоби і методи діагностики та специфічної профілактики вірусної діареї великої рогатої худоби” та 04. (2001-2005 рр.) „Розробити на основі прогресивних технологій ефективну систему діагностики, терапії та профілактики хвороб, спільних для різних видів тварин” (номер державної реєстрації 0101U001616).

Мета і завдання досліджень. Мета роботи - розробити технологію та вивчити властивості вакцини емульсійної інактивованої проти інфекційного ринотрахеїту та вірусної діареї великої рогатої худоби.

Основні завдання досліджень:

- розробити ефективну технологію накопичення вірусовміщуючої біомаси з використанням продуктивних ліній перещеплюваних клітин і штамів вірусів ІРТ та діареї;

- підібрати оптимальні способи очистки, концентрування та інактивації вірусів ІРТ та діареї;

- оцінити імуностимулюючу активність та реактогенність різних ад’ювантів у складі інактивованої вакцини проти ІРТ та ВД;

- вивчити властивості вакцини за показниками якості: стерильність, нешкідливість, реактогенність та імуногенна активність і визначити оптимальну дозу щеплення великої рогатої худоби;

- розробити нормативну документацію (технічні умови, інструкцію з виго-товлення й контролю та настанову з застосування) на вакцину емульсійну інактивовану проти інфекційного ринотрахеїту та вірусної діареї великої рогатої худоби.

Об’єкт дослідження: вірус інфекційного ринотрахеїту, вірус діареї, перещеплювані культури клітин, лабораторні тварини та велика рогата худоба.

Предмет дослідження: вакцина емульсійна інактивована проти інфекційного ринотрахеїту та вірусної діареї великої рогатої худоби. Технологія отримання і ефективність її застосування.

Методи дослідження: цитологічні, вірусологічні, серологічні, біохімічні, гематологічні та статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в Україні:

- створено бівакцину емульсійну інактивовану проти інфекційного ринотрахеїту та вірусної діареї великої рогатої худоби;

- розроблено ролерний спосіб культивування клітин і вірусів ІРТ та діареї, який дозволяє отримувати з високою інфекційною активністью вихідну вірусовміщуючу сировину для виготовлення вакцини без концентрування з застосуванням хімічних речовин;

- вивчено реактогенні та імуностимулюючі властивості бівакцини виготовленої на основі масляних і кремнійвміщуючих ад’ювантів, на лабораторних і сільськогосподарських тваринах.

Практичне значення отриманих результатів. Результати досліджень використані при розробці нормативної документації на вакцину емульсійну інактивовану проти інфекційного ринотрахеїту та вірусної діареї великої рогатої худоби (технічні умови, інструкція з виготовлення і контролю та настанова з застосування), яка розглянута й схвалена методичною комісією ІЕКВМ (протокол № 16 від 8 грудня 2004 року) та представлена в ДНКІБШМ для експертизи.

Запропонована технологія виготовлення вакцини на основі стабільних за властивостями виробничих штамів „Молдавський” та „ВК-1” вірусів ІРТ та діареї і ліній перещеплюваних клітин НВ і КСТ.

Зазначені розробки підтверджено патентами Україні №4626, №4432 від 1.01.2005 р. та висновком про видачу деклараційного патенту на штам перещеплюваних клітин нирки вівці РО-2/04, № 20040605098 від 20.01.2005 р.

Особистий внесок здобувача. Експериментальні дослідження, аналіз отриманих даних та їх узагальнення виконано дисертантом особисто. Біохімічні дослідження проводили спільно з співробітниками лабораторії біохімії
ІЕКВМ УААН Романько М.Є., Михайловою С.А., а гематологічні дослідження з науковим співробітником лабораторії повільних інфекцій ІЕКВМ УААН М’ягких Н.В.

Апробація результатів дисертації. Основні розділи дисертації доповідались і обговорювались на:

- засіданнях вченої ради й методичної комісії ІЕКВМ УААН в 2001 –
2004 рр.;

- всеукраїнській науковій конференції молодих вчених „Сучасні проблеми діагностики інфекційних хвороб тварин” (2 – 3 грудня 2003 р., м. Харків);

- міжнародній науково-практичній конференції „Актуальні проблеми ветеринарної медицини в умовах сучасного ведення тваринництва” (26 травня – 2 червня 2003р., АР Крим, м. Феодосія);

- міжнародній науково-практичній конференції „Ветеринарна медицини – 2004: сучасні аспекти розробки, маркетингу і виробництва ветеринарних препаратів” (24 – 31 травня 2004 р., АР Крим, м. Феодосія).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковані чотири наукові праці у фахових виданнях. Результати виконаної роботи захищені трьома патентами.

Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 132 сторінках комп’ютерного друку й складається з наступних розділів: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень, аналіз та узагальнення результатів досліджень, висновки, практичні пропозиції, список використаної літератури, додатки. Робота ілюстрована 17 таблицями, 13 рисунками. Список використаної літератури включає 184 найменування, у тому числі 70 іноземних.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дисертаційна робота виконана протягом 2001 - 2004 років в лабораторіях біотехнології і вірусології Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН та в дослідному господарстві „Елітне” Інституту рослинництва ім. Юр’єва УААН. Дослідження проводили на 100 білих мишах масою 18-20 г, 83 морських свинках масою 350-400 г, 855 головах ВРХ.

В лабораторних дослідах використовували: перещеплювані культури клітин нирки вівці (НВ), трахеї теляти (ТрТ), коронарних судин теляти (КСТ) та нирки новонародженого хом’ячка (ВНК-21/2-17); штам вірусу інфекційного ринотрахеїту „Молдавський”; штам вірусу діареї „ВК-1”, а також сироватки крові від лабораторних тварин і ВРХ.

Специфічні антитіла до вірусів ІРТ та діареї в сироватці крові досліджуваних тварин визначали в реакції нейтралізації (РН) за загальноприйнятим методом (Сюрин В.Н. та співавт, 1984) та мікрометодом за стандартом МЕБ (Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines, 2000).

Вихідну біомасу для виготовлення вакцини отримували культивуванням вірусів ІРТ та діареї у вирощених в бутлях моношарових перещеплюваних культурах клітин. Очистку вірусовміщуючої культуральної рідини від клітинного детриту здійснювали за методом природної седиментації (відстоювання) при 40 С впродовж 24 годин і центрифугування при 3000 об/хв на центрифузі MPW 340 (ротор до 4000) впродовж 25 – 30 хвилин. Кількість загального білка визначали за методом Лоурі (Фримель Г., 1987). Вірусовміщуючу рідину концентрували в діалізних мішках за допомогою 50% стерильного розчину ПЕГ-6000. Інактивацію вірусів здійснювали розчином формальдегіду або етиленіміну (в концентрації 0,1%) при температурі 370 С.

Імуногенну активність досліджуваного зразка вакцини оцінювали за приростом титрів специфічних антитіл до вірусів ІРТ та діареї в сироватці крові щепленої великої рогатої худоби за допомогою реакції нейтралізації. З цією метою відбирали сироватки крові до вакцинації, через 7, 25, 45, 60 та 120 діб після щеплення.

Оцінку стану клітинного імунітету за показниками фагоцитарної активності, фагоцитарного числа, кількості лейкоцитів та лейкоцитарної формули проводили за методом Чеботкевича В.Н., Лютинского С.И. (1998).

Визначення кількості імуноглобулінів класів M та G у сироватках крові ВРХ проводили за методом радіальної імунодифузії за Manchini G. (1970). Вміст загального білка в сироватці крові визначали за допомогою рефрактометра IRT – 22.

Визначення серомукоїдів у пробах сироваток крові проводили за методом Веймера та Мошина (Асатиани В.С., 1957), а циркулюючих імунних комплексів за методом Гриневича Ю.А. шляхом преципітації 3,5 % розчином поліетиленгликолю ПЕГ-тест ОЩ 280 (Меньшиков В.В. и др., 1987).

Обчислення та статистичну обробку результатів досліджень здійснювали за допомогою персонального комп’ютера в електронних таблицях Microsoft Excel XP professional, які входять до програмного пакету MS Office XP Professional.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Сучасний стан епізоотичної ситуації щодо ІРТ та ВД в Україні

З метою вивчення поширення ІРТ та ВД серед великої рогатої худоби в Україні нами було проведено дослідження сироваток крові від тварин різних вікових груп з семи областей України, при цьому визначали кількість серопозитивних тварин (табл. 1, 2).

Проведений аналіз показав, що найвищий рівень серопозитивності до вірусу ІРТ мають корови та молодняк 6-12 - місячного віку - 68,7-100 %. Нижчий рівень серопозитивності виявлено у телят 1 - 6 - місячного віку - 33,3 - 87,5 %. Відносно ситуації щодо ВД ми спостерігали таку ж закономірність. Максимальну кількість серопозитивних тварин виявлено серед корів та молодняка 6 – 12 - місячного віку – 52,0 – 100 %. У молодняка ВРХ 1 - 6 - місячного віку серопозитивність до ВД становила на рівні 42,5 – 86,7 %.

