ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О. В. ПАЛЛАДІНА

ЛЕВКОВЕЦЬ Інна Андріївна

УДК 577.336 : 595.324 : 576.851.315 : 628.8 : 517.17

РОЗРОБКА ІНСТРУМЕНТАЛЬНИХ АНАЛІТИЧНИХ БІОТЕСТІВ ТА ВИВЧЕННЯ ЇХНІХ ОСНОВНИХ ХАРАКТЕРИСТИК ПРИ ВИЗНАЧЕННІ ТОКСИЧНОСТІ ОБ’ЄКТІВ ДОВКІЛЛЯ

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор

Стародуб Микола Федорович,

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна

НАН України, головний науковий співробітник.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Дмитренко Микола Петрович,

Інститут екогігієни та токсикології

ім. Л. І. Медведя МОЗ України,

завідувач лабораторії біохімії;

кандидат біологічних наук

Грузіна Тамара Григорієвна,

Інститут біоколоїдної хімії

ім. Ф. Д. Овчаренка НАН України,

старший науковий співробітник відділу

колоїдних технологій природних систем.

Провідна установа – Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН

України, відділ структури і функції білків та пептидів

Захист відбудеться “4” квітня 2005 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (01601, м. Київ – 30, вул. Леонтовича 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О. В. Палладіна НАН України (м. Київ, вул. Леонтовича 9).

Автореферат розісланий “3” березня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Кірсенко О. В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Контроль наявності токсичних речовин у навколишньому середовищі набуває особливої актуальності у зв’язку з підвищеним надходженням до нього відходів, пестицидів та ядохімікатів, які створюють в кінцевому результаті загрозу здоров’ю людини. Існуючі на даний час підходи, як правило, основані на традиційних методах аналітичної хімії та на використанні різних варіантів хроматографії, масспектроскопії та інших. Поряд з певними перевагами вони мають недоліки та обмеження, оскільки базуються лише на фізичних та хімічних принципах. Останнє, найчастіше, і визначає трудомісткість і дорожнечу методів аналізу, недостатню їх чутливість та невідповідність вимогам, що висуваються при оцінці екологічної ситуації. Одним із загальних обмежень традиційних методів є, в ряді випадків, неможливість визначення метаболічних фізіологічно активних форм речовин. Крім того, більшість стічних вод промислового та сільськогосподарського походження має складний та непостійний вміст, а продукти розпаду і взаємодії в стічних водах окремих хімічних речовин можуть бути більш токсичними, ніж вихідні речовини, що аналізуються. У таких випадках встановити ступінь впливу стічних вод на біоценози водних об’єктів, базуючись лише на інформації про відповідність концентрацій окремих компонентів гранично допустимим нормам, практично неможливо. Підвищення інформативності та достовірності аналітичного контролю загального забруднення об’єктів довкілля може бути забезпечено лише на основі використання живих організмів як індикаторів. Для цього розроблено ряд біологічних тестів, але вони загалом є досить рутинними, довготривалими, і тому сьогодні постає проблема їх переводу на основу інструментального аналізу, що базується на принципах біосенсорики.

Біологічні тест-методи, як правило, використовують до проведення хімічного аналізу, тому що ці методи дозволяють дати експрес-оцінку навколишнього середовища і виявити, так звані, “гарячі точки”, які вказують на найбільш забруднені ділянки. При виявленні даними методами будь-яких відхилень досліджуване середовище характеризують як токсичне, після чого аналітичним шляхом необхідно встановлювати причини токсичності.

Оскільки методами біотестування з використанням живих організмів можна визначати лише загальну токсичність, то наступним кроком є впровадження нових експресних аналітичних методів для визначення індивідуальних представників токсичних речовин, що в поєднанні з біологічними методами дає повну картину стану забрудненості об’єктів довкілля. Основою для створення таких пристроїв як с позицій чутливості і селективності аналізу, так і відносно простоти, експресності і дешевизни його виконання можуть стати оптичні імуносенсори.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась в рамках наукової тематики відділу біохімії сенсорних і регуляторних систем Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна: “Створення наукових основ експресної доклінічної біохімічної діагностики і моніторингу довкілля з використанням селективних взаємодій біомолекул та біосенсорної технології”, № держреєстрації 01974004371 та “Пошук шляхів направленого упорядкування селективних біологічних структур для підвищення ефективності біосенсорних елементів”, № держреєстрації 0102V006218, а також "Зворотний біосенсорний контроль очистки стічних вод: фотоокислення з наступною деградацією, використовуючи високоефективні бактерії-деструктори детергентів”, Проект ICA2-1999-10017, Контракт № ICA2-CT-2000-10033.

Мета та завдання дослідження. Мета роботи – розробка експресних методів біотестування на основі активованої хемілюмінесценції (ХЛ) екзометаболітів дафній та біолюмінесценції (БЛ) бактерій для оцінки загальної токсичності об’єктів довкілля та оптичного імунного біосенсору для визначення індивідуальних токсикантів.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі задачі:

1.

2.

3.

4.

5.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчено здатність до активованої ХЛ екзометаболітів культурального середовища дафній. Досліджено вплив різних токсичних речовин на характер та інтенсивність активованої ХЛ. За допомогою методів біотестування на основі активованої ХЛ та бактеріальної БЛ встановлено оптимальні параметри окислювальної обробки ПАР для подальшої їх біосорбції. Вперше вивчено оптимальні характеристики нового оптичного імуносенсору на основі OWLS для аналітичного визначення гербіциду трифлюраліну, з порогом чутливості до 1 пг/мл.

Практичне значення одержаних результатів. Для практичного використання запропоновано новий інструментальний аналітичний тест для визначення загальної токсичності об’єктів довкілля на основі визначення рівня екзометаболітів культурального середовища дафній. Базуючись на отриманих даних, можна стверджувати, що він характеризується багатьма перевагами порівняно з відомими на сьогодні традиційними методами. Підібрано умови застосування представлених біотестів на основі дафній та БЛ бактерій для контролю загальної токсичності води на різних етапах її очистки. Розроблені методики дають можливість експресного та дешевого проведення аналізу з визначення загальної токсичності об’єктів довкілля. Запропонований оптичний імунний біосенсор дозволяє ефективно здійснювати контроль індивідуальних токсикантів. Поєднання представлених біотестів з розробленим оптичним імуносенсором забезпечить на практиці повний аналіз токсичності об’єктів довкілля.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Головну ідею роботи та напрям досліджень було запропоновано науковим керівником, а її практичне втілення належить здобувачу. Автором дисертаційної роботи самостійно здійснено аналіз літератури, проведено біохімічні дослідження, виконано статистичну обробку отриманих результатів та підготовлено статті до публікації. Разом з керівником представлено експериментальний матеріал на наукових семінарах та конференціях. Аналіз результатів, їх узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків проведено особисто автором. Біолюмінесцентні бактерії були отримані від співробітника Таврійського медичного університету ім. Георгієвського к.х.н. Кацева А. М. Окислювальна обробка ПАР та адсорбційно-біосорбційна доочистка була виконана співробітниками Інституту колоїдної хімії та хімії води ім. А. В. Думанського НАН України за участю проф. Клименко Н. А. та к.х.н. Вакуленко О. Ф. Розробка оптичного імуносенсору проведена на базі Інституту захисту рослин АН Угорщини за координаційною участю д.х.н. Секача А. та співробітників Центрального інституту досліджень харчових технологій Угорщини к.х.н. Вараді М. та Адані Н. OWLS-інструмент був люб’язно предоставлений директором угорської фірми Microvacuum Ltd, головним інженером Сендрьо І. Весь експериментальний матеріал отримано дисертантом.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які викладено в дисертації, були представлені на таких міжнародних наукових форумах: 61-му семінарі міжнародного кібернетичного центру “Горизонти біохімічної сенсорики в ХХІ столітті” (Варшава, 2001); Conference on Cellular Engineering (Aachen, 2001); NATO Advanced Research Workshop “Frontiers in molecular-scale science and technology of fullerene, nanotube, nanosilicon, biopolymer (DNA, protein) multifunctional nanosystems (Kiev, 2001); Fiber Optic Sensor Technology and Applications, 2001; SPIE International Symposium on Environmental and Industrial Sensing and Intelligent Systems and Advanced Manufacturing, 28 October –2 November, Boston, USA, 2001; IX Mediterranean Conference on Medical and Biological Engineering and Computing, MEDICON 2001. Pula, Croatia June 12-15, 2001; 10th ISSP & Workshop “Solubility phenomena”, 21-26 July 2002, St. Constantine Resort, Varna, Bulgaria, 2002; The fourth international conference on mashine automation, ICMA’02 (Tampere, 2002, Finland); “Czujniki optoelektroniczne i electroniczne” (Azeszбw, 2002); 10th ISSP & Workshop “Solubility phenomena”, 21-26 July 2002, St. Constantine Resort, Varna, Bulgaria, 2002; VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); 49th Plant Protection Days (Budapest, 2003); NATO ASI “Molecular electronics: Bio-sensors and Bio-computers”, 2003; 7th Int. HCH & Pesticides Forum (Kiev, 2003); на міжінститутському семінарі "Сучасні проблеми біотехнології, біосенсорики і біомедичної оптики" (Київ, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи надруковано 6 статей і 6 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 109 сторінках друкованого тексту. Робота складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини (матеріали та методи, результати та їх обговорення), висновків, списку використаних джерел, який містить 146 посилань. Робота проілюстрована 27 рисунками, 7 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури вісвітлено сучасні принципи визначення загальної токсичності об’єктів довкілля за допомогою біологічних тест-методів. Представлено відомості щодо використання різних біологічних об’єктів для біотестування, зокрема дафній та біолюмінесцентних бактерій. Розглянуто сучасні підходи до застосування оптичних імуносенсорів для визначення індивідуальних представників токсичних речовин.