Дані таблиць 1 та 2 свідчать про високий рівень інфікованості стад як вірусом ІРТ, так і вірусом діареї ВРХ. Найвищий рівень серопозитивності великої рогатої худоби до вірусів ІРТ і діареї спостерігали в Рівненській області - 96,8 та 96,1 %, відповідно. Найнижчий рівень серопозитивності до вірусу ІРТ і діареї встановлено в Луганській області – 52,9 та 32,3 %, відповідно.

Таблиця 1

Серопозитивність до вірусу ІРТ великої рогатої худоби по деяким областям України, РН (2003-2004 рр.)

Область | Корови | Телята 1 - 6 – місячного віку | Молодняк 6-12 - місяців | Всього проб

всього

проб | позитивних | всього

проб | позитивних | всього проб | позитивних | всього

проб | позитивних

проб | % | проб | % | проб | % | проб | %

Харківська | 39 | 38 | 97,4 | 101 | 68 | 67,3 | 15 | 15 | 100,0 | 155 | 121 | 78,0

Полтавська | 74 | 72 | 97,3 | 17 | 14 | 82,3 | 20 | 14 | 70,0 | 111 | 100 | 90,0

Дніпро-петровська | 35 | 32 | 91,4 | 24 | 20 | 83,3 | - | - | - | 59 | 52 | 88,1

Донецька | 30 | 24 | 80,0 | 30 | 10 | 33,3 | 25 | 25 | 100,0 | 85 | 59 | 69,4

Рівненська | 22 | 22 | 100,0 | 16 | 14 | 87,5 | 25 | 25 | 100,0 | 63 | 61 | 96,8

Луганська | 16 | 11 | 68,7 | 18 | 7 | 38,8 | - | - | - | 34 | 18 | 52,9

Одеська | 34 | 25 | 73,5 | - | - | - | 28 | 23 | 82,1 | 62 | 48 | 77,4

Таким чином, наші дані свідчать про широку змішану інфікованість вірусами інфекційного ринотрахеїту та діареї великої рогатої худоби в обстежених господарствах різних регіонів України. Це спонукало нас до створення засобу специфічної профілактики ІРТ та ВД – інактивованої вакцини.

Таблиця 2

Серопозитивність до вірусу діареї великої рогатої худоби по деяким областям України, РН (2003-2004 рр.)

Область | Корови | Телята 1 - 6 – місячного віку | Молодняк 6-12 - місяців | Всього проб

всього

проб | позитивних | всього

проб | позитивних | всього

проб | позитивних | всього

проб | позитивних

проб | % | проб | % | проб | % | проб | %

Харківська | 48 | 25 | 52,0 | 101 | 43 | 42,5 | 15 | 15 | 100,0 | 164 | 83 | 50,6

Полтавська | 69 | 49 | 71,0 | 17 | 13 | 76,5 | 20 | 18 | 90,0 | 106 | 80 | 75,5

Дніпро-петровська | 35 | 25 | 71,4 | 24 | 14 | 58,3 | - | - | - | 59 | 39 | 66,1

Донецька | 15 | 15 | 100,0 | 25 | 13 | 52,0 | 15 | 12 | 80,0 | 55 | 40 | 72,7

Рівненська | 22 | 22 | 100,0 | 15 | 13 | 86,7 | 15 | 15 | 100,0 | 52 | 50 | 96,1

Луганська | 16 | 11 | 68,7 | 18 | 0 | 0 | - | - | - | 34 | 11 | 32,3

Одеська | 22 | 15 | 68,2 | - | - | - | 28 | 22 | 78,6 | 50 | 37 | 74,0

Вибір і оцінка клітинних систем для культивування вірусів ІРТ та діареї

З метою підбору чутливої клітинної системи для накопичення вірусів ІРТ та діареї з максимальним титром інфекційної активності були випробувані лінії перещеплюваних клітин трахеї теляти, нирки вівці, коронарних судин теляти, нирки сірійського хом’ячка (табл. 3).

Таблиця 3

Результати визначення інфекційної активності вірусів ІРТ та діареї на культурах перещеплюваних клітин (М±м, n=3)

Перещеп-лювана культура клітин | Титр інфекційної активності вірусів (lg ТЦД50/см3)