Матеріали та методи досліджень. В дослідах використовували рачки Daphnia magna Straus (Cladocera, Daphnia), що мешкали в стандартних умовах. В експеримент відбирали дафній віком не більше 24 годин, яких вміщували в склянки з 10 мл культурального середовища та інкубували їх в термостаті при 28С протягом 30 хв – 24 годин (в залежності від мети експерименту). У дослідах і контролі проводили по три паралельних визначення. Спонтанну ХЛ інкубаційного середовища дафній реєстрували при додаванні 50 мкл 0,2 мМ розчину люмінолу в 50 мМ трис-буфері (рН 8,5) до 500 мкл середовища, збуджену ХЛ – при додаванні по 50 мкл 0,2 мМ люмінолу та 1% розчину пероксиду водню до 500 мкл середовища. Для підсилення активованої ХЛ в 500 мкл середовища поступово вносили по 50 мкл люмінолу, п-йодфенолу та 1% пероксиду водню.

З метою одержання та обробки інформації щодо інтенсивності ХЛ середовища інкубування дафній використовували хемілюмінометер ХМЛ-3, що включав: блок підсилення сигналу на базі ФЕП-176; блок подачі хімічних реагентів до досліджуваних зразків; блок управління, де застосовується цифрове мікропроцесорне оброблення сигналів, що дозволяє максимально автоматизувати процес. Для реєстрації сигналів використовували персональний комп’ютер, який підключали до ФЕП через інтерфейс.

Біолюмінесцентні бактерії культивували протягом 16 – 18 годин в колбах при постійному перемішуванні при температурі 18 – 20С на середовищі наступного складу: пептон – 5 г/л; екстракт дріжджів – 5 г/л; 0,51 М NaCl; 0,05 М K2HPO47H2O; 4 мМ (NH4)2HPO4; 0,4 мМ MgSO47H2O; 2 мМ CaCO3, гліцерол – 3 мг/л. Для аналізу токсичності ПАР в кюветі люмінометру БЛМ-8801 (СКТБ “Наука”, Росія) змішували 0,8 мл розчину ПАР в 2,5% розчині NaCl, 100 мкл 0,5 М фосфатного (рН 7,0) або фосфатно-цитратного буферного розчину (рН 5,5), а також 200 мкл бактеріальної суспензії, яка містила 5·105 клітин/мл. Реєстрували зміну інтенсивності (I) БЛ протягом 30 – 120 хв при різних концентраціях ПАР. Рівень токсичності виражали у вигляді концентрації ПАР, що викликає 50% зниження інтенсивності БЛ суспензії біолюмінесцентних бактерій – ЕК50 (ефективна концентрація). Рівень БЛ бактерій в 2,5% розчині NaCl в присутності відповідного буферного розчину приймали за 100%.

Концентрацію неіоногенних поверхнево-активних речовин (НПАР) контролювали спектрофотометричним методом із застосуванням фосформолібденової кислоти (ФМК), а концентрацію аніонних ПАР визначали фотометричним методом по реакції комплексоутворення з метиленовим синім (МС). Зміну оптичної густини смуги поглинання вихідної сполуки спостерігали в УФ-області (А224, А225). УФ-спектри реєстрували на приладі SPECORD UV-VIS.

Розчини оксиетильованого нонілфенолу (ОП-10) з початковою концентрацією 50 ± 3 мг/л у дистильованій воді без регулювання рН (рН0 5,9 – 6,2) та після підлужування (рН0 8,4 – 9,3), а також у пом’якшеній водопровідній воді (рН0 7,7 – 7,8), обробляли озоном, УФ-опроміненням або озоном з одночасним УФ-опроміненням на лабораторному обладнанні в реакторі фотоозонування барботажного типу з оргскла (V ~ 11 дм3). Джерело УФ-випромінювання (лампа ДРБ-15) у кварцовому кожусі занурювали в розчин, що піддавався обробці. Реактор був обладнаний системою для циркуляції (0,6 л/хв) розчину, що обробляється для змивання піни в розчин. Озонатор продуктивністю 1 г О3/годину забезпечував концентрацію О3 в озоно-повітряній суміші (ОПС), рівну 18 – 32 мг/л, при швидкості подачі ОПС в реактор – 0,08 – 0,11 л/хв. Інтенсивність УФ-опромінювання дорівнювала 0,5 – 0,64 Вт/л.

Концентрацію озону в ОПС контролювали йодометричним методом, об’єм ОПС – за допомогою газового лічильника (ГСБ-400). Дозу поглинутого озону визначали за рівнянням матеріального балансу озону в газовій фазі на вході та виході з реактора. Концентрацію розчиненого озону в пробах ОП-10 після обробки О3 та О3/УФ визначали за реакцією з індигокарміном, вміст пероксиду водню – за реакцією з сульфатом титану (IV) в сірчаній кислоті через 24 годин після озонування або О3/УФ-обробки розчину ОП-10.

Адсорбційно-біосорбційну доочистку розчину ПАР проводили шляхом його фільтрації через дві послідовно з’єднані колонки, заповнені активним вугіллям. У першій колонці використовували неінфіковане активне вугілля, в другій – вугілля з іммобілізованими бактеріями – деструкторами ПАР роду Pseudomonas. Швидкість фільтрування складала 0,5 м/годину, тривалість контакту розчину з вугіллям – 30 –100 хв.

Розробка оптичного імуносенсору була виконана за допомогою приладу OWLS 100, який контролюється програмою Biosense. Для формування функціонального аміношару на поверхні перетворювача застосовували метод силанізації з використанням водного розчину -амінопропілтриетоксисилану (АПТС). З цією метою, спочатку чипи очищали шляхом занурення їх у хромову кислоту на 15 хв, з наступним промиванням дистильованою водою. Гідратація поверхні досягалася витримуванням чипів у гарячій (90С) дистильованій воді протягом однієї години. Формування аміногруп проводили у 10% розчині АПТС (рН 3,5 доведений 1 М НСl) при 75С протягом 5 годин. Потім чипи промивали дистильованою водою та залишали на ніч при 100С, після чого їх зберігали при кімнатній температурі в ексикаторі. Подальшу модифікацію аміногруп на поверхні чипу проводили двома шляхами. Перший – за допомогою 2,5% розчину ГА, другий шлях проходив у два етапи: спочатку застосовували сукциновий ангідрид для утворення карбоксильних груп на поверхні чипу, потім проводили активацію їх за допомогою N-гідроксисукциніміду та 1-етил-3-(3-диметиламінопропіл)карбодиіміду (N-ГС/EДК).

Отриманий цифровий матеріал був статистично оброблений за допомогою комп’ютерної програми Microsoft Excel.

Результати досліджень та їх обговорення

1. Хемілюмінесценція середовища культивування дафній та оптимізація умов її визначення. Встановлено, що в середовищі культивування дафній не спостерігається спонтанна ХЛ, яку можна зареєструвати приладом з чутливістю на рівні 1·105 квантів/с. Додавання до цього середовища люмінолу не впливає на інтенсивність його свічення. Разом с тим виявилось, що при додаванні в середовище пероксиду водню в присутності люмінолу відмічається поява ХЛ. При цьому найбільший рівень її відмічається в присутності 1,6·10-2 мМ розчину люмінолу (рис. 1).

Було підібрано оптимальну кількість пероксиду водню, здатну індукувати максимальний рівень ХЛ середовища. Встановлено, що вона складає 23 мМ (рис. 2).

Представлялось доцільним вияснити, чи є у складі екзометаболітів дафній фермент, здатний до сумісного окислення пероксидом водню люмінолу та п-йодфенолу, що приводить до суттєвого підсилення ХЛ. Виявилось, що п-йодфенол в концентрації 4·10-5– 2·10-3 мМ практично не впливає на інтенсивність свічення, а подальше збільшення його вмісту в середовищі від 5·10-3 до 4·10-2 мМ знижує ХЛ в 2,5 рази (рис. 3). Виходячи з цього, п-йодфенол не тільки не підсилює ХЛ, а, можливо, перешкоджає окисленню люмінола в нашому випадку.

Відповідно до ГОСТу міжнародного стандарту, для визначення загальної токсичності водного середовища в 20 мл стандартного середовища вміщують 10 дафній. Для визначення токсичності середовища по інтенсивності ХЛ, кількість дафній можна зменшити. Встановлено (рис. 4), що для достовірного тестування інтенсивності свічення достатньо перебування п’яти дафній в 10 мл середовища протягом 30 – 60 хв.

Зберігання зразків середовища при температурі 5оС протягом 1 – 3 годин після закінчення експерименту не впливає на інтенсивність ХЛ, в той час як температура 20 2оС значно знижує її.

2. Визначення чутливості Daphnia magna до різних типів токсичних речовин за допомогою хемілюмінесцентного методу. Відповідно до міжнародного стандарту досліди на токсичність проводяться при температурі 20 ± 2С. Відомо, що підвищення температури значно збільшує чутливість гідробіонтів до токсикантів, а фізіологічна температура саме для дафній лежить в межах 18 – 28С. З’ясовано, що при температурі 28С збільшується не тільки чутливість Daphnia magna до токсиканту, але й значно скорочується час його дії. Так, при температурі 20 ± 2С чутливість дафній до біхромату калію знаходиться в межах 0,9 – 2,0 мг/л, а час визначення становить 24 – 96 годин. У наших дослідженнях при температурі 28С чутливість методу становить 0,005 мг/л, а реакція тест-організму на токсикант спостерігається вже через 2 години (рис. 5).

Характер та інтенсивність ХЛ залежать від концентрації та природи хімічного агента, тому було доцільно дослідити і порівняти вплив різних токсикантів. З цією метою використовували високотоксичний для водних безхребетних пестицид метоміл (ЛК50 = 0,032 мг/л у разі тестування через 24 години), який є інгібітором холінестерази. Як видно з отриманих результатів (рис. 6), через 2 години експерименту зміну інтенсивності ХЛ інкубаційного середовища дафній під впливом цього пестициду можна спостерігати вже при концентрації, що майже в 25 разів нижча за ЛК50.