ІРТ | ВД

Послідовні пасажі вірусів

вихідний титр | 1 | 2 | 3 | вихідний титр | 1 | 2 | 3

ТрТ | 7,12

±0,14 | 7,37

±0,14 | 7,43

±0,12 | 7,5

±0 | 6,0

±0,2 | 6,0

±0,2 | 6,25

±0,28 | 6,56

±0,12

КСТ | 7,12

±0,14 | 7,12

±0,14 | 7,12

±0,14 | 7,12

±0,14 | 6,0

±0,2 | 6,75

±0,28 | 7,0

±0,28 | 7,5

±0*

НВ | 7,12

±0,14 | 7,75

±0,28 | 7,87

±0,14 | 8,06

±0,12* | 6,0

±0,2 | 6,0

±0,2 | 6,12

±0,14 | 6,31

±0,12

ВНК-21/2-17 | 7,12

±0,14 | 7,12

±0,14 | 7,12

±0,14 | 7,12

±0,14 | 6,0

±0,2 | 6,0

±0,2 | 6,0

±0,2 | 6,0

±0,2

* - різниця достовірна при р<0,01

У процесі трьох послідовних пасажів встановлено, що найбільш високу інфекційну активність вірусу ІРТ забезпечила перещеплювана культура клітин нирки вівці на рівні 8,06±0,12 lg ТЦД50/см3. Максимальний титр інфекційної активності вірусу діареї на рівні 7,5±0 lg ТЦД50/см3 отримано на перещеплюваній культурі клітин коронарних судин теляти. Отже, перещеплювані лінії культур клітин НВ й КСТ забезпечували оптимальну репродукцію вірусів ІРТ та діареї з максимальним титром інфекційної активності. На підставі цього вони використані нами в подальшій роботі в якості базових для отримання вірусної сировини.

Визначення ефективності способів культивування і концентрування вірусів ІРТ та діареї

У процесі розробки технології отримання вірусної біомаси нами вивчено ефективність різних способів культивування вірусів ІРТ та діареї. З цією метою випробували статичний та ролерний способи культивування клітин та вірусів (табл. 4).

Таблиця 4

Результати накопичення вірусів ІРТ та діареї в залежності від способу культивування (М±м, n=3)

Вірус | Культура клітин | Титр вірусу в залежності від способу культивування (lg ТЦД50/см3)

статичний | ролерний

ІРТ | нирка вівці | 8,06±0,12 | 9,25±0,28*

ВД | коронарні судини теляти | 7,5±0 | 8,56±0,12*

* - різниця достовірна при р<0,01

В результаті цих досліджень доведено, що ролерний спосіб культивування в бутлях ефективніший за статичний в матрасах. При ролерному культивуванні титр вірусу ІРТ був вищий на 1,19 lg ТЦД50/см3 і становив 9,25±0,28 lg ТЦД50/см3 у порівнянні зі статичним способом - 8,06±0,12 lg ТЦД50/см3. Титр інфекційної активності вірусу діареї при ролерному способі культивування збільшився на 1,06 lg ТЦД50/см3 і становив 8,56±0,12 lg ТЦД50/см3 у порівнянні зі статичним - 7,5±0 lg ТЦД50/см3.

При виборі оптимального методу концентрування антигенів вірусів ІРТ та діареї для виготовлення інактивованої вакцини ми провели порівняльний аналіз активності цих вірусів, отриманих при статичному й ролерному культивуванні, та концентруванні цих вірусовміщуючих суспензій за допомогою ПЕГ-6000. Так, статичний спосіб культивування вірусів ІРТ та діареї з наступним їх концентуванням за допомогою ПЕГ-6000 дозволив одержати антигени з титром інфекційної активності 9,06±0,12 та 8,43±0,12 lg ТЦД50/см3, відповідно. При ролерному культивуванні вірусів ІРТ та діареї їх титри в клітинно-культуральній біомасі становили 9,25±0,28 та 8,56±0,12 lg ТЦД50/см3, відповідно. Концентрування вірусовміщуючої рідини, отриманої при ролерному культивуванні, за допомогою ПЕГ забезпечило підвищення титрів вірусів ІРТ та діареї лише на 0,18 та 0,31 lg ТЦД50/см3, відповідно (9,43±0,12 та 8,87±0,25 lg ТЦД50/см3). Проте, при його використанні зменшувався кінцевий об’єм біомаси вірусів в 10 разів та ускладнювався технологічний процес виробництва вакцини.

На підставі отриманих даних подальше виготовлення антигенів вірусів ІРТ та діареї здійснювали за ролерним способом культивування, який виключає необхідність подальшого концентрування.

Відпрацювання способу очистки вірусів ІРТ та діареї від клітинного детриту

З метою відпрацювання оптимального способу очистки вірусовміщуючої суспензії вірусів ІРТ та діареї від клітинного детриту було випробувано метод природної седиментації і центрифугування, після чого визначали титр інфекційної активності вірусовміщуючої рідини та вміст загального білка за Лоурі (табл. 5).