Було досліджено вплив трифлюраліну на ХЛ екзометаболітів дафній. За даними літератури напівлетальна концентрація (ЛК50) для дафній у разі тестування через 48 години становить 0,245 мг/л.

Оскільки трифлюралін впливає на ендокринну систему, то його токсичність за традиційними морфологічними показниками у дафній не можна встановити за короткий період часу визначення. Тоді як при використанні методу активованої ХЛ екзометаболітів інкубаційного середовища дафній, зміни можна реєструвати вже через 2 години експерименту. В дослідженому інтервалі концентрацій трифлюраліну спостерігалось значне зниження ХЛ. Так, при концентрації, близькій до ЛК50 для трифлюраліну, ХЛ інкубаційного середовища дафній знижувалась приблизно на 75%. (рис. 7).

Вплив різних за хімічною природою токсичних речовин може позначатися як шляхом зменшення, так і збільшення інтенсивності ХЛ.

НПАР – це високомолекулярні сполуки, які у водних розчинах не утворюють іонів. Токсична дія НПАР визначається головним чином неполярною частиною молекули, при цьому вона найбільш виражена при наявності в останніх ароматичного кільця.

З метою вивчення впливу НПАР на характер та інтенсивність ХЛ середовища інкубації дафній використовували розчини тритону Х-100. Збільшення концентрації вказаної ПАР призводило до значного підвищення ХЛ (рис. 8). Так, із підвищенням концентрації даної речовини до 25 мг/л інтенсивність ХЛ збільшувалась майже в 5 разів в порівнянні з контролем.

При цьому, під впливом тритону Х-100 на Daphnia magna в діапазоні досліджених концентрацій спостерігалась 100% виживаність молоді, що свідчить про меншу чутливість стандартного методу, основаному на іммобілізації дафній, у порівнянні з розробленим хемілюмінесцентним методом. ЛК50 для тритону через 24 години тестування стандартним методом складало 30 мг/л.

Подібний характер зміни ХЛ інкубаційного середовища дафній ми спостерігали при використанні іншого типу НПАР – твіну-80 (рис. 9). У процесі досліджень виявлено, що твін в інтервалі досліджених концентрацій поступово підвищує рівень активованої ХЛ екзометаболітів дафній. У разі 20 мг/л твіну рівень ХЛ збільшується на 80% порівняно з контролем.

В діапазоні досліджених концентрацій твіну-80 зміни на морфологічному рівні не були відмічені. НПАР даного типу, які не містять фенольного кільця, менш токсичні, ніж алкілфенолетоксилати.

3. Дослідження токсичності водних розчинів ПАР в процесі їх окислювальної обробки. Розроблений інструментальний метод біотестування був застосований нами для оптимізації технологічного процесу очистки води від НПАР типу оксиетильованих алкілфенолів.

Як об’єкт дослідження використовували неіоногенну ПАР – ОП-10, вихідна концентрація якого становила 50 ± 3 мг/л, що відповідає середньому рівню забрудненості більшості промислової стічної води цим типом сполук.

Для оцінки токсичності води за допомогою ракоподібних Daphnia magna величину рН досліджуваних проб попередньо доводили до рівня 7,8 ± 0,2. Інкубацію проводили в термостаті при 28?С протягом 24 годин.

Після біотестування розчинів ОП-10 у пом’якшеній водопровідній воді, які пройшли окислювальну обробку, та без неї, при тій самій концентрації нонілфенолетоксилатів токсичність за морфологічними ознаками була вище в пробах, які не піддавалися окисленню. Однак, це справедливо лише до певної межі концентрацій ОП-10, яка складає ~ 23 – 25 мг/л. Подальше зниження концентрації ОП-10 в процесі його окислювальної деструкції до 10 – 12,5 мг/л показувало більш високу токсичність розчинів в порівнянні з розчинами тієї ж концентрації, отриманими шляхом розведення вихідної проби. При більш глибокій окислювальній деструкції ОП-10 в розчині, ймовірно, збільшується концентрація токсичних продуктів озонолізу (наприклад, органічних пероксидів).

При дослідженні частково окислених проб ОП-10 у всьому діапазоні залишкових концентрацій відмічено значне зниження інтенсивності ХЛ відносно контролю (рис. 10).

Для того, щоб перевірити припущення про наявність в озонованих пробах сполук ПАР, які впливають на інтенсивність ХЛ, було проведено біотестування ряду проб, які містили відповідні концентрації вихідної (без обробки) речовини. Як видно із отриманих результатів (рис. 11), в досліджуваному діапазоні концентрацій (10 – 50 мг/л) спостерігалось значне підвищення рівня ХЛ інкубаційного середовища дафній. В даному випадку розбавлені проби не містили ніяких побічних речовин, що могли б вплинути на інтенсивність ХЛ, і характер залежності аналогічний одержаним для інших ПАР (тритону та твіну: рис. 8 та рис. 9 відповідно).

При вивченні морфологічних змін у дафній під впливом різних концентрацій ОП-10, отриманих розведенням вихідної проби, спостерігалась висока смертність рачків. Виходячи із кількості іммобілізованих дафній, ЛК50 (24 годин) для даної речовини становила 17,35 мг/л.

Процес окислювальної деструкції сполук ПАР супроводжувався утворенням пероксиду водню та/або органічних пероксидів. Концентрація пероксидних сполук (в перерахунку на пероксид водню) у розчинах ОП-10 в дистильованій воді після обробки О3 та О3/УФ складала 0,9 – 3,5 мг/л, у водопроводній воді – 0,3 – 1,8 мг/л. В ході роботи в модельних експериментах було показано, що присутність у середовищі інкубації дафній пероксиду водню, навіть в малих концентраціях, знижує рівень ХЛ.

Біотестування частково окислених за допомогою О3 та О3/УФ проб ОП-10 в дистильованій воді дало аналогічні результати. Присутність пероксидів підсилювала токсичність і знижувала інтенсивність ХЛ (рис. 12). Вплив самого УФ-опромінювання менше послаблював ХЛ, ніж О3/УФ-обробка досліджуваної речовини.

Узагальнення отриманих результатів дозволяє рекомендувати як оптимальний за показниками витрат окисника і тривалості обробки наступний режим попереднього окислення розчинів НПАР перед біосорбцією:

· доцільно зниження концентрації ОП-10 в розчині на ~ 50 % (від 50 до 25 мг/л);

· достатньо обмежити тривалість обробки розчинів ОП-10 озоном 30 хв, а озоном в поєднанні з УФ-опромінюванням – 20 хв.

За допомогою біолюмінесцентного методу з використанням бактерій V. fischeri F1 оцінено зміну токсичності розчинів аніонного (алкілбензолсульфонат натрію – АБС) та неіоногенного (ОП-10) ПАР в процесі їх окислювальної деструкції, а також після сорбційної доочистки частково окисленого розчину АБС на біологічно активному вугіллі (БАВ).

В таблиці 1 наведено характеристики водних розчинів АБС до і після їх окислювальної обробки та показано вплив параметрів обробки на рівень БЛ бактерій. На відміну від вихідного розчину АБС, його розчини після О3/УФ-обробки практично не знижували інтенсивність БЛ, якщо ступінь розкладання ПАР не перевищувала 50%. Однак, вже при остаточній концентрації АБС менше ніж 20 мг/л інгібування БЛ ставало помітним (на ~ 14%). Глибока деструкція вихідної сполуки (на 80 – 90%) приводила до зменшення інтенсивності БЛ майже у два рази.

Вихідний розчин ОП-10 при тестуванні в нейтральному середовищі (рН 7,0) володів низькою токсичністю, послаблення інтенсивності БЛ Vibrio fischeri F1 складало ~ 28% (табл. 2). Часткове окислення ОП-10 в слабо кислому середовищі (рН ~ 6) до остаточної концентрації 20 – 30 мг/л (за А224), незалежно від режиму обробки, слабо впливало на рівень БЛ. Токсичність цих розчинів була нижче, ніж вихідного. Тільки при ступені деструкції ОП-10, що дорівнювала 80 – 90%, рівень БЛ знижувався майже в 10 разів. Інтенсивний режим О3/УФ-обробки не приводив до збільшення токсичності реакційної суміші навіть при деструкції ОП-10 на ~ 80%. Токсичність цієї суміші помітно підсилювалась при озонуванні ОП-10 в лужному середовищі.

В фосфатно-цитратному буферному розчині (рН 5,5) БЛ бактерій Vibrio fischeri F1 при всіх вивчених режимах окислювальної обробки розчинів ОП-10 подавлялась практично повністю. Після розбавлення проб в 2 рази інтенсивність БЛ в більшості частково окислених розчинів ОП-10 була вище, ніж у вихідному, однак, в цілому, її рівень не перевищував 20% по відношенню до контролю. Враховуючи, що БЛ пов’язана з процесом ферментативного окислення і електронно-транспортними шляхами в клітині, а також беручи до уваги можливе конкурування ПАР (в тому числі і продуктів їх окислення) з міристиновим альдегідом за зв’язування з активним центром люциферази, не виключено утворення специфічних інгібіторів бактеріальної БЛ в ході окислювальної деструкції ОП-10.

Зовсім інша ступінь токсичності спостерігалась після фільтрування частково окисленного розчину АБС через БАВ. Тривалість контакту розчину АБС з БАВ протягом 30 – 100 хв забезпечувала практично повне зникнення токсичності проб, що супроводжувалось відновленням інтенсивності бактеріальної БЛ до вихідного рівня.