Інфекційний титр вірусів ІРТ та діареї не змінювався в результаті очистки й становив 9,25±0,28 та 8,56±0,12 lg ТЦД50/см3, відповідно. В той же час ступінь звільнення суспензії вірусів ІРТ та діареї від баластного білка за методом природної седиментації становив 20,0 та 28,6 %, відповідно. Методом центрифугування вірусів ІРТ та діареї ступінь очистки досягав 42,4 та 46,0 %, відповідно. На підставі проведених досліджень нами встановлено, що оптимальним методом очистки суспензії вірусів ІРТ та діареї для виготовлення вакцини є метод центрифугування.

Таблиця 5

Результати очистки вірусів ІРТ та діареї (М±м, n=3)

Спосіб очистки | Титр інфекційної активності (lg ТЦД50/см3) | Кількість білка ( мг/см3) | Ступінь очистки (%)

ІРТ | ВД | ІРТ | ВД | ІРТ | ВД

до очистки | після очистки | до очистки | після очистки | до очистки | після очистки | до очистки | після очистки

Природня седиментація | 9,25

±0,28 | 9,25

±0,28 | 8,56

±0,12 | 8,56

±0,12 | 0,85

±0,05 | 0,68

±0,03* | 0,98

±0,04 | 0,70

±0,05* | 20,0 | 28,6

Центрифу

гування | 9,25

±0,28 | 9,25

±0,28 | 8,56

±0,12 | 8,56

±0,12 | 0,85

±0,05 | 0,49

±0,02* | 0,98

±0,04 | 0,53

±0,04* | 42,4 | 46,0

* - різниця достовірна при р<0,05

Підбір ад’юванта при конструюванні інактивованої вакцини

проти ІРТ та ВД

Імунна відповідь при щепленні інактивованими вакцинами в значній мірі залежить від ад’юванта, який входить до їх складу. При конструюванні інактивованої вакцини проти ІРТ та ВД ми випробували в порівняльному аспекті декілька типів ад’ювантів у складі імунізуючого препарату за здатністю потенціювати імунну відповідь: гідроокис алюмінію (ГОА), кремнієву емульсію (КЕ 10-01) та масляні ад’юванти фірми Seppic: Montanide ISA 25, ISA 27, ISA 50, ISA 70, ISA 206.

Виготовлені зразки вакцини на основі цих ад’ювантів були стерильними і нешкідливими для лабораторних тварин та мали незначні реактогенні власти-вості. Так, при їх введенні морським свинкам спостерігали утворення невеликих пухлин розміром до 1 х 1 см2, які зникали впродовж наступних 7 – 10 діб.

Що стосується антигенних властивостей, які вивчали за титром вірусонейтралізуючих антитіл, всі дослідні зразки вакцини вже через 7 діб після введення індукували утворення специфічних антитіл до вірусів ІРТ та діареї
(рис. 1, 2).

Найбільш високий рівень антитіл проти ІРТ через 7 діб після щеплення забезпечували зразки вакцини з ад’ювантом Montanide ISA 70 та Montanide ISA 206 (6,0 log2), а найменший – з ад’ювантом КЕ 10-01 (4,0 log2). На 21 добу відмічали збільшення титру антитіл до 7,3 log2 (зразок з ГОА) і 7,0 log2 (зразки з Montanide ISA 25, 70 і 206). На 35 добу після щеплення рівень антитіл до вірусу ІРТ збільшився ще на 0,8 log2 (до 7,8 log2) – зразок вакцини з Montanide ISA 70 та зменшився на 3,1 log2 (до 4,2 log2) – зразок вакцини з гідроокисом алюмінію проти аналогічних показників на 21 добу. Всі інші дослідні зразки вакцини індукували утворення антитіл проти вірусу ІРТ в межах 6,2 – 7,0 log2. Через 60 діб специфічні антитіла до вірусу ІРТ спостерігали практично на тому ж рівні.

Що стосується динаміки формування специфічних антитіл до вірусу діареї (рис. 2), то на 7 добу титр нейтралізуючих антитіл у морських свинок, щеплених зразком вакцини з ГОА, становив лише 5,0 log2 на відміну від зразка з ад’ювантом Montanide ISA 70 - 9,0 log2. На 21 добу спостерігали зростання титру антитіл від 7,0 log2 (ГОА) до 9,5 log2 (Montanide ISA 70). Через 35 діб рівень антитіл до вірусу діареї збільшився на 1,3 log2 (8,9 log2) при використанні зразків з ад’ювантами Montanide ISA 27 і КЕ 10-01, на 0,7 log2 - Montanide ISA 50 та зменшився на 1,7 і 1,5 log2 (7,5-7,3 log2) при введенні зразків вакцини з Montanide ISA 206 і 25, відповідно.

На 60 добу спостерігали подальше зростання титрів антитіл до вірусу діареї (на 1,7 log2) під впливом вакцини з ад’ювантом Montanide ISA 70.