4. Розробка оптичного імунного біосенсору на основі OWLS для визначення окремих токсичних агентів. На рисунку 13 представлено схематичне зображення OWLS-датчика, який складається із оптичного шару хвильоводу (A), розташованого на поверхні скляної підкладки (Б) та оптичної решітки, зробленої у хвильоводі. Коли поляризоване лазерне проміння (В) (He-Ne) досягає решітки, відбувається його дифракція. Кут дифракції (Г) залежить не тільки від оптичних параметрів сенсора, а і від рефракторного індексу покриття поверхні. Хвильовід поступово обертається (Г), і коли дифрагований промінь потрапляє у хвильовід, він розповсюджується до краю датчика через багатократне внутрішнє відбиття. Інтенсивність відбитого світла реєструється фотодіодами (Д).

Оскільки біологічні процеси, що досліджуються, відбуваються у рідкій фазі, потік розчину через комірку спрямовано в області решітки хвильоводу. Детектор приладу з’єднаний з проточною інжекторною системою, яка містить перистальтичну помпу, що забезпечує потік буферного розчину зі швидкістю 90 мкл/хв, та інжектор, об’єм петлі якого становить 200 мкл.

Ефективність іммобілізації антитіл та антигенів була вивчена на моделі макромолекулярного аналіту білку теплового шоку 70 (БТШ 70). В обох випадках для його інтеграції з поверхнею сенсора використовували ГА. На рисунку 14 представлено типовий протокол іммобілізації та визначення, коли на аміносиланізовану поверхню був іммобілізований антиген БТШ 70.

Початкова частина кривої представляє активацію аміногруп поверхні чипу шляхом додавання в два етапи 2,5% водного розчину ГА. Потім поверхню декілька хвилин промивали дистильованою водою, змінювали середовище на трис-буфер (42 мМ, рН 7,4) та додавали БТШ 70 в концентрації 0,022 мг/мл. Після іммобілізації поверхню промивали буфером та 50 мМ НСl, після чого чип був готовий до використання. Цикл піків показує відповіді біосенсору на розчини з антитілами проти БТШ різної концентрації (рис. 14). Регенерацію чутливої поверхні після кожного виміру проводили 50 мМ розчином НСl.

Початковий нахил кривої, висота її підйому для стандартної концентрації та висота сигналу після промивання поверхні були пропорційні концентрації досліджуваних розчинів.

Для вивчення ефективності іншого методу іммобілізації антигену на аміномодифіковану поверхню біосенсору застосовували сукциновий ангідрид з подальшою його активацією N-ГС в присутності дегідруючого агенту. Як антиген використовували бичачий сироватковий альбумін (БСА). Відповідно проводили вимірювання концентрації розчинів поліклональних антитіл проти БСА.

Утворення карбоксильних груп на аміномодифікованій поверхні проводили шляхом занурення чипів на 1 годину при кімнатній температурі у 2% спиртовий розчин сукцинового ангідриду. Після цієї обробки сенсори висушували при 70С протягом 15 хв. Далі іммобілізували БСА до поверхні за допомогою N-ГС/ЕДК (рис. 15). Спочатку поверхню промивали трис-буфером, потім для формування активного сукцинімідного ефіру шар обробляли N-ГС/ЕДК (в дистильованій воді). Після цього поверхню знову промивали трис-буфером та середовище змінювали ацетатним буфером (13 мМ, рН 5,0) для забезпечення відповідних умов іммобілізації 0,1 мг/мл БСА. Після іммобілізації антигену поверхню промивали трис-буфером та блокували вільні сукцинімідні ефіри введенням 1 М розчину етаноламіну (рН 8,5). Під кінець поверхню чипу промивали буфером та 50 мМ HCl для видалення незв’язаних молекул. На кінець поверхня була готова для вимірювань.

Було досліджено можливість застосування OWLS-системи для визначення молекул з малим розміром, таких як гербіцид трифлюралін. У випадку виконання прямого аналізу, антитіла з отриманої проти трифлюраліну поліклональної сироватки іммобілізували на поверхню чипу та вимірювали стандартні його розчини. При іммобілізації антигену (непрямий аналіз) використовували кон’югат трифлюраліну з БСА.

Результати, отримані у випадку прямого вимірювання трифлюраліну, показали досить низьку чутливість, біля 100 нг/мл. Непрямий спосіб аналізу, що оснований на іммобілізації антигену, показав набагато вищу чутливість. У цьому випадку, взаємодія антитіл проти трифлюраліну з іммобілізованим антигеном інгібувалась наявністю трифлюраліну в зразку, що піддавався аналізу. Кон’югат БСА з трифлюраліном в концентрації 10 мкг/мл іммобілізували на поверхні трансдуцеру. Оптимальне розбавлення антисироватки становило 1:2000. Стандартні розчини трифлюраліну в межах від 10-6 до 10 нг/мл змішували з антисироваткою у співвідношенні 1:1, суміш інкубували 1 хв, після чого проводили вимірювання. Кількість антитіл, що зв’язувались з поверхнею сенсора, була обернено пропорційна вмісту трифлюраліну у зразку.