Таким чином, було показано, що виготовлені з використанням вище вказаних ад’ювантів зразки інактивованої вакцини проти ІРТ та ВД стерильні, нешкідливі для білих мишей, слабо реактогенні для морських свинок, проте мають різну антигенну активність. Так, зразок вакцини з ГОА мав саму низьку імуностимулюючу активність. Серед зразків вакцини з масляними ад’ювантами фірми Seppic найбільш виражена імуностимулююча активність відмічена у зразка з Montanide ISA 70. Після введення морським свинкам цього зразка вакцини вже через 7 діб виявляли високі титри вірусонейтралізуючих антитіл проти вірусів ІРТ та діареї на рівні 6,0 і 9,0 log2, відповідно. Крім цього, встановлена висока пролонгуюча властивість цього ад’юванта, що проявлялось наростанням титру нейтралізуючих антитіл до вірусів ІРТ та діареї на 35 добу після введення, з послідуючим їх утриманням на високому рівні до 60 діб (термін спостереження). На підставі цих результатів у подальшому в якості ад’юванту при виготовленні інактивованої вакцини проти ІРТ та ВД використовували Montanide ISA 70.

Визначення оптимальної імунізуючої дози вакцини емульсійної інактивованої проти ІРТ та ВД для щеплення ВРХ

Оптимальну імунізуючу дозу вакцини емульсійної інактивованої проти ІРТ та ВД визначали в дослідах на великій рогатій худобі. Для цього піддослідних корів щепили вакциною у дозі 5, 7 і 10 см3, а телят – 3, 5 і 7 см3.

Як свідчать результати цих досліджень, індукція вірусонейтралізуючих антитіл проти вірусів ІРТ та діареї залежала від дози щеплення (рис. 3, 4).

Початковий титр антитіл у телят становив 2,22 – 3,0 log2 до вірусу ІРТ та 2,33 – 2,5 log2 до вірусу діареї. Вже на 7 добу після щеплення ми спостерігали індукцію вірусонейтралізуючих антитіл на рівні 3,44 – 3,77 log2 до ІРТ та 6,83 – 7,33 log2 до ВД, в порівнянні з контролем – 2,0 і 3,33 log2, відповідно. Як видно, на початку імунізації доза щеплення суттєво не впливала на приріст антитіл проти цих вірусів, проте на 25 добу після вакцинації спостерігали підйом титру вірусонейтралізуючих антитіл у залежності від дози введеного препарату. Так, титр антитіл до вірусу ІРТ становив 5,0; 6,0 і 6,5 log2 та 7,8; 7,8 і 8,0 log2 до ВД при щепленні вакциною відповідно в дозі 3, 5 та 7 см3. На 45 добу рівень ВН - антитіл проти ІРТ значно збільшився при щепленні 5 см3 і досягав 7,6 log2, з послідуючою стабілізацією цього показника на 60 та 120 добу після вакцинації.

При щепленні 3 см3 титр антитіл до вірусу ІРТ на 45 добу підвищився на 1,4 log2 (6,4 log2), а у щеплених тварин вакциною в дозі 7 см3 в цей час рівень антитіл зменшився на 0,5 log2 (6,0 log2). На 60 та 120 добу після імунізації при застосуванні доз препарату об’ємом 7 см3 і 3 см3 спостерігали повільне зниження рівня антитіл до вірусу ІРТ відповідно до 4,75 – 4,54 log2 та 4,6 – 4,8 log2.

Вивчення динаміки ВН - антитіл у телят до вірусу діареї свідчить, що на 45 добу максимальні титри накопичення антитіл на рівні 9,5 – 9,33 log2 виявлені у тварин, щеплених вакциною в дозах 3 та 5 см3, відповідно. Проте, на 60 добу під впливом цих доз спостерігали зниження титру антитіл до 8,18 – 8,33 log2, відповідно. В подальших дослідженнях на 120 добу після імунізації максимальний титр антитіл до ВД зберігався при дозі щеплення об’ємом 5 см3 і становив 8,14 log2, а при дозі 3 см3 дещо знижувався до 7,5 log2. Доза вакцини об’ємом 7 см3 індукувала менший приріст антитіл до ВД на 45 добу після щеплення (8,66 log2), який в подальшому на 60 та 120 добу поступово знижувався до 7,75 – 7,0 log2.

Таким чином, аналізуючи дані з підбору оптимальної дози щеплення телят вакциною емульсійною інактивованою проти ІРТ та ВД, можна зробити висновок, що щепна доза об’ємом 5 см3 забезпечує у них максимальний рівень накопичення нейтралізуючих антитіл до цих вірусів і є оптимальною.

На рисунку 5 та 6 зображена динаміка вірусонейтралізуючих антитіл проти ІРТ та ВД у корів в залежності від дози щеплення. В зв’язку з тим, що дослідне господарство „Елітне” є стаціонарно неблагополучним щодо цих інфекцій, початкові титри ВН – антитіл до ІРТ та ВД у них знаходились на рівні 4,0 – 5,0 та 4,6 – 4,9 log2, відповідно. Через 7 діб після щеплення незалежно від дози вакцини спостерігали підйом антитіл до вірусу ІРТ та діареї до 6,0 – 6,5 log2 та 5,0 – 5,2 log2, відповідно. Титр ВН – антитіл до цих вірусів зростав до 45 доби, причому, його максимальний рівень виявляли у корів, щеплених вакциною в дозах 10 та 7 см3. Так, титр ВН – антитіл до вірусу ІРТ при щепленні корів дозою 10 та 7 см3 на 25 добу становив відповідно 7,4 та 7,33 log2, на 45 добу – 7,25 log2, а до ВД відповідно на рівні 5,4 – 5,14 log2 на 25 добу та 7,25 log2 на 45 добу. Титри антитіл до ІРТ та ВД, індуковані дозою 5 см3 вакцини, були на рівні 7.0 та 5,0 – 6,0 log2, відповідно. Починаючи з 60 доби, відмічали зниження титрів антитіл до вірусів ІРТ та діареї. Так, титр антитіл до вірусу ІРТ на 60 та 120 добу становив 6,42 – 6,0 log2 (10 см3); 6,1 – 6,0 log2 (7 см3) та 6,0 – 5,5 log2 (5 см3). Титри антитіл до ВД на 60 та 120 добу знаходились на рівні 6,12 – 5,8 log2 (10 см3); 6,12 – 6,0 log2 (7 см3) та 5,5 – 5,4 log2 (5 см3).

На підставі отриманих даних, за індукцією ВН - антитіл до вірусів ІРТ та діареї, визначена оптимальна доза щеплення корів в об’ємі 7 см3.

Поряд з цим у щеплених дослідною вакциною корів встановлено поступове зростання фагоцитарної активності, яка досягала на 45 добу після імунізації максимального статистично достовірного рівня. Причому, підвищення цього показника не залежало від дози щеплення. На 60 – 120 добу він знижувався, проте залишався вищим у порівнянні з контролем. Фагоцитарне число впродовж терміну спостереження маятникоподібно змінювалось, находячись при цьому на достатньо високому рівні. Це свідчить, що імунізація корів вакциною емульсійною інактивованою проти ІРТ та ВД стимулює фагоцитоз.

У телят після щеплення вакциною емульсійною інактивованою проти ІРТ та ВД через 25 діб збільшувалась фагоцитарна активність нейтрофілів крові. В цей час показник фагоцитарної активності досягав максимального рівня у телят, щеплених 3 та 5 см3 вакцини, підвищуючись на 85,35 – 88,38 % (р<0,05), відповідно. На 45 добу після щеплення показники фагоцитарної активності зменшились в усіх дослідних групах. На 60 добу спостерігали повторний їх підйом.

Отже, на підставі отриманих даних ми зробили висновок, що щеплення великої рогатої худоби вакциною емульсійною інактивованою проти ІРТ та ВД стимулює не тільки специфічні фактори імунітету, а й неспецифічні.

За результатами проведених досліджень нами розроблена нормативна документація на вакцину емульсійну інактивовану проти ІРТ та ВД, що розглянута і схвалена методичною комісією ІЕКВМ (протокол № 16 від 9 грудня 2004 року) та представлена в ДНКІБШМ для експертизи.

ВИСНОВКИ

1. За результатами визначення цитоморфологічних характеристик та мітотичних змін інфікованої культури клітин виробничими штамами вірусів інфекційного ринотрахеїту та діареї, вибору клітинних систем, а також вивчення ефективності способів накопичення їх біомаси, очистки, інактивації та підбору ад’юванта вперше розроблена технологія і створена емульсійна інактивована вакцина проти ІРТ та ВД великої рогатої худоби, визначені властивості вакцини за показниками якості (стерильність, нешкідливість, реактогенність, антигенна та імуногенна активність).

2. Встановлено, що чутливою клітинною системою для отримання біомаси вірусів ІРТ та діареї для виготовлення вакцини є культури перещеплюваних клітин нирки вівці й коронарних судин теляти, на яких титр інфекційності складає 8,06±0,12 lg ТЦД50/см3 та 7,5±0 lg ТЦД50/см3, відповідно.