Отримані результати свідчать про те, що чутливість OWLS-імунного біосенсору майже на три порядки вища ніж розробленого ELISA методу для аналізу трифлюраліну. Однак, у разі застосування представленого способу для практичних аналітичних цілей виникає проблема стабільності сигналу. Виявилось, що модифіковані чипи можна використовувати протягом одного дня при багатократному вимірюванні, однак при цьому відмічається зменшення сигналу біосенсору як в дослідних пробах, так і в контрольних. Погіршення сигналу може привести до похибки визначення чутливості методу, оскільки сигнал зменшується через “старіння” чипу (змивання іммобілізованого БСА-кон’югату трифлюраліну з поверхні чипу). Для усунення таких артефактів, стандартні та контрольні розчини вимірювали послідовно. Показано, що корекцію зменшення в часі інтенсивності відгуків сенсора на різні концентрації трифлюраліну можна проводити шляхом віднімання їх значень від величини сигналів відповідних до них контрольних розчинів (рис. 16).

У разі використання корекції до контролю, який зменшується у часі, ми отримуємо значно менші значення сигналів імунного біосенсору, однак одержані результати все ще показують залежність відгуків від концентрації трифлюраліну та можна встановити чіткі сигмоїдні стандартні криві, де IК50 для визначення цього аналіту становить 3,5·10-4 нг/мл.

Не дивлячись на те, що протокол іммобілізації потребує вдосконалення для вирішення проблеми десорбції антигену з поверхні чипу, отримані результати показують, що сформовані модифіковані поверхні можна з успіхом використовувати для ковалентної іммобілізації антитіл або антигенів, OWLS-біосенсор можна застосовувати для визначення як макромолекул так і для молекул з малим розміром.

Висновки

1.

2.

3.

4.

5.

6.

СПИСОК РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Ивашкевич С. П., Левковец И. А., Назаренко В. И., Стародуб Н. Ф. Хемилюминесценция среды обитания дафний и оптимизация условий ее определения // Украинский биохимический журнал – 2002. – Т. 74, № 3. – С. 77 – 81.

2. Левковець І. А., Івашкевич С. П., Назаренко В. І., Стародуб М. Ф. Застосування хемілюмінесцентного методу для визначення чутливості Daphnia magna до різних типів токсичних речовин // Український біохімічний журнал – 2002. – Т. 74, № 6. – С. 120 – 124.

3. Левковец И. А., Стародуб Н. Ф., Назаренко В. И., Ивашкевич С. П., Гончарук В. В., Клименко Н. А., Вакуленко В. Ф., Швадчина Ю. О. Оценка токсичности водных растворов ПАВ в процессе их окислительной обработки // Химия и технология воды – 2003. – Т. 25, № 1 – С. 30 – 42.

4. Кацев А. М., Стародуб Н. Ф., Левковец И. А., Гончарук В. В., Клименко Н. А., Вакуленко В. Ф. Использование бактериальной биолюминесценции для тестирования токсичности воды при ее очистке от ПАВ // Химия и технология воды – 2003. – Т. 25, № 6 – С. 594 – 602.

5. Starodub N. F., Starodub V. V., Katzev A. M., Levkovetz I. A., Dibrova T. L., Krivenchuk V. E., Schapovalenko V. F. Optical and electrochemical biosensor for express environmental monitoring / L. Barsanti et al. (eds.) Molecular Electronics: Biosensors and Biocomputers. – 2003. – P. 355 – 372.

6. Levkovets I., Adбnyi N., Trummer N., Vбradi M., Szendrх I., Starodub N. F., Szйkбcs A. Development of optical (OWLS) immunosensors for macromolecules and small analytes // Biokйmia. – 2004. XXVIII. – Р. 2 – 9.

7. Starodub N. F., Nazarenko V. I., Moiseyenko K. J., Levkovets I. A., Ivashkevich S. P. Daphnia and luminescent reaction based biosensor for control of general toxicity of environment // Proceeding of 5th International Conference on Cellular Engineering, Aachen, Germany, 4-6 July. – 2001. – Р.4-6.

8. Levkovetz I. A., Starodub N. F., Ivashkevich S. P. et al. New biosensor approach for total toxicity control of environment // Abstract Book of NATO ARW “Frontiers in molecular-scale science and technology of fullerene, nanotube, nanosilicon, biopolymer (DNA, protein) multifunctional nanosystems. (Kiev, 9-12 September, 2001). – Kiev. – 2001. – P. 11.

9. Starodub N. F., Ivashkevich S. P., Levkovetz I. А., Nazarenko V. I., Klimenko N. A. Express and instrumental analysis of total water toxicity by Daphnia chemiluminescent and microbilogical electrochemical biosensors. // Abstract Book of 10th ISSP & Workshop “Solubility phenomena”, 21-26 July 2002, St. Constantine Resort, Varna, Bulgaria. – 2002. – P. 56.

10. Назаренко В. І., Левковець І. А., Івашкевич С. П., Гойстер О. С. Визначення токсинів хемілюмінесцентним біотестуванням // Стендові повідомлення. Український біохімічний журнал – 2002. – Т. 74, № 4 б (додаток 2). – С. 189.

11. Ивашкевич С. П., Левковец И. А., Клименко Н. А. Хемилюминесцентный биотест на основе дафний с целью контроля процесса очистки воды // Там же, –