3. Застосування ролерного способу культивування забезпечує накопичення біомаси вірусів ІРТ та діареї з титром інфекційності 9,25 та 8,56 lg ТЦД50/см3, що на 1,19 lg ТЦД50/см3 та 1,06 lg ТЦД50/см3, відповідно, вище у порівнянні зі статичним і виключає процес концентрування за допомогою ПЕГ.

4. Оптимальним методом очистки біомаси вірусів ІРТ та діареї є низькошвідкісне центрифугування, що дозволяє отримати очищений від баластного білка вірусний матеріал на 42,4 % та 46,0 %, відповідно.

5. Імунна відповідь на інактивовані формальдегідом та етиленіміном антигени вірусів ІРТ та діареї не залежить від використаного інактиватора і досягає рівня специфічних антитіл 5,6 – 6,0 log2 та 8,0 – 7,66 log2, відповідно.

6. Встановлено, що ад’ювант Montanide ISA 70 у складі вакцини інактивованої проти ІРТ та ВД має найбільш виражені імуностимулюючі та пролонгуючі властивості, забезпечує індукцію вірусонейтралізуючих антитіл в організмі щеплених вакциною тварин на 2,0 - 2,5 log2 вище в порівнянні з КЕ 10-01 і ГОА та 1,0 - 1,5 log2 – з масляними ад’ювантами ISA 25, 27, 50 та 206.

7. Розроблена вакцина емульсійна інактивована проти ІРТ та ВД стерильна, нешкідлива, імуногенна й екологічно безпечна, викликає активну індукцію вірусоспецифічних антитіл, які виявляються з 7 доби, набувають максимального значення на 25 добу у корів та 45 добу у телят після щеплення і утримуються впродовж 120 діб (термін спостереження).

8. Імунізація великої рогатої худоби вакциною емульсійною інактивованою проти ІРТ та ВД в залежності від дози щеплення підвищує фагоцитарну активність нейтрофілів у корів від 8,5 % до 11,1 %, у телят від 0,6 % до 10,2 %; кількість загального білка у корів від 4,7 % до 17,5 %, у телят від 14 % до 19,5 %; концентрацію імуноглобулінів класу G у корів від 13,7 % до 15,9 %, у телят від 15,3 % до 16,2 %; концентрацію імуноглобулінів класу М у корів від
14 % до 26,3 %, у телят від 28,1 % до 36,6 %.

9. Вакцина емульсійна інактивована проти інфекційного ринотрахеїту та вірусної діареї при щепленні телят і корів в дозах 5 і 7 см3, відповідно, забезпечує створення високого рівня специфічного імунітету проти обох вірусних інфекцій (7,0 – 9,0 log2), що має важливе протиепізоотичне значення у боротьбі з цими захворюваннями.

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

Розроблено та запропоновано для ветеринарної медицини:

1. Нормативна документація на виготовлення, контроль і застосування вакцини емульсійної інактивованої проти інфекційного ринотрахеїту та вірусної діареї великої рогатої худоби, яка схвалена методичною комісією ІЕКВМ (протокол № 16 від 8.12.2004) та направлена в ДНКІБШМ на експертизу.

2. Технологію виготовлення вакцини емульсійної інактивованої проти інфекційного ринотрахеїту та вірусної діареї великої рогатої худоби, яка може бути впроваджена у біотехнологічне виробництво.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Цитогенетические изменения в перевиваемой культуре клеток, вызванные действием вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота / В.С. Белоконь, В.И. Стеценко, В.В. Кучерявенко, А.А. Лаврик // Вет. медицина: Міжвід. темат. наук. зб.– Х, 2003. – Вип. 81. – С. 51–59. (Дисертант особисто провів експериментальні дослідження з визначення цитогенетичних показників культури клітин, інфікованої вірусом інфекційного ринотрахеїту).

2. Епізоотична ситуація щодо інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби / В.І. Стеценко, Л.І. Кучерявенко, Н.П. Чечоткіна, Ю.С. Голуб,
Р.О. Кучерявенко, Л.П. Тризна, В.В. Кучерявенко, Л.Н. Покусай, В.О. Бусол // Вет. медицина: Міжвід. темат. наук. зб. – Х., 2003. – Вип. 82. – С. 585–589. (Дисертантом проведено дослідження сироваток крові великої рогатої худоби на наявність специфічних антитіл до вірусу ІРТ).

3. Кучерявенко В.В. Особенности цитопатогенного действия вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи в перевиваемой культуре клеток трахеи теленка // Вет. медицина: Міжвід. темат. наук. зб. – Х., 2004. –Вип. 83. – С. 141–146.

4. Сравнительная оценка иммуногенной активности образцов инактивированной бивакцины против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота, изготовленных на основе различных адъювантов / В.В.